Beredning av pärlstödda lipidbilayers för att studera partikelproduktionen av T-cells immunsynapser

Summary

Här presenterar vi protokollet för stegvis rekonstitution av syntetiska antigen-presentera celler med hjälp av pärla-stödda Lipid Bilayers och deras användning för att förhöra den synaptiska produktionen från aktiverade T-celler.

Abstract

Antigen-presenterar celler (APCs) presenterar tre aktiverande signaler till T-celler som deltar i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation/corepression och 3) lösliga cytokiner. T-celler frigör två typer av effektorpartiklar som svar på aktivering: transsynaptiska blåsor (tSV) och supramolekylära attackpartiklar, som överför intercellulära budbärare respektive medlar cytotoxicitet. Dessa entiteter internaliseras snabbt av API: er som är engagerade i fysisk kontakt med T-celler, vilket gör deras karakterisering skrämmande. Detta dokument presenterar protokollet att tillverka och använda pärla-stödda lipid bilayers (BSLBs) som antigen-presenterar cell (APC) mimetik för att fånga och analysera dessa transsynaptiska partiklar. Också beskrivna är protokollen för absoluta mätningar av proteintätheter på cellytor, rekonstitution av BSLBs med sådana fysiologiska nivåer och flöde cytometri förfarande för att spåra synaptiska partikel utsläpp av T-celler. Detta protokoll kan anpassas för att studera effekterna av enskilda proteiner, komplexa ligand blandningar, patogen virulens determinanter, och läkemedel på effektor produktionen av T-celler, inklusive hjälpare T-celler, cytotoxiska T lymfocyter, reglerande T-celler, och chimeric antigen receptor-uttrycka T celler (CART).

Introduction

Den immunologiska synapsen (IS) är en pivotal molekylär struktur som bildas vid gränssnittet mellan celler som är engagerade i fysisk kontakt och som underlättar ett reglerat utbyte av juxtrarininformation. Olika ISs har beskrivits i litteraturen, och en växande mängd bevis tyder på att dessa molekylära nav är en bevarad egenskap hos cellulära nätverk. Olika immunceller, inklusive B-celler, naturliga mördarceller, dendritiska celler, makrofager och T-celler, utbyter information via montering av kortlivade ^kontakter1. Multiomiska studier ökar förståelsen av nya undergrupper av leukocyter och stromala celler som driver patogena cellulära nätverk och uttrycker ytproteiner med okända funktioner. Som syntetiska APC: er tillåter BSLBs en direkt undersökning av enskilda proteiners funktionella roll i integrationen av aktiverande signaler, nämligen antigener och kostimulering/corepression, av T-celler och den resulterande frisättningen av effektorpartiklar som kallas signal fyra.

Detta dokument beskriver protokoll och kritiska tekniska punkter att tänka på när du använder BSLBs för att efterlikna ytan sammansättningen av modell APCs. Protokollen för kvantitativ mätning av immunreceptorer och andra ytproteiner på APC presenteras tillsammans med protokollet för rekonstitution av syntetiska APC: er som innehåller dessa uppmätta mängder. Därefter presenteras de steg som krävs för kokulturering av T-celler och BSLB tillsammans med protokollet för kvantitativ mätning av transsynaptisk partikelöverföring med hjälp av flödescytometri. Mest anmärkningsvärt, BSLBs underlätta studier av en plasmamembran-härledda population av TSV kallas synaptiska extosomer (SEs). T-cells antigen receptor-berikade (TCR⁺) SEs kastas som svar på TCR ^utlösande2 och effektivt fångas av BSLBs3, vilket representerar en utmärkt avläsning för att bedöma de agonistiska egenskaperna hos antigener och den modellerade membransammansättningen. CD63 ⁺ exosomer och supramolekylära attackpartiklar (SMAPs) frigörs också av stimulerade T-celler och fångas av BSLBs. De kan användas som ytterligare avläsningar av aktivering och den resulterande exocytiska och lytiska granulatutsöndringen av T-celler. Mobilisering av exocytiska blåsor till den interagerande polen i T-cellen underlättar också riktningsfrisättning av cytokiner, såsom IL-2, IFN-γ och IL-10 som svar på aktivering4,5,6,7,8. Även om T-cellsutgivna cytokiner också kan detekteras på BSLBs, är en mer dedikerad studie för närvarande under utveckling för att validera den kvantitativa analysen av cytokinfrisättning vid den immunologiska synapsen.

För att ifrågasätta hur specifika membrankompositioner påverkar T-cellernas synaptiska utdata krävs att man definierar målmembrankomponentens fysiologiska densitet. Flödescytometribaserade kvantifieringar av cellytans proteiner är ett viktigt steg i detta protokoll och kräver: 1) användning av antikroppar med känt antal fluorokromer per antikropp (F/P) och 2) benchmarkpärlor som ger en standardreferens för interpolering av fluorokrommolekyler från uppmätta genomsnittliga fluorescensintensiteter (MFI).

Dessa referensstandarder består av fem pärlpopulationer, var och en innehållande ett ökande antal likvärdiga lösliga fluorokromer (MESF), som spänner över det dynamiska intervallet av godtycklig fluorescensdetektering. Dessa standardpopulationer ger diskreta fluorescenstoppar, vilket underlättar omvandlingen av godtyckliga fluorescensenheter till MESF genom enkel linjär regression. De resulterande MESF:erna används sedan tillsammans med antikropps F/P-värden för att beräkna det genomsnittliga antalet bundna molekyler per cell (eller BSLB i senare steg). Tillämpningen av uppskattade cellytor på det genomsnittliga antalet detekterade molekyler möjliggör sedan beräkning av fysiologiska densiteter som molekyler/^μm2. Detta kvantifieringsprotokoll kan också anpassas till mätning av proteintäthet på T-celler och biokemisk rekonstitution av membrankompositioner som förmedlar bildandet av homotypiska T-cellssynapser (dvs. T-T synapses9). Vid behov kan antikroppsbindningens valency ytterligare uppskattas med hjälp av rekombinanta mål märkta med kända antal fluorokromer per molekyl. Därefter kan den antikroppsbindande valensen beräknas för samma BSLB-population genom att samtidigt jämföra antalet bundna fluorescerande proteiner och kvantifieringsantikroppar (med två olika kvantifieringsfluorokromer och MESF-standarder).

Rekonstitution av APC-membran kräver montering av stödda lipidbilayers (SLBs) på kiseldioxidpärlor1. Liposombestånd som innehåller olika fosfolipidarter kan utnyttjas för att bilda en mångsidig lipid-bilayermatris, vilket möjliggör förankring av rekombinanta proteiner med olika bindningskemi (beredningen av liposomer beskrivs i ¹⁰). När den fysiologiska densiteten (eller densiteten) hos den relevanta liganden "på celler" har definierats anpassas samma flödescytometriprotokoll för att uppskatta koncentrationen av rekombinant protein som behövs för att belägga BSLBs med målets fysiologiska densitet. Två olika förankringssystem kan användas antingen i kombination eller separat.

För det första är SLB som innehåller en slutlig 12,5 mol% av ^Ni2+-innehållande fosfolipider tillräcklig för att tillhandahålla cirka 10 000 his-tag-bindningsställen per kvadrat ^micron10 och fungerar bra för att dekorera BSLBs med mest kommersiellt tillgängliga proteiner vars fysiologiska densitet inte överstiger denna maximala lastkapacitet. Det andra lastsystemet utnyttjar biotinhaltiga fosfolipider (som mol%) för att ladda biotinylerade anti-CD3e Fab (eller HLA/MHC-monomerer) via streptavidinbroar. Kombinationen av dessa två BSLB dekorationsmetoder möjliggör sedan flexibel skrädderi av BSLBs som syntetiska APC: er. För mycket komplexa APC-ytkompositioner kan mol% av fosfolipider och proteiner ökas för att ladda så många proteiner som frågan kräver. När arbetskoncentrationerna av proteiner och mol% av biotinylerade fosfolipider har definierats kan BSLB monteras för att förhöra den synaptiska produktionen av T-celler med multiparametrisk flödescytometri.

