Summary
Vi designade och konstruerade ett mobilt laboratorium för att mäta andningsfrekvensen i isolerade mitokondrier hos vilda djur som fångats på fältplatser. Här beskriver vi design och utrustning av ett mobilt mitokondrielaboratorium och tillhörande laboratorieprotokoll.
Abstract
Mitokondriell energi är ett centralt tema inom djurbiokemi och fysiologi, med forskare som använder mitokondriell andning som ett mått för att undersöka metabolisk förmåga. För att få mått på mitokondriell andning måste färska biologiska prover användas, och hela laboratorieproceduren måste slutföras inom cirka 2 timmar. Dessutom krävs flera delar av specialutrustning för att utföra dessa laboratorieanalyser. Detta skapar en utmaning för att mäta mitokondriell andning i vävnader från vilda djur som lever långt från fysiologiska laboratorier eftersom levande vävnad inte kan bevaras särskilt länge efter insamling i fält. Att transportera levande djur över långa sträckor orsakar dessutom stress, vilket kan förändra mitokondriernas energi.
Detta manuskript introducerar Auburn University (AU) MitoMobile, ett mobilt mitokondriellt fysiologilaboratorium som kan tas in i fält och användas på plats för att mäta mitokondriell metabolism i vävnader som samlats in från vilda djur. Det mobila laboratoriets grundläggande egenskaper och steg-för-steg-metoder för att mäta isolerade mitokondriella andningsfrekvenser presenteras. Dessutom validerar de data som presenteras framgången med att utrusta det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet och göra mitokondriella andningsmätningar. Det nya med det mobila laboratoriet ligger i möjligheten att köra till fältet och utföra mitokondriella mätningar på vävnader från djur som fångats på plats.
Introduction
Hittills har studier som är utformade för att mäta mitokondriell energi begränsats till försöksdjur eller djur som fångats nära etablerade fysiologiska laboratorier, vilket uteslutit forskare från att utföra mitokondriella bioenergetiska studier i vävnader som samlats in från djur under sådana aktiviteter som migration, dykning och övervintring 1,2,3,4,5,6 . Medan många forskare framgångsrikt har mätt de basala och maximala ämnesomsättningshastigheterna och den dagliga energiförbrukningen hos vilda djur 7,8, har forskarnas kapacitet att mäta mitokondriernas prestanda förblivit begränsad (se 1,4,9). Detta beror delvis på behovet av färsk vävnad för att isolera mitokondrier och en laboratorieanläggning för att utföra isoleringarna inom cirka 2 timmar efter att den färska vävnaden erhållits. När mitokondrierna har isolerats bör även mätningarna av mitokondriernas andning slutföras inom ~1 timme.
Isolerade mitokondriella andningshastigheter utförs vanligtvis genom att mäta syrekoncentrationen i en förseglad behållare ansluten till en Clark-elektrod. Teorin bakom denna metod bygger på den grundläggande observationen att syre är den sista elektronacceptorn för mitokondriell andning under oxidativ fosforylering. Därför, när syrekoncentrationen sjunker under ett experiment, antas det att produktion av adenosintrifosfat (ATP) sker10. Förbrukat syre är en proxy för producerad ATP. Forskare kan skapa specifika experimentella förhållanden med hjälp av olika substrat och initiera adenosindifosfat (ADP)-stimulerad andning (tillstånd 3) genom att tillsätta förutbestämda mängder ADP till kammaren. Efter fosforyleringen av den exogena ADP till ATP minskar syreförbrukningen och tillstånd 4 uppnås och kan mätas. Dessutom gör tillsatsen av specifika inhibitorer det möjligt att få information om läckagerespiration och okopplad respiration10. Förhållandet mellan tillstånd 3 och tillstånd 4 bestämmer andningskontrollförhållandet (RCR), som är indikatorn för den totala mitokondriella kopplingen10,11. Lägre värden på RCR indikerar övergripande mitokondriell dysfunktion, medan högre RCR-värden tyder på en större grad av mitokondriell koppling10.
