Summary
Vi designede og konstruerede et mobilt laboratorium til måling af respirationsrater i isolerede mitokondrier hos vilde dyr fanget på feltsteder. Her beskriver vi design og indretning af et mobilt mitokondrielaboratorium og de tilhørende laboratorieprotokoller.
Abstract
Mitokondriel energetik er et centralt tema i dyrebiokemi og fysiologi, hvor forskere bruger mitokondriel respiration som en metrisk til at undersøge metabolisk kapacitet. For at opnå målene for mitokondriel respiration skal der anvendes friske biologiske prøver, og hele laboratorieproceduren skal være afsluttet inden for ca. 2 timer. Desuden kræves flere stykker specialudstyr til at udføre disse laboratorieanalyser. Dette skaber en udfordring for måling af mitokondriel respiration i væv fra vilde dyr, der lever langt fra fysiologiske laboratorier, da levende væv ikke kan bevares meget længe efter indsamling i marken. Desuden fremkalder transport af levende dyr over lange afstande stress, hvilket kan ændre mitokondriel energi.
Dette manuskript introducerer Auburn University (AU) MitoMobile, et mobilt mitokondriefysiologilaboratorium, der kan tages med i marken og bruges på stedet til at måle mitokondriemetabolisme i væv indsamlet fra vilde dyr. De grundlæggende funktioner i det mobile laboratorium og de trinvise metoder til måling af isolerede mitokondrie respirationshastigheder præsenteres. Derudover validerer de præsenterede data succesen med at udstyre det mobile mitokondriefysiologiske laboratorium og foretage mitokondrie-respirationsmålinger. Nyheden i det mobile laboratorium ligger i evnen til at køre til marken og udføre mitokondrie målinger på væv fra dyr fanget på stedet.
Introduction
Hidtil har undersøgelser designet til at måle mitokondriel energetik været begrænset til forsøgsdyr eller dyr fanget nær etablerede fysiologiske laboratorier, hvilket udelukkede forskere fra at udføre mitokondrie bioenergetiske undersøgelser i væv indsamlet fra dyr under sådanne aktiviteter som migration, dykning og dvaletilstand 1,2,3,4,5,6 . Mens mange forskere med succes har målt de basale og maksimale metaboliske hastigheder og daglige energiforbrug hos vilde dyr7,8, har forskernes kapacitet til at måle mitokondriernes ydeevne været begrænset (men se 1,4,9). Dette skyldes til dels behovet for frisk væv til isolering af mitokondrier og en laboratoriefacilitet til at udføre isoleringerne inden for ca. 2 timer efter opnåelse af det friske væv. Når mitokondrierne er blevet isoleret, skal mitokondrie-respirationsmålingerne også være afsluttet inden for ~ 1 time.
Isolerede mitokondrie respirationshastigheder udføres normalt ved at måle iltkoncentration i en forseglet beholder forbundet til en Clark-elektrode. Teorien bag denne metode er baseret på den grundlæggende observation, at ilt er den sidste elektronacceptor for mitokondriel respiration under oxidativ fosforylering. Derfor, som iltkoncentration falder under et forsøg, antages det, at adenosintrifosfat (ATP) produktion forekommer10. Forbrugt ilt er en proxy for produceret ATP. Forskere kan skabe specifikke eksperimentelle betingelser ved hjælp af forskellige substrater og indlede adenosindiphosphat (ADP)-stimuleret respiration (tilstand 3) ved at tilføje forudbestemte mængder ADP til kammeret. Efter phosphoryleringen af den eksogene ADP til ATP falder iltforbrugshastigheden, og tilstand 4 nås og kan måles. Desuden gør tilføjelsen af specifikke hæmmere det muligt at opnå information om lækagerespiration og ukoblet respiration10. Forholdet mellem tilstand 3 og tilstand 4 bestemmer respirationskontrolforholdet (RCR), som er indikatoren for den samlede mitokondriekobling10,11. Lavere værdier af RCR indikerer generel mitokondriel dysfunktion, mens højere RCR-værdier tyder på en større grad af mitokondriekobling10.
