Summary
여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.
Abstract
항원 제시 세포(APC)는 물리적 접촉에 종사하는 T 세포에 3개의 활성화 신호를 제시한다: 1) 항원, 2) 비용 절임/코어프레스, 및 3) 수용성 사이토카인. T 세포는 활성화에 응하여 이펙터 입자의 2종류를 방출합니다: 세포간 메신저와 중화 세포 독성을 각각 전송하는 트랜스 시냅스 소포(tSV) 및 수근 분자 공격 입자. 이러한 엔터티는 T 셀과의 물리적 접촉에 종사하는 APC에 의해 빠르게 내면화되어 특성화가 어려워집니다. 이 논문은 비드 지원 지질 양층(BSLBs)을 항원 제시 세포(APC) 모방으로 제조하고 사용하여 이러한 시냅스 입자를 포착하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 세포 표면에 단백질 밀도의 절대 측정을 위한 프로토콜, 그러한 생리적 수준으로 BSLB의 재구성, T 세포에 의한 시냅스 입자 방출을 추적하기 위한 유동 세포측정 절차 등이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 개별 단백질, 복잡한 리간드 혼합물, 병원균 결정제 및 약물의 효과를 조력자 T 세포, 세포 독성 T 림프구, 규제 T 세포 및 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CART)를 포함한 T 세포의 이펙터 출력에 대한 효과를 연구하도록 조정할 수 있다.
Introduction
면역학적 시냅스(IS)는 병트라크 정보의 조절된 교환을 용이하게 하는 물리적 접촉에 종사하는 세포의 인터페이스에서 형성된 중추적인 분자 구조이다. 다른 IS는 문헌에 기술되었습니다, 증거의 성장 몸은 이 분자 허브가 세포 네트워크의 보존 된 기능임을 시사한다. B 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 T 세포를 포함한 다양한 면역 세포는 단명 한 접촉1의 조립을 통해 정보를 교환합니다. 다세포 연구는 병원성 세포 네트워크를 운전하고 알 수없는 기능을 가진 표면 단백질을 표현하는 백혈구와 기질 세포의 새로운 하위 집합에 대한 이해를 발전시키고 있습니다. 합성 APC로서, BSLB는 신호, 즉 항원 및 비용 절전/코어 프레스의 통합에서 개별 단백질의 기능적 역할에 대한 직접적인 조사를 허용하고, T 세포및 신호 4라고 하는 이펙터 입자의 결과 방출을 허용한다.
이 문서에서는 BSLB를 사용하여 모델 APC의 표면 구성을 모방하는 동안 고려해야 할 프로토콜 및 중요한 기술 포인트를 설명합니다. APC에 면역 수용체 및 기타 표면 단백질의 정량적 측정을 위한 프로토콜은 이러한 측정된 양을 포함하는 합성 APC의 재구성을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 이어서, T 세포와 BSLB를 응모하는 데 필요한 단계는 유동 세포측정법을 사용하여 트랜스 시냅스 입자 전달의 정량적 측정을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 가장 놀랍게도, BSLBs는 시냅스 ectosomes (SEs)라고 불리는 tSV의 플라즈마 막 유래 인구를 연구하는 것을 용이하게합니다. T 세포 항원 수용체 농축(TCR+) SEs는 TCR 트리거ing2에 반응하여 창고되고 BSLBs3에 의해 효율적으로 포획되며, 이는 항원 및 모델링된 멤브레인 조성물의 작용특성을 평가하기 위한 우수한 판독을 나타낸다. CD63+ 엑소좀 및 수퍼분자 공격 입자(SMAP)는 또한 자극된 T 세포에 의해 방출되고 BSLBs에 의해 포획된다. 그(것)들은 T 세포에 의하여 활성화 및 결과 엑소세포 및 lytic 과립 분비의 추가 판독으로 이용될 수 있습니다. T 세포의 상호작용극에 외세포 소포의 동원은 또한 활성화에 대한 응답으로 IL-2, IFN-γ 및 IL-10과 같은 사이토카인의 방향 방출을 용이하게 한다4,5,6,7,8. T 세포 방출 된 사이토카인은 또한 BSLBs에서 검출될 수 있더라도, 면역학적 시냅스에서 사이토카인 방출의 정량적 분석을 검증하기 위하여 더 헌신적인 연구 결과는 현재 개발되고 있습니다.
특정 멤브레인 조성이 T 세포의 시냅스 출력에 미치는 영향을 심문하려면 표적 멤브레인 성분의 생리적 밀도를 정의해야 합니다. 세포 표면 단백질의 유동 세포측정 기반 정량화는 이 프로토콜에서 필수적인 단계이며, 항체당 불소크롬의 알려진 수(F/P) 및 2) 벤치마크 비드의 사용은 측정된 평균 형광 성소 인텐션(MFIs)에서 형광 분자를 보간하는 표준 기준을 제공한다.
이러한 벤치마크 표준은 5개의 구슬 모집단으로 구성되며, 각각 임의형 광채 검출의 동적 범위에 걸쳐 있는 동등한 용해성 형광(MESFs)의 수가 증가하고 있습니다. 이러한 표준 인구는 간단한 선형 회귀에 의해 임의형형 단위를 MESF로 변환하는 것을 용이하게 하는 이산 형광 피크를 산출합니다. 결과 MESFs는 그 때 세포 당 결합된 분자의 평균 수를 계산하기 위하여 항체 F/P 값과 함께 이용됩니다 (또는 나중에 단계에서 BSLB). 검출된 분자의 평균 수에 추정된 세포 표면 영역의 응용은 분자/μm2로 생리적 밀도의 계산을 가능하게 합니다. 이러한 정량화 프로토콜은 또한 T 세포에 대한 단백질 밀도 의 측정및 동종성 T 세포 시냅스의 형성을 중재하는 막 조성물의 생화학적 재구성(즉, T-T 시냅스9)에 적응될 수 있다. 필요한 경우, 항체 결합의 valency는 분자 당 불소크롬의 알려진 숫자로 표지된 재조합 표적을 사용하여 더 추정될 수 있습니다. 이어서, 항체 결합 발렛은 결합형 형광 단백질및 정량화 항체의 수를 동시에 비교하여 동일한 BSLB 집단에 대해 계산될 수 있다(2개의 상이한 정량화 형광 및 MESF 표준을 사용).
APC 멤브레인의 재구성은 실리카 구슬1에 지원되는 지질 양층(SLBs)의 조립이 필요합니다. 상이한 인지질종을 함유하는 리포솜 스톡은 다재다능한 지질 이중층 매트릭스를 형성하기 위해 활용될 수 있으며, 상이한 결합 화학을 이용한 재조합 단백질의 고정을 가능하게 한다(리포솜의 제조는 10에서 상세하다). 관련 리간드의 생리밀도(또는 밀도)가 정의되면, 동일한 유동 세포측정 프로토콜은 표적 생리밀도로 BSLB를 코팅하는 데 필요한 재조합 단백질의 농도를 추정하도록 조정된다. 두 개의 서로 다른 앵커링 시스템을 조합하거나 별도로 사용할 수 있습니다.
첫째, Ni2+함유 인지질의 최종 12.5 mol%를 함유하는 SLB는 평방 마이크로란10 당 약 10,000개의 그의 태그 결합 부위를 제공하기에 충분하며, 생리학적 밀도가 최대 적재 용량을 초과하지 않는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 단백질로 BSLB를 장식하는 데 효과적입니다. 두 번째 로딩 시스템은 스테렙타비딘 다리를 통해 바이오티닝 방지 CD3e Fab(또는 HLA/MHC 모노머)을 적재하기 위해 비오틴 함유 인지질(mol%)을 이용합니다. 이러한 두 가지 BSLB 장식 방법의 조합은 합성 APC로 BSLBs의 유연한 테일러링을 가능하게합니다. 매우 복잡한 APC 표면 조성물의 경우, 인지질및 단백질의 몰%는 당면한 질문만큼 많은 단백질을 적재하도록 증가시킬 수 있다. 단백질의 작동 농도와 바이오타이니지의 몰%가 정의되면, BSLB는 다중 파라메트릭 유동 세포측정을 사용하여 T 세포의 시냅스 출력을 심문하기 위해 조립될 수 있다.
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Protocol
1. 정량적 유동 세포측정을 사용하여 세포 표면 단백질 밀도 측정
- EDTA(최종 2mM 농도)와 인간 AB 혈청(최종 10%)을 첨가하여 0.22 μm 필터링된 인간 유동 세포측정 버퍼(hFCB)를 멸균 인산완충식염수(PBS), pH 7.4( 표 1 참조)를 준비한다. 0.22 μm 모공 필터 유닛을 사용하여 용액을 필터링하여 혈청 불순물을 제거하고 4°C에 보관합니다.
- 실온(RT)에서 5분 동안 300 × g 에서 원심분리로 세포와 퇴적물을 회수합니다.
- PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 각 세척 단계에서PBS의 세포를 원래 부피(원심분리 전)로 재보중단하고 RT에서 5분 동안 300× g 로 회전합니다.
- 혈전계11에서 트라이판 블루 스테인드 셀 서스펜션을 계산합니다. 또는 전류 제외를 사용하여 셀을 계산합니다. 후자의 경우 CASY-TT 제조업체의 지침을 따르십시오( 재료 표 참조).
참고: CASY-TT 셀 카운터는 셀 크기 및 셀 볼륨의 백분율을 측정할 수 있습니다. - 1:1,000의 고정 가능한 염료 eFluor 780 또는 이와 유사한( 재료표 참조)를 포함하는 PBS의 부피를 107 세포/mL의 염색 농도로 재보페킹하는 데 필요한 경우를 계산합니다.