Som tidigare nämnts måste insamlingen av biologiskt material, mitokondriell isolering och mätning av andningshastigheter slutföras inom 2 timmar efter att vävnaden erhållits. För att utföra denna uppgift utan att transportera djur över stora avstånd till etablerade laboratorier, konstruerades ett mobilt mitokondriefysiologiskt laboratorium för att tas till fältplatser där dessa data kan samlas in. En Jayco Redhawk fritidsbil från 2018 omvandlades till ett mobilt laboratorium för molekylär fysiologi och döptes till Auburn University (AU) MitoMobile (figur 1A). Ett fritidsfordon valdes på grund av den inbyggda kylen, frysen, vattentanken och VVS, el som drivs av 12-voltsbatterier, gasgenerator, propantank och självnivellerande system. Dessutom ger fritidsfordonet möjlighet att stanna på avlägsna platser över natten för datainsamling. Fordonets front har inte ändrats och utgör kör- och sovplats (figur 1B). Tidigare installerade sovrumsbekvämligheter (säng, TV och skåp) i den bakre delen av fordonet och spishällen togs bort.
Specialtillverkade hyllor i rostfritt stål och en anpassad bänkskiva i kvarts som stöds av 80/20 aluminiumram installerades i stället för sovrumsbekvämligheterna och spishällen (Figur 1C). Laboratoriebänkarna ger tillräckligt med utrymme för datainsamling (figur 1D). Hänsyn togs till energiförbrukningen för varje utrustning (t.ex. kylcentrifug, mitokondriella andningskammare, plattläsare, datorer, homogenisatorer, vågar, bärbar ultrafrys och andra allmänna laboratorietillbehör). För att klara centrifugens stora spännings- och strömbehov uppgraderades det elektriska systemet till utrustning av flygplanskvalitet. Ett externt fack i den bakre delen av fordonet omvandlades till ett förvaringsfack för flytande kväve, som uppfyller USA:s transportdepartements riktlinjer för lagring och transport av flytande kväve. Denna förvaringsenhet är konstruerad av rostfritt stål och har ordentlig ventilation för att förhindra att expanderande kvävgas läcker in i fordonets passagerarutrymme.
För att bekräfta att det mobila laboratoriet kan användas i mitokondriella bioenergetiska studier isolerades mitokondrier och mitokondriell respirationsfrekvens från vildhärledda husmöss (Mus musculus) bakbensskelettmuskulatur mättes. Eftersom Mus musculus är en modellorganism är mitokondriernas andningsfrekvens för denna art väletablerad12,13,14. Även om tidigare studier har dokumenterat mitokondriell isolering via differentiell centrifugering15,16,17, beskrivs nedan en kort översikt över de metoder som används i de mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriemetoderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande avsnitt beskriver mitokondriella laboratoriemetoder. Alla djurhanterings- och vävnadsinsamlingsprocedurer godkändes av Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee (#2019-3582).
1. Beskrivning av buffertar som används för datainsamling
OBS: Dessa buffertar kan beredas i ett stationärt laboratorium och flyttas till det mobila laboratoriet före fältresan (om inte annat anges nedan).
- Bered bufferten för mitokondriell isolering av skelettmuskulaturen med bovint serumalbumin (BSA) enligt tabell 1.
- Lös upp kemikalier i avjoniserat vatten (~ 90% volym) förutom den fettsyrafria BSA. Ställ bufferten i kylskåpet tills temperaturen är 4 °C.
- Justera lösningen till ett pH på 7,5 samtidigt som temperaturen hålls vid 4 °C.
- Tillsätt fettsyrafri BSA och höj volymen till 100%. Fördela lösningen i 50 ml koniska rör. Förvara denna lösning vid -20 °C fram till användning.
- Bered bufferten för mitokondriell isolering av skelettmuskulaturen utan BSA enligt tabell 1.
- Lös upp kemikalierna i avjoniserat vatten (~ 90% volym). Ställ bufferten i kylskåpet tills temperaturen är 4 °C.
