Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

Abstract

תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) מציגים שלושה אותות מפעילים לתאי T העוסקים במגע פיזי: 1) אנטיגן, 2) תמחיר / דיכוי ליבה, ו -3) ציטוקינים מסיסים. תאי T משחררים שני סוגים של חלקיקי מפעיל בתגובה להפעלה: שלפוחיות טרנס-סינפטיות (tSVs) וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים, המעבירים שליחים בין-תאיים ומתווכים ציטוטוקסיות, בהתאמה. ישויות אלה מופנמות במהירות על ידי נגמ"שים העוסקים במגע פיזי עם תאי T, מה שהופך את האפיון שלהם להרתיע. מאמר זה מציג את הפרוטוקול כדי לפברק ולהשתמש ב-Belayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים (BSLBs) כחיקויים של תאים מציגי אנטיגן (APC) כדי ללכוד ולנתח חלקיקים טרנס-סינפטיים אלה. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים למדידות המוחלטות של צפיפות חלבונים על משטחי תאים, שחזור של BSLBs עם רמות פיזיולוגיות כאלה, ואת הליך ציטומטריית הזרימה למעקב אחר שחרור חלקיקים סינפטיים על ידי תאי T. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההשפעות של חלבונים בודדים, תערובות ליגנד מורכבות, דטרמיננטים פתוגן virulence, ותרופות על תפוקת האפקט של תאי T, כולל תאי T עוזר, לימפוציטים T ציטוטוקסיים, תאי T רגולטוריים, ותאי T קולטני אנטיגן כימריים מבטאים (CART).

Introduction

הסינפסה החיסונית (IS) היא מבנה מולקולרי מרכזי שנוצר בממשק של תאים העוסקים במגע פיזי המאפשר חילופי מידע מוסדר של juxtracrine. ISs שונים תוארו בספרות, וגוף גדל והולך של ראיות מצביע על כך שרכזות מולקולריות אלה הן תכונה שמורה של רשתות סלולריות. תאי חיסון שונים, כולל תאי B, תאי רוצח טבעיים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי T, מחליפים מידע באמצעות הרכבה של מגעים קצרי מועד1. מחקרים רב-לאומיים מקדמים את ההבנה של תת-קבוצות חדשות של לויקוציטים ותאי סטרומה המניעים רשתות תאיות פתוגניות ומבטאים חלבוני שטח בעלי פונקציות לא ידועות. כמו APCs סינתטיים, BSLBs לאפשר חקירה ישירה של התפקיד התפקודי של חלבונים בודדים בשילוב של הפעלת אותות, כלומר אנטיגנים ו costimulation / corepression, על ידי תאי T ואת שחרור וכתוצאה מכך שחרור של חלקיקים מפעילים המכונה אות ארבע.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים ואת הנקודות הטכניות הקריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש ב- BSLBs כדי לחקות את הרכב פני השטח של APCs מודל. הפרוטוקולים למדידה כמותית של קולטני מערכת החיסון וחלבוני שטח אחרים ב- APCs מוצגים יחד עם הפרוטוקול לשחזור של נגמ"שים סינתטיים המכילים כמויות נמדדות אלה. לאחר מכן, השלבים הנדרשים עבור coculturing תאי T ו- BSLB מוצגים יחד עם הפרוטוקול למדידה הכמותית של העברת חלקיקים טרנס-סינפטית באמצעות cytometry זרימה. למרבה הפלא, BSLBs להקל על לימוד אוכלוסייה שמקורה קרום פלזמה של tSVs המכונה אקטואוזומים סינפטיים (SEs). תאי T-cell antigen מועשרים בקולטן (TCR+) SEs נשפכים בתגובה TCR מפעיל2 ביעילות נתפס על ידי BSLBs3, המייצג קריאה מצוינת כדי להעריך את המאפיינים האגוניסטיים של אנטיגנים ואת הרכב הממברנה מודל. אקסוזומים CD63+ וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים (SMAPs) משתחררים גם הם על ידי תאי T מגורים ונלכדים על ידי BSLBs. הם יכולים לשמש כקריאות נוספות של הפעלה והפרשת גרגיר אקסוציטית וליטית וכתוצאה מכך על ידי תאי T. גיוס שלפוחיות אקסוציאטיות לקוטב האינטראקציה של תא T מקל גם על שחרור כיווני של ציטוקינים, כגון IL-2, IFN-γ ו- IL-10 בתגובה להפעלה 4,5,6,7,8. למרות ציטוקינים שוחררו תאי T ניתן לזהות גם על BSLBs, מחקר ייעודי יותר נמצא כעת בפיתוח כדי לאמת את הניתוח הכמותי של שחרור ציטוקינים בסינפסה החיסונית.

כדי לחקור כיצד הרכבי ממברנה ספציפיים משפיעים על התפוקה הסינפטית של תאי T דורש להגדיר את הצפיפות הפיזיולוגית של רכיב קרום היעד. כימות מבוססי ציטומטריה זרימה של חלבונים על פני התא הם צעד חיוני בפרוטוקול זה ודורשים: 1) שימוש בנוגדנים עם מספר ידוע של פלואורוכרום לנוגדן (F/P), ו -2) חרוזי בנצ'מרק המספקים התייחסות סטנדרטית לאינטרפולציה של מולקולות פלואורוכרום מעוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות נמדדות (MFIs).

תקני אמת מידה אלה מורכבים מחמש אוכלוסיות חרוזים, שכל אחת מהן מכילה מספר גדל והולך של פלואורכומים מסיסים מקבילים (MESFs), המשתרעים על פני הטווח הדינמי של זיהוי פלואורסצנטיות שרירותי. אוכלוסיות סטנדרטיות אלה מניבות פסגות פלואורסצנטיות נפרדות, ומאפשרות המרה של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ל- MESFs על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. ה- MESFs המתקבלים משמשים לאחר מכן לצד ערכי F/P נוגדנים כדי לחשב את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל תא (או BSLB בשלבים מאוחרים יותר). היישום של אזורי שטח תא משוערים למספר הממוצע של מולקולות שזוהו ואז מאפשר חישוב של צפיפות פיזיולוגית כמו מולקולות / μm2. פרוטוקול כימות זה יכול להיות מותאם גם למדידת צפיפות החלבון על תאי T ולשיקום הביוכימי של הרכבי הממברנה המתווכים את היווצרות הסינפסות ההומוטיפיות של תאי T (כלומר, סינפסות T-T9). במידת הצורך, ניתן להעריך עוד יותר את הערכיות של כריכת נוגדנים באמצעות מטרות רקומביננטיות המסומנות במספרים ידועים של פלואורוכרומים לכל מולקולה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכיות המחייבת נוגדנים עבור אותה אוכלוסיית BSLB על ידי השוואת מספר חלבונים פלואורסצנטיים מאוגדים ונוגדני כימות (באמצעות שני פלואורוקרומים כימות שונים ותקני MESF).

השחזור של ממברנות APC דורש הרכבה של bilayers השומנים נתמך (SLBs) על חרוזי סיליקה1. מלאי ליפוזום המכיל מינים שונים של פוספוליפידים ניתן לרתום כדי ליצור מטריצת ליפיד-bilayer רב תכליתית, המאפשרת עיגון של חלבונים רקומביננטיים עם כימיה מחייבת שונה (הכנת ליפוזומים מפורטת ב 10). לאחר הגדרת הצפיפות הפיזיולוגית (או הצפיפות) של הליגנד הרלוונטי "על התאים", אותו פרוטוקול ציטומטריית זרימה מותאם להערכת ריכוז החלבון הרומביננטי הדרוש לציפוי BSLBs בצפיפות הפיזיולוגית של המטרה. ניתן להשתמש בשתי מערכות עיגון שונות בשילוב או בנפרד.

ראשית, SLB המכיל 12.5 mol% סופי של Ni2 + המכיל פוספוליפידים מספיק כדי לספק כ -10,000 אתרי כריכת התג שלו לכל micron10 מרובע ועובד היטב כדי לקשט BSLBs עם רוב החלבונים הזמינים מסחרית אשר צפיפות פיזיולוגית שלהם אינה עולה על קיבולת טעינה מקסימלית זו. מערכת הטעינה השנייה רותמת פוספוליפידים המכילים ביוטין (כמו מול%) לטעינת ביו-טיניל נגד CD3e Fab (או מונומרים HLA/MHC) באמצעות גשרי סטרפטאבידין. השילוב של שתי שיטות קישוט BSLB אלה מאפשר תפירה גמישה של BSLBs כנגמ"שים סינתטיים. עבור קומפוזיציות משטח APC מורכבות מאוד, ניתן להגדיל את המול% של פוספוליפידים וחלבונים כדי לטעון חלבונים רבים ככל שהשאלה בהישג יד דורשת. לאחר ריכוזי העבודה של חלבונים מול% של פוספוליפידים biotinylated מוגדרים, BSLBs ניתן להרכיב כדי לחקור את הפלט הסינפטי של תאי T עם cytometry זרימה multiparametric.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מדידה של צפיפות חלבון פני התא עם ציטומטריית זרימה כמותית