Protocol

1. Mätning av proteintätheter i cellytan med kvantitativ flödescytometri

1. Förbered 0,22 μm-filtrerad humanflödescytometribuffert (hFCB) genom att tillsätta EDTA (till en slutlig 2 mM-koncentration) och humant AB-serum (till en slutlig 10%) till steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7.4 (se tabell 1). Filtrera lösningen med hjälp av en porfilterenhet på 0,22 μm för att avlägsna serumföroreningar och lagra vid 4 °C.
2. Återvinn cellerna och sedimentera dem genom centrifugering vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur (RT).
3. Tvätta cellerna två gånger med PBS. I varje tvättsteg återanvänder du cellerna i PBS till den ursprungliga volymen (före centrifugering) och snurrar ner vid 300 × g i 5 min vid RT.
4. Räkna trypan blåfärgade cell suspensioner i en ^{hemocytometer11}. Alternativt kan du räkna celler med elektrisk strömuteslutning. Följ casy-TT-tillverkarens instruktioner (se materialförteckningen) för det senare.
   CASY-TT-cellräknaren gör det möjligt att bestämning av procent livskraftiga celler, cellstorlek och cellvolym.
5. Beräkna volymen av PBS som innehåller 1:1 000 utspädning av Fixable Viability Dye eFluor 780 eller liknande (se tabellen över material) som krävs för att återanvända cellerna till en färgning koncentration av 107 celler/ml.
6. Återanvänd cellerna med hjälp av livskraften dye-PBS-lösningen och inkubera på is i 30 min.
7. Ta bort livskraftsfärgen genom att tillsätta en volym iskall hFCB. Snurra ner vid 300 × g i 5 min vid 4 °C.
   OBS: Från och med nu, håll kylkedjan obruten.
8. Tvätta cellerna med hFCB som innehåller 1:50 utspädning av Fc-receptorblockeringslösningen (se materialtabellen). För volymen till en slutlig koncentration av ¹⁰⁷ celler/ml och inkubera i ytterligare 15 minuter för att uppnå effektiv FcgR-blockering.
9. Fördela 100 μL av cellupphängningen (dvs. ¹⁰⁶ celler) per brunn på en U-botten- eller V-bottenplatta med 96 brunnar. Håll cellerna på is och skyddade mot ljus (täck med aluminiumfolie).
10. Förbered en antikropps master mix i hFCB genom att definiera de optimala antikroppskoncentrationerna för varje fluorokromkonjugerad antikropp, och viktigast av allt, för de antikroppar som används för att bestämma ytproteintätheter. Till exempel, för kvantifiering av ICAM-1 uttryck på tonsillär cellpopulationer, som visas i figur 1, förbereda en blandning som innehåller 1:200 utspädningar av anti-CD4, anti-CD19 och anti-CXCR5 tillsammans med mättande koncentrationer av en anti-ICAM-1 antikropp med kända AF647 fluorokromer per antikropp (dvs. 10 μg/mL, som definierades av oberoende antikroppsexperiment).
11. Som ytterligare kontroller, förbered en antikroppsblandning som innehåller relevanta antikroppsisotypkontroller (vid samma effektiva koncentrationer som deras motsvarigheter konjugerade med samma fluorokromer för bakgrundsretraktion), dvs.
    OBS: I exemplet ovan används en sådan isotypkontroll för att subtrahera bakgrundfluorescens från den sanna ICAM-1-signalen på celler.
12. Vid kvantifiering av proteintätheter på cellundergrupper som förekommer vid låga frekvenser i vävnader, förbered fluorescens minus en (FMO) kontroller som innehåller alla färgningsantikroppar utom de markörer som är av intresse (se mer information i ¹²).
13. Snurra ner 96-brunnsplattan som innehåller cellerna vid 300 × g i 5 min vid 4 °C, kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 50 μL av antingen kvantifieringsantikroppsmästareblandningen eller isotypantikroppsblandningen.
14. Inkubera cellerna i minst 30 min vid 4 °C och 400 varv/min med hjälp av en plattskakapparat. Skydda plattorna från ljus (täck med aluminiumfolie).
15. Tvätta cellerna tre gånger med hFCB och centrifugera vid 300 × g i 5 min vid 4 °C.
16. Återutnyttja cellpelleten med hjälp av 200 μL PBS (dvs. till en slutlig koncentration på 5 × ¹⁰⁶ celler/ml).
17. För förvärv:
    1. Om du använder en standard BD FACS-lastare, överför proverna till 5 mL polystyren rundbottna rör (se materialförteckningen).
    2. Om du använder höggenomströmningsprovtagare (HTS, även kallad plattläsare), fortsätt omedelbart till steg 1.19.
18. Innan du fortsätter med datainsamlingen för MESF-standarderna bör du kontrollera högsta och lägsta gränsvärden för fluorescensintensitetsintensitet för kvantifieringskanalerna.
19. Innan kompensation, skaffa data för MESF-standarderna, se till att både de dimmigaste och ljusaste populationerna faller i det linjära mätområdet.
20. Skaffa kompensationsproverna. Håll spänningsvärdena för fotomultipliktplierröret (PMT) för kvantifieringskanalerna oförändrade för att bevara det dynamiska detekteringsområdet. Gör smärre justeringar i PMT-spänningen i andra kanaler innan du beräknar kompensationsmatriserna.
21. Beräkna och tillämpa kompensation.
22. Skaffa och spara minst 2 × ¹⁰⁴ mesfpärlor totalt för var och en av kvantifieringskanalerna.
23. Välj populationen av enstaka celler baserat på deras sida och framåt ljusspridningsområden (SSC-A respektive FSC-A, enligt figur 1A i), följt av valet av händelser inom tidskontinuum (figur 1A ii) respektive låg för flygtid (W) i både FSC och SSC jämfört med deras höjder (dvs. FSC-W/FSC-H, följt av SSC-W/SSC-H-gating enligt figur 1A iii respektive iv). Definiera en sista enhändelseport som innehåller händelser med proportionell FSC-A kontra FSC-H-distribution (bild 1A (v)).
24. Skaffa kontrollprover (Isotype-märkta och FMO-kontroller).
25. Skaffa prover och registrera tills minst 10 000 målceller har förvärvats.
    OBS: den robusta bestämningen av genomsnittliga molekylära densiteter kräver analys av flera givare över oberoende experiment. Detta är avgörande vid analys av antingen cellundergrupper som finns i reducerade frekvenser eller härrör från knappa biologiska material (t.ex. från humanvävnadsbiopsier).
26. Tvätta cytometern igång i 5 min med en FACS-rengöringslösning följt av 5 min ultrapurvatten innan du stänger av instrumentet. Om du använder HTS följer du alternativen under fliken HTS och Clean Plate-programmet.
    OBS: För att minska prov-till-prov-överföring, aktivera sit (sampler) flush eller high-throughput sampler wash alternativ, som automatiskt tvättar cytometern mellan rör eller brunnar. Innan förvärvet påbörjas, kör ultrapurvatten i 10 minuter med hög flödeshastighet för att avlägsna otvättade biologiska föroreningar från cytometerprovlinjen.
27. Exportera FCS-filerna (Flow Cytometry Standard).

2. MESF överkorrigerade medelvärdes- (eller median)fluorescensintensitetsanalyser (MFI)

1. Öppna programvaran för flödescytometrianalys och ladda experimentets FCS-filer. Välj population av pärlor baserat på deras sida och framåt ljusspridningsområden (SSC-A kontra FSC-A), som visas i figur 1A (i).
2. Kontrollera datakvaliteten genom att kontrollera fördelningen av enskilda händelser över tid, enligt steg 1.24.
   OBS: Bubblor skapar luckor i fördelningen av händelser över tid; Detta visas vanligtvis i början av förvärvet med HTS. Undvik att välja händelser som flankerar luckor i förvärvstiden eftersom dessa lägger till mätfel på grund av optiska avvikelser.
3. Fokusera på de enskilda händelserna.
   1. Celler
      1. Identifiera enskilda celler först baserat på deras SSC-A- och FSC-A-fördelning (figur 1A i), följt av händelser som är låga för W i sekventiella grindarna FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 1A-panelen (iii)) och SSC-W/SSC-H (singlets-2; Bild 1En panel iv. Definiera ytterligare en singlets-3-grind genom att välja händelser med proportionella FSC-A och FSC-H (bild 1A, panel (v)). Slutligen identifiera levande celler som de negativa för det fixerbara bärkraftsfärgämnet.
   2. MESF pärlor
      1. Följ samma singlets-1 till singlets-3 diskriminering som i steg 2.3.1.1 (figur 1B, paneler i till v)). Identifiera var och en av MESF-populationerna (blank, 1, 2, 3 och 4) baserat på deras fluorescensnivåer (se figur 1B, panel (vi)).
4. Extrahera MFI av MESF-fraktioner tomma och 1 till 4.
5. Generera korrigerade MFI-värden (cMFI) för MESF-fraktioner 1 till 4 genom att subtrahera MFI:erna för den tomma pärlpopulationen från varje fraktion.
6. Beräkna raden med den bäst lämpade för förhållandet mellan cFI och de MESF-värden som tillhandahålls av leverantören (oberoende variabel, som är bråkdels tom som är lika med noll).
7. Extrahera lutningen (b i ekvationen nedan) av mesf:s linjära regression över cMFI (figur 1B-panelen (viii) visar en regression där y = a + bx; med a = 0).
8. Extrahera medianvärdet (för bimodala fluorescensfördelningar) eller medelvärdet (för normala eller log-normala fluorescensfördelningar) fluorescensintensiteter från de populationer som är av intresse (TFH- och B-celler i figur 1A-panelen (vii)).
9. Som i steg 2.5-2.7 extraherar du MFI-värdena från isotypmärkta kontrollceller.
10. Om F/P för isotypkontroller är desamma som kvantifieringsantikropparna korrigerar MFI:erna i färgade celler genom att subtrahera MFI från Isotypmärkta celler.
11. Om isotypernas F/P skiljer sig från kvantifieringsantikropparnas, extrahera MESF från isotyperna genom att dividera MFI:erna för isotypmärkta celler med den lutning som beräknas i steg 2.7. Subtrahera Isotype MESF från kvantifiering MESF innan du uppskattar bundna kvantifieringsantikroppar.
12. Dividera MESF med F/P av kvantifieringsantikropparna för att uppskatta antalet bundna molekyler per cell (Molec. _som visas i flödesdiagrammet för figur 1C).
13. Dividera antalet bundna molekyler med den uppskattade cellytan (CSA (^μm2)) för att extrahera densiteten hos proteiner som molec./^μm2 (figur 1C). Mer information finns i avsnittet representativa resultat.