Som tidligere nævnt skal indsamling af biologisk materiale, mitokondrieisolering og måling af respirationshastigheder være afsluttet inden for 2 timer efter opnåelse af væv. For at udføre denne opgave uden at transportere dyr over store afstande til etablerede laboratorier blev der bygget et mobilt mitokondriefysiologilaboratorium, der skal føres til feltsteder, hvor disse data kan indsamles. Et 2018 Jayco Redhawk fritidskøretøj blev omdannet til et mobilt molekylært fysiologilaboratorium og navngivet Auburn University (AU) MitoMobile (figur 1A). Et fritidskøretøj blev valgt på grund af det indbyggede køleskab, fryser, vandopbevaringstank og VVS, elektricitet drevet af 12 volt batterier, gasgenerator, propantank og selvnivellerende system. Desuden giver fritidskøretøjet mulighed for at opholde sig på fjerntliggende steder natten over til dataindsamling. Køretøjets front blev ikke ændret og giver køre- og soverum (figur 1B). Tidligere installerede soveværelsesfaciliteter (seng, tv og skab) bag på køretøjet og komfuret blev fjernet.
Specialfremstillede hylder i rustfrit stål og en brugerdefineret kvarts bordplade understøttet af 80/20 aluminiumsramme blev installeret i stedet for soveværelsets faciliteter og komfur (figur 1C). Laboratoriebænkene giver tilstrækkelig plads til dataindsamling (figur 1D). Strømforbruget for hvert stykke udstyr (dvs. kølecentrifuge, mitokondrie-respirationskamre, pladelæsere, computere, homogenisatorer, vægte, bærbar ultrafryser og andre generelle laboratorieforsyninger) blev taget i betragtning. For at understøtte centrifugens store spændings- og strømkrav blev det elektriske system opgraderet til udstyr af flykvalitet. Et udvendigt rum bag på køretøjet blev omdannet til en opbevaringsplads for flydende nitrogen, hvilket opfylder det amerikanske transportministeriums retningslinjer for opbevaring og transport af flydende nitrogen. Denne opbevaringsenhed blev konstrueret med rustfrit stål og har korrekt udluftning for at forhindre enhver ekspanderende nitrogengas i at lække ind i køretøjets kabine.
For at bekræfte, at det mobile laboratorium kan anvendes i mitokondrie bioenergetiske undersøgelser, blev mitokondrier isoleret, og mitokondrie respirationshastigheder fra vildtafledte husmus (Mus musculus) bagben skeletmuskulatur blev målt. Fordi Mus musculus er en modelorganisme, er mitokondrierespirationshastighederne for denne art veletablerede12,13,14. Selvom tidligere undersøgelser har dokumenteret mitokondrieisolering via differentiel centrifugering15,16,17, er en kort oversigt over de metoder, der anvendes i de mobile mitokondriefysiologiske laboratoriemetoder, beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De følgende afsnit beskriver mitokondrie laboratoriemetoder. Alle procedurer for håndtering af dyr og vævsopsamling blev godkendt af Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee (#2019-3582).
1. Beskrivelse af buffere, der anvendes til dataindsamling
BEMÆRK: Disse buffere kan fremstilles i et stationært laboratorium og flyttes til det mobile laboratorium inden ekskursionen (medmindre andet er angivet nedenfor).
- Mitokondrieisolationsbufferen til skeletmuskulatur fremstilles med bovin serumalbumin (BSA), som det fremgår af tabel 1.
- Opløs kemikalier i deioniseret vand (~ 90% volumen) undtagen fedtsyrefri BSA. Anbring bufferen i køleskabet, indtil temperaturen er 4 °C.
- Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,5, samtidig med at temperaturen holdes på 4 °C.
- Tilsæt den fedtsyrefri BSA og bring lydstyrken op til 100%. Alikvote opløsningen i 50 ml koniske rør. Denne opløsning opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Forbered mitokondrieisolationsbufferen til skeletmuskulaturen uden BSA som vist i tabel 1.
- Opløs kemikalierne i deioniseret vand (~ 90% volumen). Anbring bufferen i køleskabet, indtil temperaturen er 4 °C.
- Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,5, samtidig med at temperaturen holdes på 4 °C.