  1. הכינו מאגר ציטומטריה של זרימה אנושית מסוננת ב-0.22 מיקרומטר (hFCB) על-ידי הוספת EDTA (לריכוז סופי של 2 מ"מM) וסרום AB אנושי (ל-10%) סופיים לתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 (ראו טבלה 1). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת סינון נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים בסרום ולאחסן ב 4 °C (6 °F).
  2. לשחזר את התאים ומשקעים אותם על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. בכל שלב כביסה, הגדילו מחדש את התאים ב-PBS לאמצעי האחסון המקורי (לפני צנטריפוגה) והסתובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  4. לספור השעיות תא מוכתמות כחול טריפאן בהמוציטומטר11. לחלופין, ספור תאים באמצעות אי-הכללת זרם חשמלי. עבור האחרון, בצע את ההוראות של יצרן CASY-TT (עיין בטבלת החומרים).
    הערה: מונה התא CASY-TT מאפשר קביעת אחוז תאים בני קיימא, גודל התא ונפח התא.
  5. חשב את הנפח של PBS המכיל 1:1,000 דילול של צבע קיימא תיקון eFluor 780 או דומה (ראה את טבלת החומרים) הנדרש כדי resuspend התאים לריכוז כתמים של 107 תאים / מ"ל.
  6. לפנק מחדש את התאים באמצעות פתרון צבע קיימא-PBS ודגור על קרח במשך 30 דקות.
  7. הסר את צבע הכדאיות על-ידי הוספת נפח אחד של hFCB קר כקרח. ספין למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
    הערה: מעתה והלאה, שמור על שרשרת הקור לא שבורה.
  8. לשטוף את התאים עם hFCB המכיל 1:50 דילול של פתרון חסימת קולטן Fc (ראה את טבלת החומרים). הביאו את הנפח לריכוז סופי של 107 תאים/מ"ל ודגרו במשך 15 דקות נוספות כדי להשיג חסימת FcgR יעילה.
  9. להפיץ 100 μL של השעיית התא (כלומר, 106 תאים) לכל באר של צלחת U-bottom או V-bottom 96-well. שמור את התאים על קרח מוגן מפני אור (לכסות עם רדיד אלומיניום).
  10. הכן תערובת מאסטר נוגדנים hFCB על ידי הגדרת ריכוזי הנוגדנים האופטימליים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והכי חשוב, עבור אותם נוגדנים המשמשים לקביעת צפיפות חלבון פני השטח. לדוגמה, לכימות ביטוי ICAM-1 על אוכלוסיות תאי שקדים, כפי שמוצג באיור 1, הכינו תערובת המכילה דילול של 1:200 של נוגדנים נגד CD4, אנטי-CD19 ואנטי-CXCR5 יחד עם ריכוזים רוויים של נוגדן אנטי-ICAM-1 עם פלואורוכרום ידוע AF647 לנוגדן (כלומר, 10 מיקרוגרם/מ"ל, שהוגדרו על ידי ניסויי טיטור נוגדנים עצמאיים).
  11. כמו פקדים נוספים, להכין תערובת מאסטר נוגדנים המכילה את פקדי איזוטיפ הנוגדנים הרלוונטיים (באותם ריכוזים יעילים כמו עמיתיהם מצומדים עם אותם פלואורוכרומים לחיסור רקע), כלומר, להשתמש 10 מיקרוגרם / מ"ל של בקרת איזוטיפ AF647 רלוונטית.
    הערה: בדוגמה לעיל, פקד איזוטיפ כזה משמש להפחתת פלואורסצנטיות ברקע מאות ICAM-1 האמיתי בתאים.
  12. בעת כימות צפיפות חלבון בתת-קבוצות תאים הנמצאות בתדרים נמוכים בתוך רקמות, הכן פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO) המכילים את כל הנוגדנים הכתומים למעט סמני העניין (ראו פרטים נוספים ב-12).
  13. ספין למטה צלחת 96-well המכיל את התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F), להשליך את supernatant, ו resuspend התאים ב 50 μL של תערובת מאסטר נוגדן כימות או תערובת מאסטר נוגדן איזוטיפ.
  14. לדגור על התאים לפחות 30 דקות ב 4 °C (65 °F) ו 400 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. להגן על הצלחות מפני אור (לכסות עם רדיד אלומיניום).
  15. לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות hFCB וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
  16. Resuspend גלולה התא באמצעות 200 μL של PBS (כלומר, לריכוז סופי של 5 × 106 תאים / מ"ל).
  17. לרכישה:
    1. אם אתם משתמשים במטען סטנדרטי של BD FACS, העבירו את הדגימות לצינורות עגולים עם 5 מ"ל פוליסטירן (ראו טבלת החומרים).
    2. אם אתה משתמש בסמפלרים בעלי תפוקה גבוהה (HTS, המכונה גם קוראי לוחות), המשך מיד לשלב 1.19.
  18. לפני שתמשיך ברכישת הנתונים עבור תקני MESF, בדוק את המגבלות הליניאריות של עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית והמינימלית עבור ערוצי הכימות.
  19. לפני הפיצוי, רכשו נתונים עבור תקני MESF, והבטיחו שהאוכלוסיות העמומות והמבריקות ביותר ייפלו בטווח המדידה הליניארי.
  20. לרכוש את דגימות הפיצוי. שמור את ערכי המתח של שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) עבור ערוצי הכימות ללא שינוי כדי לשמר את טווח הזיהוי הדינמי. בצע התאמות קלות במתח PMT של ערוצים אחרים לפני חישוב מטריצות הפיצוי.
  21. חשב והחל פיצוי.
  22. לרכוש ולשמור מינימום של 2 × 104 חרוזים MESF סה"כ עבור כל אחד מערוצי הכימות.
  23. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים בהתבסס על אזורי פיזור האור הצדדי והפנימי שלהם (SSC-A ו- FSC-A, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 1A (i)), ולאחר מכן את בחירת האירועים בתוך רצף הזמן (איור 1A (ii)) ונמוך לזמן הטיסה (W) הן ב- FSC והן ב- SSC בהשוואה לגבהים שלהם (כלומר, FSC-W/FSC-H, ואחריו SSC-W/SSC-H gating כפי שמוצג באיור 1A (iii) ו-(iv), בהתאמה). הגדר שער סופי של אירוע יחיד המכיל אירועים עם התפלגות FSC-A פרופורציונלית לעומת FSC-H (איור 1A (v)).
  24. השג דגימות בקרה (פקדי איזוטיפ עם תווית ופקדי FMO).
  25. לרכוש דגימות ולרשום עד לפחות 10,000 תאי יעד נרכשו.
    הערה: הקביעה החזקה של צפיפות מולקולרית ממוצעת דורשת ניתוח של מספר תורמים על פני ניסויים עצמאיים. הדבר חיוני בעת ניתוח תת-קבוצות תאים הנמצאות בתדרים מופחתים או נגזרות מחומר ביולוגי נדיר (למשל, מביופסיות של רקמות אנושיות).
  26. לשטוף את cytometer פועל במשך 5 דקות עם פתרון ניקוי FACS ואחריו 5 דקות של מים ultrapure לפני כיבוי המכשיר. אם אתה משתמש ב- HTS, בצע את האפשרויות תחת הכרטיסיה HTS ותוכנית צלחת נקייה.
    הערה: כדי להפחית את ההובלה מדגם לדגימה, הפעל את האפשרויות לשטיפה לשבת (סמפלר) או לשטוף סמפלר בעל תפוקה גבוהה , אשר ישטפו באופן אוטומטי את הציטומטר בין צינורות או בארות. לפני תחילת הרכישה, להפעיל מים ultrapure במשך 10 דקות בקצב זרימה גבוה כדי להסיר כל מזהמים ביולוגיים לא שטופים מקו מדגם cytometer.
  27. יצא את קבצי תקן Cytometry זרימה (FCS).

2. MESF תיקן יתר על המידה ממוצע (או חציוני) ניתוח רגרסיה פלואורסצנטית (MFI)

  1. פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה וטען את קבצי FCS הניסוי. בחר את אוכלוסיית החרוזים בהתבסס על אזורי פיזור האור בצדם ובחזית (SSC-A לעומת FSC-A), כפי שמוצג באיור 1A (i).
  2. שלוט באיכות הנתונים על-ידי בדיקת ההפצה של אירועים בודדים לאורך זמן, כפי שצוין בשלב 1.24.
    הערה: בועות יוצרות פערים בהתפלגות האירועים לאורך זמן; פעולה זו מופיעה בדרך כלל בתחילת הרכישה באמצעות HTS. הימנע מבחירת אירועים המאגדים פערים בזמן הרכישה מכיוון שאלה מוסיפים שגיאות מדידה עקב סטיות אופטיות.
  3. תתמקד באירועים היחידים.
    1. תאים
      1. זהה תחילה תאים בודדים בהתבסס על התפלגות ה-SSC-A וה-FSC-A שלהם (איור 1A (i)), ולאחר מכן אירועים נמוכים עבור W בשערים הרצופים FSC-W/FSC-H (סינגלים-1, איור 1A החלונית (iii)) ו-SSC-W/SSC-H (סינגלים-2; איור 1A החלונית (iv)). הגדר שער סינגלים-3 נוסף על-ידי בחירת אירועים עם FSC-A ו- FSC-H פרופורציונליים (איור 1A, חלונית (v)). לבסוף, זהה תאים חיים ככאלה שליליים לצבע הכדאיות הניתן לתיקון.
    2. חרוזי MESF
      1. בצע את אותן אפליית סינגלים-1 לסינגלים-3 כמו בשלב 2.3.1.1 (איור 1B, לוחות (i) עד (v)). זהה כל אחת מאוכלוסיות ה-MESF (ריקות, 1, 2, 3 ו-4) בהתבסס על רמות עוצמת הפלואורסצנטיות שלהן (ראו איור 1B, פאנל (vi)).
  4. חלץ את ה- MFI של שברי MESF ריקים ו- 1 עד 4.
  5. צור ערכי MFI מתוקנים (cMFI) עבור שברי MESF 1 עד 4 על-ידי הפחתה של ה- MF של אוכלוסיית החרוזים הריקים מכל שבר.
  6. חשב את שורת ההתאמה הטובה ביותר עבור קשר הגומלין בין מחווני cMF לערכי MESF המסופקים על-ידי הספק (משתנה בלתי תלוי, בהיותה שבר ריק השווה לאפס).
  7. חלץ את השיפוע (b במשוואה שלהלן) של הרגרסיה הליניארית של MESF חלקי cMFI (איור 1B החלונית (viii) מראה רגרסיה שבה y = a + bx; עם = 0).
  8. יש לחלץ את חציון (להפצות פלואורסצנטיות דו-מודולריות) או ממוצע (להפצות פלואורסצנטיות רגילות או רגילות) מעוצמות פלואורסצנטיות מאוכלוסיות העניין (תאי TFH ו-B בחלונית איור 1A (vii)).
  9. כמו בשלבים 2.5-2.7, לחלץ את ערכי MFI מתאי בקרה בעלי תווית איזוטיפ.
  10. אם ה- F/P של פקדי האיזוטיפ זהה לנוגדני הכימות, תקן את ה- MFIs של תאים מוכתמים על-ידי הפחתה של קובצי ה- MFIs מתאים המסומנים באיזוטיפ.
  11. אם ה- F/P של האיזוטיפים שונה מאלה של נוגדני הכימות, חלץ את ה- MESF מהאיזוטיפים על-ידי חלוקת ה- MF של קובצי ה- MF של תאים המסומנים באיזוטיפ עם השיפוע המחושב בשלב 2.7. הפחת איזוטיפ MESF מהכימות MESF לפני הערכת נוגדני כימות מאוגדים.
  12. חלק את ה- MESF ב- F/P של נוגדני הכימות כדי להעריך את מספר המולקולות הכרוכות לתא (Molec). כפי שמוצג בדיאגרמת הזרימה של איור 1C).
  13. חלקו את מספר המולקולות הכרוכות עם שטח הפנים המשוער של התא (CSA (μm2)) כדי לחלץ את צפיפות החלבונים כמופרה./מיקרומטר2 (איור 1C). עיין במקטע התוצאות הייצוגיות לקבלת פרטים נוספים.