- 생존 가능성 염료-PBS 용액을 사용하여 세포를 다시 중단하고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 얼음-차가운 hFCB의 한 부피를 추가하여 생존 성 염료를 제거합니다. 4°C에서 5분 동안 300 × g 로 회전합니다.
참고 : 지금부터 콜드 체인을 끊지 않도록하십시오. - fc 수용체 차단 용액의 1:50 희석을 포함하는 hFCB로 세포를 세척 하십시오(재료 표 참조). 107 셀/mL의 최종 농도로 부피를 가져와 서 15분 동안 배양하여 효율적인 FcgR 차단을 달성하십시오.
- U-바닥 또는 V-바닥 96 -웰 플레이트의 웰 당 셀 서스펜션(즉, 106셀)의 100 μL을 분배한다. 얼음에 세포를 유지하고 빛으로부터 보호 (알루미늄 호일로 커버).
- 각 플루오로크롬-공주 항체에 대한 최적의 항체 농도를 정의하여 hFCB에서 항체 마스터 믹스를 준비하고, 가장 중요한 것은 표면 단백질 밀도를 결정하는 데 사용되는 항체에 대해서이다. 예를 들어 편도선 세포 집단에 대한 ICAM-1 발현의 정량화는, 도 1에 도시된 바와 같이, 항체당 알려진 AF647 형광크롬을 함유한 항체(즉, 10 μg/mL)를 함유한 항체(즉, 10 μg/mL)를 항체당 항체의 포화 농도와 함께 안티 CD4, 안티 CD19 및 항 CXCR5의 희석을 포함하는 혼합을 준비한다.
- 추가 컨트롤로서 관련 항체 동형 컨트롤을 포함하는 항체 마스터 믹스를 준비합니다(배경 뺄셈을 위해 동일한 플루오로크롬으로 컨쥬게이징된 대조군과 동일한 유효 농도 )를 준비하십시오.
참고: 위의 예에서, 이러한 동종형 제어는 세포에 대한 진정한 ICAM-1 신호로부터 배경 형광을 빼는 데 사용된다. - 조직 내의 낮은 주파수에서 존재하는 세포 하위 집합에 단백질 밀도를 정량화할 때, 관심있는 마커를 제외한 모든 염색 항체를 포함하는 형광 마이너스 1 (FMO) 제어를 준비합니다 ( 12에서 자세한 세부 사항 참조).
- 세포를 포함하는 96웰 플레이트를 4°C에서 5 분 동안 5 분 동안 5분 동안 ×, 수퍼네티트를 버리고, 정량화 항체 마스터 믹스 또는 동종타입 항체 마스터 믹스의 50 μL로 세포를 재연한다.
- 플레이트 셰이커를 사용하여 4°C 및 400 rpm에서 적어도 30분 동안 세포를 배양한다. 플레이트를 빛으로부터 보호합니다(알루미늄 호일로 덮습니다).
- hFCB및 원심분리기를 사용하여 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 세 번 세척합니다.
- PBS의 200 μL을 사용하여 세포 펠릿을 다시 중단합니다 (즉, 5 × 106 세포 /mL의 최종 농도).
- 취득의 경우:
- 표준 BD FACS 로더를 사용하는 경우 샘플을 5mL 폴리스티렌 라운드 하단 튜브로 전송합니다( 재료 표 참조).
- 높은 처리량 샘플러(HTS,플레이트 판독기라고도 함)를 사용하는 경우 즉시 1.19단계로 진행합니다.
- MESF 표준에 대한 데이터 수집을 진행하기 전에 정량화 채널의 형광 강도 최대 및 최소 한도를 확인합니다.
- 보상하기 전에 MESF 표준에 대한 데이터를 획득하여 가장 어둡고 밝은 모집단이 선형 측정 범위에 속하도록 합니다.
- 보상 샘플을 획득합니다. 정량화 채널의 광증 튜브(PMT) 전압 값을 변경하지 않고 유지하여 동적 감지 범위를 유지합니다. 보정 매트릭스를 계산하기 전에 다른 채널의 PMT 전압에서 약간의 조정을 수행합니다.
- 보상을 계산하고 적용합니다.
- 각 정량화 채널에 대해 최소 2× 104 개의 총 MESF 구슬을 획득하고 저장합니다.
- 측면 및 전방 광 산란 영역(그림 1A (i)에 도시된 대로 SSC-A 및 FSC-A에 기초하여 단일 셀의 인구를 선택하고, 그 다음으로 시간 연속체(그림 1A (ii)) 및 FSC 및 SSC 모두에서 비행 시간(W)의 낮은 선택과 비행 시간(W)을 선택합니다. FSC-W/FSC-H, 그림 1A (iii) 및 (iv)에 도시된 바와 같이 SSC-W/SSC-H 게이팅이 각각 뒤따릅니다. 비례 FSC-A와 FSC-H 분포가 포함된 이벤트가 포함된 최종 단일 이벤트 게이트를 정의합니다(그림 1A (v).
- 제어 샘플(Isotype 표지 및 FMO 컨트롤)을 획득합니다.
- 최소 10,000개의 표적 세포가 획득될 때까지 샘플을 획득하고 기록합니다.
참고: 평균 분자 밀도의 강력한 결정은 독립적 인 실험을 통해 여러 기증자의 분석을 필요로한다. 이것은 감소된 주파수에서 찾아낸 또는 희소한 생물학 물질에서 파생된 세포 서브세트를 분석할 때 중요합니다 (예를 들면, 인간 적인 조직 생검에서). - FACS 세정 용액으로 5분 동안 시토미터를 세척한 다음 5분 동안 초순수수를 씻어내고 기기를 종료합니다. HTS를 사용하는 경우 탭 HTS 및 클린 플레이트 프로그램 아래의 옵션을 따르십시오.
참고: 시료 간 이월을 줄이려면 튜브 나 우물 사이의 세포계를 자동으로 세척하는 앉아서 (샘플러) 플러시 또는 높은 처리량 샘플러 세척 옵션을 활성화하십시오. 인수를 시작하기 전에 고유량으로 10분 동안 초순수수를 실행하여 세포계 샘플 라인에서 세척되지 않은 생물학적 오염물질을 제거합니다. - 유동 세포측정 표준(FCS) 파일을 내보냅니다.
2. MESF 과고평균(또는 중앙값) 형광 강도(MFI) 회귀 분석
- 흐름 세포 분석 분석 소프트웨어를 열고 실험 FCS 파일을 로드합니다. 그림 1A (i)에 도시된 바와 같이 측면 및 전방 광 산란 영역(SSC-A 대 FSC-A)을 기반으로 구슬의 모집단을 선택합니다.
- 1.24 단계에서 표시된 대로 시간이 지남에 따라 단일 이벤트의 분포를 확인하여 데이터 품질을 제어합니다.
참고: 거품은 시간이 지남에 따라 이벤트 분포에 간격을 둡니다. 이는 일반적으로 HTS를 사용하여 인수 시작 부분에 나타납니다. 광학 수차로 인한 측정 오차가 추가됨에 따라 획득 시간의 간격을 두는 이벤트를 선택하지 마십시오. - 단일 이벤트에 집중합니다.
- 셀
- 먼저 SSC-A 및 FSC-A 분포(그림 1A(i )를 기반으로 단일 셀을 식별한 다음 순차 게이트 FSC-W/FSC-H(singlets-1, 그림 1A 패널(iii) 및 SSC-W/SSC-H(singlets-2; 그림 1A 패널(iv). 비례 FSC-A 및 FSC-H(그림 1A, 패널(v)가 있는 이벤트를 선택하여 추가 싱글-3 게이트를 정의합니다. 마지막으로, 살아있는 세포를 고정 가능한 생존성 염료에 대한 부정적인 것으로 식별합니다.
- MESF 구슬
- 2.3.1.1 단계(그림 1B, 패널(i)에서 (v)로 동일한 싱글-1을 따라 형광 강도 수준에 따라 각 MESF 인구(공백, 1, 2, 3 및 4)를 식별합니다( 그림 1B, 패널(vi)참조).
- 셀
- MESF 분수블 블랭크 및 1~4의 MFI를 추출합니다.
- 각 분획에서 빈 비드 모집단의 MFI를 빼서 MESF 분획 1에서 4까지 수정된 MFI(cMFI) 값을 생성합니다.
- 공급업체에서 제공하는 cMF와 MESF 값 간의 관계에 가장 적합한 선을 계산합니다(독립 변수, 0과 동일한 분수 공백).
- cMFI를 통해 MESF의 선형 회귀의 경사(아래 방정식에서 b )를 추출합니다(도 1B 패널(viii)은 y = +bx; = 0)이 있는 회귀를 나타낸다.
- 관심 집단으로부터의 중앙값(이중형광 분포의 경우) 또는 평균(정상 또는 로그-정상 형광 분포의 경우) 형광 강도를 추출한다( 도 1A 패널(vii)의 TFH 및 B 세포).
- 2.5-2.7 단계와 마찬가지로 동형 표지 제어 셀에서 MFI 값을 추출합니다.
- 동형 대조군의 F/P가 정량화 항체와 동일한 경우, 이소타입 표지된 세포로부터 MF를 빼서 스테인드 셀의 MF를 수정한다.