- Skru lydstyrken op til 100%. Alikvote opløsningen i 50 ml koniske rør. Denne opløsning opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Forbered bufferen til resuspension af skeletmuskulaturen som vist i tabel 1.
- Opløs kemikalierne i deioniseret vand (~ 90% volumen). Anbring bufferen i køleskabet, indtil temperaturen er 4 °C.
- Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,4, samtidig med at temperaturen holdes på 4 °C.
- Skru lydstyrken op til 100%. Alikvote opløsningen i 50 ml koniske rør. Denne opløsning opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Forbered bufferen til respiration i skeletmuskulaturen som vist i tabel 2.
- Opløs kemikalierne i deioniseret vand (~ 90% volumen) undtagen fedtsyrefri BSA. Bufferen opvarmes, indtil temperaturen er 37 °C.
- Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 7,0, samtidig med at temperaturen holdes på 37 °C.
- Tilsæt den fedtsyrefri BSA og bring lydstyrken op til 100%. Alikvote opløsningen i 50 ml koniske rør. Denne opløsning opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Forbered respirationssubstraterne som vist i tabel 2.
- Sørg for, at disse substrater er friske på dataindsamlingsdagen i 100 mM Tris-HCI, pH 7,4. Opbevares på is indtil brug.
BEMÆRK: De angivne værdier skal udgøre en tilstrækkelig koncentreret opløsning til, at mitokondrierne kan optage tilstrækkeligt substrat. De endelige koncentrationer af substraterne er 2 mM pyruvat, 2 mM malat, 10 mM glutamat og 5 mM succinat.
- Sørg for, at disse substrater er friske på dataindsamlingsdagen i 100 mM Tris-HCI, pH 7,4. Opbevares på is indtil brug.
2. Udførelse af mitokondrieisolering (figur 2)
BEMÆRK: Mitokondrieisolering og mitokondriel respirationsmålinger udføres i laboratoriebænkområdet i det mobile laboratorium, og alle opløsninger skal opbevares ved 4 °C, medmindre andet er angivet.
- Parker det mobile laboratorium på fladt underlag. Tænd generatoren, og niveller. Forlæng diaset og opsæt udstyret.
- Optø de ønskede mængder buffere.
BEMÆRK: Generelt er der behov for 30 ml skeletmuskelisolationsbuffer og 10 ml skeletmuskelisolationsbuffer uden BSA pr. Muskel. - Opsæt og kalibrer mitokondriernes respirationskamre til den ønskede temperatur for eksperimenter og det aktuelle barometriske tryk i henhold til producentens anvisninger. Se materialetabellen for specifikke kamre, der anvendes i forsøg.
- Aflive dyret via halshugning.
BEMÆRK: Den aktuelle undersøgelse brugte halshugning til eutanasi. Nogle gasser, såsom kuldioxid og isofluran, påvirker mitokondriefunktionen18,19,20; Disse virkninger bør overvejes, når man vælger den bedste metode til eutanasi for hver undersøgelse. Hvilken metode der skal udføres for hver undersøgelse, bestemmes af det videnskabelige spørgsmål, der stilles. - Punktvis skeletmuskulatur, trim hurtigt fedt og bindevæv væk, vej og placer musklen i skeletmuskelisolationsbuffer med BSA (mindst 1/10 w / v) (f.eks. 1 g skeletmuskulatur til 10 ml buffer).
- Hak skeletmuskulaturen med en saks på is.
- Overfør hakket væv til et 50 ml centrifugerør ved hjælp af en skåret 5 ml pipetspids. Homogeniser det med et blad (se materialetabellen) ved 50% effekt i 5 s. Der tilsættes protease (5 mg/g våd muskel) og fordøjes i 7 minutter, idet opløsningen blandes for hver 30. s. Afslut reaktionen ved at tilføje en lige så stor mængde isolationsbuffer med BSA.
- Homogenatet centrifugeres ved 500 × g i 10 min. Supernatanten overføres gennem osteklæde i to lag med en skåret pipetspids på 5 ml til et rent 50 ml centrifugeglas. Supernatanten centrifugeres ved 3.500 × g i 10 minutter for at udfælde en brun mitokondriepille.