3. מינים פונקציונליים של פוספוליפידים לשימוש בכיול חלבונים המצפים BSLBs

  1. השתמש 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) כמרכיב העיקרי של מטריצת השומנים להרכיב bilayer השומנים נתמך. לדלל את כל מינים שומנים אחרים בתמיסת DOPC זו.
  2. השתמש בין 0.2 ל 1 מול% של 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) מצומדים לצבעים, כולל ATTO 390, 488 או 565 (ראה את טבלת החומרים), כדי ליצור BSLBs עם פלואורסצנטיות פנימית.
    הערה: הפלואורסצנטיות הפנימית של BSLBs מאפשרת זיהוי של BSLBs בודדים ותאים בודדים בניסויי העברה סינפטיים.
  3. יש להשתמש ב-12.5 ממול% מ-0.4 מ"מ DGS-NTA(Ni) (1,2-דיאולואיל-סן-גליצרו-3-[N-(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל) סוקציניל)כדי לעגן את החלבונים המתויגים שלו. שמור על המול% של DGS-NTA(Ni) קבוע ולבצע פי 2 titrations של חלבונים מתויגים His החל מ 100 ננומטר כריכוז הגבוה ביותר. השאר תנאי אחד ללא חלבון כשליטה שלילית לכימות מוחלט.
    הערה: אותות עזר ומולקולות הידבקות, כגון ICAM-1, מתוכננים עם תג 12-His כדי להגדיל את הזיקה של החלבון עבור DGS-NTA(Ni).
  4. השתמש בביוטיניל קאפ PE (1,2-דיאולואיל-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinylyl) כדי לעגן חלבונים ביו-טיניל באמצעות גשרים ביוטין-סטרפטאבידין-ביוטין. השתמש טיטרציה טורית פי 5 של 0.4 mM Biotinyl Cap PE כיסוי בין 10 מול% ו 0 מול% (כמו שליטה שלילית). שמור על ריכוז של חלבונים סטרפטאבידין וביוטינילציה קבוע (200 ננומטר) הן בניסויי כיול והן בשחזור של נגמ"שים סינתטיים לניסויי העברה סינפטיים.
    הערה: ניתוח רגרסיה של צפיפות אמפירית של חלבונים biotinylated על מול% הסופי של Biotinylyl Cap PE במטריצת השומנים (המכיל גם DGS-NTA(Ni) כדי לעגן חלבונים מתויגים שלו) יגדיר את המול% שישמש כדי לשחזר את צפיפות היעד של אנטיגן.

4. הכנת תמיסת מלח חצובה HEPES משלימה המכילה 1% אלבומין בסרום

הערה: תוספת של תמיסת מלח עם חוצץ HEPES המכילה 1% אלבומין בסרום אנושי (HBS/HSA) או 1% אלבומין סרום בקר (HBS/BSA) נדרש בשלבי הכביסה וטעינת החלבון של BSLBs (טבלה 1). הכן פתרון מלאי HBS 10x ואת מאגר העבודה טרי ככל האפשר; יש לשמור בקירור ולהשתמש בו תוך חודש. בעוד BSA הוא חלופה זולה יותר HSA, הוא מספק חסימה יעילה של שומנים Ni-chelating13 ומומלץ לניסויים תפוקה גבוהה.

  1. הכן פתרון מאגר מלאי 10x של HBS הוסיף המכיל 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM גלוקוז, 10 mM CaCl2, ו 20 מ"מ MgCl2.
    הערה: המסת MgCl2 היא אקסותרמית מאוד וסכנת כוויות. מוסיפים מלח זה לאט על נפח גדול של ממס. הימנע מהכנת פתרונות מרוכזים (כלומר, 1 מ ') של מלחים אלה כפי שהם נוטים לזרז לאורך זמן, מה שהופך את התוספת המדויקת שלהם למאגר העבודה קשה.
  2. סנן את פתרון 10x באמצעות יחידת סינון 0.22 מיקרומטר ולשמור אותו סטרילי ב 4 °C (60 °F).
  3. עבור 500 מ"ל של HBS/has, יש ליטול 50 מ"ל של פתרון 10x HBS בתוספת תשלום, להתאים את ה-pH ל-7.4 במידת הצורך ולהרכיב את הנפח ל-483.4 מ"ל עם מים אולטרה-פורר.
  4. הוסף 16.6 מ"ל של פתרון HSA של 30% ל- 483.4 מ"ל של HBS, pH 7.4.
  5. עבור 500 מ"ל של HBS / BSA, להמיס 5 גרם של BSA ב HBS ודגור ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות. לאחר מכן, לערבב בעדינות ב RT על ידי היפוך הבקבוק מעת לעת עד שאין גבישי חלבון גלויים או גושים.
  6. סנן את הפתרון המתקבל משלב 4.5 באמצעות יחידת סינון של 0.22 מיקרומטר (עיין בטבלת החומרים) ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (4 °F).