- Justera lösningen till ett pH på 7,5 samtidigt som temperaturen hålls vid 4 °C.
- Höj volymen till 100 %. Fördela lösningen i 50 ml koniska rör. Förvara denna lösning vid -20 °C fram till användning.
- Bered bufferten för resuspension av skelettmuskulaturen enligt tabell 1.
- Lös upp kemikalierna i avjoniserat vatten (~ 90% volym). Ställ bufferten i kylskåpet tills temperaturen är 4 °C.
- Justera lösningen till ett pH-värde på 7,4 samtidigt som temperaturen hålls vid 4 °C.
- Höj volymen till 100 %. Fördela lösningen i 50 ml koniska rör. Förvara denna lösning vid -20 °C fram till användning.
- Förbered skelettmuskelandningsbufferten enligt tabell 2.
- Lös upp kemikalierna i avjoniserat vatten (~ 90% volym) förutom den fettsyrafria BSA. Värm bufferten tills temperaturen är 37 °C.
- Justera lösningen till ett pH på 7,0 samtidigt som temperaturen hålls vid 37 °C.
- Tillsätt fettsyrafri BSA och höj volymen till 100%. Fördela lösningen i 50 ml koniska rör. Förvara denna lösning vid -20 °C fram till användning.
- Bered andningssubstraten enligt tabell 2.
- Se till att dessa substrat görs färska på dagen för datainsamling i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Förvara på is fram till användning.
OBS: De angivna värdena är att göra en tillräckligt koncentrerad lösning för att tillräckligt med substrat ska tas upp av mitokondrierna. De slutliga koncentrationerna av substraten är 2 mM pyruvat, 2 mM malat, 10 mM glutamat och 5 mM succinat.
- Se till att dessa substrat görs färska på dagen för datainsamling i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Förvara på is fram till användning.
2. Utföra mitokondriell isolering (figur 2)
OBS: Mitokondriell isolering och mitokondriell andningsmätning utförs i laboratoriebänken i det mobila laboratoriet, och alla lösningar ska förvaras vid 4 °C om inget annat anges.
- Parkera det mobila laboratoriet på plan mark. Slå på generatorn och nivellera fordonet. Dra ut rutschkanan och ställ in utrustningen.
- Tina upp önskade mängder buffertar.
OBS: I allmänhet behövs 30 ml skelettmuskelisoleringsbuffert och 10 ml skelettmuskelisoleringsbuffert utan BSA per muskel. - Ställ in och kalibrera mitokondriernas andningskammare till önskad experimenttemperatur och aktuellt barometertryck enligt tillverkarens instruktioner. Se materialtabellen för specifika kammare som används i experiment.
- Avliva djuret genom halshuggning.
OBS: I den aktuella studien användes halshuggning för eutanasi. Vissa gaser, såsom koldioxid och isofluran, påverkar mitokondriell funktion18,19,20; Dessa effekter bör beaktas vid val av den bästa dödshjälpsmetoden för varje studie. Vilken metod som ska användas för varje studie avgörs av den vetenskapliga frågeställningen som ställs. - Punktbeskatta skelettmuskulaturen, trimma snabbt bort fett och bindväv, väg och placera muskeln i skelettmuskelisoleringsbuffert med BSA (minst 1/10 vikt/volym) (t.ex. 1 g skelettmuskel till 10 ml buffert).
- Hacka skelettmuskulaturen med en sax på is.
- Överför den malda vävnaden till ett 50 ml centrifugrör med hjälp av en skuren 5 ml pipettspets. Homogenisera den med ett blad (se materialtabellen) med 50 % effekt i 5 s. Tillsätt proteas (5 mg/g våt muskel) och smält i 7 minuter, blanda lösningen var 30:e sekund. Avsluta reaktionen genom att lägga till en lika stor volym isoleringsbuffert med BSA.