3. Funktionella fosfolipidarter att använda vid kalibrering av proteiner som täcker BSLB

1. Använd 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfololin) som huvudkomponent i lipidmatrisen som bildar den lipidbiayer som stöds. Späd alla andra lipidarter i denna DOPC-lösning.
2. Använd mellan 0,2 och 1 mol% av 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) konjugerad till färgämnen, inklusive ATTO 390, 488 eller 565 (se tabellen över material), för att generera BSLB med inneboende fluorescens.
   OBS: BSLBs inneboende fluorescens underlättar identifieringen av enstaka BSLB och enskilda celler i synaptiska överföringsexperiment.
3. Använd 12,5 mol% av 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-karboxoxypentyl) iminoacetic syra) succinyl]) för att förankra his-märkta proteiner. Håll mol% av DGS-NTA(Ni) konstant och utför 2-faldiga titreringar av de his-märkta proteinerna från och med 100 nM som den högsta koncentrationen. Lämna ett tillstånd utan protein som en negativ kontroll för absoluta kvantifieringar.
   OBS: Tillbehörssignaler och vidhäftningsmolekyler, såsom ICAM-1, är utformade med en 12-hans tagg för att öka proteinets affinitet för DGS-NTA(Ni).
4. Använd Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) för att förankra biotinylerade proteiner via biotin-streptavidin-biotinbroar. Använd en 5-faldig seriell titrering av 0,4 mM Biotinyl Cap PE som täcker mellan 10 mol% och 0 mol% (som negativ kontroll). Håll koncentrationen av streptavidin och biotinylerade proteiner konstant (200 nM) i både kalibreringsexperiment och rekonstitution av syntetiska APC:er för synaptiska överföringsexperiment.
   OBS: Regressionsanalyserna av empiriska densiteter av biotinylerade proteiner över den sista mol% av Biotinyl Cap PE i lipidmatrisen (som också innehåller DGS-NTA(Ni) för att förankra his-märkta proteiner) kommer att definiera mol% som ska användas för att rekonstruera måltätheter av antigen.

4. Beredning av kompletterad HEPES buffrad saltlösning innehållande 1% serumalbumin

OBS: Kompletterad HEPES-buffrad saltlösning innehållande 1% humant serumalbumin (HBS/HSA) eller 1% bovint serumalbumin (HBS/BSA) krävs i tvätt- och proteinbelastningsstegen hos BSLBs (tabell 1). Förbered en 10x HBS-lagerlösning och arbetsbufferten så färsk som möjligt; förvaras i kylskåp och användas inom en månad. Medan BSA är ett billigare alternativ till HSA, Det ger effektiv blockering av Ni-kelaterande ^lipider13 och rekommenderas för hög genomströmning experiment.

1. Förbered en 10x lagerbuffertlösning av kompletterad HBS som innehåller 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glukos, 10 mM _CaCl2 och 20 mM _MgCl2.
   OBS: Upplösning av _MgCl2 är mycket exoterm och en brännrisk. Tillsätt detta salt långsamt och på en stor mängd lösningsmedel. Undvik att förbereda koncentrerade lösningar (dvs. 1 M) av dessa salter eftersom de tenderar att fälla ut med tiden, vilket gör deras exakta tillsats av arbetsbufferten svår.
2. Filtrera 10x-lösningen med en 0,22 μm filterenhet och håll den steril vid 4 °C.
3. För 500 ml HBS/har, ta 50 ml av den kompletterade 10x HBS-lösningen, justera pH till 7,4 vid behov och gör upp volymen till 483,4 ml med ultrapurvatten.
4. Tillsätt 16,6 ml 30% HSA-lösning till 483,4 ml HBS, pH 7,4.
5. För 500 ml HBS/BSA, lös upp 5 g BSA i HBS och inkubera vid 37 °C i 30 minuter. Blanda sedan försiktigt vid RT genom att invertera flaskan regelbundet tills det inte finns några synliga proteinkristaller eller klumpar.
6. Filtrera den resulterande lösningen från steg 4.5 med hjälp av en 0,22 μm filterenhet (se materialtabellen) och förvara den vid 4 °C.