5. כיול צפיפות חלבונים על BSLBs

  1. לפני נטילת 5.00 ±0.05 מיקרומטר קוטר לא פונקציונלי חרוזי סיליקה, לערבב את פתרון המלאי היטב resuspend כל גושים גדולים של חרוזים משקעים בתחתית הבקבוקונים.
    הערה: חרוזי סיליקה נוטים משקעים במהירות, מה שעלול להוביל לשגיאות ספירה. ערבבו במרץ על ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח המרבי של מיקרופיפט P1000.
  2. לדלל 1 μL של פתרון חרוזים ב 1,000 μL של PBS, לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer, ולחשב את הריכוז שלהם לכל mL.
    הערה: כתמים כחולים של טריפאן אינם נחוצים להדמיית חרוזי סיליקה.
  3. חשב את הנפח של חרוזי סיליקה הדרושים עבור 5 × 105 BSLBs סופיים לכל נקודה של titration.
  4. מעבירים את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.
  5. לשטוף את חרוזי סיליקה שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, צנטריפוגה החרוזים עבור 15 s על microcentrifuge ספסל ב RT (בסל"ד קבוע).
    הערה: בעת הסרת תמיסת הכביסה, יש להימנע מהפרעה לכדור החרוזים. עמודת חיץ קטנה לא תשפיע על התפשטות הליפוזומים המרכיבים את תערובת מאסטר הליפוזום מכיוון שאלה נמצאים גם ב- PBS.
  6. הכן שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום כדי להרכיב את BSLB על חרוזי סיליקה שטף (למשל, אם הנפח הכולל הראשוני של חרוזי סיליקה הוא 20 μL, להכין מינימום של 60 μL של תערובת מאסטר ליפוזום).
  7. עבור ביוטיניל קאפ PE מול% titrations
    1. הכינו את תערובות מאסטר השומנים המכילות דילול של פי 5 של Biotinyl Cap PE.
      1. לדלל את 0.4 mM Biotinyl Cap PE מול% מטריצת DOPC 100%.
      2. ערבבו כל נקודת טיטרציה של Biotinyl Cap PE Mol% ביחס של 1:1 (vol:vol) עם פתרון של 0.4 מ"מ 25% DGS-NTA(Ni) כך ש-12.5 מולן סופי של שומנים המכילים Ni נמצאים בכל התייקרויות.
        הערה: 12.5 mol% (vol:vol%) של שומנים המכילים Ni מייצגים את הרכב השומנים המעורבים של BSLBs שבו חלבונים מתויגים שלו ניתן לבדוק גם כיול מקביל. לדוגמה, מאז כל מניות ליפוזום מוכנים באותו ריכוז טוחן, כדי להגיע ליעד מול% תערובת ב 200 μL של תערובת ליפוזום סופי, פשוט לערבב 100 μL של 25 mol% של Ni המכיל DGS-NTA עם 100 μL של 100 mol% DOPC.
    2. העבר 5 × 105 חרוזי סיליקה שטופים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, כך שנקודת טיטרציה אחת של Biotinyl Cap PE מורכבת לכל צינור.
    3. הוסיפו את תערובות ה-Biotinyl Cap PE mol% titration Master לחרוזי הסיליקה השטופים וערבבו בעדינות על ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף להרוס את bilayer השומנים.
    4. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs היוצרים כעת כדי לעקור את האוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.
    5. הוסף ארגון למלאי השומנים 0.4 מ"מ לפני האחסון ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית.
      הערה: חבר צינור קטן לגליל הגז ארגון/חנקן. לפני הוספת גז לצינורות, להתאים את וסת בלון הגז כך הלחץ מוגדר לא יותר מ 2 פסאיי. חברו קצה פיפטה סטרילי לצינורות השקע כדי לכוון את זרם הגז בתוך ציר הליפוזום למשך 5 שניות ולסגור במהירות את המכסה. במקרה של מלאי שומנים בדם, לאטום את המכסה של הצינור עם סרט פרפין לפני אחסונו ב 4 °C (60 °F).
    6. העבירו את ה-BSLBs למערבל מעבדה אנכי בעל זווית משתנה (ראו טבלת החומרים) וערבבו במשך 30 דקות ב-RT באמצעות ערבוב מסלולי של 10 סל"ד.
      הערה: שלב זה ימנע את המשקעים של חרוזים במהלך היווצרות של bilayer השומנים הנתמך.
    7. לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
    8. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין או 5% BSA המכיל 100 מיקרומטר של NiSO4 כדי להרוות אתרי NTA וסטרפטאבידין של 200 nM כדי לצפות את כל אתרי עיגון הביוטין ב- BSLBs באופן אחיד. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה חצי מהנפח הכולל ודגרים במיקסר האנכי לא יותר מ-20 דקות ב-RT ו-10 סל"ד.
    9. לסובב את BSLBs על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) חוצץ.
      הערה: שמור חרוזים שטופים אנכית עם נפח קטן של חיץ לשטוף המכסה את BSLBs. הימנע התייבשות של BSLBs כמו אוויר יהרוס את bilayer השומנים.
  8. עבור titration של חלבונים מתויגים שלו על 12.5 mol% של DGS-(Ni) NTA המכיל BSLBs
    1. הכן שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום המכיל 12.5 mol% סופי של DGS-NTA(Ni).
    2. השתמשו בתערובת הראשית של ליפוזום כדי לנפח מחדש את חרוזי הסיליקה השטופים ולערבב בעדינות על ידי צנרת מעלה ומטה מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף נזק bilayer השומנים.
    3. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs היוצרים כעת כדי לעקור את האוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.
    4. הוסף ארגון למלאי השומנים 0.4 מ"מ לפני האחסון ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית.
    5. מעבירים את ה-BSLBs למיקסר האנכי ומערבבים במשך 30 דקות ב-RT באמצעות ערבוב מסלולי ב-10 סל"ד.
    6. לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
    7. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין (או 5% BSA) המכיל 100 מיקרומטר של NiSO4 כדי להרוות אתרי NTA ב- BSLBs. יש לערבב בעדינות ולדגור במיקסר האנכי למשך לא יותר מ-20 דקות ב-RT ו-10 סל"ד.
    8. לשטוף שלוש פעמים באמצעות HBS / HSA (BSA) כדי להסיר את פתרון החסימה עודף.
    9. בלוח חדש של 96 בארות תחתית U להכין דילול סדרתי פי 2 של החלבונים.
      1. הכן ריכוז התחלתי של 100 nM עבור חלבון העניין בנפח כולל של 200 μL של HBS / HSA (BSA) חיץ, להפיץ 100 μL של פתרון זה בעמודה הראשונה, ואת 100 μL הנותרים על גבי עמודה #2 המכיל 100 μL של HBS / HSA (BSA) חיץ.
      2. המשך על-ידי העברה סדרתית של 100 μL מעמודה #2 לעמודה #3 וחזור על הפעולה לפי הצורך כדי לכסות את כל נקודות הטיטורציה. השאר את העמודה האחרונה של הסדרה ללא חלבון, מכיוון שהיא תשמש כהפניה הריקה לכימות.
    10. תנצל מחדש את ה- BSLBs המוכנים באמצעי אחסון כך ש- 5 × 105 BSLB יכילו במאגר HBS/HSA (BSA) של 100 μL.
    11. העבר 100 μL של השעיית BSLB לבארות של צלחת 96-well 96-well תחתית U שנייה, כך שכל באר מקבלת 5 × 105 BSLBs.
    12. לסובב את הצלחת השנייה המכילה BSLBs במשך 2 דקות ב 300 × g ו RT ולהשליך את supernatant.
    13. מעבירים את נפחי 100 ה-μL מלוחית החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLBs המשקעים. מערבבים בעדינות, נמנעים מעודף ייצור בועות בזמן ההזרמה, ודגרו במשך 30 דקות ב-RT ו-1,000 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    14. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם HBS / HSA (BSA) חיץ באמצעות שלבי משקע של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
    15. אם החלבון רקומביננטי המשמש בכיול מצומד ישירות לפלואורוקרומים ויש לו ערכי F/P ידועים, המשך לשלב 5.8.20.
    16. אם החלבון רקומביננטי המשמש בכיול הוא ללא תווית או מצומד לפלואורוכרומים או שאין תקן חרוזים MESF זמין, השתמש ב- Alexa Fluor 488 או בנוגדנים מצומדים 647 עם ערכי F/P ידועים כדי להכתים את ה- BSLB מצופה החלבון.
    17. כתם בריכוזים רוויים של נוגדני כימות.
      הערה: בהתאם לרמת ביטוי היעד, אלה נעים בין 5 ל 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    18. יש להכתים במשך 30 דקות ב-RT ו-1,000 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    19. לשטוף פעמיים עם HBS / HSA (BSA) חוצץ ופעם אחת עם PBS באמצעות שלבי משקע של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
      הערה: השתמשו ב-PBS, pH 7.4 כדי לחדש את ה-BSLBs שנשטפו לפני הרכישה. אין להשתמש במאגרים המכילים חלבון, שכן זה מוביל להיווצרות בועות במהלך ערבוב אוטומטי של דגימות עם דוגמים בעלי תפוקה גבוהה.
    20. רכשו את תקני MESF וודאו שהפסגות הבהירות ביותר יישארו בטווח הזיהוי הליניארי של גלאי הכימות (ערוץ), כפי שמוצג באיור 1B (vii).
    21. לרכוש את הדגימות באופן ידני או באמצעות HTS. אם משתמשים באפשרות השנייה, resuspend BSLBs ב- 100 μL של PBS ולרכוש 80 μL באמצעות קצב זרימה בין 2.5 ל 3.0 μL / s, נפח ערבוב של 100 μL (או 50% של נפח הכולל אם נפח resuspension הוא פחות), מהירות ערבוב של 150 μL / s, וחמישה תערובות כדי להבטיח BSLBs הם monodispersed.
    22. יצא את קבצי FCS.
    23. התמקדו באירועים בודדים עבור הניתוחים (איור 2A), שכן כפילויות או שלישייה יציגו שגיאה בקביעה. השתמש בזיהוי מקונן של אירועים בודדים כפי שצוין בפרוטוקול שלב 1.2.3.
    24. מדוד את ה- MFI של כל שבר MESF (1-4) והפחת את ה- MFI של חרוזים ריקים כדי לחלץ ממשקי MF מתוקנים (cMFI).
    25. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לחלץ את השיפוע (ב) של MESF מעל cMFI המחושב עבור תקני MESF, אשר ישמש בשלב 5.33.
    26. לחלץ את ה- MFI של כל נקודת טיטרציה ולהפחית את ה- MFI של חרוזים ללא חלבון כדי להשיג cMFIs.
    27. חלק את ה- cMFIs עם השיפוע המחושב בשלב 5.31 כדי לחלץ את ה- MESF המאוגד ל- BSLBs עבור כל נקודת טיטרציה.
    28. חלק את MESF מאוגד BSLBs על ידי ערך F /P של נוגדן הכימות כדי לחלץ את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל BSLB.
    29. באמצעות הקוטר של BSLBs (5.00 ± 0.05 מיקרומטר), לחלץ את שטח הפנים חרוז (SA = 4pr2) כדי לחשב את הצפיפות הסופית של חלבון (molec./μm2) לכל נקודת טיטרציה (ריכוז חלבון).
    30. בצע ניתוח רגרסיה חדש של ריכוז חלבון על פני צפיפות חלבון כדי לחשב את השיפוע (b) של קו ההתאמה הטובה ביותר.
      הערה: הריכוז של 12.5 mol% של DGS-NTA(Ni) מעניק יכולת עיגון מקסימלית של כ 10,000 molec./μm210 מבלי לגרום להפעלה לא ספציפית של תאי T או להשפיע על הניידות לרוחב של SLBs.