- Centrifugera homogenatet vid 500 × g i 10 minuter. Överför supernatanten genom ostduk med dubbla lager med hjälp av en avskuren 5 ml pipettspets till ett rent 50 ml centrifugrör. Centrifugera supernatanten vid 3 500 × g i 10 minuter för att fälla ut en brun mitokondriell pellet.
- Häll ut resten av supernatanten. Tillsätt samma volym isoleringsbuffert med BSA till centrifugröret. Återsuspendera mitokondriepelleten med en flexibel skrapa (polisman) genom att försiktigt arbeta bort mitokondriepelleten från centrifugrörets väggar. Centrifugera vid 3 500 × g i 10 minuter.
- Häll ut resten av supernatanten. Tillsätt samma volym isoleringsbuffert utan BSA till centrifugröret. Återsuspendera mitokondriepelleten genom att försiktigt arbeta bort mitokondriepelleten från centrifugrörets väggar med en ren polisman. Centrifugera vid 3 500 × g i 10 minuter.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera mitokondriepelleten i resuspensionsbuffert genom att försiktigt arbeta bort mitokondriepelleten från centrifugrörets väggar med en ren polisman.
OBS: Volymen på resuspensionsbufferten beror på storleken på mitokondriepelleten. - Överför de resuspenderade mitokondrierna till en Dounce homogenisator med en skuren 1 ml pipettspets. Använd Dounce homogenisator och homogenisera suspensionen försiktigt med 4-5 pass.
- Placera mitokondriesuspensionen i ett märkt 2 ml mikrocentrifugrör med en annan skuren 1 ml pipettspets.
3. Mätningar av mitokondriell andning (figur 3)
- Komplexa I-substrat
- Tillsätt 945 μl andningsbuffert till kammaren. Se till att omröraren snurrar och att bufferttemperaturen hålls på 37 °C. Starta registreringen av datainsamlingen.
- När syrekoncentrationen har stabiliserats, tillsätt 20 μL av mitokondrierna och lägg locket på kammaren. I programvaran anges att mitokondrier lades till i kammaren.
- Tillsätt 10 μl 1 M glutamat, 10 μL 200 mM malat och 10 μL 200 mM pyruvat i kammaren med enskilda sprutor och vänta tills signalen stabiliseras. I programvaran anger du att substrat har lagts till.
OBS: Dessa substrat används vanligtvis för att mäta kolhydratdriven andning. För andra kombinationer av substrat som ska användas för att mäta fettdriven andning, se21. - Tillsätt 5 μL ADP med en separat spruta och observera den snabba syreförbrukningen (tillstånd 3). I programvaran anger du att ADP har lagts till.
OBS: Efter fosforyleringen av den tillsatta ADP:n kommer syreförbrukningshastigheten att plana ut till tillstånd 4. - Efter 4 minuters datainsamling i tillstånd 4 avslutar du inspelningen. Spara datafilen.
- Komplexa II-substrat
- Tillsätt 963 μl av andningsbufferten till kammaren. Se till att omröraren snurrar och att bufferttemperaturen hålls på 37 °C. Starta registreringen av datainsamlingen.
- När syrekoncentrationen har stabiliserats, tillsätt 20 μL mitokondrier och lägg locket på kammaren. I programvaran anger du att mitokondrier har lagts till i lösningen.
- Tillsätt 2 μl 4 μg/μl rotenon följt av 10 μl 500 mM succinat i kammaren med separata sprutor och vänta tills signalen stabiliserats. I programvaran anger du att substrat har lagts till.
- Tillsätt 5 μL ADP med en separat spruta och observera den snabba syreförbrukningen (tillstånd 3). I programvaran anger du att ADP har lagts till.