5. Proteintäthetskalibreringar på BSLB

1. Innan du tar de 5,00 ±0,05 μm diameter icke-funktionaliserade kiseldioxidpärlor, blanda lagerlösningen väl och återanvänd alla stora klumpar av pärlor sedimenterade på botten av kolvarna.
   OBS: Kiseldioxidpärlor tenderar att sedimentera snabbt, vilket kan leda till räknefel. Blanda kraftigt genom pipettering upp och ner hälften av den maximala volymen för en P1000 mikropipett.
2. Späd 1 μL pärla lösning i 1 000 μL PBS, räkna pärlorna med hjälp av en hemocytometerkammare och beräkna deras koncentration per ml.
   OBS: Trypan blå färgning behövs inte för att visualisera kiseldioxidpärlor.
3. Beräkna volymen av kiselpärlor som behövs för 5 × ¹⁰⁵ slutliga BSLB per punkt i titreringen.
4. Överför den erforderliga volymen kiseldioxidpärlor till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerör.
5. Tvätta kiseldioxidpärlor tre gånger med 1 ml steril PBS, centrifugera pärlorna i 15 s på en bänkskiva mikrocentrifuge vid RT (vid fast varvtal).
   OBS: Undvik att störa pärlpellet när du tar bort tvättlösningen. En liten buffertkolonn påverkar inte spridningen av liposomerna som komponerar den liposommästarblandningen eftersom dessa också finns i PBS.
6. Förbered tre volymer av den liposommästarblandningen för att montera BSLB på de tvättade kiseldioxidpärlorna (t.ex. om den ursprungliga totala volymen kiseldioxidpärlor är 20 μL, förbered minst 60 μL av den liposommästarblandningen).
7. För Biotinyl Cap PE mol% titrationer
   1. Förbered lipidmasterblandningarna som innehåller 5-faldiga utspädningar av Biotinyl Cap PE.
      1. Späd ut 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% i en 100% DOPC-matris.
      2. Blanda varje Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt vid ett 1:1 (vol:vol) förhållande med en lösning på 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) så att en slutlig 12,5 mol av Ni-innehållande lipider finns i alla titrationer.
         OBS: De 12,5 mol% (vol:vol%) av Ni-innehållande lipider representerar den blandade lipidsammansättningen hos BSLBs där his-märkta proteiner också kan testas i parallella kalibreringar. Eftersom till exempel alla liposombestånd bereds med samma molarkoncentration, för att nå målblandningen med mol% i 200 μL slutlig liposomblandning, blanda helt enkelt 100 μL 25 mol % ni-innehållande DGS-NTA med 100 μL 100 mol DOPC.
   2. Överför 5 × ¹⁰⁵ tvättade kiseldioxidpärlor till 1,5 mL mikrocentrifugerör, så att en Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt monteras per rör.
   3. Tillsätt Biotinyl Cap PE mol% titrering masterblandningar till de tvättade kiseldioxidpärlorna och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner hälften av den totala volymen. Undvik att bilda bubblor, som i överskott förstör lipidbilayer.
   4. Tillsätt argongas (eller kväve) på röret som innehåller de nu formande BSLB: erna för att tränga undan luft och skydda lipiderna från oxidation under blandning.
   5. Tillsätt Argon till 0,4 mM lipidlager före lagring och manipulera med hjälp av en steril teknik.
      OBS: Anslut en liten slang till argon/kvävegascylindern. Innan du lägger gas i rören, justera gascylindriga regulatorn så att trycket inte är inställt högre än 2 psi. Anslut en steril pipettspets till utloppsslangen för att rikta gasströmmen inuti liposombuljongen i 5 s och stäng snabbt locket. När det gäller lipidlager, försegla rörets lock med paraffinfilm innan det lagras vid 4 °C.
   6. Flytta BSLB:erna till en vertikal laboratorieblandare med variabel vinkel (se materialtabellen) och blanda i 30 minuter vid RT med en orbital blandning av 10 varv/min.
      OBS: Detta steg förhindrar sedimentering av pärlor under bildandet av den stödda lipidbilayer.
   7. Snurra ner pärlorna genom att centrifugera i 15 s på RT på en bänkskiva minicentrifuge och tvätta sedan tre gånger med 1 ml HBS/HSA (BSA) för att avlägsna överflödiga liposomer.
   8. Blockera de bildade BSLB: erna genom att tillsätta 1 ml 5% kasein eller 5% BSA innehållande 100 μM _NiSO4 för att mätta NTA-platser och 200 nM streptavidin för att täcka alla biotin-förankringsplatser på BSLB: er enhetligt. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner halva den totala volymen och inkubera i den vertikala mixern i högst 20 min vid RT och 10 rpm.
   9. Snurra ner BSLBs genom att centrifugera i 15 s vid RT på en minicentrifuge på bänkskivan och tvätta sedan tre gånger med 1 ml HBS/HSA-buffert (BSA).
      OBS: Håll tvättade pärlor vertikalt med en liten volym tvättbuffert som täcker BSLBs. Undvik uttorkning av BSLBs eftersom luft kommer att förstöra lipidbilayer.
8. För titrering av his-märkta proteiner på 12,5 mol% av DGS-(Ni) NTA-innehållande BSLBs
   1. Förbered tre volymer liposom master mix som innehåller en slutlig 12,5 mol% av DGS-NTA(Ni).
   2. Använd den liposommästarblandningen för att återanvända de tvättade kiseldioxidpärlorna och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner hälften av den totala volymen. Undvik att bilda bubblor, vilket i överskott skadar lipidbilayer.
   3. Tillsätt argongas (eller kväve) på röret som innehåller de nu formande BSLB: erna för att tränga undan luft och skydda lipiderna från oxidation under blandning.
   4. Tillsätt Argon till 0,4 mM lipidlager före lagring och manipulera med hjälp av en steril teknik.
   5. Flytta BSLBs till den vertikala mixern och blanda i 30 min vid RT med orbital blandning vid 10 rpm.
   6. Snurra ner pärlorna genom att centrifugera i 15 s på RT på en bänkskiva minicentrifuge och tvätta sedan tre gånger med 1 ml HBS/HSA (BSA) för att avlägsna överflödiga liposomer.
   7. Blockera de bildade BSLB: erna genom att tillsätta 1 ml 5% kasein (eller 5% BSA) innehållande 100 μM _NiSO4 för att mätta NTA-platser på BSLBs. Blanda försiktigt och inkubera i den vertikala mixern i högst 20 min vid RT och 10 rpm.
   8. Tvätta tre gånger med HBS/HSA (BSA) för att avlägsna den överflödiga blockeringslösningen.
   9. I en ny U-botten 96-brunnsplatta förbereder 2-faldiga seriella utspädningar av proteinerna.
      1. Förbered en startkoncentration på 100 nM för det protein som är av intresse för en total volym på 200 μL HBS/HSA-buffert (BSA), fördela 100 μL av denna lösning i den första kolonnen och de återstående 100 μL ovanpå kolumn #2 som innehåller 100 μL HBS/HSA-buffert (BSA).
      2. Fortsätt med att seriellt överföra 100 μL från kolumn #2 till kolumn #3 och upprepa vid behov för att täcka alla titreringspunkter. Lämna den sista kolumnen i serien utan protein, eftersom detta kommer att användas som tom referens för kvantifiering.
   10. Återanslut de beredda BSLB:erna i en sådan volym att 5 × ¹⁰⁵ BSLB finns i 100 μL HBS/HSA-buffert (BSA).
   11. Överför 100 μL BSLB-suspensionen till brunnar på en andra U-botten 96-brunnsplatta, så att varje brunn får 5 × ¹⁰⁵ BSLBs.
   12. Snurra ner den andra plattan som innehåller BSLBs i 2 min vid 300 × g och RT och kassera supernatanten.
   13. Överför volymerna 100 μL från proteintitreringsplattan till plattan som innehåller sedimenterade BSLBs. Blanda försiktigt, undvik överskott av bubbelgenerering under pipettering och inkubera i 30 minuter vid RT och 1 000 varv/min med en plattskakapparat. Skydda mot ljus med aluminiumfolie.
   14. Tvätta plattan tre gånger med HBS/HSA(BSA) buffert med sedimenteringssteg på 300 × g i 2 min vid RT.
   15. Om det rekombinanta protein som används vid kalibreringen är direkt konjugerat till fluorokromer och har kända F/P-värden, fortsätt till steg 5.8.20.
   16. Om det rekombinanta protein som används vid kalibreringen är omärkt eller konjugerat till fluorokromer eller om ingen MESF-pärla är tillgänglig, använd Alexa Fluor 488 eller 647-konjugerade antikroppar med kända F/P-värden för att färga den proteinbelagda BSLB.
   17. Fläck med mättande koncentrationer av kvantifieringsantikroppar.
       OBS: Beroende på måluttrycksnivån varierar dessa mellan 5 och 10 μg/ml.
   18. Fläck i 30 min vid RT och 1 000 varv/min med en plattskakapparat. Skydda mot ljus med aluminiumfolie.
   19. Tvätta två gånger med HBS/HSA(BSA) buffert och en gång med PBS med sedimenteringssteg på 300 × g i 2 min vid RT.
       OBS: Använd PBS, pH 7.4 för att återanvända de tvättade BSLB:erna före förvärvet. Använd inte buffertar som innehåller protein, eftersom detta leder till bildandet av bubblor under automatisk blandning av prover med provtagare med hög genomströmning.
   20. Skaffa MESF-standarderna och se till att de ljusaste topparna finns kvar i det linjära detektionsområdet för kvantifieringsdetektorn (kanalen), som visas i figur 1B (vii).
   21. Skaffa proverna manuellt eller använd HTS. Om BSLBs används i 100 μL PBS och förvärvar 80 μL med ett flöde mellan 2,5 och 3,0 μL/s, en blandningsvolym på 100 μL (eller 50 % av den totala volymen om resuspensionvolymen är mindre), en blandningshastighet på 150 μL/s och fem blandningar för att säkerställa BSL.
   22. Exportera FCS-filerna.
   23. Fokusera på enskilda händelser för analyserna (figur 2A), eftersom dubbletter eller trillingar kommer att införa fel i bestämningen. Använd kapslingsidentifiering av enskilda händelser enligt protokollsteg 1.2.3.
   24. Mät MFI för varje MESF-fraktion (1-4) och subtrahera MFI för tomma pärlor för att extrahera korrigerade MFI (cMFI).
   25. Utför en linjär regressionsanalys för att extrahera MESF:s lutning (b) över cMFI som beräknas för MESF-standarder, som kommer att användas i steg 5.33.
   26. Extrahera MFI för varje titreringspunkt och subtrahera MFI av pärlor utan protein för att erhålla cMFIs.
   27. Dela cFI:erna med lutningen beräknad i steg 5.31 för att extrahera mesf som är bunden till BSLB för varje titreringspunkt.
   28. Dividera MESF som är bunden till BSLB med F/P-värdet för kvantifieringsantikroppen för att extrahera det genomsnittliga antalet molekyler som binds per BSLB.
   29. Använd BSLBs diameter (5,00 ± 0,05 μm) och extrahera pärlans yta (SA = ^4pr2) för att beräkna den slutliga densiteten av protein (molec./^μm2) per titreringspunkt (proteinkoncentration).
   30. Utför en ny regressionsanalys av proteinkoncentrationen över proteintätheten för att beräkna lutningen (b) för linjen för bästa passform.
       OBS: Koncentrationen av 12,5 mol% av DGS-NTA(Ni) ger en maximal förankringskapacitet på cirka 10 000 mol./^μm210 utan att inducera ospecificerad aktivering av T-celler eller påverka SLB:s laterala rörlighet.

6. Utföra synaptiska överföringsexperiment mellan T-celler och BSLB

1. Innan du kör det synaptiska överföringsexperimentet
   1. Skaffa icke-fluorescerande BSLB, BSLB med fluorescerande lipider, oförstådda celler (eller kompensationspärlor; se tabellen över material) och enfärgade celler (eller kompensationspärlor) för att identifiera instrumentets fluorescensspektruminteraktioner. Fokusera på de detektorer med hög spridningsspridning för att omforma den polykromatiska panelen, öka känsligheten och minska mätfelet på kritiska detektorer (se ¹⁴).
   2. Titrera detektionsantikropparna för att hitta den optimala koncentrationen, vilket möjliggör identifiering av positiva händelser utan att äventyra detektion av negativa.
      OBS: Upprepa detta steg när det finns ett antikroppsparti som ändras eftersom F/P-värdena och ljusstyrkan varierar från parti till batch.
   3. Valfritt: Optimera PMT-spänningarna genom att förvärva provet vid olika spänningsområden (dvs. en spänningsvandring) för att hitta DE PMT som leder till optimal signal över brus (dvs. separation av negativ och positiva samtidigt som signalen från den ljusaste befolkningen förblir i det linjära intervallet).
2. Mätning av överföring av T-cellsutgång till BSLB
   1. Förbered kompletterat RPMI 1640 (häri R10 medium) som innehåller 10% värmeinaktiverat fetalt bovinserum (FBS), 100 μM icke-essentiella aminosyror, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyveuvat, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin. Använd R10 medium för att odla och expandera T-celler.
   2. På dag 1 isoleraR du T-celler från perifert blod eller lakoreduktionssystem (LRS) kammare. Använd immundensitetscellisolerings- och separationssatser (se tabellen över material) för anrikning av mänskliga CD4⁺ och CD8⁺ T-celler.
   3. Frö cellerna vid en slutlig koncentration som sträcker sig mellan 1,5 och 2,0 × ¹⁰⁶ celler/ ml, med 6-brunnsplattor med högst 5 ml totalt per brunn.
   4. Aktivera T-celler med hjälp av ett 1:1-förhållande mellan mänskliga T-cellsaktivering (anti-CD3/anti-CD28) magnetiska pärlor (se tabellen över material) och tillsätt 100 IE rekombinant human IL-2 för att stödja cellproliferation och överlevnad.
   5. På dag 3, ta bort de aktiverande magnetiska pärlor med hjälp av magnetiska kolumner (se tabellen över material). Se till att magnetiska pärlor förblir fästa på rörets sidor innan du återställer cellerna för ytterligare tvättsteg.
   6. Tvätta de magnetiska pärlorna igen med 5 ml färskt R10-medium, blanda väl och sätt tillbaka dem i magneten . Återställ denna volym och blanda med de celler som återvinns i steg 6.2.5.
   7. Återsuspend cellerna till 1,5-2 × ¹⁰⁶ celler/ml i färsk R10 innehållande 100 U/ml IL-2. Fyll på medium efter 48 h, se till att det sista tillskottet av IL-2 är 48 h före experimentdagen (dag 7 till 14 av kulturen).
   8. På dagen för det synaptiska överföringsexperimentet bereder du det synaptiska överföringsanalysmediet (se tabell 1) genom att komplettera Phenol Red-free RPMI 1640 medium med 10% FBS, 100 μM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin. Inkludera inte rekombinant människa IL-2.
   9. Räkna celler med antingen trypan blå färgning eller elektrisk strömuteslutning och återanvänd dem till en slutlig koncentration av 2,5 × ¹⁰⁶ celler/ml i medium. Om överdriven celldöd observeras (>10%), avlägsna döda/döende celler med en blandning av polysackarider och natriumdiatrizoat (se materialförteckningen) enligt följande:
      1. Lager 15 ml cellodling ovanpå 13 ml av lösningen polysackarider-natriumdiatrizoat.
      2. Centrifugera i 1 250 × g i 20 min vid RT med minimal acceleration och retardation. Samla cellskiktet (molnet) i gränssnittet mellan mediet och polysackarider-natriumdiatrizoatlösningen.
      3. Tvätta cellerna minst två gånger med förvarnat Synaptic Transfer Assay medium (beredd i steg 6.2.7).
      4. Räkna och återanvända cellerna till en slutlig koncentration på 2,5 × ¹⁰⁶/ml med hjälp av Synaptic Transfer Assay medium. Cokultur 100 μL av denna cellfjädring med BSLBs (se steg 6.2.15).
   10. Beräkna antalet BSLB som behövs för experimentet. överväga att alla de olika proteinmasterblandningarna och antigentitreringarna ska testas (antingen biotinylerade HLA/MHC-peptidmonomerer eller monobiotinylerade anti-CD3ε Fab).
   11. Montera BSLBs genom att följa samma steg från protokoll avsnitt 5 men den här gången kombinera alla titreringar av proteiner och lipider som krävs för att rekonstruera ett komplext APC-membran (figur 3A). Håll samma vol: vol-förhållanden mellan den ursprungliga kiseldioxidpärlorvolymen och volymen av proteinblandning som används under kalibreringar, samt tider och temperaturer som används vid lastning av BSLBs. Om till exempel 0,5 μL kiseldioxidpärlor/brunn och 100 μL/brunn av proteinblandning användes för den första kalibreringen, bibehålla förhållandet 5:1 000 vol:vol för att förbereda BSLBs för att kokulkuleras med T-celler.
   12. När BSLBs har laddats med proteinblandningen av intresse, tvätta BSLBs två gånger med HBS/HSA (BSA) för att avlägsna överskott av obundna proteiner. Använd sedimenteringshastigheter på 300 × g i 2 min vid RT i varje tvättsteg och kassera supernatanterna.
   13. Återsuspend de 5 × ¹⁰⁵ BSLBs per brunn i 200 μL.
   14. Överför 100 μL per brunn till en ny U-botten 96-brunnsplatta för att göra en dubblett, så att den slutliga mängden BSLB per brunn är 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Snurra ner BSLBs på 300 × g i 2 min och RT och kassera supernatanten.
   16. Återanvänd BSLB:erna med hjälp av 100 μL T-cellsuspension. blanda försiktigt för att förhindra bildandet av bubblor.
   17. Inkubera kokulturerna i 90 min vid 37 °C.
       OBS: Alternativt kan celler och pärlor återanvändas i HBS/HSA (BSA) buffert istället för Fenol-Röd fri RPMI för kokulturen. I detta fall måste inkubationen utföras i en icke-CO2-inkubator eftersom denna gas snabbt kommer att försura bufferten i avsaknad av bikarbonat.
   18. Kyl ner BSLB-T-cellmikrorna genom att först inkubera cellerna på RT i minst 15 minuter. Skydda dem från ljus.
   19. Centrifugera cellerna i 5 min vid 500 × g och RT; kassera supernatanten.
   20. Återanvänd cellerna i RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ och ^Mg2+-free) för blockering. Placera cellerna på is i 45 minuter. Skydda mot ljus.
   21. Vid inkubation av cellerna, förbered antikropps masterblandningen med iskall 0,22 μm-filtrerad 2% BSA i PBS som en färgbuffert, vilket ger extra blockering.
       OBS: Vissa partier av antikroppar som konjugerats till briljanta violetta färgämnen tenderar att binda till BSLBs icke-specifikt. Blockering med 5% BSA-PBS hjälper till att minska detta brus. Från och med nu, se till att hålla kylkedjan obruten.
   22. Snurra ner kokulturerna vid 500 × g i 5 min och 4 °C. Innan du kasserar supernatanterna, se kort till att pelleten är närvarande genom att inspektera botten av 96-brunnsplattan med hjälp av en bakgrundsbelysning.
   23. Använd en flerkanalspipett och återanvänd cellerna i färgningsblandningen som innehåller optimerade antikroppskoncentrationer.
       OBS: Använd pipettspetsar utan filter för att förhindra uppkomst av bubblor och fel i fördelningen av färgningsvolymer.
   24. Inkludera isotypmärkta celler och BSLBs, fluorescerande och icke-fluorescerande BSLBs och celler och BSLBs färgade ensamma. Respektera det totala antalet händelser per brunn för alla kontroller (dvs. endast BSLB som innehåller 5 × ¹⁰⁵ BSLB/brunn, och endast cellkontroller som innehåller 5 × ¹⁰⁵ celler/brunn för att undvika en relativ ökning av antikroppar per betsad händelse).
   25. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner halva volymen och inkubera i 30 minuter på is. Skydda mot ljus.
   26. Tvätta cellerna och BSLB två gånger med iskall 2% BSA-PBS, pH 7,4 och sedimenteringssteg på 500 × g i 5 min vid 4 °C. Återanvänd de tvättade kokulturerna i 100 μL PBS och förvärva omedelbart.
   27. Om fixering behövs, fixera med 0,5% w/v PFA i PBS i 10 min, tvätta en gång och förvara i PBS tills det förvärvas. Skydda mot ljus.
   28. Innan kompensation, förvärva MESF-standarder, vilket säkerställer att både de dimmigaste och ljusaste populationerna faller i det linjära mätområdet.
   29. Hämta kompensationsprover, beräkna kompensation och tillämpa kompensationsmatrisen (länken) på experimentet.
   30. Förvärva och spara minst 2 × ¹⁰⁴ mesf-standarder totalt för var och en av kvantifieringskanalerna.
   31. För förvärv med provtagare med hög genomströmning, sätt instrumentförvärvet på standard, sätt provförvärv till 80 μL (eller 80 % av den totala volymen), provflödeshastigheten mellan 2,0 och 3,0 μL/s, provblandningsvolym på 50 μL (eller 50 % av den totala volymen för att undvika bildning under blandning), provblandning av 150 μL/s och blandning per brunn mellan 3 och 5.
   32. Skaffa minst 1 × ¹⁰⁴ enskilda BSLB per prov (se figur 3B-paneler i)-vi för referensgitterstrategin).
   33. Tvätta cytometern som körs i 5 min en rengöringslösning följt av 5 min ultrapurvatten innan du stänger av instrumentet. Om du använder HTS följer du alternativen under fliken HTS och alternativet Rensa .
   34. Exportera FCS-filer.

7. Mätning av synaptisk överföring av partiklar till BSLB

1. Öppna experimentet FCS filer. Välj populationen av celler och BSLB baserat på deras sida och framåt ljusspridningsområden (SSC-A kontra FSC-A), som visas i figur 3B (i).
2. Välj händelser i fönstret för kontinuerligt förvärv (bild 3B (ii).Select the events within the continuous acquisition window (Bild 3B (ii)).
3. Fokusera på de enskilda händelserna i både celler och BSLB; identifiera enskilda celler först baserat på lågt W i sekventiella grindar FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 3B panel iii)) och SSC-W/SSC-H (singlets-2; Bild 3B-panelen (iv)). Definiera ytterligare en singlets-3-grind genom att välja händelser med proportionella FSC-A och FSC-H (bild 3B, panel (v)).
4. Extrahera MFI av MESF-fraktioner tomma och 1 till 4 och från enstaka celler och MESF för varje experimentprov.
5. Generera korrigerade MFI-värden (cMFI) för MESF-fraktioner 1 till 4 genom att subtrahera MFI för den tomma pärlpopulationen från varje fraktion.
6. Generera cFI för enskilda BSLB och celler (se figur 3C-panelen (i)).
7. Använd signalen från BSLB färgade med isotypkontrollantikroppar för att korrigera MFI för BSLB färgat med antikroppar mot relevanta T-cellmarkörer. Använd cMFI för att beräkna den normaliserade synaptiska överföringsprocenten (NST%) med hjälp av ekvationen som visas i bild 3C-panelen (ii).
8. Om du i stället är intresserad av de partiklar som specifikt överförts som svar på TCR-utlösning, subtrahera signalen från null BSLBs från MFI av agonistiska BSLBs.
9. Om du är intresserad av att bestämma det totala antalet molekyler som överförs som partikellast över T-cell-BSLB-gränssnittet, förvärva MESF-benchmarkpärlor med samma instrumentinställningar och förvärvssession för T-cell-BSLB-kokulturer.
10. Analysera MESF pärla populationer och extrahera deras cMFIs som anges i protokoll steg 5.8.15 till 5.8.17. Beräkna lutningen på den linje som passar bäst för regressionsanalysen av MESF över cMFI.
11. Använd den beräknade lutningen för att extrahera antalet MESF som deponeras på BSLBs. Använd cMFIs beräknade med antingen isotypkontroller eller null BSLB som ämnen för att extrahera antalet MESF som överförs specifikt till stimulerande BSLB.
12. Beräkna antalet molekyler av markörer som överförs till BSLB genom att dividera de beräknade (genomsnittliga) MESF:erna per BSLB med kvantifieringsantikroppens F/P-värde.

Representative Results

FCM för absolut proteinkvantifiering på cellytan
Rekonstitution av BSLBs presenterar fysiologiska densiteter av ligands kräver uppskattning av totala proteintätheter på den modellerade cell delmängd. För att rekonstituera BSLBs, inkludera alla relevanta ligand förväntas spela en roll i signalaxeln av intresse tillsammans med proteiner som stöder vidhäftning och funktionell interaktion mellan BSLB och celler, såsom ICAM-1 och costimulatoriska molekyler, t.ex. CD40, CD58 och B7-receptorer (CD80 och CD86). Ytterligare proteiner kan tillsättas beroende på den aktuella frågan, inklusive costimulatoriska molekyler som ICOSL3, PD-L1 och PD-L215. För andra molekyler, rekonstituerade BSLB med molekylär densitet som bestäms genom att direkt analysera celler med kvantitativ flödescytometri. För direkt konjugerade antikroppar tillhandahåller BioLegend F/P-värden för varje antikroppspartinummer. Antikroppar kan också märkas internt och F/P-förhållanden som bestäms av spektrofotometri, vilket ger ett alternativ när det inte finns några kommersiella antikroppar som är konjugerade med önskad fluorokrom. Eftersom vi använder samma antikroppar för att kalibrera antalet rekombinanta proteiner på ytan av celler och BSLB, finns det inget behov av att korrigera den antikroppsbindande valensionen eftersom detta förblir konstant. Om den antikroppsbindande valenensen krävs, använd både rekombinanta proteiner och antikroppar med kända F/P för att dekorera BSLB och jämföra molekyler av laddade rekombinanta proteiner med antalet bundna antikroppar efter färgning under mättande förhållanden.

De bundna antikroppsmolekylerna per cell kan uppskattas med hjälp av en särskild monokromatisk flödescytometrisk mätning eller en polykromatisk panel av antikroppar avsedda att uppskatta absoluta proteintätheter på en relativt sällsynt delmängd av celler i en vävnad av intresse, såsom palatin tonsiller. Figur 1 visar representativa mätningar av densiteter av ICAM-1 i CXCR5 + B-celler och follikulära T-celler (TFH) som ett exempel. Samma färgningsprotokoll och flödescytometrianalysprinciper som visas i figur 1A kan användas för att mäta proteintätheter på epitelceller, stromalceller, monocyter, monocytbaserade dendritiska celler (moDC) eller på B- och T-lymfocyter i andra mänskliga vävnader och musvävnader. För vävnader som skiljer sig från blod och tonsiller måste försiktighet iakttas när man isolerar celler med hjälp av proteascocktails, eftersom den långvariga exponeringen av celler för smältande enzymer minskar nivåerna av cellytans uttryck.

Fokusera förvärvet och analyserna på enstaka, levande celler inom det kontinuerliga förvärvsfönstret (figur 1A ii), som händelser utanför tidskontinuum sprider avvikande ljus, vilket äventyrar kvantifieringen. För att öka noggrannheten i bestämningar, minska den ospecificerade färgningen av APC genom effektiv blockering av FcγRs. Det mänskliga serumet och EDTA som finns i hFCB möjliggör effektiv FcγR-blockering samtidigt som frigör fri ^Ca2+ för att minska den spontana aggregeringen av celler under deras manipulering och färgning (svarta pilar i figur 1A (iii) och (iv) visar återstående dubbletter i suspensioner av tonsillärceller).

Att hålla reda på instrumentets prestanda genom att använda installationspärlor och spårningspärlor och programvaran (eller liknande; se materialförteckningen) är avgörande för reproducerbarheten av kvantifieringar över tid, särskilt i senare steg när den synaptiska överföringen av partiklar till BSLB mäts med endast MFI (dvs. för fluorokromer för vilka det inte finns några MESF-standarder). Kontrollera på samma sätt det linjära intervallet (dvs. linjäritetsminimum och linjäritets maximum) för godtyckliga fluorescensenheter för kvantifieringsdetektorn som ska användas tillsammans med MESF-standarderna så att varje kalibreringspunkt behåller det linjära förhållandet mellan fluorescens och antalet fluorokromer.

Beredning av prover "tomma" för fluorescens, eller prover som ger en uppfattning om bakgrundsfärgningsljudet, är avgörande för att subtrahera den ospecificerade fluorescerande signalen. Isotypkontroller och/eller biologiskt nollprover (t.ex. knockouts) är nödvändiga för att korrigera för cellernas bakgrundssignal och extrahera den sanna signalen som härrör från kvantifieringsantikropparna (figur 1A-panelen viii). På samma sätt använder standard MESF-pärlor en särskild tom population för att subtrahera bakgrundssignalen från varje verkligt positiv pärlpopulation (figur 1B-paneler (vii) och (viii)). När regressionsanalyserna har utförts och lutningen som definierar förhållandet mellan MESF och korrigerade MFI extraheras, följer omvandlingen till absoluta molekylära densiteter enkla matematiska operationer (figur 1C).

För att uppskatta CSA i figur 1C användes elektrisk strömuteslutning (CASY-TT) för att extrahera mätningar av cellvolym och diameter från tusentals celler. Den resulterande CSA som uppskattas vid beräkningen av ytan för sfärer (^4pr2) varierar med cellernas aktiveringstillstånd, med observerade värden på 170,37 ± 4,91 ^μm2 för icke-aktiverade B-celler och 234,52 ± 1,53 ^μm2 respektive 318 ± 24,45 ^μm2 för icke-aktiverade respektive aktiverade T-celler. Dessa CSAs är jämförbara med de som uppskattas av bildframställning tekniker såsom tredimensionella brytning index tomografi av nonactivated ^lymfocyter16.

När intervallet av fysiologiska densiteter har definierats (t.ex. genom att jämföra yttätheter på celler som genomgår olika aktiveringsprogram) kan BSLB användas för att modellera dessa ytor. En titrering av biotinylerade antigena HLA-peptidmonomerer som tillhandahålls av NIH-tetrameranläggningen (eller monobiotinylerade monomeriska anti-CD3ε-Fab) kan användas tillsammans med ICAM-1 12-His för att rekonstruera ett kanoniskt APC-membran. Kommersiella proteiner märkta med 6, 9, 12 och 14 His kan användas för att dekorera ytan på BSLB (se figur 2A för exempel med ICAM-1 12-His). Proteintitreringar tillsammans med kvantitativa FCM-analyser ger en robust metod för att rekonstruera fysiologiska APC-ytor och testa deras effekt på synaptiska utdata från olika T-cellsundergrupper.

För att studera produktionen av T-cellssynapser, använd ett 1:1 BSLB-till-T-cellförhållande för att säkerställa att en cell i genomsnitt interagerar med en BSLB under den studerade perioden. Vi har observerat att materialöverföringen är proportionell mot inkubationstiden, vilket ger en mångsidig plattform för att upptäcka molekyler som överförs i låga mängder över cellen: BSLB-gränssnittet. En lämplig paneldesign är därför avgörande för att öka känsligheten och tillförlitligheten hos detektion av transsynaptiskt material, som när det gäller tv-apparater varierar utgången mellan 25 och 36 blåsor/cell/20 ^min2,3. Testa först spektralspillet av varje fluorokrommärkt antikropp och lipid. När hög spridning observeras rekommenderar vi titrering av färgning antikroppar och procenten av fluorescerande lipider som utgör BSLB, samt PMT spänning promenader för att minska spridningsfelet på kompenserade prover och förbättra signalen över bullerförhållande, respektive (se till12,14,17 för en dedikerad introduktion till ämnet).

Användningen av kvantifieringskontroller, inklusive null BSLB (som saknar antigen eller anti-CD3 Fab) och antingen knockoutceller eller isotypmärkta ^prover18, är avgörande för att noggrant mäta överföringen av effektor tSV, såsom SEs, samt supramolekylära attackpartiklar som frigörs inom synaptisk klyvning. Använd mycket rikliga cell-ytproteiner som CD4, CD2 eller CD45 tillsammans med syntetiska fluorescerande lipider (DOPE Atto konjugat) för att identifiera populationen av enstaka celler och BSLB vid kallbaserad dissociation av konjugat. Fokusera analyserna på det geometriska medelvärdet eller medianvärdet av fluorescensintensiteter i enstaka BSLB och celler (CD4 används i figur 3B). SEs är en specialiserad typ av tSV som härrör från plasmamembranet (PM), och deras överföring till BSLB framgår av förstärkningen av markörsignal på BSLB med konsekvent förlust av signal på ytan av de interagerande cellerna (se TCR på BSLBs som visas i figur 2B, violetta pilar). Null BSLBs saknar antingen antigen eller anti-CD3 är en utmärkt referens för att hålla reda på den specifika insamlingen av TCR (och andra T-cellmarkörer) på BSLB som härrör från stimulerande interagerande celler via deras TCR-komplex.

Figur 1: Absolut kvantifiering av proteiner på ytan av APC: er. (A) Exempel på kvantitativa flödescytometrimätningar av ICAM-1 på ytan av tonsillär B-celler (Foll. Bc) och hjälpare T-celler (TFH). (i-vii) Gating strategi för att analysera enstaka CXCR5 ⁺ Bc och TFH isolerade från mänskliga palatin tonsiller. Visas är den sekventiella gating-strategin för att identifiera enskilda livehändelser som ingår i det kontinuerliga fönstret för förvärv. iii-iv) svarta pilar anger dubbletter. viii) överdragna histogram som visar cellytans uttryck för ICAM-1 (kricka histogram) jämfört med FMO-kontroller (grå histogram) och FMO-kontroller märkta med relevanta isotyper (svarta histogram, som överlappar de grå histogrammen) hos de populationer som visas i (vii). Pilar anger riktningen för den kapslade gatingstrategin som används för att identifiera CXCR5⁺ B-celler (Bc; CD19⁺) och TFH (CD4⁺). (B) Extraktion av absoluta molekyler på ytan av tonsillärceller från MFI kräver regressionsanalyser av MESF-benchmarkpärlor som förvärvats med samma instrumentinställning som de celler som visas i A. (i-v) Visas är den sekventiella gating-strategin för att identifiera enskilda livehändelser som ingår i det kontinuerliga fönstret för förvärv. vi) Gating och mätning av MFI från olika standardpopulationer av MESF. vii) visas överlagda histogram av de MESF-populationer som identifierats i vi. De värden som visas längst upp till höger representerar MFI:erna för var och en av de 5 MESF-populationerna (tom, 1, 2, 3 och 4). viii) Linjär regression av MESF över cMFI för mesfpopulationerna som visas i (vii). Visas är lutningen (b) för att extrahera MESF som är bunden till celler från data i A. C) Vid extraktion av antalet molekyler, följ enkla matematiska operationer som börjar med tillämpningen av lutningen beräknad i viii från uppmätt MESF cMFI (cMFIM) och referens MESF-värden (MESFR). Om du vill extrahera mesf som är bunden till celler (_MESFcells) delar du den korrigerade MFI:et av celler (cMFIcells) med den beräknade lutningen. Sedan för att beräkna antalet molekyler bundna till celler (Molec. _celler), dela _MESFcells med F/P av detektionsantikroppen (kvantifiering). Slutligen, för att beräkna den molekylära densiteten på ytan av celler (_Dcells), dela Molec. _celler av den uppskattade cellytan (CSAE). Förkortningar: X = oberoende variabel; Y = beroende variabel (uppmätt fluorescens), _cMFIM = uppmätt korrigerad MFI; _MESFR = REFERENS MESF-värden; _MESFcells = uppskattad MESF per cell; _cMFIcells = korrigerade MFI-celler; Molec. _celler = uppskattade molekyler per cell. _Dcells = uppskattad densitet på celler; _CSAE = uppskattad cellyta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2: Rekonstitution av BSLB med rekombinant ICAM-1 och mätning av partikelöverföring till BSLBs. (A, i-vi) Flödescytometrianalys av BSLB rekonstituerad med ökad densitet av rekombinant monomerisk ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Liksom i figur 1, fokusera gatingstrategin på enskilda BSLB inom det kontinuerliga fönstret för förvärv. Observera gapet omedelbart före tidskontinuumporten, som uteslöts för att förhindra mätfel. vi) God proteinkvalitet resulterar ofta i en homogen beläggning av BSLB vid höga koncentrationer, med observation av smala fluorescensfördelningar (låg variationskoefficient, se histogram i vi). (B) Regressionsanalyser av ICAM-1 referenskoncentration (_CR) över uppmätt densitet (_DM). Använd lutningen för att beräkna målkoncentrationer av protein (_CT) för att uppnå densiteten hos celler (_Dcells) mätt i experimenten i figur 1. Förkortningar: 12-His = 12-histidines tagg; _DM = uppmätta molekylära densiteter; _CR = referenskoncentrationer av rICAM-1; _CT = målkoncentration (som ska interpoleras). _Dcells = densitet mätt i celler (se även Fig. 1C). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Mätning av T-cellssynaptiska partiklar som överförts till BSLB. (A; i-v) Flödesdiagram som visar de kritiska stegen för samodling av T-celler med BSLBs rekonstituerande modellmembran och efterföljande mätning av partikelöverföring med flödescytometri. iv) Blå och mörkgula diagram visar den relativa fördelningen och placeringen av celler och BSLB i biparametriska flödescytometridiagram. v) Fluorescensfördelnings histogram som visar den relativa vinsten av fluorescens av agonistiska BSLB (mörkgul) jämfört med null BSLBs (grå). B) Föredömligt synaptiskt överföringsexperiment. (i-vi) Visas är gating-strategin för att identifiera enskilda BSLB och celler i fönstret för kontinuerligt förvärv. Violetta pilar anger analysriktningen, som fortsätter i C. (C) (i) Fokusera analyserna på MFI för enstaka celler (blå) och enstaka BSLB (gul). (ii) Ekvationer för att beräkna den normaliserade synaptiska överföringen (NST%, top) och _Tmax% (nedersta) från cMFI beräknad för BSLB och celler. iii-vi) Överdragna histogram som visar förändringen av fluorescensintensitetsfördelningar för celler (blå nyanser) och BSLB (gula nyanser) över olika densiteter hos T-cellen som aktiverar anti-CD3ε-Fab, inklusive icke-aktiverande (grå) och aktiverande med antingen 250 (mjukt färgvärde) eller 1 000 (högt färgvärde) molec./^μm2. Tal i olika färgvärden representerar NST% mätt för BSLB-histogrammen som visas i gult. De överdragna histogrammen visar den övergripande hierarkin i den synaptiska överföringen av T-cellsblåsor positiva för olika markörer. För denna sammansättning av BSLB (200 molec./^μm2 av ICAM-1 och ökande densitet av anti-CD3ε-Fab) överförs TV-apparater till BSLB med TCR⁺(iii) > CD81⁺(iv) > CD4⁺(v) > CD28⁺(vi). Som framgår av tidigare artiklar är TCR och CD81 komponenter i betydande betydande företag och överförs med jämförelsevis högre effektivitet till CD4, trots att den senare uttrycks på jämförelsevis högre ytnivåer. SE-utgjutning resulterar i förlust av cellytan CD81 och TCR och vinsten av dessa signaler på BSLB (öppna lila pilar för 250 molec./^μm2 och slutna lila pilar för 1 000 molec./^μm2 i gula histogram). D) Felaktig nedkylning av konjugat leder till att celler sliter av SLB från kiseldioxidpärlor sett från jämförelse av ingångspärlor (vänster biparametriskt område) och konjugateringar som utsätts för snabb nedkylning till 4 °C från 37 °C (höger biparametriskt område). Jämför också med figur 3B-panelen (vi). Förkortningar: PRF1 = perforin 1; NST% = normaliserad synaptisk överföring; _Tmax% = procent av maximal observerad överföring (i kontroll- eller referenstillstånd); tSV: transsynaptiska blåsor; SEs: synaptiska extosomer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Tabell 1: Buffertar som används i det här protokollet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

BSLBs är mångsidiga verktyg för att studera partikelproduktionen hos T-celler stimulerade med modell APC-membran. Metodens flexibilitet gör det möjligt att rekondrera komplexa och reduktionistiska membrankompositioner för att studera effekterna av ligands och deras signaler på utsöndringen av tSV och supramolekylära attackpartiklar och deras komponenter. Vi har testat denna teknik på olika T-celler, inklusive föraktiverad TH, CTL, Tregs och ^CART15. Detta protokoll fungerar också för mätning av synaptisk partikelutsläpp av nyisolerade och quiescent T-celler. En begränsning med att använda nyisolerade T-celler är att dessa quiescenta populationer producerar en annan profil av transsynaptiska partiklar, vilket korrelerar med deras cellytakomposition (se ¹⁵ för mer information).

Som en enkel flöde cytometri panel, rekommenderar vi användning av anti-TCR klon IP26, anti-CD81 klon 5A6, anti-perforin (PRF1) klon B-D48 eller anti-CD40L klon 24-31, och ATTO 390 eller ATTO 565-innehållande lipider (för att ge BSLBs en inneboende fluorescens). För att hjälpa till att diskriminera enstaka celler från enstaka BSLB och konjugat rekommenderar vi användning av anti-CD4 klon OKT4 och/eller anti-CD45 klon HI30, som överförs till BSLBs på begränsade nivåer trots att de uttrycks på mycket höga nivåer på cellytan (se Tabell över material för ytterligare information om fluorokromer och andra validerade antikroppar). Paneler med ett högre antal fluorokromer kan konstrueras men kräver en systematisk utvärdering av fluorescensspektrumspill av varje analyserad fluorokrom. För att öka känsligheten, prova olika titreringar av kvantifieringsantikroppar från 0,5 μg till 20 μg/ml slutlig och upprepa när nya lager av antikroppar används. För att säkerställa reproducerbarheten av de absoluta och relativa mätningarna av partikelöverföring titrera och beräkna bindningskapaciteten för varje nytt parti biotinylerade och Ni-innehållande fosfolipider, eftersom de kan skilja sig avsevärt från parti till parti. Den gradvisa nedkylningen av T-cell-BSLB konjugat är avgörande för att öka känsligheten för detektion av partiklar med låg förekomst. Den snabba nedkylningen av kokulturer leder till destruktion av BSLB, vilket framgår av den betydande förlusten av lipidfluorescens (figur 3D).

Olika mätvärden kan användas för att mäta partikelproduktionen av T-cells immunsynapser beroende på den experimentella frågan. Till exempel, när mindre skillnader förväntas i baslinjen uttrycksnivåer av ytproteiner sorterade i spirande SEs, kan en normaliserad synaptisk överföring (NST%) metrisk användas (figur 3C panel (ii) toppekvation). Den senare kvantifierar procent MFI-signalen på BSLBs som en funktion av den totala, kombinerade MFI av celler och pärlor. En varning från detta tillvägagångssätt är analysen av överförda markörer som inte uttrycks på pm, såsom komponenter i supramolekylära ^{attackpartiklar19}. Eftersom dessa element når BSLBs av vägar oberoende av PM transitering, såsom intracellulär lagra exocytos, rekommenderas inte beräkningen av NST% eftersom resultatet kommer att blåsas upp eftersom täljaren kommer att delas med en jämförelsevis liten nämnare (cellytans uttrycksnivå). Använd i stället korrigerade MFI för att jämföra deponering av perforin och granzymer mellan null BSLBs och BSLB som uppvisar ökande densitet av antigen eller anti-CD3 Fab. Alternativt, för att spåra intracellulära element som överförs till BSLB, använd för jämförelse antingen de uppskattade absoluta molekylerna som överförts eller procenten av signalen med avseende på den maximala signalen som överförs till BSLBs (_Tmax%) (figur 3C panel (ii) bottenekvation). För _Tmax%, använd antingen cMFI eller molekyler som mäts på BSLB-provet (eller tillståndet) som uppvisar den högsta antigentätheten som referens _Tmax. När du analyserar olika givare, använd donatorspecifik _Tmax för jämförelser. Vid studier av det material som överförts som svar på den specifika utlösningen av TCR kan MFI också korrigeras till den nivå av bakgrundsöverföring som observerats på antigennegativa (null) BSLB.

Att uppskatta det absoluta antalet molekyler som överförs till BSLB är en mer robust metod, eftersom det innebär MESF-kalibrering med mätning av molekyler som endpoint och en bättre jämförelse av oberoende experiment. _Tmax% erbjuder en liknande normalisering över oberoende experiment och är särskilt användbart vid användning av polykromatisk FCM för intracellulära markörer, såsom perforin och granzymer, eller för markörer för vilka ingen MESF-standard är tillgänglig. _Tmax% är helt enkelt den procentandel av signalen i ett givet tillstånd till det tillstånd som har den högsta överföringen i kontrolltillståndet (t.ex. fordons-/obehandlade kontroller för läkemedelsstudier, kontrollguide RNAs för CRISPR/Cas9-bibliotek). Vidare kan _Tmax% användas för både cMFIs och ett absolut antal molekyler och har varit särskilt användbart för jämförelser sida vid sida av effekterna av genborttagningar på den synaptiska produktionen av T-celler. Det senare är uppenbart när genredigering leder till hög variation i det dynamiska området av immunreceptoruttryck bland oberoende givare och experiment, vilket kan påverka absoluta och NST% mätningar.

BSLBs har underlättat fångst och karakterisering av den synaptiska utdata av olika T-celltyper, som annars är svåra att isolera på grund av deras snabba internalisering av ^APCs2. BSLBs fysiska stabilitet ger också en plattform för fluorescensaktiverad cellsortering av BSLB som har undersökts av T-celler, vilket möjliggör biokemisk karakterisering av mycket rena partikelpreparat med hjälp av masspektrometri och nukleinsyrasekvenseringsteknik. Den senare underlättar den detaljerade karakteriseringen av intercellulära budbärare som kastas av T-celler under ett brett spektrum av experimentella förhållanden. Olika frågor kan behandlas, bland annat hur dessa partikelbudbärare förändras mellan olika T-celltyper och aktiveringstillstånd, hur kanoniska och icke-biologiska antigenreceptorer (dvs. chimeriska antigenreceptorer) och hur agonistiska och antagonistiska membransignaler påverkar partikelsammansättningen. Vi utvecklar för närvarande denna teknik ytterligare för kvantitativ karakterisering av cytokiner utsöndras vid immunsynapsen av stimulerade T-celler. Det senare kräver noggrann studie av kombinationer av rekombinanta cytokinreceptorer och antikroppar, vilket ger effektiv fångst av interleukiner, interferoner och kemokiner som deponerats på BSLBs efter T-cellsaktivering. BSLBs kan anpassas för att modellera ytsammansättningen hos andra APC: er som misstänks utlösa tSV-frisättning av T-celler, såsom stromal och medfödda immunceller. BSLBs kan också anpassas för att screena nya farmakologiska föreningar som söker positiv och negativ modulering av exocytiska och tSV utsöndring maskiner för behandling av cancer och andra patologier. Slutligen kan BSLBs också användas för att upptäcka virulensdeterminanter som modulerar T-cellsfunktionen i ^{infektionssjukdomar20}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack	Starlab	S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3799	For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3894	For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil	Any brand		For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 and 310818	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4	BioLegend	356934	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19	BioLegend	302234	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1	BioLegend		Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1	BioLegend	357414 and 357421	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4	BioLegend	317414 and 317422	PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3	BioLegend	334304	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5	BioLegend		Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30	BioLegend	304056 and 368516	Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 and 353015	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2	BioLegend	344002	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6	BioLegend	349512 and 349502	PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 and 311402	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 and 307622	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produced in house	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7	BioLegend	135230 and 329902	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 and 306714	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888	BioLegend	400902	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Company (BD)	23-14523-00	Acquisition software
Bovine Seum Albumin	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Calcium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo	Becton Dickinson & Company (BD)	Version 10.7.1	Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	51026282	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution	BioLegend	422302	Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT	Biovendis Products GmbH		For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Magessium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes	Keison Products	P-2-24	Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11	BioLegend	400330 and 400355	Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma	Falcon	353046	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Sodium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate	Merck, Sigma-Aldrich	656895	For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	488	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	647	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15064	Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15361	Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrifuge	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882