- Den resterende supernatant hældes ud. Der tilsættes den samme mængde isolationsbuffer med BSA til centrifugeglasset. Mitokondriepillen resuspenderes med en fleksibel skraber (politimand) ved forsigtigt at arbejde mitokondriepillen ud af centrifugerørets vægge. Der centrifugeres ved 3.500 × g i 10 min.
- Den resterende supernatant hældes ud. Der tilsættes den samme mængde isolationsbuffer uden BSA til centrifugeglasset. Mitokondriepillen resuspenderes ved forsigtigt at arbejde mitokondriepillen ud af centrifugerørets vægge med en ren politimand. Der centrifugeres ved 3.500 × g i 10 min.
- Supernatanten dekanteres, og mitokondriepillen resuspenderes i resuspensionsbuffer ved forsigtigt at bearbejde mitokondriepillen fra centrifugerørets vægge med en ren politimand.
BEMÆRK: Resuspensionsbufferens volumen afhænger af mitokondrispillerens størrelse. - Overfør de resuspenderede mitokondrier til en Dounce homogenisator med en skåret 1 ml pipetspids. Brug Dounce-homogenisatoren til forsigtigt at homogenisere suspensionen med 4-5 passager.
- Anbring mitokondriesuspensionen i et mærket 2 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en anden skåret 1 ml pipetspids.
3. Mitokondriel respirationsmålinger (figur 3)
- Komplekse I-substrater
- Tilsæt 945 μL respirationsbuffer til kammeret. Sørg for, at rørevingen roterer, og at buffertemperaturen holdes på 37 °C. Start registreringen af dataindsamlingen.
- Når iltkoncentrationen er stabiliseret, tilsættes 20 μL mitokondrier og låget placeres på kammeret. I softwaren angiver du, at mitokondrier blev tilføjet til kammeret.
- Der tilsættes 10 μL 1 M glutamat, 10 μL 200 mM malat og 10 μL 200 mM pyruvat til kammeret med individuelle sprøjter, og vent, indtil signalet stabiliseres. I softwaren angiver du, at der er tilsat substrater.
BEMÆRK: Disse substrater bruges typisk til at måle kulhydratdrevet respiration. For andre kombinationer af substrater, der skal anvendes til måling af fedtdrevet respiration, se21. - Tilsæt 5 μL ADP med en separat sprøjte og observer det hurtige iltforbrug (tilstand 3). I softwaren angiver du, at ADP blev tilføjet.
BEMÆRK: Efter phosphoryleringen af den tilsatte ADP vil iltforbrugshastigheden plateau til tilstand 4. - Efter 4 minutters dataindsamling i tilstand 4 skal du afslutte optagelsen. Gem datafilen.
- Komplekse II substrater
- Der tilsættes 963 μL af respirationsbufferen til kammeret. Sørg for, at rørevingen roterer, og at buffertemperaturen holdes på 37 °C. Start registreringen af dataindsamlingen.
- Når iltkoncentrationen er stabiliseret, tilsættes 20 μL mitokondrier og låget placeres på kammeret. I softwaren angiver, at mitokondrier blev tilføjet til opløsningen.
- Der tilsættes 2 μL 4 μg/μL rotenon efterfulgt af 10 μL 500 mM succinat til kammeret ved hjælp af separate sprøjter, og vent, indtil signalet stabiliseres. I softwaren angiver du, at der er tilsat substrater.
- Tilsæt 5 μL ADP ved hjælp af en separat sprøjte og observer det hurtige iltforbrug (tilstand 3). I softwaren angiver du, at ADP blev tilføjet.