OBS: Efter fosforyleringen av den tillsatta ADP:n kommer syreförbrukningshastigheten att plana ut till tillstånd 4. - Efter 4 minuters datainsamling i tillstånd 4 avslutar du inspelningen. Spara datafilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det aktuella manuskriptet undersöktes mitokondriell andning hos Mus musculus (n = 7, man = 5, kvinna = 2; ålder = 1,30 ± 0,2 år) i ett mobilt mitokondriefysiologiskt laboratorium (Figur 1). För att mäta skelettmuskulaturens mitokondriella andning användes hela bakbenet, alltså aerob och anaerob muskel, för mitokondriell isolering (Figur 2). Exempel på rådata för mitokondriell andning visas i figur 3. Figur 3A och figur 3B representerar komplex I-driven mitokondriell andning. Den branta lutningen som observeras i figur 3A representerar den höga maximala andningsfrekvensen. Detta är det värde som används för ytterligare dataanalys. Den framgångsrika isoleringen av mitokondrier från bakbenens skelettmuskel observeras genom den skarpa svängen och stabiliseringen av en ny lutning, som bestämmer tillstånd 4 (figur 3B).
Dessa data kan också tolkas som att mitokondrierna är högfungerande på grund av den skarpa vändningen för att etablera tillstånd 4. Ett liknande mönster kan observeras för komplex II-driven mitokondriell andning (Figur 3C och Figur 3D). Figur 3E,F visar dåligt fungerande mitokondrier, antingen på grund av mitokondriell fysiologi eller misslyckad mitokondriell andning. Figur 3E visar kopplingen av mitokondrierna för komplex I-driven mitokondriell andning, sett av vändningen till tillstånd 4. Figur 3F visar dock okopplad komplex II-mitokondriell andning, vilket visas av en platt linje efter tillsats av ADP, och ingen "sväng" för att producera tillstånd 4-data. Dessa data tyder på möjliga problem under mitokondriell isolering, som diskuteras nedan.
De numeriska värdena för tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR för både komplex I och komplex II för dessa djur finns i figur 4. Dessa data bestämdes genom att mäta 30 s av den brantaste lutningen efter tillsats av ADP för att bestämma tillstånd 3 (Figur 3A,C) och mäta lutningen efter "svängen" i 1 minut för att mäta tillstånd 4 (Figur 3B,D). När dessa värden erhölls normaliserades data till proteininnehåll (via Bradford-analys22). Med hjälp av de normaliserade värdena beräknades RCR genom att dividera värdet för normaliserat tillstånd 3 med värdet för normaliserat tillstånd 4.
Figur 1: AU MitoMobile, ett mobilt laboratorium för mitokondriell fysiologi. (A) Utsidan av AU MitoMobile. (B) Insidan av fordonet sett framifrån där inga ändringar har gjorts. (C) Fordonets bakre del som visar installationen av bänkar, förvaringsutrymmen och centrifug. (D) Installationen av utrustningen under datainsamlingen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mitokondriell isolering och andningsmätning i skelettmuskulaturen. (1) Vävnaden dissekeras från djuret och placeras i en buffert där den (2) hackas, homogeniseras, behandlas med proteas och centrifugeras tills mitokondriepelleten erhålls. (3) Mitokondriekulan återupplivas och andningsdata erhålls. (4) Uppgifter om syreförbrukning kan användas för att beräkna tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR. Förkortning: RCR = respiratory control ratio. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mitokondriella respirationsmätningar med komplexa I- och komplexa II-substrat. Syreförbrukning med komplexa I-substrat, med betoning på lutningsanalysen av tillstånd 3 (A) och tillstånd 4 (B). Syreförbrukning med komplexa II-substrat, med betoning på lutningsanalysen av tillstånd 3 (C) och tillstånd 4 (D). Suboptimal mitokondriell andning kan ses i komplex I-driven andning (E) och komplex II-driven andning (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Data insamlade på husmöss (Mus musculus) i AU MitoMobile. Mitokondriell isolering och andning utfördes med den procedur som beskrivs här. Pyruvat, malat och glutamat användes för att bestämma komplex I-andningsfrekvens. Succinat och rotenon användes för att mäta komplexa II-andningsfrekvenser. (A) Komplexa I tillstånd 3 mätningar, (B) komplexa I tillstånd 4 mätningar, (C) komplex I RCR, (D) komplex II tillstånd 3 mätningar, (E) komplex II tillstånd 4 mätningar, och (F) komplex II RCR. Förkortning: RCR = respiratory control ratio. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mitokondrier isoleringsbuffert för skelettmuskulatur | ||
| Reagens | med BSA, koncentration (mM) | utan BSA, koncentration (mM) |
| KCl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Bas | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| Fettsyrafri BSA | 0.15% | - |
| Isolerad mitokondrier resuspensionsbuffert för skelettmuskulatur | ||
| Reagens | Koncentration (mM) | |
| Mannitol | 220 | |
| Sackaros | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA | 1 | |
Tabell 1: Isoleringsbuffertar för mitokondrier (med och utan BSA) och isolerade mitokondrier, resuspensionsbuffert för skelettmuskulatur.
| Buffert för andning | |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| KCl | 100 |
| MOPPAR | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glukos | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| Fettsyrafri BSA | 0.20% |
| Substrat för respiration | |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| Pyruvat | 200 |
| Malate | 200 |
| Succinate | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamat | 1000 |
Tabell 2: Respirationsbuffert och substrat.
| Tillstånd 3 | Tillstånd 4 | GVP | Studera | Substrat |
| 368,3±80,4 | 68,9±25,0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM pyruvat, 2 mM malat |
| 241,8±22,5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM pyruvat, 2 mM malat |
| 285,7±36,5 | 81,9±2,9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM bärnstenssyra, 4 μM rotenon |
| 493.4±105.4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | Pågående studie | 2 mM pyruvat, 2 mM malat, 10 mM glutamat |
| 559,5±74,9 | 165,2±18,5 | 3.4±0.2 | Pågående studie | 5 mM bärnstenssyra, 4 μg/μL rotenon |
Tabell 3: Jämförelsevärden för tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR. Förkortning: RCR = respiratory control ratio. Värdena för tillstånd 3 och tillstånd 4 visas i nmol O2/mg protein/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet gör det möjligt för forskare att isolera mitokondrier och mäta mitokondriell andningsfrekvens inom 2 timmar efter vävnadsinsamling på avlägsna fältplatser. Resultaten som presenteras här tyder på att mätningar av mitokondriell andning som görs i AU MitoMobile är jämförbara med mätningar som görs i ett universitets forskningslaboratorium. Specifikt är värdena för tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR för vildhärledda Mus musculus som presenteras här jämförbara med tidigare publicerade resultat från samma laboratorium och andra (tabell 3)12,23. Det bör dock noteras att på grund av olika musstammar och metoder som används kan en direkt jämförelse av dessa studier inte göras. Dessa resultat visar proof of concept för mätning av mitokondriell andning i detta mobila mitokondriella fysiologilaboratorium.
Alla kemikalier och material som behövs för mitokondriernas isolering och andning kan transporteras och lagras i det mobila laboratoriet, vilket ger enkel åtkomst vid installation och utförande av experiment. Dessutom ger isolerade mitokondrier som samlats in i ett mobilt mitokondriellt laboratorium ett unikt prov för att utföra andra biokemiska mätningar såsom utsläpp av reaktiva syreföreningar. Det är viktigt att frysta mitokondrier kan transporteras till ett stationärt laboratorium för ytterligare biokemiska mätningar (t.ex. individuella enzymaktiviteter för elektrontransportkedja). Att isolera mitokondrier via centrifugeringsdifferentiering är inte den enda metoden för att mäta mitokondriell andning. Andra laboratorier har utfört framgångsrika mätningar av mitokondriell andning med permeabiliserade fibrer. Även om det aktuella manuskriptet inte beskriver denna metod (för mer detaljer om permeabiliserade fibrer, se 24,25,26,27,28), är det viktigt för läsarna att notera att ett mobilt mitokondriellt fysiologilaboratorium också skulle kunna hysa de material som behövs för denna procedur. Se andra recensioner om styrkorna och svagheterna hos var och en av dessa metoder25,29,30.
Flera laboratorier som utför mitokondriell bioenergetisk forskning har publicerat felsökningsrekommendationer som läsarna kan ha nytta av. För varje enskilt experimentellt projekt bör en enda omgång buffertar göras för att samla in alla data. Genom att använda buffertar som görs på olika dagar skapas möjlighet till variation i lösningar för att påverka mitokondriella andningsmätningar. Skador på det yttre mitokondriella membranet kommer att uppstå under isoleringsprocessen; Korrekt utförande av isoleringsmetoden genom laboratorieträning kan dock minimera den skada som naturligt kommer att uppstå med denna procedur29,31. Under isoleringsprocessen indikeras icke-funktionella eller alltför skadade mitokondrier av en vit fluffig mitokondriell pellets snarare än en kompakt brun pellet. Icke-funktionella eller skadade mitokondrier kan orsakas av ett för högt varvtal under bladhomogenisering, homogenisering för länge, tillsats av för mycket proteas eller nedbrytning för länge, eller för många slag som används under den slutliga omblandningen av mitokondrier.
Dessutom kommer valet av vilken muskel som ska isoleras och hur mycket muskler som används att påverka det mitokondriella utbytet. Till exempel, hos ett djur med högre mitokondriell densitet, såsom en fågel21, kommer fler mitokondrier att fällas ut jämfört med en blandning av skelettmuskelfibertyper från en bakdel av en råtta. Detta kommer också att förändra mängden vävnad som behövs för en framgångsrik isolering. Ju större mitokondriell densitet i en vävnad, desto lägre mängd vävnad behövs för framgångsrik isolering. Forskare bör också överväga volymen av mannitol-sackaroslösning som tillsätts till de slutliga isolerade mitokondrierna. En mer tätt packad mitokondriell pellet kommer att behöva en högre utspädning, medan en mindre tätt packad mitokondriell pellet kommer att behöva en lägre utspädning. Omfattningen av utspädningen beror på djuret, den oxidativa naturen hos skelettmuskeln som isoleras, och hur tätt packad mitokondriepelleten är.
Att ha tillräckligt med elkraft för att stödja all utrustning som behövs för datainsamling i ett mobilt laboratorium kan vara utmanande. Noterbart är att den kylda centrifugen drar en hög ström under drift (särskilt under de inledande faserna av nedkylning). Därför bör särskilda överväganden göras för att säkerställa att fordonets elektriska effekt motsvarar det elektriska behovet hos den utrustning som behövs för att köras samtidigt. En rekommendation som kan lösa denna begränsning är att lägga till fler strömkällor (t.ex. extra batterier, ytterligare generatorer). Noterbart är att metoden för att mäta mitokondriell andning med permeabiliserade fibrer inte kräver användning av en kylcentrifug och kan också ge en lösning på den begränsade kraftkällan. Miljöförhållanden och vägkvalitet bör också beaktas vid användning av ett mobilt laboratorium. Det mobila mitokondriefysiologiska laboratoriet som diskuteras här kördes framgångsrikt på motorvägar med klart väder. Grusvägar med hårt väder kommer att innebära större svårigheter att köra fordonet till den plats som är av intresse. Även om mitokondriell isolering inte är en ny metod, ger dess användning i ett mobilt laboratorium ett unikt sätt att kvantifiera mitokondriell energi hos frilevande djur. Detta kan vara avgörande för att belysa skillnaderna mellan laboratoriedjur och vilda djur32,33,34. Dessutom gör det mobila mitokondriella fysiologilaboratoriet det möjligt för forskare att studera energibegränsningar och energiska extremer som finns bland djur i den naturliga världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna tackar Mark Nelms och John Tennant från avdelningen för elektro- och datateknik vid Samuel Ginn College of Engineering vid Auburn University för att ha hjälpt till med den strukturella och elektriska utrustningen av AU MitoMobile. Dessutom erkänner författarna finansieringen för att utrusta AU MitoMobile och forskning från ett Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -anslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