6. ביצוע ניסויי העברה סינפטיים בין תאי T ו- BSLBs

  1. לפני הפעלת ניסוי ההעברה הסינפטית
    1. רכשו BSLBs לא פלואורסצנטיים, BSLBs עם שומנים פלואורסצנטיים, תאים לא מזוהמים (או חרוזי פיצוי; עיין בטבלת החומרים) ותאים מוכתמים בצבע יחיד (או חרוזי פיצוי) כדי לזהות את אינטראקציות ספקטרום הפלואורסצנטיות של המכשיר. התמקד בגלאים אלה עם התפשטות גלישה גבוהה כדי לעצב מחדש את הלוח הפוליכרומטי, להגביר את הרגישות ולהפחית את שגיאת המדידה בגלאים קריטיים (ראה 14).
    2. יש לזרז את נוגדני הזיהוי כדי למצוא את הריכוז האופטימלי, ולאפשר זיהוי אירועים חיוביים מבלי להתפשר על גילוי שליליות.
      הערה: חזור על שלב זה בכל פעם שיש שינוי של מנת נוגדנים מכיוון שערכי ה- F/P והבהירות משתנים מאצווה לאצווה.
    3. אופציונלי: מטב את מתחי ה- PMT על-ידי רכישת המדגם בטווחי מתח שונים (כלומר, הליכות מתח) כדי למצוא את ה- PMTs המובילים לאות אופטימלי על פני רעש (כלומר, הפרדה של שליליות וחיוביות תוך הבטחת האות של האוכלוסייה הבהירה ביותר נשאר בטווח הליניארי).
  2. מדידת העברת פלט תאי T ל- BSLBs
    1. הכינו תוספת של RPMI 1640 (כאן R10 בינוני) המכיל 10% של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/ml של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין. השתמש במדיום R10 כדי לתרבות ולהרחיב תאי T.
    2. ביום הראשון, לבודד תאי T מתאי דם היקפי או מערכת לויקורדוקציה (LRS). השתמש בערכות בידוד והפרדה של תאי חיסון (עיין בטבלת החומרים) להעשרת תאי CD4+ ו- CD8+ T אנושיים.
    3. זרע את התאים בריכוז סופי הנע בין 1.5 ל 2.0 × 106 תאים / מ"ל, באמצעות צלחות 6-well עם לא יותר מ 5 מ"ל סה"כ לבאר.
    4. הפעל תאי T באמצעות יחס של 1:1 של הפעלת תאי T אנושיים (אנטי-CD3/anti-CD28) חרוזים מגנטיים (ראה טבלת החומרים) והוסף 100 יב"ל של IL-2 אנושי רקומביננטי כדי לתמוך בשגשוג ובהישרדות של תאים.
    5. ביום 3, הסר את החרוזים המגנטיים המפעילים באמצעות עמודות מגנטיות (ראה טבלת החומרים). ודא כי חרוזים מגנטיים להישאר מחוברים לצדי הצינור לפני שחזור התאים עבור צעדי כביסה נוספים.
    6. לשטוף את החרוזים המגנטיים פעם נוספת עם 5 מ"ל של בינוני R10 טרי, לערבב היטב, ולהחזיר אותם למגנט . שחזר אמצעי אחסון זה וערבב עם התאים ששוחזרו בשלב 6.2.5.
    7. הגדילו מחדש את התאים ל-1.5-2 ×-106 תאים/מ"ל ב-R10 טרי המכיל 100 U/mL של IL-2. לחדש את המדיום לאחר 48 שעות, לוודא כי התוספת האחרונה של IL-2 הוא 48 שעות לפני יום הניסויים (ימים 7 עד 14 של תרבות).
    8. ביום של ניסוי ההעברה הסינפטית, להכין את מדיום בדיקת העברה סינפטית (ראה טבלה 1) על ידי שכשהם פנול אדום RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS, 100 μM חומצות אמינו לא חיוניות, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U / מיליליטר של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין. אין לכלול IL-2 אנושי רקומביננטי.
    9. ספרו תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן או אי-הכללת זרם חשמלי והגדילו אותם לריכוז סופי של 2.5 × 106 תאים/מ"ל בינוני. אם נצפתה מוות תאי מופרז (>10%), הסר תאים מתים/גוססים באמצעות תערובת של פוליסכריד ונתרן דיאטריזוט (ראה טבלת החומרים) כדלקמן:
      1. שכבה 15 מ"ל של תרבית תאים על גבי 13 מ"ל של פתרון פוליסכריד-נתרן diatrizoate.
      2. צנטריפוגה עבור 1,250 × גרם במשך 20 דקות ב RT עם האצה מינימלית deacceleration. לאסוף את שכבת התא (ענן) בממשק בין המדיום ואת הפתרון דיסכריד-נתרן diatrizoate.
      3. לשטוף את התאים לפחות פעמיים עם מדיום העברה סינפטית מראש (מוכן בשלב 6.2.7).
      4. לספור ולחדש את התאים לריכוז סופי של 2.5 × 106/mL באמצעות מדיום בדיקת העברה סינפטית. Coculture 100 μL של השעיית תא זה עם BSLBs (ראה שלב 6.2.15).
    10. חשב את מספר ה- BSLBs הדרושים לניסוי; שקול את כל תערובות מאסטר חלבון שונות ו titrations אנטיגן להיבדק (או biotinylated HLA / MHC-פפטיד מונומרים או מונוביוטינילט אנטי CD3ε Fab).
    11. הרכיבו את ה-BSLBs על-ידי ביצוע אותם שלבים מפרוטוקול סעיף 5, אך הפעם, שלבו את כל התוספות של חלבונים ושומנים הנדרשים כדי לשקם קרום APC מורכב (איור 3A). שמור על אותו נפח: קשרי וול בין נפח חרוזי הסיליקה הראשוני לבין נפח תערובת החלבון המשמשת במהלך כיול, כמו גם פעמים וטמפרטורות המשמשים בטעינת BSLBs. לדוגמה, אם 0.5 μL של חרוזי סיליקה / טוב ו 100 μL / באר של תערובת חלבון שימשו לכיול הראשוני, לשמור על יחסי 5:1,000 vol: vol כדי להכין את BSLBs להיות cocultured עם תאי T.
    12. לאחר BSLBs כבר טעון עם תערובת חלבון של עניין, לשטוף את BSLBs פעמיים עם HBS / HSA (BSA) כדי להסיר חלבונים בלתי מאוגדים עודפים. השתמש במהירויות משקעים של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT בכל שלב כביסה ולהשליך את supernatants.
    13. resuspend 5 × 105 BSLBs לבאר ב 200 μL.
    14. העבר 100 μL לבאר לצלחת חדשה של U-bottom 96-well כדי ליצור שכפול, כך שהסכום הסופי של BSLB לבאר הוא 2.5 × 105.
    15. לסובב את BSLBs ב 300 × g במשך 2 דקות ו RT ולהשליך את supernatant.
    16. Resuspend BSLBs באמצעות 100 μL של השעיית תא T; מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות.
    17. לדגור את cocultures במשך 90 דקות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: לחלופין, תאים וחרוזים ניתן resuspended במאגר HBS / HSA (BSA) במקום פנול אדום RPMI חינם עבור coculture. במקרה זה, הדגירה חייבת להתבצע בחממה שאינה CO2 כמו גז זה יהיה במהירות חומצי את המאגר בהיעדר ביקרבונט.
    18. לקרר את cocultures תא BSLB-T על ידי הדגירה הראשונה של התאים ב RT לפחות 15 דקות. הגן עליהם מפני אור.
    19. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 500 × g ו RT; זרוק את הסופר-נרטיב.
    20. לחדש את התאים ב RT 2% BSA-PBS (Ca2 + ו Mg2 + ללא) לחסימה. מניחים את התאים על קרח במשך 45 דקות. הגן מפני אור.
    21. בעת הדגירה של התאים, הכינו את תערובת הנוגדנים הראשית באמצעות קר כקרח 0.22 מיקרומטר מסונן 2% BSA ב- PBS כחוצץ כתמים, אשר יספק חסימה נוספת.
      הערה: קבוצות מסוימות של נוגדנים המחוברים לצבעים סגולים מבריקים נוטים להיקשר ל- BSLBs באופן לא ספציפי. חסימה עם 5% BSA-PBS מסייעת להפחית רעש זה. מעתה והלאה, הקפד לשמור על השרשרת הקרה רצופה.
    22. לסובב את cocultures ב 500 × גרם במשך 5 דקות ו 4 °C (5 °F). לפני השלכת supernatants, בקצרה לוודא את הכדור קיים על ידי בדיקת החלק התחתון של צלחת 96-well באמצעות תאורה אחורית.
    23. באמצעות פיפטה רב ערוצית, resuspened התאים בתערובת מאסטר כתמים המכיל ריכוזי נוגדנים ממוטבים.
      הערה: השתמש בעצות פיפטה ללא מסנן כדי למנוע יצירת בועות ושגיאות בהפצת אמצעי אחסון מכתימים.
    24. כלול תאים בעלי תווית איזוטיפ ו- BSLBs, BSLBs פלואורסצנטיים ולא פלואורסצנטיים, ותאים ו- BSLBs מוכתמים לבדם. כבד את המספר הכולל של אירועים לבאר עבור כל הפקדים (כלומר, רק BSLBs המכילים 5 × 105 BSLB / טוב, ורק פקדי תאים המכילים 5 × 105 תאים / טוב כדי למנוע עלייה יחסית של נוגדנים לכל אירוע מוכתם).
    25. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה חצי מהנפח ודגור במשך 30 דקות על קרח. הגן מפני אור.
    26. לשטוף את התאים BSLBs פעמיים באמצעות קר כקרח 2% BSA-PBS, pH 7.4, ושלבי משקע של 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). Resuspend cocultures שטף ב 100 μL של PBS לרכוש מיד.
    27. אם יש צורך בקיבעון, תקן באמצעות 0.5% w / v של PFA ב- PBS במשך 10 דקות, לשטוף פעם אחת, ולשמור ב- PBS עד הרכישה. הגן מפני אור.
    28. לפני הפיצוי, רכשו תקני MESF, המבטיחים שהאוכלוסיות העמומות והמבריקות ביותר ייפלו בטווח המדידה הליניארי.
    29. לרכוש דוגמאות פיצוי, לחשב פיצוי, ולהחיל את מטריצת הפיצוי (קישור) לניסוי.
    30. השג ושמור מינימום של 2 × 104 תקני MESF בסך הכל עבור כל אחד מערוצי הכימות.
    31. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים כסטנדרט, הגדר רכישת מדגם ל- 80 μL (או 80% מהנפח הכולל), קצב זרימת מדגם בין 2.0 ל- 3.0 μL/s, נפח ערבוב מדגם של 50 μL (או 50% מהנפח הכולל כדי למנוע היווצרות בועות במהלך ערבוב), ערבוב מדגם של 150 μL/s וערבוב לבאר בין 3 ל -5.
    32. רכשו לפחות 1 ×-104 BSLBs בודדים לכל דגימה (עיינו בחלוניות איור 3B (i)-(vi) לאסטרטגיית הייחוס).
    33. לשטוף את cytometer פועל במשך 5 דקות פתרון ניקוי ואחריו 5 דקות של מים ultrapure לפני כיבוי המכשיר. אם אתה משתמש ב- HTS, בצע את האפשרויות תחת הכרטיסיה HTS והאפשרות ניקוי .
    34. יצא קבצי FCS.