- 등류형의 F/P가 정량화 항체와 차이가 있는 경우, 동형 표지 세포의 MIF를 2.7단계에서 계산한 경사로 분할하여 동종형으로부터 MESF를 추출한다. 결합된 정량화 항체를 추정하기 전에 정량화 MESF에서 이소형 MESF를 빼는다.
- MESF를 정량화 항체의 F/P로 나누어 세포당 결합된 분자의 수를 추정한다(Molec. 도 1C의 흐름 다이어그램에 도시된 셀).
- 결합된 분자의 수를 추정된 세포 표면적(CSA(μm2)과 나누어 단백질의 밀도를 molec./μm2 (도 1C)로 추출한다. 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하십시오.
3. BSLB를 코팅하는 단백질의 교정에 사용하는 기능성 인지질 종
- 지원되는 지질 양성재를 형성하는 지질 매트릭스의 주요 성분으로서 0.4 mM DOPC (1,2-디엘리틸-sn-글리세로-3-인포콜린)를 사용한다. 이 DOPC 솔루션에서 다른 모든 지질 종을 희석시다.
- ATTO 390, 488, 또는 565(재료표 참조)를 포함하여 염료에 컨쥬드된 0.4m DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-인포에탄올라민)의 0.2~1몰%를 사용하여 내장된 인플루오를 사용한 BSLB를 생성한다.
참고: BSLBs의 본질적인 형광은 시냅스 전달 실험에서 단일 BSLB 및 단일 세포의 식별을 용이하게 합니다. - 0.4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-디오레오틸-sn-glycero-3-[(N-(5-아미노-1-카바티펜틸) 이미노아제산) succinyl]의 12.5 몰%를 사용하여 태그된 단백질을 고정시하십시오. DGS-NTA(Ni)의 몰%를 일정하게 유지하고 100nM부터 가장 높은 농도로 시작하여 그의 태그가 붙은 단백질의 2배 적정을 수행합니다. 절대 정량화에 대한 부정적인 대조군으로 단백질없이 하나의 상태를 둡니다.
참고: ICAM-1과 같은 액세서리 신호 및 접착 분자는 DGS-NTA(Ni)에 대한 단백질의 선호도를 높이기 위해 12-His 태그로 설계되었습니다. - 비오티닐 캡 PE(1,2-디올리틸-sn-글리세로-3-인포에타놀라민-N-(캡 바이오티클)를 사용하여 비오틴-스트렙타비딘-비오틴 브리지를 통해 바이오티니고드 단백질을 고정하십시오. 0.4 mM Biotinyl Cap PE의 5배 직렬 적정을 사용하여 10 mol%에서 0mol% 사이를 커버합니다(음의 제어로). 교정 실험과 시냅스 전달 실험을 위한 합성 APC의 재구성 모두에서 스트렙타비딘 및 바이오티니저 단백질의 농도(200nM)를 일정하게 유지한다.
참고: 지질 매트릭스에서 바이오티닐 캡 PE의 최종 몰%를 통해 생물신생 단백질의 경험적 밀도의 회귀 분석은 (또한 DGS-NTA(Ni 포함) 그의 태그된 단백질을 고정하기 위해) 항원의 표적 밀도를 재구성하는 데 사용되는 몰%를 정의합니다.
4. 1 % 세럼 알부민을 포함하는 보충 HEPES 완충식식염수의 준비
참고: BSLBs(표 1)의 세척 및 단백질 적재 단계에서 1% 인간 혈청 알부민(HBS/HSA) 또는 1% 소 혈청 알부민(HBS/BSA)을 함유한 HEPES 버퍼링 식염수를 보충한다. 10x HBS 스톡 솔루션과 작업 버퍼를 가능한 한 신선하게 준비합니다. 냉장 보관하고 1개월 이내에 사용하십시오. BSA는 HSA에 대한 저렴한 대안이지만 Ni-chelating 지질13 의 효율적인 막힘을 제공하며 높은 처리량 실험에 권장됩니다.
- 200mHEPES, 7m Na2HPO4, 1400mM NaCl, 50mM KCl, 60mM, 10mM CaCl2, 20mM MgCl2를 함유한 보충 HBS의 10배 스톡 버퍼 솔루션을 준비한다.
참고 : MgCl2 용해력은 매우 외설적이고 화상 위험입니다. 이 소금을 천천히 그리고 대량의 용매에 넣습니다. 이러한 염의 농축 솔루션(즉, 1M)을 준비하는 것을 피하여 시간이 지남에 따라 침전되는 경향이 있어 작업 버퍼에 정확한 추가를 어렵게 만듭니다. - 0.22 μm 필터 장치를 사용하여 10x 용액을 필터링하고 4 °C에서 멸균하십시오.
- HBS/has의 500mL의 경우, 보충된 10x HBS 용액의 50mL를 취하고, 필요한 경우 pH를 7.4로 조정하고, 초순수수로 483.4mL로 부피를 구성한다.
- HBS의 483.4mL, pH 7.4에 30% HSA 솔루션의 16.6mL을 추가합니다.
- HBS/BSA 500mL의 경우 HBS에서 BSA 5g을 용해하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 눈에 보이는 단백질 결정이나 덩어리가 없을 때까지 병을 주기적으로 반전시켜 RT에서 부드럽게 섞습니다.
- 0.22 μm 필터 유닛을 사용하여 4.5 단계에서 생성된 용액을 필터링하고 (재료 표 참조) 4°C에 저장합니다.
5. BSLB의 단백질 밀도 교정
- 5.00 ±0.05 μm 직경비기능 실리카 구슬을 복용하기 전에 스톡 솔루션을 잘 혼합하고 플라스크 바닥에 퇴적된 큰 구슬 덩어리를 재연합니다.
참고: 실리카 구슬은 퇴적물을 빠르게 하는 경향이 있어 오류 계산으로 이어질 수 있습니다. P1000 마이크로파이프의 최대 부피의 절반을 위아래로 파이프팅하여 적극적으로 섞는다. - PBS의 1,000 μL에서 비드 용액 1μL을 희석하고, 혈류계 챔버를 사용하여 구슬을 계산하고, mL당 농도를 계산합니다.
참고: 실리카 구슬을 시각화하기 위해 트라이판 블루 염색이 필요하지 않습니다. - 적점당 5× 105 개의 최종 BSLB에 필요한 실리카 구슬의 양을 계산합니다.
- 실리카 구슬의 필요한 부피를 멸균 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송합니다.
- 실리카 구슬을 멸균 PBS 1mL로 세 번 세척하고, RT(고정 rpm)의 벤치탑 미세센심분리기에서 15s의 구슬을 원심분리합니다.
참고: 세척 용액을 제거할 때 비드 펠릿을 방해하지 마십시오. 작은 버퍼 컬럼은 PBS에도 리포솜 마스터 믹스를 구성하는 리포솜의 확산에 영향을 미치지 않습니다. - 세척된 실리카 구슬에 BSLB를 조립하기 위해 리포솜 마스터 믹스의 3부피를 준비한다(예: 실리카 구슬의 초기 총 부피가 20 μL인 경우 리포솜 마스터 믹스의 최소 60μL을 준비한다).
- 바이오티닐 캡 PE 몰% 적정용
- 바이오티닐 캡 PE의 5배 희석을 포함하는 지질 마스터 믹스를 준비한다.
- 100% DOPC 매트릭스에서 0.4 mM 바이오티클 캡 PE MOL%를 희석시하십시오.
- 각 바이오티닐 캡 PE mol% 타이티네이션 포인트를 0.4mM 25% DGS-NTA(Ni)의 용액과 1:1(vol:vol) 비율로 혼합하여 니 함유 지질의 최종 12.5mol%가 모든 적정에 존재한다.
참고: Ni 함유 지질의 12.5 mol% (vol:vol%)는 BSLBs의 혼합 지질 조성물을 나타내며, 이 에 대한 그의 태그된 단백질은 병렬 교정으로 테스트될 수 있습니다. 예를 들어, 모든 리포솜 재고가 동일한 어금니 농도로 제조되기 때문에 최종 리포솜 믹스의 200 μL에서 목표 몰% 혼합물에 도달하기 위해 Ni 함유 DGS-NTA의 25 mol%의 100 μL을 100 μL과 100 μL의 DOPC100 μL을 혼합하기만 하면 됩니다.
- 5 × 105 개의 실리카 구슬을 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고, 이에 따라 바이오티닐 캡 PE%의 적정포인트 1개를 튜브당 조립한다.
- 세정제 실리카 구슬에 바이오티닐 캡 PE Mol% 타이티션 마스터 믹스를 넣고 총 부피의 절반을 위아래로 피펫하여 부드럽게 섞습니다. 지질 이중층을 과도하게 파괴하는 거품을 형성하지 마십시오.
- 현재 형성되는 BSLB를 함유하는 튜브에 Argon(또는 질소) 가스를 추가하여 공기를 대체하고 혼합 시 산화로부터 지질을 보호합니다.
- 멸균 기술을 사용하여 보관하기 전에 0.4 mM 지질 주식에 아르곤을 추가하고 조작합니다.
참고: 작은 튜브를 아르곤/질소 가스 실린더에 연결합니다. 튜브에 가스를 추가하기 전에 가스 실린더 레귤레이터를 조정하여 압력이 2 psi 보다 높게 설정되지 않도록 합니다. 멸균 파이펫 팁을 콘센트 튜브에 연결하여 리포솜 스톡 내부의 가스 스트림을 5s로 지시하고 뚜껑을 빠르게 닫습니다. 지질 주식의 경우, 4 °C에 저장하기 전에 파라핀 필름으로 튜브의 뚜껑을 밀봉하십시오. - BSLB를 수직, 가변 각 실험실 믹서로 이동하고( 재료의 표 참조) 10 rpm의 궤도 혼합을 사용하여 RT에서 30 분 동안 혼합하십시오.