BEMÆRK: Efter phosphoryleringen af den tilsatte ADP vil iltforbrugshastigheden plateau til tilstand 4. - Efter 4 minutters dataindsamling i tilstand 4 skal du afslutte optagelsen. Gem datafilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det nuværende manuskript undersøgte mitokondrierespirationen af vildtafledt Mus musculus (n = 7, han = 5, hun = 2; alder = 1,30 ± 0,2 år) i et mobilt mitokondriefysiologilaboratorium (figur 1). For at måle mitokondriel respiration af skeletmuskulatur blev hele bagbenet, således aerob og anaerob muskel, brugt til mitokondrieisolering (figur 2). Eksempler på rå mitokondrie respirationsdata er vist i figur 3. Figur 3A og figur 3B repræsenterer kompleks I-drevet mitokondriel respiration. Den stejle hældning, der observeres i figur 3A , repræsenterer den høje maksimale respirationshastighed. Dette er den værdi, der bruges til yderligere dataanalyse. Den vellykkede isolering af mitokondrier fra bagbenets skeletmuskulatur observeres ved den skarpe drejning og stabiliseringen af en ny hældning, som bestemmer tilstand 4 (figur 3B).
Disse data kan også fortolkes som, at mitokondrierne er højt fungerende på grund af den skarpe drejning for at etablere tilstand 4. Et lignende mønster kan observeres for kompleks II-drevet mitokondriel respiration (figur 3C og figur 3D). Figur 3E,F viser dårligt fungerende mitokondrier, enten på grund af mitokondriefysiologi eller mislykket mitokondriel respiration. Figur 3E viser koblingen af mitokondrierne for kompleks I-drevet mitokondriel respiration, set ved drejningen til tilstand 4. Figur 3F viser imidlertid ukoblet kompleks II mitokondriel respiration, som demonstreret ved en flad linje efter tilsætning af ADP, og ingen "drejning" for at producere tilstand 4-data. Disse data tyder på mulige problemer under mitokondrieisolering, som diskuteres nedenfor.
De numeriske værdier af tilstand 3, tilstand 4 og RCR for både kompleks I og kompleks II af disse dyr findes i figur 4. Disse data blev bestemt ved at måle 30 s af den stejleste hældning efter tilsætning af ADP for at bestemme tilstand 3 (figur 3A, C) og måle hældningen efter "drejningen" i 1 min for at måle tilstand 4 (figur 3B, D). Når disse værdier var opnået, blev dataene normaliseret til proteinindhold (via Bradford-assay22). Ved hjælp af de normaliserede værdier blev RCR beregnet ved at dividere den normaliserede tilstand 3-værdi med den normaliserede tilstand 4-værdi.
Figur 1: AU MitoMobile, et mobilt mitokondriefysiologilaboratorium. (A) Ydersiden af AU MitoMobile. (B) Indersiden af køretøjet set fremad, hvor der ikke er foretaget ændringer. (C) Køretøjets bagende, der viser afleveringen af bænke, opbevaringsrum og centrifuge. (D) Opsætning af udstyret under dataindsamling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mitokondriel isolation og respirationsmålingsprocedure i skeletmuskulatur. (1) Væv dissekeres fra dyret og anbringes i buffer, hvor det (2) hakkes, homogeniseres, behandles med protease og underkastes centrifugering, indtil mitokondriepellet er opnået. (3) Mitokondripellet resuspenderes, og der opnås respirationsdata. (4) Data om iltforbrug kan bruges til at beregne tilstand 3, tilstand 4 og RCR. Forkortelse: RCR = respirationskontrolforhold. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mitokondrie respirationsmålinger med komplekse I og komplekse II substrater. Oxygenforbrug med komplekse I-substrater, der fremhæver hældningsanalysen af tilstand 3 (A) og tilstand 4 (B). Oxygenforbrug med komplekse II-substrater, der fremhæver hældningsanalysen af tilstand 3 (C) og tilstand 4 (D). Suboptimal mitokondriel respiration kan ses i kompleks I-drevet respiration (E) og kompleks II-drevet respiration (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Data indsamlet på husmus (Mus musculus) i AU MitoMobile. Mitokondriel isolering og åndedræt blev udført ved anvendelse af proceduren beskrevet her. Pyruvat, malat og glutamat blev brugt til at bestemme komplekse I-respirationshastigheder. Succinat og rotenon blev brugt til at måle komplekse II respirationshastigheder. (A) Komplekse I-tilstands-3-målinger, (B) komplekse I-tilstands-4-målinger, (C) komplekse I-RCR-målinger, (D) komplekse II-tilstands-3-målinger, (E) komplekse II-tilstands-4-målinger og (F) komplekse II RCR-målinger. Forkortelse: RCR = respirationskontrolforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mitokondrier isolation buffer til skeletmuskulatur | ||
| Reagens | med BSA, koncentration (mM) | uden BSA, koncentration (mM) |
| KCl | 100 | 100 |
| Tris-HCI | 40 | 40 |
| Tris-base | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| Fedtsyrefri BSA | 0.15% | - |
| Isoleret mitokondrier resuspension buffer til skeletmuskulatur | ||
| Reagens | Koncentration (mM) | |
| Mannitol | 220 | |
| Saccharose | 70 | |
| Tris-HCI | 10 | |
| EGTA | 1 | |
Tabel 1: Mitokondrieisolationsbuffere (med og uden BSA) og isolerede mitokondrierresuspensionsbuffere til skeletmuskulatur.
| Respirationsbuffer | |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| KCl | 100 |
| MOPPER | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glukose | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| Fedtsyrefri BSA | 0.20% |
| Respirationssubstrater | |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| Pyruvat | 200 |
| Malate | 200 |
| Succinat | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamat | 1000 |
Tabel 2: Respirationsbuffer og substrater.
| Stat 3 | Stat 4 | RCR | Studium | Substrater |
| 368.3±80.4 | 68.9±25.0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM pyruvat, 2 mM malat |
| 241.8±22.5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM pyruvat, 2 mM malat |
| 285.7±36.5 | 81.9±2.9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM succinat, 4 μM rotenon |
| 493.4±105.4 | 61.3±9.6 | 8.2±2.2 | Aktuel undersøgelse | 2mM pyruvat, 2mM malat, 10 mM glutamat |
| 559.5±74.9 | 165.2±18.5 | 3.4±0.2 | Aktuel undersøgelse | 5 mM succinat, 4 μg/μL rotenon |
Tabel 3: Sammenligningsværdier for tilstand 3, tilstand 4 og RCR. Forkortelse: RCR = respirationskontrolforhold. Tilstand 3 og tilstand 4 værdier vist i nmolerO2/mg protein/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mobile mitokondriefysiologiske laboratorium gør det muligt for forskere at isolere mitokondrier og måle mitokondrierespirationshastigheder inden for 2 timer efter vævsopsamling på fjerntliggende feltsteder. Resultaterne heri tyder på, at målinger af mitokondriel respiration foretaget i AU MitoMobile er sammenlignelige med målinger foretaget i et universitetsforskningslaboratorium. Specifikt er værdierne for tilstand 3, tilstand 4 og RCR for vildtafledt mus musculus, der præsenteres her, sammenlignelige med tidligere offentliggjorte resultater fra samme laboratorium og andre (tabel 3)12,23. Det skal dog bemærkes, at der på grund af forskellige musestammer og anvendte metoder ikke kan foretages en direkte sammenligning af disse undersøgelser. Disse resultater demonstrerer proof of concept til måling af mitokondriel respiration i dette mobile mitokondriefysiologiske laboratorium.
Alle de kemikalier og materialer, der er nødvendige for mitokondrieisolering og respiration, kan transporteres og opbevares i det mobile laboratorium, hvilket giver nem adgang ved opsætning og udførelse af eksperimenter. Derudover giver isolerede mitokondrier indsamlet i et mobilt mitokondrielaboratorium en unik prøve til at udføre andre biokemiske målinger såsom emission af reaktive iltarter. Det er vigtigt, at frosne mitokondrier kan transporteres til et stationært laboratorium til yderligere biokemiske målinger (f.eks. Individuelle elektrontransportkædeenzymaktiviteter). Især isolering af mitokondrier via centrifugeringsdifferentiering er ikke den eneste metode til måling af mitokondriel respiration. Andre laboratorier har udført vellykkede målinger af mitokondriel respiration med permeabiliserede fibre. Selvom det nuværende manuskript ikke beskriver denne metode (for flere detaljer om permeabiliserede fibre, se 24,25,26,27,28), er det vigtigt for læserne at bemærke, at et mobilt mitokondriefysiologilaboratorium også kunne huse de materialer, der er nødvendige for denne procedure. Se andre anmeldelser om styrker og svagheder ved hver af disse metoder25,29,30.
Flere laboratorier, der udfører mitokondriel bioenergetikforskning, har offentliggjort fejlfindingsanbefalinger, som læserne kan finde nyttige15,17. For ethvert enkelt eksperimentelt projekt skal der laves en enkelt batch buffere til indsamling af alle data. Brug af buffere lavet på forskellige dage skaber mulighed for variation i opløsninger til påvirkning af mitokondrie respirationsmålinger. Skader på den ydre mitokondriemembran vil forekomme under isoleringsprocessen; Imidlertid kan korrekt udførelse af isolationsmetoden gennem laboratorietræning minimere den skade, der naturligt vil opstå med denne procedure29,31. Under isoleringsprocessen indikeres ikke-funktionelle eller overdrevent beskadigede mitokondrier med en hvid fluffy mitokondriel pellet snarere end en kompakt brun pellet. Ikke-funktionelle eller beskadigede mitokondrier kan skyldes et for stort omdrejningstal under bladhomogenisering, homogenisering for længe, tilsætning af for meget protease eller fordøjelse for længe eller for mange slag, der anvendes under den endelige resuspension af mitokondrier.
Desuden vil valget af, hvilken muskel der skal isoleres, og hvor meget muskel der bruges, påvirke mitokondrieudbyttet. For eksempel i et dyr med en højere mitokondrietæthed, såsom en fugl21, vil flere mitokondrier blive udfældet sammenlignet med en blanding af skeletmuskelfibertyper fra en rottes bagben. Dette vil også ændre mængden af væv, der er nødvendigt for en vellykket isolering. Jo større mitokondrietætheden i et væv er, desto lavere er mængden af væv, der er nødvendigt for en vellykket isolering. Forskere bør også overveje mængden af mannitol-saccharoseopløsning tilsat til de endelige isolerede mitokondrier. En tættere pakket mitokondriel pellet vil have brug for en højere fortynding, mens en mindre tæt pakket mitokondriel pellet vil have brug for en lavere fortynding. Omfanget af fortyndingen afhænger af dyret, den oxidative karakter af skeletmuskulaturen, der isoleres, og hvor tæt pakket mitokondriepellet er.
At have tilstrækkelig elektrisk strøm til at understøtte alt udstyr, der er nødvendigt til dataindsamling i et mobilt laboratorium, kan være udfordrende. Især trækker den nedkølede centrifuge en høj strøm under drift (især i de indledende faser af nedkøling). Der bør derfor tages særlige hensyn for at sikre, at køretøjets elektriske effekt svarer til det elektriske behov for det udstyr, der er nødvendigt for at køre samtidigt. En anbefaling, der kan løse denne begrænsning, er tilføjelsen af flere strømkilder (f.eks. Ekstra batterier, ekstra generatorer). Især behøver metoden til måling af mitokondriel respiration med permeabiliserede fibre ikke brug af en kølecentrifuge og kan også give en opløsning til den begrænsede strømkilde. Miljøforhold og vejkvalitet bør også tages i betragtning ved brug af et mobilt laboratorium. Det mobile mitokondriefysiologiske laboratorium, der diskuteres heri, blev med succes kørt på interstate veje med klart vejr. Grusveje med hårdt vejr vil give større vanskeligheder med at køre køretøjet til det interessante sted. Selvom mitokondrieisolering ikke er en ny metode, giver dens anvendelse i et mobilt laboratorium en unik måde at kvantificere mitokondriel energetik hos fritlevende dyr. Dette kan være afgørende for at belyse forskellene mellem laboratoriedyr og vilde dyr32,33,34. Derudover giver det mobile mitokondriefysiologiske laboratorium forskere mulighed for at studere energetiske begrænsninger og energetiske ekstremer, der findes blandt dyr i den naturlige verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Mark Nelms og John Tennant fra afdelingen for elektro- og computerteknik på Samuel Ginn College of Engineering ved Auburn University for at hjælpe med den strukturelle og elektriske indretning af AU MitoMobile. Derudover anerkender forfatterne finansieringen til at udstyre AU MitoMobile og forskning fra et Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