7. מדידת ההעברה הסינפטית של חלקיקים ל- BSLB

  1. פתח את קבצי FCS הניסוי. בחר את אוכלוסיית התאים וה-BSLBs בהתבסס על אזורי פיזור האור בצד ובחזית שלהם (SSC-A לעומת FSC-A), כפי שמוצג באיור 3B (i).
  2. בחר את האירועים בחלון הרכישה הרציף (איור 3B (ii)).
  3. התמקד באירועים בודדים של שני התאים וה- BSLB; לזהות תאים בודדים תחילה בהתבסס על W נמוך בשערים הרצופים FSC-W/FSC-H (סינגלים-1, איור 3B החלונית (iii)) ו- SSC-W/SSC-H (סינגלים-2; איור 3B החלונית (iv)). הגדר שער סינגלים-3 נוסף על-ידי בחירת אירועים עם FSC-A ו- FSC-H פרופורציונליים (איור 3B, חלונית (v)).
  4. חלץ את ה- MFI של שברי MESF ריקים ו- 1 עד 4 ותאים בודדים ו- MESF עבור כל דגימת ניסוי.
  5. צור ערכי MFI מתוקנים (cMFI) עבור שברי MESF 1 עד 4 על-ידי חיסור ה- MFI של אוכלוסיית החרוזים הריקה מכל שבר.
  6. צור מחווני cMFIs עבור BSLBs ותאים בודדים (עיין בחלונית איור 3C (i)).
  7. השתמש באות מ- BSLB מוכתם בנוגדני בקרת איזוטיפ כדי לתקן את ה- MFI של BSLB המוכתם בנוגדנים כנגד סמני תאי ה- T הרלוונטיים. השתמשו ב-cMFI לחישוב אחוז ההעברה הסינפטית המנורמלת (NST%) באמצעות המשוואה המוצגת בחלונית איור 3C (ii).
  8. אם אתה מעוניין במקום זאת בחלקיקים שהועברו באופן ספציפי בתגובה להפעלת TCR, הפחת את האות מ- BSLBs ריקים מה- MFI של BSLBs אגוניסטיים. השתמש ב- cMFI זה כדי לחשב את אחוז ה- NST מונחה TCR באמצעות המשוואה המוצגת בחלונית איור 3C (ii).
  9. אם מעוניינים לקבוע את המספר הכולל של מולקולות המועברות כמטען חלקיקים בממשק T cell-BSLB, רכשו חרוזי בנצ'מרק MESF באמצעות אותן הגדרות מכשירים והפעלת רכישה עבור cocultures תא T-BSLB.
  10. לנתח אוכלוסיות חרוזים MESF ולחלץ cMFIs שלהם כפי שצוין בשלבי פרוטוקול 5.8.15 עד 5.8.17. חשב את השיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר לניתוח רגרסיה של MESF חלקי cMFI.
  11. השתמש במדרון המחושב כדי לחלץ את מספר ה- MESF שהופקד על BSLBs. השתמש ב- cMFIs המחושב באמצעות פקדי איזוטיפ או BSLB ריקים כריקים כדי לחלץ את מספר ה- MESF שהועבר במיוחד ל- BSLBs מגרה.
  12. חשב את מספר המולקולות של סמנים המועברים ל- BSLBs על-ידי חלוקת ה- MESFs המחושב (הממוצע) ל- BSLB לפי ערך ה- F/P של נוגדן הכימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FCM לכימות חלבונים מוחלט על פני התא
שחזור של BSLBs המציגים צפיפות פיזיולוגית של ליגנדים דורש הערכה של צפיפות החלבון הכוללת בקבוצת המשנה של התאים המעוצבים. כדי לשקם את ה-BSLBs, כלול כל ליגנד רלוונטי שצפוי למלא תפקיד בציר האיתות של עניין לצד חלבונים התומכים בהידבקות ובאינטראקציה תפקודית בין BSLB לתאים, כגון ICAM-1 ומולקולות תותבות, למשל, קולטני CD40, CD58 ו- B7 (CD80 ו- CD86). ניתן להוסיף חלבונים נוספים בהתאם לשאלה שלפנינו, כולל מולקולות costimulatory כגון ICOSL3, PD-L1 ו- PD-L215. עבור כל מולקולה אחרת, לשקם BSLBs באמצעות דחיסויות מולקולריות שנקבעו על ידי ניתוח ישיר של תאים עם ציטומטריית זרימה כמותית. עבור נוגדנים מצומדים ישירות, BioLegend מספקת ערכי F/P עבור כל מספר מגרש נוגדנים. נוגדנים יכולים להיות מסומנים גם בתוך הבית ואת יחסי F / P שנקבעו על ידי spectrophotometry, מתן חלופה כאשר אין נוגדנים מסחריים מצומדים פלואורוכרום הרצוי. מכיוון שאנו משתמשים באותם נוגדנים כדי לכייל את מספר החלבונים הרומביננטיים על פני השטח של תאים ו- BSLBs, אין צורך לתקן את הערכות מחייבת הנוגדנים מכיוון שזה נשאר קבוע. אם נדרשת ערכיות מחייבת נוגדנים, השתמש הן בחלבונים רקומביננטיים והן בנוגדנים עם F/P ידועים כדי לקשט BSLBs ולהשוות מולקולות של חלבונים רקומביננטיים טעונים עם מספר הנוגדנים הכרוכים בעקבות הכתמים בתנאים רוויים.

ניתן להעריך את מולקולות הנוגדנים הכבולות לכל תא באמצעות מדידה ציטומטרית ייעודית של זרימה מונוכרומטית או פאנל פוליכרומטי של נוגדנים שנועד להעריך צפיפות חלבונים מוחלטת על תת-קבוצה נדירה יחסית של תאים בתוך רקמה של עניין, כגון שקדי פלטין. איור 1 מציג מדידות מייצגות של צפיפות ICAM-1 בתאי CXCR5+ B ותאי T זקיקים (TFH) כדוגמה. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כתמים ועקרונות ניתוח ציטומטריית זרימה המוצגים באיור 1A כדי למדוד את צפיפות החלבון בתאי האפיתל, בתאי סטרומה, במונוציטים, בתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים (moDCs), או בלימפוציטים מסוג B ו-T ברקמות אנושיות ועכבר אחרות. עבור רקמות שונות מדם ושקדים, יש לנקוט זהירות בעת בידוד תאים באמצעות קוקטיילים פרוטאז, כמו חשיפה ממושכת של תאים לעיכול אנזימים מפחית את רמות ביטוי פני התא.

מקד את הרכישה וניתוחים בתאים בודדים וחיים בחלון הרכישה הרציף (איור 1A ii), כאשר אירועים מחוץ לרצף הזמן מפזרים אור באופן חריג ופוגעים בכימות. כדי להגביר את הדיוק של קביעות, להפחית את ההכתמה הלא ספציפית של APCs על ידי חסימה יעילה של FcγRs. הסרום האנושי וה-EDTA הקיימים ב-hFCB מאפשרים חסימה יעילה של FcγR תוך כדי קליטת Ca2+ חופשית כדי להפחית את הצבירה הספונטנית של תאים במהלך המניפולציה וההכתמה שלהם (חצים שחורים באיור 1A (iii) ו-(iv) מראים כפילויות שנותרו בהשעיות של תאי שקדים).

מעקב אחר ביצועי המכשיר באמצעות חרוזי ההתקנה והמעקב והתוכנה (או דומה; עיין בטבלת החומרים) הוא קריטי לשחזור של כימות לאורך זמן, במיוחד בשלבים מאוחרים יותר כאשר ההעברה הסינפטית של חלקיקים ל- BSLB נמדדת באמצעות MFIs בלבד (כלומר, עבור פלואורוכרומים שעבורם אין תקני MESF). באופן דומה, בדוק את הטווח הליניארי (כלומר, מינימום ליניאריות ומקסימום ליניאריות) של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות עבור גלאי הכימות לשימוש לצד תקני MESF, כך שכל נקודת כיול שומרת על הקשר הליניארי בין פלואורסצנטיות למספר הפלואורוכרומים.

הכנת דגימות "ריקות" עבור פלואורסצנטיות, או דגימות המספקות מושג על רעש הכתמת הרקע, חיוניות כדי להפחית את האות הפלואורסצנטי הלא ספציפי. פקדי איזוטיפ ו/או דגימות Null ביולוגיות (למשל, נוקאאוטים) חיוניים לתיקון אות הרקע של התאים ולחילוץ האות האמיתי הנגזר מנוגדני הכימות (איור 1A פאנל (viii)). באופן דומה, חרוזי MESF סטנדרטיים משתמשים באוכלוסייה ריקה ייעודית כדי להפחית את אות הרקע מכל אוכלוסיית חרוזים חיובית באמת (איור 1B לוחות (vii) ו- (viii)). לאחר ביצוע ניתוחי הרגרסיה והשיפוע המגדיר את הקשר בין MESF לבין ממשקי MF מתוקנים מופק, ההמרה לצפיפות מולקולרית מוחלטת מתבצעת בהתאם לפעולות מתמטיות פשוטות (איור 1C).

כדי להעריך CSA באיור 1C, אי-הכללת זרם חשמלי (CASY-TT) שימשה לחילוץ מדידות של נפח וקוטר התא מאלפי תאים. CSA המתקבל מוערך מחישוב שטח הפנים עבור כדורים (4pr2) משתנה עם מצב ההפעלה של התאים, עם ערכים נצפו של 170.37 ± 4.91 μm2 עבור תאי B לא מופעלים ו 234.52 ± 1.53 מיקרומטר2 ו 318 ± 24.45 μm2 עבור תאי T לא מופעלים ומופעלים, בהתאמה. רשויות אישורים אלה דומות לאלה המוערכות על ידי טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה תלת-ממדית של אינדקס שבירה תלת מימדי של לימפוציטים שאינם פעילים16.

לאחר שהוגדר טווח הצפיפות הפיזיולוגית (למשל, על ידי השוואת צפיפות פני השטח בתאים העוברים תוכניות הפעלה שונות), ניתן להשתמש ב- BSLBs כדי לדגמן משטחים אלה. טיטרציה של מונומרים אנטיגניים HLA-פפטיד אנטיגניים biotinylated המסופקים על ידי מתקן TETRAMER NIH (או מונוביוטינילט מונומרי אנטי CD3ε-Fab) ניתן להשתמש לצד ICAM-1 12-His כדי לשחזר קרום APC קנוני. חלבונים מסחריים המסומנים ב-6, 9, 12 ו-14 שלו יכולים לשמש לקישוט פני השטח של BSLB (ראו איור 2A לדוגמאות עם ICAM-1 12-His). טיטרציות חלבון יחד עם ניתוחי FCM כמותיים מספקים מתודולוגיה חזקה לשקם משטחי APC פיזיולוגיים ולבדוק את השפעתם על הפלט הסינפטי של תתי-קבוצות שונות של תאי T.