참고: 이 단계는 지원되는 지질 이중층의 형성 중에 구슬의 침전을 방지할 것입니다. - 벤치탑 미니센트심분리기에서 RT에서 15s원심분리를 한 다음 HBS/HSA(BSA)의 1mL로 세 번 세척하여 과도한 리포솜을 제거합니다.
- NTA 부위를 포화시키기 위해 NiSO4 의 100 μM을 함유한 5% 카제인 또는 5% BSA의 1mL 또는 5% BSA를 추가하여 형성된 BSLB를 차단하고, 200nM 스트렙타비딘은 BSLB의 모든 비오틴 앵커링 부위를 균일하게 코팅한다. 총 볼륨의 절반을 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 섞고 RT와 10 rpm에서 20분 이상 수직 믹서에 인큐베이션합니다.
- 벤치탑 미니원심분리기에서 RT에서 15s원심분리를 한 다음 HBS/HSA(BSA) 버퍼 1mL로 세 번 세척하여 BSL을 스핀다운합니다.
참고: BSLB를 덮는 소량의 세척 버퍼로 수직으로 세척된 구슬을 수직으로 유지합니다.
- 바이오티닐 캡 PE의 5배 희석을 포함하는 지질 마스터 믹스를 준비한다.
- DGS-(Ni) NTA 함유 BSLB의 12.5 mol%에 대한 태그가 지정된 단백질의 적정을 위해
- DGS-NTA(Ni)의 최종 12.5 몰%를 포함하는 리포솜 마스터 믹스 3권 준비.
- 리포솜 마스터 믹스를 사용하여 세척된 실리카 구슬을 재중단하고 총 볼륨의 절반을 위아래로 피펫하여 부드럽게 섞습니다. 과도한 손상지질 이중 층을 형성하지 마십시오.
- 현재 형성되는 BSLB를 함유하는 튜브에 Argon(또는 질소) 가스를 추가하여 공기를 대체하고 혼합 시 산화로부터 지질을 보호합니다.
- 멸균 기술을 사용하여 보관하기 전에 0.4 mM 지질 주식에 아르곤을 추가하고 조작합니다.
- BSLB를 수직 믹서로 이동하고 10 rpm에서 궤도 혼합을 사용하여 RT에서 30 분 동안 혼합하십시오.
- 벤치탑 미니센트심분리기에서 RT에서 15s원심분리를 한 다음 HBS/HSA(BSA)의 1mL로 세 번 세척하여 과도한 리포솜을 제거합니다.
- BSLB에 NTA 사이트를 포화시키기 위해 NiSO4의 100 μM을 포함하는 5% 카제인(또는 5% BSA)의 1mL(또는 5% BSA)를 추가하여 형성된 BSLB를 차단합니다.
- HBS/HSA(BSA)를 사용하여 3회 세척하여 과도한 차단 액액을 제거합니다.
- 새로운 U-bottom 96-well 플레이트에서 단백질의 2배 연속 희석을 준비합니다.
- HBS/HSA(BSA) 버퍼의 총 부피 200μL에 대한 관심 있는 단백질에 대해 100nM의 시작 농도를 준비하고, 첫 번째 열에서 이 솔루션의 100 μL을 분배하고, 나머지 100μL은 HBS/HSA(BSA) 버퍼의 100μL를 포함하는 열 위에 100 μL을 분배한다.
- 열 #2에서 열 #3로 100 μL을 연속적으로 전송하고 필요에 따라 반복하여 모든 적정 점을 덮습니다. 이 정량화에 대한 빈 참조로 사용되기 때문에, 단백질없이 시리즈의 마지막 열을 둡니다.
- 5 × 105 BSLB가 HBS /HSA (BSA) 버퍼의 100 μL에 포함되는 것을 같은 부피로 준비 된 BSLB를 다시 중단합니다.
- BSLB 서스펜션의 100 μL을 두 번째 U-바닥 96웰 플레이트의 우물로 옮기고, 각 음료는 5× 105 BSLB를 받는다.
- 300 × g 와 RT에서 2 분 동안 BSLB를 포함하는 두 번째 플레이트를 스핀 다운하고 상체를 폐기하십시오.
- 단백질 적정판에서 퇴적BSL을 함유하는 플레이트로 100μL 부피를 옮기십시오. 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오.
- HBS/HSA(BSA) 버퍼로 플레이트를 300× g 의 퇴적단계를 사용하여 RT에서 2분 동안 플레이트를 세 번 세척합니다.
- 교정에 사용되는 재조합 단백질이 플루오로크롬에 직접 수렴되고 F/P 값을 알고 있는 경우, 5.8.20단계로 진행한다.
- 교정에 사용되는 재조합 단백질이 불소 크롬에 라벨이 없거나 공주되거나 MESF 비드 표준이 없는 경우, 알려진 F/P 값을 가진 알렉사 플루어 488 또는 647-공주 항체를 사용하여 단백질 코팅 BSLB를 염색하십시오.
- 정량화 항체의 포화 농도와 얼룩.
참고: 대상 식 수준에 따라 이러한 범위는 5에서 10 μg/mL 사이입니다. - 플레이트 셰이커를 사용하여 RT에서 30 분 동안 얼룩과 1,000 rpm. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하십시오.
- HBS/HSA(BSA) 버퍼로 두 번 세척하고 PBS로 한 번 300 × g 의 퇴적단계를 사용하여 RT에서 2분 동안 세척합니다.
참고: PBS, pH 7.4를 사용하여 인수 전에 세척된 BSLB를 다시 일시 중단합니다. 이 높은 처리량 샘플러와 샘플의 자동 혼합 동안 거품의 형성으로 이어질 으로, 단백질을 포함하는 버퍼를 사용하지 마십시오. - MESF 표준을 획득하여 도 1B (vii)에 도시된 바와 같이 정량화 검출기(channel)에 대한 선형 검출 범위에 가장 밝은 피크가 남아 있는지 확인합니다.
- 수동으로 또는 HTS를 사용하여 샘플을 획득합니다. 후자를 사용하는 경우 PBS의 100 μL에서 BSL을 재연하고 2.5와 3.0 μL/s 사이의 유량을 사용하여 80 μL을 획득하고, 100 μL의 혼합 부피 (또는 재서스펜션 볼륨이 적을 경우 총 부피의 50%), 150 μL/s의 혼합 속도 및 5개의 혼합을 사용하여 BSL을 분산시킵니다.
- FCS 파일을 내보냅니다.
- 두 배 또는 세 쌍둥이가 결정에 오류를 유발하기 때문에 분석(그림 2A)에 대한 단일 이벤트에 중점을 둡니다. 프로토콜 단계 1.2.3에 표시된 단일 이벤트의 중첩 된 식별을 사용합니다.
- 각 MESF 분획(1-4)의 MFI를 측정하고 빈 구슬의 MFI를 빼서 수정된 MFI(cMFI)를 추출합니다.
- MESF 표준에 대해 계산된 cMFI를 통해 MESF의 경사(b)를 추출하기 위해 선형 회귀 해석을 수행하여 5.33 단계에서 사용할 것이다.
- 각 적정 점의 MFI를 추출하고 cMFI를 얻기 위해 단백질없이 구슬의 MFI를 뺍니다.
- cMF를 5.31 단계에서 계산된 경사로 나누어 각 적정점에 대해 BSLB에 바인딩된 MESF를 추출합니다.
- MESF를 정량화 항체의 F/P 값으로 BSLB에 결합하여 BSLB당 결합된 분자의 평균 수를 추출하도록 분할한다.
- BSLBs(5.00 ± 0.05 μm)의 직경을 사용하여, 적정점당 단백질(molec./μm2)의 최종 밀도를 계산하기 위해 비드 표면적(SA= 4pr2)을 추출한다.
- 단백질 밀도에 비해 단백질 농도의 새로운 회귀 분석을 수행하여 가장 적합한 선의 경사(b)를 계산합니다.
참고: DGS-NTA(Ni)의 12.5 mol%의 농도는 T 세포의 비특이적 활성화를 유도하거나 SLB의 측면 이동성에 영향을 미치지 않고 약 10,000몰릭의 최대 고정 용량을 부여합니다.
6. T 세포와 BSLB 사이의 시냅스 전달 실험 수행
- 시냅스 전송 실험을 실행하기 전에
- 비형광 BSLB, 형광 지질, 스테인드 셀(또는 보정 구슬 참조), 단일 색 염색 세포(또는 보상 구슬)가 있는 비형성 BSLB를 획득하여 계측기의 형광 스펙트럼 상호 작용을 식별합니다. 다색패널을 재설계하고, 감도를 높이고, 중요한 검출기의 측정 오차를 줄이기 위해 유출이 많은 검출기에 초점을 맞춥니다( 14 참조).
- 검출 항체를 적시하여 최적의 농도를 찾아네거런스 검출을 손상시키지 않으면서 양성 이벤트 검출을 가능하게 합니다.
참고: F/P 값과 밝기가 배치마다 다르기 때문에 항체 로트 변경이 있을 때마다 이 단계를 반복합니다. - 선택 사항: 다양한 전압 범위(즉, 전압 보행)에서 샘플을 획득하여 PMT 전압을 최적화하여 노이즈에 대한 최적의 신호로 이어지는 PMT를 찾습니다(즉, 가장 밝은 모집단의 신호가 선형 범위에 남아 있는지 확인).
- BSLB로의 T셀 출력 전달 측정
- 가열 불활성 태아 소 혈청 (FBS), 100 μM 비 필수 아미노산, 10mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루바테, 100 U/ml의 페니실린, 100 U/ml의 페니핀을 함유한 보충 RPMI 1640(본명 R10 배지)을 준비합니다. R10 배지를 사용하여 T 셀을 배양하고 확장합니다.
- 1일째에는 말초 혈액 또는 백혈감소 시스템(LRS) 챔버에서 T 세포를 분리합니다. 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 농축을 위해 면역 밀도 세포 격리 및 분리 키트(재료 표 참조)를 사용합니다.
- 1.5와 2.0 × 106 세포/mL 사이의 최종 농도로 세포를 시드하여 6웰 플레이트를 사용하여 우물당 총 5mL 이하의 플레이트를 사용하십시오.
- 인간 T 세포 활성화(anti-CD3/anti-CD28) 자기 비드( 재료표 참조)를 사용하여 T 세포를 활성화하고 세포 증식 및 생존을 지원하기 위해 재조합 인간 IL-2의 100 IU를 추가합니다.
- 3일째에는 자기 열을 사용하여 자기 구슬활성화를 제거합니다(재료표 참조). 마그네틱 비드가 추가 세척 단계를 위해 세포를 복구하기 전에 튜브 측면에 부착된 상태로 유지되도록 합니다.
- 신선한 R10 배지 5mL로 다시 한 번 마그네틱 구슬을 씻고 잘 섞어서 자석에 다시 넣습니다. 이 볼륨을 복구하고 6.2.5 단계에서 복구 된 세포와 혼합하십시오.
- IL-2의 100 U/mL을 포함하는 신선한 R10에서 1.5-2 × 106 세포/mL로 세포를 재중단합니다. 48h 이후의 배지를 보충하여 IL-2의 마지막 첨가가 실험 일 전 48시간(문화의 7일에서 14일)인지 확인합니다.
- 시냅스 이송 실험 당일, 10% FBS, 100μM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루바테, 100 U/ml의 음실, 100 U/ml의 페놀 무적 RPMI 1640 배지를 보충하여 시냅틱 트랜스퍼 아세이매(표 1 참조)를 준비한다. 재조합 인간 IL-2를 포함하지 마십시오.
- 트라이판 블루 염색 또는 전류 제외를 사용하여 세포를 계산하고 배지에서 2.5 × 106 셀/mL의 최종 농도로 다시 중단합니다. 과도한 세포 사멸이 관찰되는 경우 (>10%), 다당류와 나트륨 다이아트리조아테의 혼합물을 사용하여 죽어 죽는 세포를 제거하십시오 ( 재료의 표 참조) 다음과 같이:
- 다당류-나트륨 디아트리조에이트 용액의 13mL 위에 세포 배양층 15mL.
- RT에서 20분 동안 1,250 × g 의 원심분리기는 최소 가속 및 가속을 합니다. 배지와 다당류-나트륨 디아트리조아테 용액 사이의 인터페이스에서 세포 층(cloud)을 수집합니다.
- 미리 따뜻해진 시냅스 전송 분석 매체로 적어도 두 번 세포를 세척하십시오(6.2.7 단계에서 준비).
- 시냅틱 전송 분석 매체를 사용하여 세포를 2.5 × 106/mL의 최종 농도로 카운트 및 재일시 중지합니다. BSLB와 이 세포 현탁액의 공동 배양 100 μL (단계 6.2.15 참조).
- 실험에 필요한 BSLB 수를 계산합니다. 테스트할 모든 다른 단백질 마스터 믹스 및 항원 적정(생체신생 HLA/MHC-펩타이드 모노머 또는 모노바이오티니화 항 CD3θ Fab)을 고려하십시오.
- 이번에는 프로토콜 섹션 5에서 동일한 단계를 수행하여 BSLB를 조립하지만, 복잡한 APC 멤브레인을 재구성하는 데 필요한 단백질과 지질의 모든 적정을 결합합니다(도 3A). 동일한 vol을 유지: 초기 실리카 구슬 볼륨과 교정 중에 사용되는 단백질 혼합의 부피, BSLB의 하중에 사용되는 시간과 온도 사이의 vol 관계. 예를 들어, 실리카 비드/웰 및 100 μL/단백질 혼합의 0.5 μL이 초기 교정에 사용된 경우, 5:1,000 vol:vol 비율을 유지하여 BSLB를 T 세포와 결합할 수 있도록 준비한다.
- BSLB가 관심있는 단백질 혼합으로 로드되면, HBS / HSA (BSA)와 함께 두 번 BSLB를 세척하여 과도한 언바운드 단백질을 제거하십시오. 각 세척 단계에서 RT에서 2 분 동안 300 × g 의 퇴적 속도를 사용하고 슈퍼 나티츠를 폐기하십시오.
- 200 μL에서 우물 당 5 × 105 BSL을 다시 중단합니다.
- 우물당 100 μL을 새로운 U-bottom 96-well 플레이트로 전송하여 복제하여 웰당 최종 BSLB의 최종 양이 2.5 × 105입니다.
- BSL을 300 × g 에서 2분 × 및 RT로 스핀다운하고 상체를 폐기하십시오.
- T 셀 현탁액의 100 μL을 사용하여 BSLB를 다시 일시 중단; 거품의 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합.
- 37°C에서 90분 동안 동문화를 배양한다.
참고: 또는, 세포와 구슬은 공동 문화에 대한 페놀-레드 프리 RPMI 대신 HBS/HSA(BSA) 버퍼에서 재장축될 수 있다. 이 경우, 이 가스가 중탄산염이 없는 경우 완충제를 빠르게 산화하기 때문에 비CO2 인큐베이터에서 인큐베이션을 수행해야 합니다. - BSLB-T 세포 균주들을 먼저 RT에서 세포를 최소 15분 동안 배양하여 식힙니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 50 ×0 g 및 RT에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 차단을 위해 RT 2% BSA-PBS(Ca2+ 및 Mg2+-free)의 세포를 다시 중단합니다. 세포를 얼음 위에 45분 동안 놓습니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 세포를 배양하는 동안, 추가 차단을 제공하는 염색 버퍼로 PBS에서 얼음 감기 0.22 μm 필터링 2 % BSA를 사용하여 항체 마스터 믹스를 준비합니다.
참고: 화려한 바이올렛 염료에 컨쥬게이트된 항체의 일부 배치는 BSLBs에 특이하게 결합하는 경향이 있다. 5% BSA-PBS로 차단하면 이 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다. 지금부터 콜드 체인을 끊지 않도록 하십시오. - 5분 및 4°C의 500g × g에서 코컬쳐를 회전시다. 수퍼네이너티를 폐기하기 전에 백라이트를 사용하여 96웰 플레이트의 바닥을 검사하여 펠릿이 있는지 간략하게 확인하십시오.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 최적화된 항체 농도를 포함하는 염색 마스터 믹스에서 세포를 재연한다.
참고: 필터가 없는 파이펫 팁을 사용하여 얼룩진 볼륨 분포에서 기포와 오류가 생성되는 것을 방지합니다. - 동형 표지 된 세포와 BSLBs, 형광 및 비 형광 BSLBs, 세포 및 BSLB단독으로 염색 포함. 모든 대조군(즉, 5× 105 BSLB/well을 포함하는 BSLB만, 스테인드 이벤트당 항체의 상대적 증가를 피하기 위해 5× 105 세포/웰을 포함하는 세포 만 포함)에 대해 잘 당 총 이벤트 수를 존중한다.
- 볼륨의 절반을 위아래로 파이프로 부드럽게 섞고 얼음에 30분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 500 × g 의 얼음-감기 2% BSA-PBS, pH 7.4 및 퇴적단계를 사용하여 세포와 BSLB를 두 번 세척한다. 세척된 동문화를 PBS 100μL로 재차 중단하고 즉시 획득합니다.
- 고정이 필요한 경우 PBS에서 PFA의 0.5%를 10분 동안 수정하고 한 번 세척하고 획득할 때까지 PBS에 보관하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
- 보상하기 전에 MESF 표준을 획득하여 가장 어둡고 밝은 개체수가 선형 측정 범위에 속하도록 보장합니다.
- 보상 샘플을 획득하고 보상을 계산하고 보정 매트릭스(link)를 실험에 적용합니다.
- 각 정량화 채널에 대해 최소 2× 104 개의 총 MESF 표준을 획득하고 저장합니다.
- 고처리량 샘플러를 사용하여 획득을 위해, 기기 획득을 표준으로 설정하고, 샘플 수집을 80 μL(또는 총 부피의 80%)로 설정하고, 샘플 유량은 2.0과 3.0 μL/s, 50 μL의 샘플 혼합 부피(또는 혼합 시 거품 형성을 피하기 위해 총 부피의 50%), 150ΜL/s의 샘플링 혼합 및 3개 사이의 혼합을 제공합니다.
- 샘플당 최소 1× 104 개의 단일 BSLBs를 획득합니다(참조 게이팅 전략에 대한 그림 3B 패널(i)-(vi)을 참조하십시오).
- 세정용액을 5분 동안 세척한 후 5분 동안 초순수수를 씻어 내고 기기를 종료합니다. HTS를 사용하는 경우 탭 HTS 및 클린 옵션 의 옵션을 따릅니다.
- FCS 파일을 내보냅니다.
7. 입자를 BSLB로 시냅스 전달 측정
- 실험 FCS 파일을 엽니다. 도 3B (i)에 도시된 바와 같이, 세포 및 BSLB의 모집단은 측면 및 전방 광 산란 영역(SSC-A 대 FSC-A)을 기준으로 선택합니다.
- 연속 획득 창 내에서 이벤트를 선택합니다(그림 3B (ii).
- 세포와 BSLB 의 단일 이벤트에 초점을 맞춥니다. 순차 게이트 FSC-W/FSC-H(singlets-1, 도 3B 패널(iii) 및 SSC-W/SSC-H(singlets-2)에서 낮은 W를 기반으로 단일 셀을 먼저 식별합니다. 그림 3B 패널(iv). 비례 FSC-A 및 FSC-H(그림 3B, 패널(v)가 있는 이벤트를 선택하여 추가 싱글-3 게이트를 정의합니다.
- 각 실험 샘플에 대해 MESF 분획블 및 1~4개의 MFI를 추출합니다.
- 각 분수에서 빈 비드 모집단의 MFI를 빼서 MESF 분획 1내지 4에 대한 수정된 MFI(cMFI) 값을 생성합니다.
- 단일 BSLB 및 셀에 대한 cMFI를 생성합니다( 그림 3C 패널(i)을 참조하십시오.
- BSLB로부터의 신호를 이소타입 대조군 항체로 염색하여 관련 T 세포 마커에 대한 항체로 염색된 BSLB의 MFI를 교정한다. cMFI를 사용하여 도 3C 패널(ii)에 표시된 방정식을 사용하여 정규화된 시냅스 전송 퍼센트(NST%)를 계산합니다.
- TCR 트리거링에 대응하여 특별히 전송된 입자에 관심이 있는 경우, 고뇌BS의 MFI에서 null BSLBs로부터 신호를 빼내세요.
- T 세포-BSLB 인터페이스를 통해 입자 화물로 전송된 총 분자 수를 결정하는 데 관심이 있다면 T 셀-BSLB 공존을 위한 동일한 계측기 설정 및 획득 세션을 사용하여 MESF 벤치마크 구슬을 획득하십시오.
- MESF 비드 모집단을 분석하고 프로토콜 단계 5.8.15 ~ 5.8.17에 표시된 대로 cMF를 추출합니다. cMFI를 통해 MESF의 회귀 분석에 가장 적합한 선의 경사를 계산합니다.
- 계산된 경사를 사용하여 BSLB에 증착된 MESF 수를 추출합니다.
- BSLB당 계산된 (평균) MESF를 정량화 항체의 F/P 값으로 나누어 BSLB로 이송된 마커의 분자 수를 계산한다.
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Representative Results
세포 표면에 절대 단백질 정량화를 위한 FCM
리간드의 생리밀도를 제시하는 BSLBs의 재구성은 모델링된 세포 하위 집합에 대한 총 단백질 밀도의 추정을 요구한다. BSLB를 재구성하기 위해, ICAM-1 및 비용 류 분자와 같은 BSLB 와 세포 사이의 접착 및 기능적 상호 작용을 지원하는 단백질과 함께 관심의 신호 축에서 역할을 할 것으로 예상되는 관련 리간드(CD80 및 CD86)를 포함한다. 추가 단백질은 ICOSL3, PD-L1 및 PD-L215와 같은 비용 류 분자를 포함하여 손에 질문에 따라 추가 될 수 있습니다. 다른 분자의 경우, 정량적 유동 세포측정을 사용하여 세포를 직접 분석하여 결정된 분자 밀도를 사용하여 BSLB를 재구성합니다. 직접 컨쥬게이션된 항체의 경우 BioLegend는 각 항체 로트 수에 대해 F/P 값을 제공합니다. 항체는 또한 분석광법에 의해 결정된 사내 및 F/P 비로 표시될 수 있고, 바람직한 불소크롬에 공인하는 상업적 항체가 없을 때 대안을 제공한다. 우리는 세포와 BSLBs의 표면에 재조합 단백질의 수를 보정하기 위하여 동일 항체를 사용하기 때문에, 이것은 상수남아 있기 때문에 항체 결합 valency를 정정할 필요가 없습니다. 항체 결합 valency가 필요한 경우, BSLB를 장식하고 포화 조건 하에서 염색 한 다음 바운드 항체의 수와 로드 된 재조합 단백질의 분자를 비교하기 위해 알려진 F / P와 재조합 단백질과 항체를 모두 사용합니다.
세포당 결합된 항체 분자는 팔라틴 편도선과 같은 관심 조직 내의 비교적 드문 세포 하위 집합에 절대 단백질 밀도를 추정하기 위한 항체의 전용 단색 유량 세포 측정 또는 다색판 패널을 사용하여 추정될 수 있다. 도 1 은 CXCR5+ B 세포 및 여포 T 세포(TFH)에서 ICAM-1의 밀도를 대표적인 측정을 예로 들 수 있다. 도 1A 에 도시된 동일한 염색 프로토콜 및 유량 세포 분석 원리는 상피 세포, 기질 세포, 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 또는 다른 인간 및 마우스 조직에서 B 및 T 림프구에 단백질 밀도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 혈액과 편도선과 다른 조직의 경우, 세포를 프로테아제 칵테일을 사용하여 세포를 분리할 때 주의를 기울여야 하며, 효소를 소화하기 위해 세포의 장기간 노출되면 세포 표면 발현 수준이 감소하기 때문에 주의해야 합니다.
연속 획득 창(그림 1A ii) 내에서 단일 라이브 셀에 획득 및 분석을 집중하여 시간 연속체 외부의 이벤트가 빛을 분산시켜 정량화를 손상시키는 다. 결정의 정확도를 높이려면 Fcγrs의 효율적인 차단을 통해 APC의 비특이적 염색을 줄입니다. hFCB에 존재하는 인간 혈청 및 EDTA는 그들의 조작 및 염색 도중 세포의 자발적인 응집을 감소시키기 위하여 자유로운 Ca2+ 를 첼로하는 동안 효율적인 FcγR 차단을 가능하게 합니다 ( 그림 1A (iii)와 (iv)는 편도선 세포의 현탁액에 남아 있는 이중을 보여줍니다).
설정 및 추적 구슬 및 소프트웨어(또는 이와 유사한 것 )를 사용하여 계측기 성능을 추적하는 것은 시간이 지남에 따라 정량화의 재현성에 매우 중요하며, 특히 나중에 는 입자를 BSLB로 시냅스 전송하는 MFI(즉, MESF 표준이 없는 불소크롬)만 사용하여 측정됩니다. 마찬가지로, 각 교정 지점이 형광수와 형광수 사이의 선형 관계를 유지하도록 하는 정량화 검출기에 대해 임의형형광장치의 선형 범위(즉, 선형 최소 및 선형도 최대)를 확인한다.
형광을 위한 "빈" 샘플, 또는 배경 염색 소음의 아이디어를 제공하는 견본의 준비는, 비특이적인 형광 신호를 빼기 위하여 필수적입니다. 동위원소 대조군 및/또는 생물학적으로 null 샘플(예를 들어, 녹아웃)은 세포의 배경 신호를 보정하고 정량화 항체로부터 유래된 실제 신호를 추출하는 데 필수적이다(도 1A 패널(viii)). 마찬가지로, 표준 MESF 구슬은 각 진정으로 긍정적 인 구슬 인구에서 배경 신호를 빼기 위해 전용 빈 모집단을 사용합니다 (그림 1B 패널 (vii) 및 (viii)). 회귀 해석이 수행되고 MESF와 수정된 MF 사이의 관계를 정의하는 경사가 추출되면 절대 분자 밀도로의 변환은 간단한 수학적 작업(그림 1C)을 따릅니다.
도 1C에서 CSA를 추정하기 위해, 전류 배제(CASY-TT)는 수천 개의 세포로부터 세포 부피 및 직경의 측정을 추출하는 데 사용되었습니다. 생성된 CSA는 구체(4pr2)에 대한 표면적 계산에서 추정되는 세포의 활성화 상태에 따라 다르며, 비활성화 B 셀의 경우 170.37 ± 4.91 μm2, 비활성화 및 활성화T 셀의 경우 각각 234.52 ± 1.53 μm2 및 318 ± 24.45 μm2의 관측값으로 세포의 활성화 상태에 따라 다릅니다. 이 CSA는 불활성화 된 림프구16의 3차원 굴절 지수 단층 촬영과 같은 이미징 기술에 의해 추정된 것과 유사합니다.
생리밀도의 범위가 정의되면(예를 들어, 다른 활성화 프로그램을 수행하는 세포의 표면 밀도를 비교하여), BSLB는 이러한 표면을 모델링하는 데 사용될 수 있다. NIH 테트라머 시설(또는 모노바이오티니졸드 단황 항CD3θ-Fab)에서 제공하는 생체개니화 항원HLA-펩타이드 모노머의 적정은 ICAM-1 12-그의 표준 APC 멤브레인을 재구성하는 데 사용될 수 있다. 6, 9, 12 및 14로 태그된 상업용 단백질은 BSLB의 표면을 장식하는 데 사용할 수 있습니다(ICAM-1 12-His를 가진 예는 그림 2A 참조). 정량적 FCM 분석과 함께 단백질 적정은 생리적 APC 표면을 재구성하고 다른 T 세포 서브세트의 시냅스 출력에 미치는 영향을 테스트하는 강력한 방법론을 제공합니다.
T 세포 시냅스의 출력을 연구하기 위해 1:1 BSLB 대 T 세포 비율을 사용하여 평균적으로 한 세포가 연구 기간 동안 하나의 BSLB와 상호 작용할 수 있도록 하십시오. 우리는 재료 전달이 잠복기 시간에 비례한다는 것을 관찰하여 셀:BSLB 인터페이스를 통해 낮은 수량으로 전송되는 분자를 검출하기위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 따라서 tSV의 경우와 같이, 적절한 패널 설계는 트랜스 시냅스 물질의 검출의 감도 및 신뢰성을 높이는 데 매우 중요하며, 출력은 25~36개의 소포/셀/셀/20 min2,3 사이에서 다릅니다. 먼저 각 불소 크롬 표지 항체와 지질의 스펙트럼 유출을 테스트합니다. 높은 유출이 관찰될 때, BSLB를 구성하는 염색 항체의 적정과 BSLB를 구성하는 형광 지질의 백분율뿐만 아니라 PMT 전압 워크를 권장하여 보상 된 샘플의 확산 오류를 줄이고 소음 비율에 대한 신호를 향상시키는 것이 좋습니다 (피사체에 대한 전용 소개는 12,14,17을 참조하십시오).
null BSLBs(항원 또는 항 CD3 Fab 부족)와 녹아웃 셀 또는 동종 표지 시료18을 포함한 정량화 제어의 사용은 SEs와 같은 이펙터 tSV의 전달뿐만 아니라 시냅틱 cleft 내에서 방출되는 수분자 공격 입자를 정확하게 측정하는 데 필수적입니다. CD4, CD2 또는 CD45와 같은 매우 풍부한 세포 표면 단백질을 합성 형광 지질(DOPE Atto conjugates)과 함께 사용하여 공수의 냉기 적 해리시 단일 세포 및 BSLB의 인구를 식별합니다. 단일 BSLB 및 셀에서 형광 강도의 기하학적 평균 또는 중앙값에 대한 해석에 초점을 맞춥니다(CD4는 도 3B에 사용됩니다). SEs는 플라즈마 멤브레인(PM)으로부터 유래된 tSV의 특수한 유형이며, BSLB로의 전송은 상호 작용 세포의 표면에 일관된 신호 손실로 BSLB에 마커 신호의 이득에 의해 입증된다(도 2B, 바이올렛 화살표에 도시된 바와 같이 BSLBs상에 TCR을 참조). 항원 또는 항 CD3가 결여된 Null BSLBs는 TCR 복합체를 통해 상호 작용하는 세포를 자극하여 BSLB에 TCR(및 기타 T 세포 마커)의 특정 획득을 추적하는 훌륭한 참고 자료입니다.
그림 1: APC 의 표면에 단백질의 절대적인 정량화. (A) 편도선 B 세포의 표면에 ICAM-1의 정량적 유량 세포 측정의 예 (Foll. Bc) 및 도우미 T 셀 (TFH). (i-vii) 인간 팔라틴 편도선에서 분리된 단일 CXCR5+ Bc 및 TFH를 분석하기 위한 게이팅 전략. 연속 적인 수집 창에 포함된 단일 라이브 이벤트를 식별하기 위한 순차적인 게이팅 전략이 표시됩니다. (iii-iv) 검은 화살표는 이중을 나타냅니다. (viii) FMO 컨트롤 (회색 히스토그램)과 FMO 컨트롤에 비해 ICAM-1 (청록색 히스토그램)의 세포 표면 발현을 보여주는 히스토그램과 관련 동종유형(회색 히스토그램과 겹치는 검은 색 히스토그램)에 비친 집단의 중첩. 화살표는 CXCR5+ B 셀(Bc)을 식별하는 데 사용되는 중첩 게이팅 전략의 방향을 나타냅니다. CD19+) 및 TFH(CD4+). (B) MFI로부터 편도선 세포의 표면에 절대 분자의 추출은 A에 표시된 세포와 동일한 계측기 설정을 사용하여 획득한 MESF 벤치마크 구슬의 회귀 분석이 필요하다. (i-v) 연속 적인 수집 창에 포함된 단일 라이브 이벤트를 식별하기 위한 순차적인 게이팅 전략이 표시됩니다. (vi) 다른 표준 MESF 인구에서 MF의 게이팅 및 측정. (vii) 표시된 MESF 집단의 중첩된 히스토그램(vi). 오른쪽 상단에 표시된 값은 5개의 MESF 모집단(공백, 1, 2, 3 및 4)에 대한 MF를 나타냅니다. (viii) (vii)에 도시된 MESF 인구에 대한 cMFI를 통해 MESF의 선형 회귀. A의 데이터로부터 셀에 바인딩된 MESF를 추출하기 위한 경사(b)가 도시되어 있다. (C) 분자 수의 추출에서, 측정된 MESF cMFI(cMFIM)로부터 계산된 경사의 적용으로 시작하여 간단한 수학 작업을 따르고 MESFR(MESFR)을 참조한다. 세포(MESFcells)에 결합된 MESF를 추출하려면, 계산된 경사로 셀(cMFIcells)의 수정된 MFI를 나눕니다. 그런 다음 세포에 바인딩된 분자의 수를 계산합니다(Molec. 세포), 검출(정량화) 항체의 F/P로 MESFcells를 분할한다. 마지막으로, 세포의 표면에 분자 밀도를 계산 (Dcells), 몰렉스를 분할. 추정된 세포 표면적(CSAE)에 의한 세포. 약어: X = 독립 변수; Y = 종속 변수(측정형 형광), cMFIM = 측정된 수정된 MFI; MESFR = 참조 MESF 값; MESFcells = 셀당 추정 MESF; cMFIcells = 수정된 MFI 셀; 몰크. 세포 = 세포 당 추정 된 분자. Dcells = 세포에 대한 추정 밀도; CSAE = 추정 된 셀 표면적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 재조합 ICAM-1을 가진 BSLB의 재구성 및 BSLBs로미립분리기의 측정. (A, i-vi) BSLBs의 유량 세포측정 분석은 재조합 단황 ICAM-112-His (rICAM-1)의 증가된 밀도로 재구성됩니다. (i-v) 그림 1과 마찬가지로 연속 인수 창 내에서 단일 BSLB에 게이팅 전략을 집중합니다. 측정 오류를 방지하기 위해 제외된 시간 연속체 게이트 바로 앞의 간격을 확인합니다. (vi) 좋은 단백질 품질은 종종 좁은 형광 분포의 관찰과 함께 고농도에서 BSLB의 균일 한 코팅을 초래합니다 (변화의 낮은 계수, vi에서 히스토그램을 참조하십시오). (B) 측정밀도(DM)를 통해 ICAM-1 기준 농도(CR)의 회귀 분석. 경사를 사용하여 단백질(CT)의 표적 농도를 계산하여 도 1의 실험에서 측정된 세포(Dcells)의 밀도를 달성한다. 약어: 12-His = 12-히스티딘 태그; DM = 분자 밀도 측정; CR = rICAM-1의 기준 농도; CT = 표적 농도(보간됨); 세포 = 세포에서 측정된 밀도(도 1C 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: BSLB로 전송된 T 세포 시냅스 입자의 측정. (A; i-v) 모델 멤브레인을 재구성하는 BSLBs와 T 세포의 공동 배양을 위한 중요한 단계를 보여주는 플로우 다이어그램과 유동 세포측정을 사용하여 입자 전달의 후속 측정. (iv) 파란색 및 어두운 노란색 다이어그램은 비파라메트릭 흐름 세포 측정 플롯에서 세포 및 BSLB의 상대 분포 및 위치를 표시합니다. (v) 불경병 분포 히스토그램은 null BSLBs(회색)에 비해 고뇌BS(다크 옐로우)의 형광의 상대적 이득을 나타낸다. (B) 예시적인 시냅스 전달 실험. (i-vi) 표시된 게이팅 전략은 연속 획득 창 내에서 단일 BSLB 및 셀을 식별하는 것입니다. 보라색 화살표는 C. (C) (i) 단일 세포 (파란색) 및 단일 BSLBs (노란색)의 MFI에 대한 분석을 집중하여 C. (C)에서 계속되는 분석 방향을 나타냅니다. (ii) BSLB 및 셀에 대해 계산된 cMFI로부터 정규화된 시냅스 전송(NST%, 상단) 및 Tmax%(아래)를 계산하는 방정식. (iii-vi) 비활성화(회색) 및 250(연색값) 또는 1,000(고색 두더지)로 활성화되는 T-셀의 다양한 밀도에 걸쳐 세포(파란색 음영) 및 BSLB(노란색 음영)에 대한 형광 강도 분포의 변화를 보여주는 오버레이 히스토그램. 서로 다른 색상 값의 숫자는 노란색으로 표시된 BSLB 히스토그램에 대해 측정된 NST%를 나타냅니다. 오버레이 된 히스토그램은 다른 마커에 대해 양성 T 세포 소포의 시냅스 전달에서 가장 중요한 계층 구조를 보여줍니다. BSLBs의 이 조성물을 위해(ICAM-1의 200몰드./μm2 및 안티 CD3θ-Fab의 밀도 증가), tSV는 cd81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi)를 > TCR+(iii) 및 BSLB로 전송됩니다. 이전 문서에서 설명한 바와 같이, TCR 및 CD81은 SEs의 구성 요소이며, 후자가 비교적 높은 표면 수준에서 표현되었음에도 불구하고 비교적 높은 효율을 CD4로 전송합니다. SE 흘리기는 세포 표면 CD81 및 TCR의 손실과 BSLBs에 이러한 신호의 이득 (250 몰크에 대한 보라색 화살표를 열고, 노란색 히스토그램에서 1,000 molec./μm2에 대한 보라색 화살표를 닫는). (D) 공자의 부적절한 냉각은 입력 구슬(왼쪽 비파라메트릭 플롯)을 비교하는 것과 같이 실리카 구슬으로부터 SLB를 찢어내는 세포로 이어지며, 37°C(오른쪽 양파라메트릭 플롯)에서 4°C로 급속냉각을 실시한 회인을 비교한다. 도 3B 패널(vi)과도 비교합니다. 약어: PRF1 = 페포린 1; NST% = 정규화된 시냅스 전송; Tmax% = 최대 관찰 전송의 퍼센트(제어 또는 참조 조건); tSV: 시냅스 소포; SEs: 시냅스 ectosomes. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
BSLB는 모델 APC 멤브레인으로 자극된 T 세포의 미립자 출력을 연구하기 위한 다목적 도구입니다. 이 방법의 유연성은 복잡하고 환량주의 막 조성물의 재구성을 통해 리간드의 효과와 그 신호가 tSV 및 수분자 공격 입자 및 그 구성요소의 분비에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 우리는 사전 활성화 TH, CTL, Tregs 및 CART15를 포함하여 다양한 T 세포에 이 기술을 시험했습니다. 이 프로토콜은 또한 새로 분리된 T 세포의 시냅스 입자 방출의 측정에도 효과적입니다. 새로 고립된 T 세포를 사용하는 한 가지 제한은 이러한 정지 모집단이 세포 표면 조성과 상관관계가 있는 트랜스 시냅스 입자의 다른 프로파일을 생성한다는 것입니다(자세한 내용은 15 개 참조).
간단한 유동 세포측정 패널로서, 우리는 안티 TCR 클론 IP26, 안티 CD81 클론 5A6, 안티 페롤린 (PRF1) 클론 B-D48 또는 안티 CD40L 클론 24-31, ATTO 390 또는 ATTO 390 또는 ATTO 565 함유 지질 (Btrors)의 사용을 권장합니다. 단일 BSLB 및 컨쥬게이트에서 단일 세포를 구별하기 위해, 우리는 세포 표면에서 매우 높은 수준에서 발현되었음에도 불구하고 제한된 수준에서 BSLB로 전송되는 안티 CD4 클론 OKT4 및 /또는 안티 CD45 클론 HI30의 사용을 권장합니다 (불소 크롬 및 기타 검증 된 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). 형광의 수가 높은 패널은 설계될 수 있지만 분석된 각 형광의 형광 스펙트럼 유출에 대한 체계적인 평가가 필요합니다. 감도를 높이려면 0.5 μg에서 20 μg/mL 최종에 이르는 정량화 항체의 상이한 적정을 시도하고 항체의 새로운 재고가 사용될 때마다 반복하십시오. 입자 전달의 절대 및 상대 적 측정의 재현성을 보장하기 위해, 적분해및 바이오티니및 니함유 인지질의 각 새로운 제비의 결합 용량을 계산, 그들은 로트에서 크게 다를 수 있습니다. T 세포-BSLB 회인의 점진적인 냉각은 낮은 풍부하게 입자의 검출 감도를 높이는 데 중요합니다. 지질 형광의 상당한 손실에 의해 입증 된 바와 같이, 공존의 급속한 냉각은 BSLBs의 파괴로 이어집니다 (그림 3D).
상이한 메트릭은 손에 실험적 질문에 따라 T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신진 SEs로 정렬된 표면 단백질의 기준선 발현 수준에서 사소한 차이가 예상되는 경우 정규화된 시냅스 전달(NST%) 메트릭을 사용할 수 있습니다(그림 3C 패널(ii) 상단 방정식). 후자는 세포와 구슬의 결합 된 MFI의 총 의 함수로 BSLBs의 퍼센트 MFI 신호를 정량화합니다. 이러한 접근법에서 한 가지 주의 사항은 초분자 공격 입자의 성분과 같은 PM에 발현되지 않은 전송된 마커의 분석이다19. 이러한 원소는 세포내 매장 외세포증과 같은 PM 트랜짓과 무관한 경로에 의해 BSLB에 도달하므로, 분자가 비교적 작은 분모(cell surface 표현 수준)로 나눌 것이기 때문에 그 결과로 팽창되기 때문에 NST%의 계산이 권장되지 않는다. 대신 보정된 MF를 사용하여 null BSLB와 BSLB 사이의 페롤린 증착을 비교하여 항원 또는 항 CD3 Fab의 밀도가 증가합니다. 대안적으로, BSLB로 전송된 세포내 원소를 추적하기 위하여는, BSLBs(Tmax%)로 전송된 최대 신호에 관하여 전송된 추정절대 분자 또는 신호의 백분율(그림 3C 패널 (ii) 바닥 방정식)을 비교하기 위하여 이용하십시오. Tmax의 경우, BSLB 샘플(또는 조건)에서 측정된 cMFI 또는 분자를 사용하여 가장 높은 항원 밀도를 참조 Tmax로 제시한다. 다른 기증자를 분석할 때, 비교를 위해 기증자 특정 Tmax를 사용하십시오. TCR의 특정 트리거링에 대응하여 전송된 물질을 연구할 때, MF는 항원 음성(null) BSLBs에서 관찰된 배경 전달 수준으로 교정될 수도 있다.
BSLB로 전송된 분자의 절대 수를 추정하는 것은 더 강력한 방법입니다, 이것은 끝점으로 분자의 측정과 MESF 교정을 포함하고 독립적인 실험의 더 나은 비교를 관련시키기 때문에. Tmax%는 독립적인 실험전반에 걸쳐 유사한 정규화를 제공하며, 페포린 및 그란자임과 같은 세포 내 마커에 다색 FCM을 사용하거나 MESF 표준을 사용할 수 없는 마커에 특히 유용합니다. Tmax%는 단순히 제어 조건에서 가장 높은 전송을 가진 조건에 주어진 조건에서 신호의 백분율입니다 (예를 들어, 약물 연구를 위한 차량/치료되지 않은 제어, CRISPR/Cas9 라이브러리를 위한 제어 가이드 RNA). 또한, Tmax%는 cMFIs 와 절대 분자 수 모두에 사용될 수 있으며 T 세포의 시냅스 출력에 대한 유전자 삭제의 효과의 나란히 비교에 특히 유용하였다. 후자는 유전자 편집이 절대 및 NST% 측정에 영향을 미칠 수 있는 독립적인 기증자 및 실험 중 면역 수용체 발현의 동적 범위에서 높은 가변성으로 이끌어 내는 때 분명합니다.
BSLB는 다른 T 세포 유형의 시냅스 출력의 캡처 및 특성화를 용이하게했으며, 그렇지 않으면 APC2에 의한 급속한 내재화로 인해 격리하기가 어렵습니다. BSLBs의 물리적 안정성은 또한 T 세포에 의해 조사된 BSLB의 형광 활성화 세포 분류를 위한 플랫폼을 제공하므로 질량 분광및 핵산 염기서열분석 기술에 의한 고순수 입자 제제의 생화학적 특성화를 가능하게 한다. 후자는 실험 조건의 넓은 범위에서 T 세포에 의해 창고 세포 간 메신저의 상세한 특성을 용이하게. 이러한 미립자 메신저가 다른 T 세포 유형 및 활성화 상태 사이에서 어떻게 변화하는지, 정경 및 비정산 항원 수용체 (즉, 키메라 항원 수용체)가 어떻게 입자 조성에 미치는 영향을 포함하여 다른 질문을 해결할 수 있습니다. 우리는 현재 자극된 T 세포의 면역 시냅스에서 분비된 사이토카인의 정량적 특성화를 위해 이 기술을 더욱 개발하고 있습니다. 후자는 T 세포 활성화 후 BSLBs에 증착 인터류킨, 인터페론 및 화학 요법의 효율적인 캡처를 제공, 재조합 사이토카인 수용체와 항체의 조합의 신중한 연구가 필요합니다. BSLB는 기질 및 선천성 면역 세포와 같은 T 세포에 의한 tSV 방출을 유발하는 것으로 의심되는 다른 APC의 표면 조성을 모델링하도록 조정할 수 있다. BSLBs는 또한 암 및 그밖 병리의 처리를 위한 외세포 및 tSV 분비 기계의 양성 및 부정적인 변조를 찾는 새로운 약리학 화합물을 스크린에 적응할 수 있습니다. 마지막으로, BSLBs는 또한 감염성 질환에서 T 세포 기능을 변조하는 독성 결정물질을 발견하는 데 사용될 수 있다20.
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Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 건설적인 과학적 토론, 특히 우리의 흐름 세포측정 시설 매니저 조나단 웨버에 대한 우리의 실험실 구성원과 류머티즘 지역 사회의 케네디 연구소에 감사드립니다. 이 작품은 웰컴 트러스트 수석 연구 펠로우십 100262Z/12/Z, ERC 고급 보조금(SYNECT AdG 670930), 유금학 연구를 위한 케네디 트러스트(KTRR) (3대 MLD)에 의해 지원되었습니다. PFCD는 EMBO 장기 펠로우십(ALTF 1420-2015)이 유럽위원회(LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) 및 마리 스클로도우스카-퀴리 액션과 옥스포드 브리스톨 마이어스 스퀴브 펠로우십과 함께 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
References
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