לחקר הפלט של סינפסות תאי T, השתמש ביחס תא BSLB-to-T של 1:1 כדי להבטיח כי, בממוצע, תא אחד יקיים אינטראקציה עם BSLB אחד במהלך התקופה הנחקרת. ראינו כי העברת החומר היא פרופורציונלית לזמן הדגירה, ומספקת פלטפורמה רב-תכליתית לזיהוי מולקולות המועברות בכמויות נמוכות על פני ממשק התא:BSLB. עיצוב פאנל מתאים הוא אפוא קריטי להגברת הרגישות והאמינות של זיהוי של חומר טרנס-סינפטי, כמו במקרה של tSVs, הפלט משתנה בין 25 ל 36 שלפוחיות / תא / 20 min2,3. בדוק תחילה את הדליפה הספקטרלית של כל נוגדן ושומנים המסומנים בפלואורוכרום. כאשר נצפתה גלישה גבוהה, אנו ממליצים על טיטרציה של נוגדנים מכתימים ואת אחוז השומנים הפלואורסצנטיים המרכיבים את ה- BSLB, כמו גם הליכות מתח PMT כדי להפחית את שגיאת ההתפשטות על דגימות מפוצות ולשפר את יחס האות על רעש, בהתאמה (עיין ב - 12,14,17 עבור מבוא ייעודי לנושא).

השימוש בפקדי כימות, כולל BSLBs ריקים (ללא אנטיגן או אנטי-CD3 Fab) ותאי נוקאאוט או דגימות בעלות תווית איזוטיפ18, חיוני כדי למדוד במדויק את העברת tSV המחולל, כגון SEs, כמו גם חלקיקי התקפה סופרמולקולריים המשתחררים בתוך השסע הסינפטי. השתמש בחלבונים נפוצים מאוד על פני התא כגון CD4, CD2 או CD45 לצד שומנים פלואורסצנטיים סינתטיים (מצומדים ATTO של סמים) כדי לזהות את האוכלוסייה של תאים בודדים ו- BSLB על פירוק מבוסס קר של מצומדים. מקד את הניתוחים בממוצע הגיאומטרי או בחציון של עוצמות הפלואורסצנטיות ב-BSLB ובתאים בודדים (CD4 משמש באיור 3B). SEs הם סוג מיוחד של tSV הנגזר מקרום הפלזמה (PM), והעברתם ל- BSLB באה לידי ביטוי ברווח של אות סמן על BSLBs עם אובדן עקבי של אות על פני השטח של התאים האינטראקטיביים (עיין TCR על BSLBs כפי שמוצג באיור 2B, חצים סגולים). BSLBs Null חסר אנטיגן או אנטי CD3 הם התייחסות מצוינת כדי לעקוב אחר הרווח הספציפי של TCR (וסמני תאי T אחרים) על BSLB הנובע מגירוי תאים אינטראקציה באמצעות קומפלקס TCR שלהם.

Figure 1
איור 1: כימות מוחלט של חלבונים על פני השטח של נגמ"שים. (A) דוגמה למדידות ציטומטריית זרימה כמותית של ICAM-1 על פני השטח של תאי שקדים B (פול. Bc) ותאי T עוזרים (TFH). (i-vii) אסטרטגיית Gating לניתוח יחיד CXCR5 + Bc ו- TFH מבודדים משקדים פלטין אנושיים. מוצגת אסטרטגיית ההתהוות הרציפה לזיהוי אירועים חיים בודדים הכלולים בחלון הרציף של הרכישה. (iii-iv) חצים שחורים מציינים כפולות. (viii) היסטוגרמה מכוסה המציגה את ביטוי פני התא של ICAM-1 (היסטוגרמה צהבהבה) בהשוואה לבקרות FMO (היסטוגרמה אפורה) ובקרות FMO המסומנות באיזוטיפים רלוונטיים (היסטוגרמה שחורה, החופפים להיסטוגרמה האפורה) של האוכלוסיות המוצגות ב- (vii). חצים מציינים את הכיוון עבור אסטרטגיית ההזנה המקוננת המשמשת לזיהוי תאי CXCR5+ B (Bc; CD19+) ו- TFH (CD4+). (B) מיצוי של מולקולות מוחלטות על פני השטח של תאי שקדים מ- MFI דורש ניתוח רגרסיה של חרוזי בנצ'מרק MESF שנרכשו באמצעות אותה הגדרת מכשיר כמו התאים המוצגים ב- A. (i-v) מוצגת אסטרטגיית ההתהוות הרציפה לזיהוי אירועים חיים בודדים הכלולים בחלון הרציף של הרכישה. (vi) Gating ומדידה של MFIs מאוכלוסיות MESF סטנדרטיות שונות. (vii) המוצגות הן היסטוגרמה מכוסה של אוכלוסיות MESF שזוהו ב- (vi). הערכים המוצגים בפינה השמאלית העליונה מייצגים את ממשקי ה- MF עבור כל אחת מחמש אוכלוסיות MESF (ריקות, 1, 2, 3 ו- 4). (viii) רגרסיה ליניארית של MESF מעל cMFI עבור אוכלוסיות MESF המוצגות ב- (vii). מוצג השיפוע (ב) לחילוץ MESF המאוגד לתאים מנתונים ב- A. (ג) בהפקת מספר המולקולות, בצע פעולות מתמטיות פשוטות החל מיישום השיפוע המחושב ב- (viii) מ- MESF cMFI מדוד (cMFIM) והפניה לערכי MESF (MESFR). כדי לחלץ את ה- MESF המאוגד לתאים (MESFcells), חלק את ה- MFI המתוקן של תאים (cMFIcells) לפי השיפוע המחושב. לאחר מכן, כדי לחשב את מספר המולקולות הקשורות לתאים (Molec. תאים), לחלק MESFcells על ידי F / P של זיהום (כימות) נוגדן. לבסוף, כדי לחשב את הצפיפות המולקולרית על פני השטח של תאים (Dcells), לחלק Molec. תאים לפי שטח הפנים המשוער של התא (CSAE). קיצורים: X = משתנה בלתי תלוי; Y = משתנה תלוי (פלואורסצנטיות נמדדת), cMFIM = MFI מתוקן נמדד; MESFR = ערכי MESF הפניה; MESFcells = MESF מוערך לכל תא; cMFIcells = תאי MFI מתוקנים; מולאק. תאים = מולקולות משוערות לכל תא. Dcells = צפיפות משוערת על תאים; CSAE = שטח פנים תא משוער. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיקום של BSLB עם ICAM-1 רקומביננטי ומדידת העברת חלקיקים ל- BSLBs. (A, i-vi) ניתוח ציטומטריה של BSLBs שהוחזר עם צפיפות מוגברת של ICAM-1 מונומרי רקומביננטי 1 12-His (rICAM-1). (i-v) כמו באיור 1, מקד את אסטרטגיית הגיימינג ב-BSLBs בודדים בחלון הרציפה של הרכישה. שים לב לפער מיד לפני שער רצף הזמן, שלא נכלל כדי למנוע שגיאות מדידה. (vi) איכות חלבון טובה לעתים קרובות גורמת ציפוי הומוגני של BSLB בריכוזים גבוהים, עם תצפית של התפלגות פלואורסצנטיות צרה (מקדם נמוך של וריאציה, ראה היסטוגרמה vi). (B) ניתוח רגרסיה של ריכוז ייחוס ICAM-1 (CR) על פני צפיפות נמדדת (DM). השתמשו בשיפוע כדי לחשב ריכוזי יעד של חלבון (CT) כדי להשיג את צפיפות התאים (Dcells) הנמדדת בניסויים באיור 1. קיצורים: תג 12-His = 12-histidines; DM = צפיפות מולקולרית נמדדת; CR = ריכוזי ייחוס של rICAM-1; CT = ריכוז היעד (כדי להיות אינטרפולציה); Dcells = צפיפות הנמדדת בתאים (ראה גם איור 1C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידת חלקיקים סינפטיים של תאי T המועברים ל- BSLBs. (A; i-v) דיאגרמת זרימה המציגה את השלבים הקריטיים לשיתוף פולחן של תאי T עם BSLBs מחדש של ממברנות מודל ואת המדידה הבאה של העברת חלקיקים עם cytometry זרימה. (iv) דיאגרמות כחולות וצהובות כהות מציגות את ההתפלגות והמיקום היחסיים של תאים ו- BSLBs בסכסוכי ציטומטריה של זרימה דו-צדדית. (v) היסטוגרמה להפצת פלואורסצנטיות המציגה את הרווח היחסי של פלואורסצנטיות של BSLBs אגוניסטיים (צהוב כהה) בהשוואה ל- BSLBs ריק (אפור). (B) ניסוי העברה סינפטי למופת. (i-vi) מוצגת אסטרטגיית ההרחבה לזיהוי BSLBs ותאים בודדים בחלון הרכישה הרציף. חצים סגולים מציינים את כיוון הניתוח, הממשיך ב- C. (C) (i) מיקוד הניתוחים ב- MFI של תאים בודדים (כחולים) ו- BSLBs בודדים (צהובים). (ii) משוואות לחישוב ההעברה הסינפטית המנורמלת (NST%, top) ו- Tmax% (למטה) מה- cMFI המחושב עבור BSLB ותאים. (iii-vi) היסטוגרמה מכסה המציגה את השינוי של התפלגות עוצמת פלואורסצנטיות עבור תאים (גוונים כחולים) ו- BSLBs (גוונים צהובים) על-פני דחיסויות שונות של תאי T המפעילים אנטי-CD3ε-Fab, כולל אי-הפעלה (אפור) והפעלה עם 250 (ערך צבע רך) או 1,000 (ערך צבע גבוה) molec./μm2. מספרים בערכי צבע שונים מייצגים את NST% הנמדד עבור היסטוגרמה BSLB המוצגת בצהוב. ההיסטוגרמות המכוסות מציגות את ההיררכיה הכוללת בהעברה הסינפטית של שלפוחיות תאי T חיוביות עבור סמנים שונים. עבור הרכב זה של BSLBs (200 molec./μm2 של ICAM-1 והגדלת הצפיפות של אנטי CD3ε-Fab), tSVs מועברים ל- BSLB עם TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi). כפי שהוכח במאמרים קודמים, TCR ו- CD81 הם רכיבים של SEs ומועברים עם יעילות גבוהה יחסית ל- CD4, למרות שהאחרון בא לידי ביטוי ברמות משטח גבוהות יחסית. SE שפיכת תוצאות באובדן משטח התא CD81 ו- TCR ואת הרווח של אותות אלה על BSLBs (חצים סגולים פתוחים עבור 250 molec./μm2, וחצים סגולים סגורים עבור 1,000 molec./μm2 בהיסטוגרמה צהובה). (D) קירור לא תקין של מצומדים מוביל לתאים קורעים את ה- SLB מחרוזי סיליקה כפי שניתן לראות מהשוואת חרוזי קלט (עלילה דו-צדדית שמאלית) והצומדים הנתונים לקירור מהיר עד 4 °C (37 °C (עלילה דו-צדדית ימנית). השווה גם לחלונית איור 3B (vi). קיצורים: PRF1 = perforin 1; NST% = העברה סינפטית מנורמלת; Tmax% = אחוז ההעברה המרבית שנצפתה (במצב בקרה או הפניה); tSVs: שלפוחיות טרנס-סינפטיות; אס: אקטואוזומים סינפטיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מאגרים המשמשים בפרוטוקול זה. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BSLBs הם כלים רב-תכליתיים לחקר תפוקת החלקיקים של תאי T מגורה עם ממברנות APC מודל. הגמישות של השיטה מאפשרת שחזור של הרכבי ממברנות מורכבים ורדוקציוניסטיים כדי לחקור את ההשפעות של ליגנדים ואת האותות שלהם על הפרשת tSVs וחלקיקי התקפה סופרמולקולרית ורכיביהם. בדקנו טכנולוגיה זו בתאי T שונים, כולל TH, CTL, טרגס ו- CART15. פרוטוקול זה פועל גם למדידת שחרור חלקיקים סינפטיים של תאי T מבודדים טריים ודיכאוניים. מגבלה אחת של שימוש בתאי T מבודדים טריים היא שאוכלוסיות שקטות אלה מייצרות פרופיל שונה של חלקיקים טרנס-סינפטיים, אשר מתואמים עם הרכב פני התא שלהם (ראה 15 לפרטים נוספים).

כמו לוח ציטומטריה זרימה פשוטה, אנו ממליצים על השימוש של שיבוט נגד TCR IP26, נגד CD81 שיבוט 5A6, אנטי perforin (PRF1) לשכפל B-D48 או נגד CD40L clone 24-31, ו ATTO 390 או ATTO 565 המכיל שומנים (כדי להעניק BSLBs פלואורסצנטיות מהותית). כדי לסייע בהפלת תאים בודדים מ- BSLBs בודדים והצומדים, אנו ממליצים על שימוש בשיבוט נגד CD4 OKT4 ו/או שיבוט נגד CD45 HI30, המועברים ל- BSLBs ברמות מוגבלות למרות שהם באים לידי ביטוי ברמות גבוהות מאוד על פני התא (ראה רשימת חומרים לפרטים נוספים על פלואורוכרומים ונוגדנים מאומתים אחרים). לוחות עם מספר גבוה יותר של פלואורוכרום ניתן לעצב אבל דורשים הערכה שיטתית של שפיכת ספקטרום פלואורסצנטיות של כל פלואורוכרום מנותח. כדי להגביר את הרגישות, נסה titrations שונים של נוגדני כימות הנעים בין 0.5 מיקרוגרם ל 20 מיקרוגרם / מ"ל סופי, ולחזור על בכל פעם מלאי חדש של נוגדנים משמשים. כדי להבטיח רבייה של המדידות המוחלטות והיחסיות של העברת חלקיקים, titrate ולחשב את היכולת המחייבת של כל הרבה חדש של ביוטינילציה וני המכיל פוספוליפידים, כפי שהם עשויים להיות שונים באופן משמעותי מ הרבה הרבה. ההתקררות ההדרגתית של מצומדי תא T-BSLB היא קריטית להגברת הרגישות של זיהוי חלקיקים עם שפע נמוך. ההתקררות המהירה של cocultures מובילה להרס של BSLBs, כפי שמעיד האובדן המשמעותי של פלואורסצנטיות השומנים (איור 3D).

ניתן להשתמש במדדים שונים כדי למדוד את תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T בהתאם לשאלה הניסיונית שלפנינו. לדוגמה, כאשר צפויים הבדלים קלים ברמות הביטוי הבסיסיות של חלבוני פני השטח הממוינים ל- SEs ניצנים, ניתן להשתמש במדד העברה סינפטית מנורמל (NST%) (איור 3C פאנל (ii) משוואה עליונה). האחרון מכמת את אחוז אות ה- MFI ב- BSLBs כפונקציה של ה- MFI המשולב הכולל של תאים וחרוזים. אזהרה אחת מגישה זו היא ניתוח של סמנים שהועברו שאינם באים לידי ביטוי על PM, כגון רכיבים של חלקיקי התקפה supramolecular19. כמו אלמנטים אלה להגיע BSLBs על ידי מסלולים שאינם תלויים במעבר PM, כגון exocytosis חנות תאית, החישוב של NST% אינו מומלץ כמו התוצאה תהיה מנופחת כי הנומרטור יחולק על ידי מכנה קטן יחסית (רמת ביטוי פני התא). במקום זאת, השתמש בממשקי MFF מתוקנים כדי להשוות את התצהיר של פורן וגרנזימים בין BSLBs ריקים ו- BSLBs המציגים צפיפות הולכת וגדלה של אנטיגן או אנטי-CD3 Fab. לחלופין, כדי לעקוב אחר אלמנטים תאיים המועברים ל- BSLBs, השתמש לשם השוואה במולקולות המוחלטות המשוערות שהועברו או באחוז האות ביחס לאות המרבי המועבר ל- BSLBs (Tmax%) (איור 3C פאנל (ii) משוואה תחתונה). עבור Tmax%, השתמש ב- cMFI או במולקולות הנמדדות בדגימת BSLB (או במצב) המציגות את צפיפות האנטיגן הגבוהה ביותר כהפניה Tmax. בעת ניתוח תורמים שונים, השתמש Tmax ספציפי לתורם להשוואות. כאשר לומדים את החומר המועבר בתגובה להפעלה הספציפית של TCR, ניתן לתקן גם MFIs לרמה של העברת רקע שנצפתה ב- BSLBs אנטיגן שלילי (null).

הערכת המספר המוחלט של מולקולות המועברות ל- BSLBs היא שיטה חזקה יותר, שכן הדבר כרוך בכיול MESF עם מדידת מולקולות כנקודת הקצה והשוואה טובה יותר של ניסויים עצמאיים. Tmax% מציע נורמליזציה דומה על פני ניסויים עצמאיים והוא שימושי במיוחד בעת שימוש FCM פוליכרומטי עבור סמנים תאיים, כגון perforin ו granzymes, או עבור סמנים שעבורם אין תקן MESF זמין. Tmax% הוא פשוט אחוז האות בכל תנאי נתון למצב עם ההעברה הגבוהה ביותר בתנאי הבקרה (למשל, פקדי רכב / לא מטופלים עבור מחקרי סמים, RNAs מדריך בקרה עבור ספריות CRISPR / Cas9). יתר על כן, Tmax% יכול לשמש הן עבור cMFIs והן עבור מספר מוחלט של מולקולות והיה שימושי במיוחד עבור השוואות זה לצד זה של ההשפעות של מחיקות גנים על הפלט הסינפטי של תאי T. זה האחרון ניכר כאשר עריכת גנים מובילה לשונות גבוהה בטווח הדינמי של ביטוי קולטן החיסון בקרב תורמים וניסויים עצמאיים, אשר עשויים להשפיע על מדידות מוחלטות ו- NST%.

BSLBs הקלו על לכידה ואפיון של הפלט הסינפטי של סוגי תאי T שונים, שאחרת קשה לבודד אותם עקב ההפנמה המהירה שלהם על ידי APCs2. היציבות הפיזית של BSLBs מספקת גם פלטפורמה למיון תאים המופעלים בפלואורסצנטיות של BSLBs שנסקרו על ידי תאי T, ובכך מאפשרת אפיון ביוכימי של תכשירי חלקיקים טהורים ביותר על ידי ספקטרומטריית מסה וטכנולוגיות ריצוף חומצות גרעין. זה האחרון מאפשר את האפיון המפורט של שליחים בין-תאיים לשפוך על ידי תאי T תחת מגוון רחב של תנאים ניסיוניים. ניתן לענות על שאלות שונות, כולל כיצד שליחים חלקיקיים אלה משתנים בין סוגי תאי T ומצבי הפעלה שונים, כיצד קולטני אנטיגן קנוניים ולא קנוניים (כלומר, קולטני אנטיגן כימריים), וכיצד אותות ממברנה אגוניסטיים ואנטגוניסטיים משפיעים על הרכב החלקיקים. אנו מפתחים כעת טכנולוגיה זו בהמשך לאפיון הכמותי של ציטוקינים המופרשים בסינפסה החיסונית של תאי T מגורים. זה האחרון דורש מחקר זהיר של שילובים של קולטני ציטוקינים רקומביננטיים ונוגדנים, מתן לכידה יעילה של interleukins, אינטרפרונים, וכימותרפיה שהופקדו על BSLBs לאחר הפעלת תא T. BSLBs ניתן להתאים כדי מודל הרכב פני השטח של APCs אחרים חשודים לעורר שחרור tSV על ידי תאי T, כגון תאי מערכת החיסון סטרומה ומולדת. BSLBs ניתן גם להתאים כדי לסנן תרכובות פרמקולוגיות חדשות המבקשות אפנון חיובי ושלילי של מכונות הפרשת exocytic ו- tSV לטיפול בסרטן ופתולוגיות אחרות. לבסוף, BSLBs יכול לשמש גם כדי לגלות דטרמיננטים virulence ויסות תפקוד תאי T במחלות זיהומיות20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו ולקהילת מכון קנדי לראומטולוגיה על דיונים מדעיים קונסטרוקטיביים, במיוחד מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שלנו, ג'ונתן וובר. עבודה זו מומנה על ידי מלגת המחקר הראשית של Wellcome Trust 100262Z/12/Z, המענק המתקדם של ERC (SYNECT AdG 670930), וקרן קנדי למחקר ראומטולוגיה (KTRR) (כל השלושה ל- MLD). PFCD נתמך על ידי EMBO ארוך טווח מלגה (ALTF 1420-2015, בשיתוף עם הנציבות האירופית (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ומארי Sklodowska-Curie פעולות) ומלגת אוקספורד-בריסטול מאיירס סקוויב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 182
הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter