Summary
ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。
Abstract
抗原提示細胞(APC)は、物理的接触に関与するT細胞に、1)抗原、2)共刺激/コアプレス、および3)可溶性サイトカインの3つの活性化シグナルを提示する。T細胞は活性化に応答して2種類のエフェクター粒子を放出する:シナプス小胞(tSV)および超分子攻撃粒子は、それぞれ細胞間メッセンジャーを伝達し、細胞毒性を媒介する。これらの実体は、T細胞との物理的接触に関与するAPCによって迅速に内在化され、それらの特性評価を困難にする。この論文では、ビーズ支持脂質二重層(BSLB)を抗原提示細胞(APC)模倣体として製造および使用して、これらのシナプス貫通粒子を捕捉および分析するためのプロトコルを提示する。また、細胞表面上のタンパク質密度の絶対測定のためのプロトコル、そのような生理学的レベルを有するBSLBの再構成、およびT細胞によるシナプス粒子放出を追跡するためのフローサイトメトリー手順も記載されている。このプロトコールは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性Tリンパ球、制御性T細胞、およびキメラ抗原受容体発現T細胞(CART)を含むT細胞のエフェクター出力に対する個々のタンパク質、複合リガンド混合物、病原体病原性決定基、および薬物の効果を研究するために適合させることができる。
Introduction
免疫学的シナプス(IS)は、物理的接触に従事する細胞の界面に形成される極めて重要な分子構造であり、ジュクストラクリン情報の調節された交換を促進する。さまざまなISが文献に記載されており、これらの分子ハブが細胞ネットワークの保存された特徴であることを示唆する証拠が増えています。B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、T細胞などのさまざまな免疫細胞は、短命の接点1の集合を介して情報を交換します。マルチオーミック研究は、病原性細胞ネットワークを駆動し、未知の機能を有する表面タンパク質を発現する白血球および間質細胞の新規サブセットの理解を進めている。合成APCとして、BSLBは、T細胞による活性化シグナル、すなわち抗原および共刺激/コアプレッションの統合における個々のタンパク質の機能的役割の直接的な調査を可能にし、その結果、シグナル4と呼ばれるエフェクター粒子の放出を可能にする。
このホワイトペーパーでは、BSLBを使用してモデルAPCの表面組成を模倣する際に考慮すべきプロトコルと重要な技術的ポイントについて説明します。APC上の免疫受容体および他の表面タンパク質の定量的測定のためのプロトコルは、これらの測定された量を含む合成APCの再構成のためのプロトコルと共に提示される。次に、T細胞とBSLBの共培養に必要なステップを、フローサイトメトリーを用いたシナプス間貫通粒子移動の定量的測定のためのプロトコールとともに提示する。最も驚くべきことに、BSLBは、シナプスエクトソーム(SE)と呼ばれるtSVの原形質膜由来集団の研究を容易にする。T細胞抗原受容体富化(TCR+)SEは、TCRトリガー2に応答して放出され、BSLBs3によって効率的に捕捉され、抗原およびモデル化された膜組成のアゴニスト特性を評価するための優れた読み出しを表す。CD63+エキソソームおよび超分子攻撃粒子(SMAP)も、刺激されたT細胞によって放出され、BSLBによって捕捉される。それらは、T細胞による活性化および結果として生じる外分泌性および溶解性顆粒分泌の追加の読み出しとして使用することができる。T細胞の相互作用極への外来小胞の動員はまた、活性化に応答してIL−2、IFN−γ、およびIL−10などのサイトカインの指向性放出を促進する4、5、6、7、8。T細胞放出サイトカインはBSLBでも検出できるが、免疫学的シナプスにおけるサイトカイン放出の定量的解析を検証するためのより献身的な研究が現在開発中である。
特定の膜組成がT細胞のシナプス出力にどのように影響するかを調べるには、標的膜成分の生理学的密度を定義する必要があります。細胞表面タンパク質のフローサイトメトリーベースの定量は、このプロトコルの重要なステップであり、1)抗体あたりの蛍光色素数(F/P)が既知である抗体の使用、および2)測定された平均蛍光強度(MFI)から蛍光色素分子を補間するための標準的な基準を提供するベンチマークビーズが必要です。
これらのベンチマーク標準は、5つのビーズ集団で構成され、それぞれが任意の蛍光検出のダイナミックレンジにまたがる同等の可溶性蛍光色素(MESF)の数を増やしています。これらの標準集団は離散的な蛍光ピークを生成し、単純な線形回帰によって任意の蛍光単位のMESFへの変換を容易にする。得られたMESFは、抗体F/P値とともに使用され、細胞当たりの結合分子の平均数(または後のステップではBSLB)を計算する。推定された細胞表面積を平均検出分子数に適用することで、生理学的密度を分子/μm2として計算することができます。この定量化プロトコルはまた、T細胞上のタンパク質密度の測定およびホモタイプT細胞シナプス(すなわち、T−Tシナプス9)の形成を媒介する膜組成物の生化学的再構成にも適合させることができる。必要に応じて、抗体結合の価数は、1分子当たり既知の数の蛍光色素で標識された組換え標的を使用することによってさらに推定することができる。次いで、結合蛍光タンパク質の数と定量抗体とを同時に比較することによって(2つの異なる定量蛍光色素およびMESF標準を使用)、同じBSLB集団に対する抗体結合価数を計算することができる。
APC膜の再構成には、シリカビーズ上に支持された脂質二重層(SLB)を組み立てる必要があります1。異なるリン脂質種を含むリポソームストックを利用して、汎用性の高い脂質二重層マトリックスを形成することができ、異なる結合化学を有する組換えタンパク質のアンカーリングを可能にする(リポソームの調製は 10に詳述されている)。「細胞上」の関連するリガンドの生理学的密度(または密度)が定義されると、同じフローサイトメトリープロトコルが、BSLBsを標的生理学的密度で被覆するのに必要な組換えタンパク質の濃度を推定するように適合される。2つの異なるアンカーシステムは、組み合わせて使用することも、別々に使用することもできます。
第1に、最終的な12.5モル%のNi2+含有リン脂質を含有するSLBは、1平方ミクロンあたり約10,000個のHisタグ結合部位を提供するのに十分であり10 、生理学的密度がこの最大負荷容量を超えないほとんどの市販タンパク質でBSLBを装飾するのによく機能する。第2のローディングシステムは、ビオチン含有リン脂質(モル%)を利用して、ストレプトアビジン架橋を介してビオチン化抗CD3e Fab(またはHLA/MHCモノマー)をロードする。これら2つのBSLB装飾方法を組み合わせることで、BSLBを合成APCとして柔軟に調整できます。非常に複雑なAPC表面組成の場合、リン脂質およびタンパク質のmol%を増加させて、手元の質問が必要とするだけ多くのタンパク質を負荷することができる。タンパク質の作用濃度とビオチン化リン脂質のmol%が定義されると、BSLBを組み立てて、マルチパラメトリックフローサイトメトリーでT細胞のシナプス出力を調べることができます。
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Protocol
1. 定量フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質密度の測定
- 0.22 μmろ過ヒトフローサイトメトリーバッファー(hFCB)を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にEDTA(最終2 mM濃度まで)およびヒトAB血清(最終10%まで)を添加して調製します( 表1参照)。0.22 μmの細孔フィルターユニットを使用して溶液をろ過し、血清不純物を除去し、4°Cで保存する。
- 細胞を回収し、室温(RT)で5分間300× g で遠心分離することによってそれらを沈殿させる。
- PBSで細胞を2回洗浄する。各洗浄ステップで、PBS中の細胞を元の容量(遠心分離前)に再懸濁し、RTで5分間300× g でスピンダウンする。
- トリパンブルー染色された細胞懸濁液を血球計数器でカウント11。あるいは、電流排除を使用してセルをカウントします。後者の場合は、CASY-TTの製造元の指示に従ってください( 材料表を参照)。
メモ: CASY-TT セルカウンタを使用すると、生細胞の割合、セルサイズ、およびセル体積を決定できます。 - 細胞を107細胞/mLの染色濃度に再懸濁するために必要な、固定可能な生存率色素eFluor 780または類似の1:1,000希釈(材料表を参照)を含むPBSの体積を計算する。
- 生存率色素PBS溶液を用いて細胞を再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。
- 氷冷hFCBを1体積加えることにより生存率色素を除去する。300 × g で 4 °C で 5 分間スピンダウンします。
注:これからは、コールドチェーンが壊れないようにしてください。 - Fc受容体遮断溶液の1:50希釈液を含むhFCBで細胞を洗浄する( 材料表を参照)。容量を107 細胞/mLの最終濃度にし、さらに15分間インキュベートして効率的なFcgRブロッキングを実現します。
- U底またはV底96ウェルプレートのウェルあたり100μLの細胞懸濁液(すなわち、106 細胞)を分配する。細胞を氷の上に置き、光から保護します(アルミホイルで覆う)。
- 各蛍光色素結合抗体、および最も重要なのは、表面タンパク質密度を決定するために使用される抗体に最適な抗体濃度を定義することによって、hFCB中の抗体マスターミックスを調製します。例えば、扁桃腺細胞集団におけるICAM-1発現の定量のために、 図1に示すように、抗CD4、抗CD19、および抗CXCR5の1:200希釈液を含む混合物を、抗ICAM-1抗体の飽和濃度とともに、抗体当たり既知のAF647蛍光色素(すなわち、独立した抗体滴定実験によって定義された10μg/mL)と共に調製する。
- 追加の対照として、関連する抗体アイソタイプ対照を含む抗体マスターミックスを調製し(バックグラウンド減算のために 同じ蛍光色素と結合させた対応するものと同じ有効濃度で )、すなわち、関連するAF647アイソタイプ対照の10μg/mLを使用する。
注: 上記の例では、このようなアイソタイプコントロールを使用して、細胞上の真のICAM-1シグナルからバックグラウンド蛍光を差し引いています。 - 組織内に低周波で存在する細胞サブセット上のタンパク質密度を定量する場合、目的のマーカーを除くすべての染色抗体を含む蛍光マイナス1(FMO)対照を調製する( 12のさらなる詳細を参照のこと)。
- 細胞を含む96穴プレートを300 × g で4°Cで5分間スピンダウンし、上清を捨て、定量抗体マスターミックスまたはアイソタイプ抗体マスターミックスのいずれかの50 μLに細胞を再懸濁した。
- プレートシェーカーを用いて細胞を4°Cおよび400rpmで少なくとも30分間インキュベートする。プレートを光から保護します(アルミホイルでカバー)。
- hFCBを用いて細胞を3回洗浄し、300× g で4°Cで5分間遠心分離機で洗浄した。
- 200 μLのPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁する(すなわち、最終濃度5×106 細胞/mLまで)。
- 買収の場合:
- 標準のBD FACSローダーを使用している場合は、サンプルを5 mLのポリスチレン製丸底チューブに移します( 材料表を参照)。
- ハイスループットサンプラー(HTS、プレートリーダーとも呼ばれます)を使用している場合は、すぐにステップ1.19に進みます。
- MESF標準のデータ取得を進める前に、定量チャネルの蛍光強度直線性の最大限界と最小限界を確認してください。
- 補正する前に、MESF規格のデータを取得して、最も暗い母集団と最も明るい母集団の両方が測定の線形範囲に入るようにします。
- 補正サンプルを取得します。定量化チャンネルの光電子増倍管(PMT)電圧値を変更せずに、検出のダイナミックレンジを維持します。補償マトリックスを計算する前に、他のチャンネルのPMT電圧を少し調整してください。
- 報酬を計算して適用します。
- 定量化チャネルごとに合計 2 個から 104 個の MESF ビーズを最小 2 個×保存します。
- 単一細胞の集団を、その側方および前方光散乱領域(図1A(i)に示すように、それぞれSSC-AおよびFSC-A)に基づいて選択し、続いて、時間連続体内の事象の選択(図1A(ii))およびFSCおよびSSCの両方において、それらの高さと比較して飛行時間(W)が低い(すなわち、 FSC-W/FSC-H、続いて、図1A(iii)および(IV)にそれぞれ示すようにSSC-W/SSC-Hゲーティングが続く。FSC-AとFSC-Hの分布が比例したイベントを含む最終的な単一イベントゲートを定義します(図1A(v))。
- 対照サンプル(アイソタイプ標識およびFMO対照)を取得します。
- サンプルを取得し、最低 10,000 個の標的細胞が取得されるまで記録します。
注:平均分子密度のロバストな決定には、独立した実験にわたっていくつかのドナーの分析が必要です。これは、頻度が低下して見つかった細胞サブセット、または希少な生物学的材料(例えば、ヒト組織生検)に由来する細胞サブセットを分析する場合に重要です。 - 5分間稼働中のサイトメーターをFACS洗浄液で洗浄し、続いて5分間超純水を洗浄してから装置をシャットダウンします。HTSを使用している場合は、[ HTSとクリーンプレート]プログラムのタブの下にあるオプションに従います。
注:サンプル間の持ち越しを減らすには、 シット( サンプラー)フラッシュまたは ハイスループットサンプラー 洗浄オプションを有効にして、チューブまたはウェル間のサイトメーターを自動的に洗浄します。取得を開始する前に、超純水を高流量で10分間流し、サイトメーターサンプルラインから未洗浄の生物学的汚染物質を除去します。 - フローサイトメトリー標準 (FCS) ファイルをエクスポートします。
2. MESFの過剰補正平均(または中央値)蛍光強度(MFI)回帰分析
- フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験FCSファイルをロードします。 図1A (i)に示すように、ビーズの側方および前方光散乱領域(SSC-A対FSC-A)に基づいてビーズの集団を選択します。
- ステップ 1.24 に示すように、時間の経過に伴う単一イベントの分布をチェックすることによって、データ品質を制御します。
メモ: バブルは、時間の経過とともにイベントの分布にギャップを作り出します。これは通常、HTS を使用した取得の開始時に表示されます。集録時間内にギャップのあるイベントは、光学収差による測定誤差を増大させるため、選択しないでください。 - 単一のイベントに焦点を当てます。
- 細胞
- 最初にSSC-AおよびFSC-A分布に基づいて単一細胞を同定し(図1A (i))、続いてシーケンシャルゲートFSC-W/FSC-H(シングルス-1、 図1A パネル(iii))およびSSC-W/SSC-H(シングルス-2; 図1A パネル(iv))。比例FSC-AとFSC-Hを持つ事象を選択して、追加のシングルス-3ゲートを定義します(図1A、パネル(v))。最後に、生細胞を固定可能な生存率色素に対して陰性のものとして同定する。
- MESFビーズ
- ステップ 2.3.1.1 と同じ singlets-1 から singlets-3 の判別に従います (図 1B、パネル (i) から (v))。蛍光強度レベルに基づいて、MESF集団(ブランク、1、2、3、および4)のそれぞれを同定する( 図1B、パネル(vi)を参照)。
- 細胞
- ブランクおよび1~4のMESF画分のMFIを抽出する。
- 各フラクションからブランクビーズ母集団のMFIを差し引くことによって、MESFフラクション1〜4の補正MFI(cMFI)値を生成します。
- cMFI とベンダーから提供された MESF 値 (独立変数、ゼロに等しい小数部ブランク) の関係に最も適した線を計算します。
- cMFIに対するMESFの線形回帰の傾き(下式のb )を抽出する(図1B パネル(viii)は、y = a + bx;a = 0の回帰を示す)。
- 目的の集団から蛍光強度の中央値(二峰性蛍光分布の場合)または平均(正規または対数正規蛍光分布の場合)を抽出する( 図1AパネルのTFHおよびB細胞 (vii))。
- ステップ2.5~2.7と同様に、アイソタイプ標識対照細胞からMFI値を抽出する。
- アイソタイプコントロールのF/Pが定量抗体と同じ場合は、アイソタイプ標識細胞からMFIを差し引いて染色細胞のMFIを補正します。
- アイソタイプのF/Pが定量抗体のF/Pと異なる場合は、アイソタイプ標識細胞のMFIをステップ2.7で計算した傾きで除算して、アイソタイプからMESFを抽出します。結合した定量抗体を推定する前に、定量MESFからアイソタイプMESFを差し引く。
- MESFを定量抗体のF/Pで割って、細胞あたりの結合分子数を推定する(Molec.図1C)のフロー図に示すようなセル。
- 結合分子の数を推定細胞表面積(CSA(μm2))で除算し、タンパク質の密度をmolc./μm2として抽出します(図1C)。詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。
3. BSLBsをコーティングするタンパク質の較正に使用する機能性リン脂質種
- 0.4 mM DOPC (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)を、支持された脂質二重層を形成する脂質マトリックスの主要成分として使用する。このDOPC溶液中の他のすべての脂質種を希釈する。
- ATTO 390、488、または565(材料表を参照)を含む色素に結合させた0.4mM DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)を0.2~1モル%使用して、固有の蛍光を有するBSLBを生成する。
注:BSLBの固有蛍光は、シナプス伝達実験における単一BSLBおよび単一細胞の同定を容易にする。 - 12.5 mol% の 0.4 mM DGS-NTA(Ni ) (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル) イミノ二酢酸) スクシニル]) を使用して、Hisタグ付きタンパク質をアンカーします。DGS-NTA(Ni)のmol%を一定に保ち、最高濃度として100nMから始まるHisタグ付きタンパク質の2倍の滴定を実行します。タンパク質を含まない1つの条件を絶対定量のための陰性対照として残す。
注:ICAM-1などのアクセサリシグナルおよび接着分子は、DGS-NTA(Ni)に対するタンパク質の親和性を高めるために、12-Hisタグを使用して設計されています。 - ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン架橋を介してビオチン化タンパク質を固定するために 、ビオチ ニルキャップPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル))を使用します。10 mol% ~ 0 mol% をカバーする 0.4 mM ビオチニルキャップ PE の 5 倍連続滴定を使用します (ネガティブ コントロールとして)。ストレプトアビジンおよびビオチン化タンパク質の濃度を、較正実験およびシナプス伝達実験のための合成APCの再構成の両方で一定(200nM)に保つ。
注:脂質マトリックス中のビオチニルキャップPEの最終モル%に対するビオチン化タンパク質の経験的密度の回帰分析(Hisタグ付きタンパク質を固定するためにDGS-NTA(Ni)も含む)は、抗原の標的密度を再構成するために使用されるmol%を定義する。
4. 1%血清アルブミンを含む補充HEPES緩衝生理食塩水の調製
注:BSLBの洗浄およびタンパク質ローディングステップでは、1%ヒト血清アルブミン(HBS/HSA)または1%ウシ血清アルブミン(HBS/BSA)を含む補充HEPES緩衝生理食塩水が必要です(表1)。10倍のHBSストック溶液と作業バッファーをできるだけ新鮮に準備します。冷蔵保存し、1ヶ月以内に使用してください。BSAはHSAに代わる安価な代替品ですが、Niキレート脂質13 の効率的な閉塞を提供し、ハイスループット実験に推奨されます。
- 200 mM HEPES、7 mM Na2HPO4、1400 mM NaCl、50 mM KCl、60 mM グルコース、10 mM CaCl2、および 20 mM MgCl2 を含む補充 HBS の 10 倍のストック緩衝液を調製します。
注:MgCl2を 溶解することは発熱性が高く、火傷の危険があります。この塩をゆっくりと大量の溶媒に加えます。これらの塩は時間の経過とともに沈殿する傾向があり、作業バッファーへの正確な添加が困難になるため、濃縮溶液(すなわち、1 M)の調製は避けてください。 - 0.22 μm フィルターユニットを使用して 10x 溶液をろ過し、4 °C で滅菌したままにします。
- 500 mL の HBS/has の場合は、補充した 10x HBS 溶液を 50 mL とり、必要に応じて pH を 7.4 に調整し、超純水で容量を 483.4 mL にします。
- 483.4 mLのHBS(pH 7.4)に16.6 mLの30%HSA溶液を加える。
- 500 mL の HBS/BSA の場合、5 g の BSA を HBS に溶解し、37 °C で 30 分間インキュベートします。次に、目に見えるタンパク質結晶または凝集塊がなくなるまで定期的にボトルを反転させてRTで穏やかに混合します。
- ステップ4.5で得られた溶液を0.22μmのフィルターユニット( 材料表を参照)を使用してろ過し、4°Cで保存します。
5. BSLBのタンパク質密度校正
- 直径5.00±0.05μmの非官能化シリカビーズを服用する前に、原液をよく混ぜ合わせ、フラスコの底に沈降したビーズの大きな塊を再懸濁してください。
注:シリカビーズはすぐに沈降する傾向があり、カウントエラーにつながる可能性があります。P1000マイクロピペットの最大容量の半分を上下にピペッティングして、激しく混合します。 - 1,000 μLのPBSで1 μLのビーズ溶液を希釈し、血球計数器チャンバーを使用してビーズをカウントし、mLあたりの濃度を計算します。
注:シリカビーズを視覚化するためにトリパンブルー染色は必要ありません。 - 滴定のポイントあたり5〜105 の最終BSLBに必要なシリカビーズの体積×計算します。
- 必要量のシリカビーズを滅菌1.5mL微量遠心チューブに移す。
- シリカビーズを1mLの滅菌PBSで3回洗浄し、RT(固定rpm)でベンチトップ型微量遠心分離機上でビーズを15秒間遠心分離する。
注:洗浄液を除去するときは、ビーズペレットを乱さないでください。小さなバッファーカラムは、リポソームマスターミックスを構成するリポソームの広がりに影響を与えません。 - 洗浄したシリカビーズ上にBSLBを組み立てるために、3倍量のリポソームマスターミックスを調製する(例えば、シリカビーズの初期総容量が20μLの場合、最小60μLのリポソームマスターミックスを調製する)。
- ビオチニルキャップPEモル%滴定用
- ビオチニルキャップPEの5倍希釈物を含む脂質マスターミックスを調製する。
- 0.4 mM ビオチニルキャップ PE モル% を 100% DOPC マトリックスで希釈します。
- 各ビオチニルキャップPEモル%滴定ポイントを1:1(vol:vol)比で0.4mM 25% DGS-NTA(Ni)の溶液と混合して、すべての滴定で最終的な12.5モル%のNi含有脂質が存在するようにします。
注:Ni含有脂質の12.5モル%(vol:vol%)は、Hisタグ付きタンパク質も並行較正で試験することができるBSLBの混合脂質組成を表す。例えば、すべてのリポソームストックが同じモル濃度で調製されるので、最終リポソームミックスの200 μL中の目標mol%混合物に到達するには、25 mol%のNi含有DGS-NTAの100 μLと100 μLの100 mol% DOPCを単に混合する。
- 5 × 105 洗浄したシリカビーズを 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移し、チューブごとに 1 つのビオチニルキャップ PE mol% 滴定ポイントが組み立てられるようにします。
- 洗浄したシリカビーズにビオチニルキャップPEモル%滴定マスターミックスを加え、全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合する。過剰に脂質二重層を破壊する気泡を形成しないでください。
- 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して空気を置換し、混合中の酸化から脂質を保護します。
- 保存前にアルゴンを0.4 mM脂質ストックに加え、滅菌技術を用いて操作する。
メモ:小さなチューブをアルゴン/窒素ガスボンベに接続します。チューブにガスを追加する前に、圧力が2psi以下に設定されるようにガスボンベレギュレータを調整してください。滅菌ピペットチップを出口チューブに接続して、リポソームストック内のガス流を5秒間指示し、蓋をすばやく閉じます。脂質ストックの場合は、チューブの蓋をパラフィンフィルムで密封してから4°Cで保管してください。 - BSLBを垂直、可変角度の実験用ミキサー( 材料表を参照)に移動し、10rpmの軌道混合を使用してRTで30分間混合する。
注:このステップは、支持された脂質二重層の形成中のビーズの沈降を防止する。 - ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、1mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
- 100 μM の NiSO4 を含む 1 mL の 5 mL の 5% カゼインまたは 5% BSA を加えて NTA 部位を飽和させ、200 nM ストレプトアビジンを加えて BSLB 上のすべてのビオチンアンカー部位を均一にコーティングすることにより、形成された BSLB をブロックします。全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合し、垂直ミキサーでRTおよび10rpmで20分以内にインキュベートします。
- ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してBSLBをスピンダウンし、1 mLのHBS/HSA(BSA)バッファーで3回洗浄します。
メモ: BSLB を覆う少量の洗浄バッファーで洗浄ビーズを垂直に保管してください。空気は脂質二重層を破壊するため、BSLB の脱水を避けてください。
- ビオチニルキャップPEの5倍希釈物を含む脂質マスターミックスを調製する。
- 12.5モル%のDGS(Ni)NTA含有BSLBsに対するHisタグ付きタンパク質の滴定用
- 最終的な12.5モル%のDGS-NTA(Ni)を含む3倍量のリポソームマスターミックスを調製する。
- リポソームマスターミックスを使用して、洗浄したシリカビーズを再懸濁し、全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合します。気泡の形成を避けます, 過剰に脂質二重層を損傷します.
- 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して空気を置換し、混合中の酸化から脂質を保護します。
- 保存前にアルゴンを0.4 mM脂質ストックに加え、滅菌技術を用いて操作する。
- BSLBを垂直ミキサーに移動し、10rpmでの軌道混合を使用してRTで30分間混合する。
- ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、1mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
- 100 μM の NiSO4 を含む 5% カゼイン (または 5% BSA) を 1 mL 加えて、形成された BSLB をブロックし、BSLB 上の NTA サイトを飽和させます。穏やかに混合し、垂直ミキサーで RT および 10 rpm で 20 分以内に インキュベートします。
- HBS/HSA(BSA)を使用して3回洗浄し、余分なブロッキング溶液を除去します。
- 新しいU底96ウェルプレートで、タンパク質の2倍連続希釈液を調製する。
- HBS/HSA(BSA)バッファーの全容量200 μLで目的タンパク質の開始濃度100 nMを調製し、この溶液を最初のカラムに100 μL、残りの100 μLを100 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーを含むカラム#2の上に分配します。
- カラム #2 からカラム #3 に 100 μL を連続して移し、必要に応じて繰り返してすべての滴定ポイントをカバーします。タンパク質を含まない系列の最後の列は、定量化の空白の参照として使用されるため、そのままにしておきます。
- 調製したBSLBを、100 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーに5×105 BSLBが含まれるように容量に再懸濁します。
- 100 μLのBSLB懸濁液を第2のU底96ウェルプレートのウェルに移し、各ウェルが5×105 BSLBを受け取るようにする。
- BSLBを含む2番目のプレートを300 × g およびRTで2分間スピンダウンし、上清を廃棄する。
- 沈殿したBSLBを含むプレートに100 μL容量のタンパク質滴定プレートを移します。穏やかに混合し、ピペッティング中に過剰な気泡発生を避け、プレートシェーカーを使用してRTおよび1,000 rpmで30分間インキュベートします。アルミホイルで光から保護してください。
- RT で 2 分間、300 × g の沈降ステップを使用して、プレートを HBS/HSA(BSA) バッファーで 3 回洗浄します。
- 校正に使用した組換えタンパク質が蛍光色素に直接コンジュゲートされ、F/P値がわかっている場合は、ステップ5.8.20に進みます。
- 校正に使用した組換えタンパク質が標識されていないか、蛍光色素にコンジュゲートされている場合、またはMESFビーズ標準が利用できない場合は、既知のF/P値を持つAlexa Fluor 488または647結合抗体を使用して、タンパク質コーティングBSLBを染色します。
- 定量抗体の飽和濃度で染色する。
注:標的発現レベルに応じて、これらの範囲は5〜10μg/mLです。 - プレートシェーカーを使用してRTおよび1,000rpmで30分間染色する。アルミホイルを使用して光から保護します。
- HBS/HSA(BSA)バッファーで2回、PBSで1回、RTで2分間300× g の沈降ステップを使用して洗浄します。
注: PBS、pH 7.4 を使用して、取得前に洗浄した BSLB を再懸濁してください。タンパク質を含むバッファーは、ハイスループットサンプラーとのサンプルの自動混合中に気泡が形成されるため、使用しないでください。 - 図1B(vii)に示すように、MESF規格を取得し、最も明るいピークが定量検出器(チャネル)の線形検出範囲に残っていることを確認します。
- サンプルを手動で取得するか、HTS を使用して取得します。後者を使用する場合は、BSLB を 100 μL の PBS に再懸濁し、2.5 ~ 3.0 μL/s の流速、100 μL の混合容量 (再懸濁容量が小さい場合は全容量の 50%)、混合速度 150 μL/s、および 5 つの混合を使用して 80 μL を取得し、BSLB が単分散であることを確認します。
- FCS ファイルをエクスポートします。
- 分析では、ダブレットまたはトリプレットが決定に誤差をもたらすため、単一のイベント(図2A)に焦点を当てます。プロトコル・ステップ 1.2.3 で示されているように、単一イベントのネストされた識別を使用します。
- 各MESF画分(1〜4)のMFIを測定し、ブランクビーズのMFIを差し引いて補正MFI(cMFI)を抽出する。
- 線形回帰分析を実行して、手順 5.33 で使用する MESF 標準に対して計算された cMFI に対する MESF の傾き (b) を抽出します。
- 各滴定点のMFIを抽出し、タンパク質を含まないビーズのMFIを差し引いてcMFIを得た。
- ステップ5.31で計算した傾きでcMFIを除算し、滴定点ごとにBSLBに結合したMESFを抽出します。
- BSLBに結合したMESFを定量抗体のF/P値で割り、BSLBあたりに結合した平均分子数を抽出します。
- BSLBの直径(5.00 ± 0.05 μm)を使用してビーズ表面積(SA = 4pr2)を抽出し、滴定点あたりのタンパク質の最終密度(モルク/μm2)を計算しました(タンパク質濃度)。
- タンパク質密度に対するタンパク質濃度の新しい回帰分析を実行して、最適ラインの傾き(b)を計算します。
注:DGS-NTA(Ni)の濃度が12.5モル%の場合、T細胞の非特異的活性化を誘導したり、SLBの側方移動度に影響を与えたりすることなく、約10,000モル/μm210の最大アンカー能力が得られます。
6. T細胞とBSLB間のシナプス伝達実験の実施
- シナプス伝達実験を行う前に
- 非蛍光BSLB、蛍光脂質を含むBSLB、未染色細胞(または補償ビーズ; 材料表を参照)、および単色染色細胞(または補償ビーズ)を取得して、機器の蛍光スペクトル相互作用を特定します。スピルオーバーの広がりが大きい検出器に焦点を当てて、多色パネルを再設計し、感度を高め、重要な検出器の測定誤差を低減します( 14を参照)。
- 検出抗体を滴定して最適な濃度を見つけ、陰性の検出を損なうことなく陽性事象の検出を可能にします。
注:F/P値と輝度がバッチごとに異なるため、抗体ロットが変化するたびにこの手順を繰り返します。 - オプション:異なる電圧範囲(すなわち、電圧ウォーク)でサンプルを集録することによってPMT電圧を最適化し、最適な信号対ノイズをもたらすPMTを見つけます(すなわち、最も明るい母集団の信号が線形範囲にとどまるようにしながら、負と正の分離)。
- BSLBへのTセル出力伝達の測定
- 10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100μM非必須アミノ酸、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを含む補充RPMI 1640(本明細書中R10培地)を調製する。R10培地を使用してT細胞を培養および展開する。
- 1日目に、末梢血または白血還元系(LRS)チャンバーからT細胞を単離する。ヒトCD4+およびCD8+ T細胞を濃縮するために、免疫密度細胞単離および分離キット(材料表を参照)を使用してください。
- 106 cells/mL から 1.5 ~ 2.0 の範囲の最終濃度で細胞×を播種し、1 ウェルあたり合計 5 mL 以下の 6 ウェルプレートを使用します。
- ヒトT細胞活性化(抗CD3/抗CD28)磁気ビーズ( 材料表を参照)の1:1の比率を使用してT細胞を活性化し、細胞の増殖および生存をサポートするために組換えヒトIL-2を100IU添加する。
- 3日目に、磁気カラムを使用して活性化磁気ビーズを除去します(材料表を参照)。追加の洗浄ステップのために細胞を回収する前に、磁気ビーズがチューブの側面に取り付けられたままであることを確認してください。
- 磁気ビーズを5 mLの新鮮なR10培地でもう一度洗い流し、よく混ぜて磁石に戻します。この量を回収し、ステップ6.2.5で回収した細胞と混合する。
- 100 U/mLのIL-2を含む新鮮なR10で細胞を1.5-2×106 細胞/mLに再懸濁する。48時間後に培地を補充し、IL-2の最終添加が実験日の48時間前(培養の7〜14日目)であることを確認する。
- シナプス転移実験当日、フェノールレッドフリーRPMI 1640培地に10%FBS、100μM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを補給してシナ プス転写アッセイ培地 ( 表1参照)を調製した。組換えヒトIL-2を含まない。
- トリパンブルー染色または電流排除のいずれかを使用して細胞をカウントし、培地中の106 細胞/mL×2.5の最終濃度に再懸濁する。過剰な細胞死(>10%)が観察された場合は、多糖類とジアトリゾ酸ナトリウムの混合物( 材料表を参照)を使用して、死んでいる/死にかけている細胞を除去してください。
- 13mLの多糖 - ジアトリゾ酸ナトリウム溶液の上に15mLの細胞培養物の層。
- RTで1,250 × g の遠心分離機をRTで20分間、最小限の加速と低加速で行います。培地と多糖 - ジアトリゾ酸ナトリウム溶液との間の界面に細胞層(雲)を集める。
- 予め加温したシナプス転写アッセイ培地(ステップ6.2.7で調製)で細胞を少なくとも2回洗浄する。
- シナプストランスファーアッセイ培地を用いて細胞を計数し、最終濃度2.5×106/mLまで再懸濁する。この細胞懸濁液100 μLをBSLBsと共培養する(ステップ6.2.15参照)。
- 実験に必要なBSLBの数を計算します。試験するすべての異なるタンパク質マスターミックスおよび抗原滴定(ビオチン化HLA/MHCペプチドモノマーまたはモノビオチン化抗CD3ε Fabのいずれか)を検討してください。
- プロトコルセクション5から同じ手順に従ってBSLBを組み立てますが、今回は、複雑なAPC膜を再構成するために必要なタンパク質と脂質のすべての滴定を組み合わせてください(図3A)。同じ体積を保つ:初期シリカビーズ体積と較正中に使用されるタンパク質混合物の体積との間の体積関係、ならびにBSLBの装填に使用される時間と温度。例えば、初期較正に0.5 μLのシリカビーズ/ウェルと100 μL/ウェルのタンパク質ミックスを使用した場合、5:1,000 vol:vol比を維持して、T細胞と共培養するBSLBを調製します。
- BSLBに目的のタンパク質ミックスをロードしたら、BSLBをHBS/HSA(BSA)で2回洗浄して、過剰な未結合タンパク質を除去します。各洗浄ステップでRTで300× g の沈降速度を2分間使用し、上清を捨てます。
- 1ウェルあたり5×105 BSLBを200 μLで再懸濁する。
- 1ウェルあたり100 μLを新しいU底96ウェルプレートに移し、1ウェルあたりのBSLBの最終量が2.5 × 105になるように複製を作成します。
- BSLBを300 × g で2分間スピンダウンし、RTし、上清を捨てます。
- 100μLのT細胞懸濁液を用いてBSLBを再懸濁する;気泡の形成を防ぐために穏やかに混合する。
- 共培養物を37°Cで90分間インキュベートする。
注: あるいは、細胞およびビーズを、フェノールレッドを含まない RPMI の代わりに HBS/HSA(BSA) バッファーに再懸濁して、共存させることもできます。この場合、このガスは重炭酸塩の非存在下で緩衝液を急速に酸性化するので、インキュベーションは非CO2 インキュベーターで行わなければならない。 - BSLB-T細胞共培養を冷却するには、まずRTで細胞を最低15分間インキュベートします。光からそれらを守ります。
- 細胞を500 × g およびRTで5分間遠心分離する。上清を捨てる。
- ブロッキングのために細胞をRT 2% BSA-PBS(Ca2+およびMg2+フリー)に再懸濁する。細胞を氷の上に45分間置く。光から保護します。
- 細胞をインキュベートしながら、PBS中の氷冷0.22 μmろ過2% BSAを染色バッファーとして使用して抗体マスターミックスを調製し、これにより追加のブロッキングが提供されます。
注:ブリリアントバイオレット色素にコンジュゲートした抗体のいくつかのバッチは、BSLBsに非特異的に結合する傾向がある。5% BSA-PBSでブロッキングすると、このノイズを減らすのに役立ちます。 これからは、コールドチェーンが切れないようにしてください。 - 共培養物を500 × g で5分間、4°Cでスピンダウンします。 上清を捨てる前に、バックライトを用いて96ウェルプレートの底部を検査して、ペレットが存在することを簡単に確認する。
- 多チャンネルピペットを用いて、最適化された抗体濃度を含む染色マスターミックス中の細胞を再懸濁する。
注:フィルターのないピペットチップを使用して、気泡の発生や染色量の分布のエラーを防ぎます。 - アイソタイプ標識された細胞およびBSLBs、蛍光および非蛍光BSLB、ならびに単独で染色された細胞およびBSLBsが含まれる。すべてのコントロールのウェルあたりのイベントの総数を尊重します(すなわち、染色されたイベントあたりの抗体の相対的な増加を避けるために、5×105 BSLB /ウェルを含むBSLBのみ、および5×105 細胞/ウェルを含む細胞コントロールのみ)。
- 体積の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合し、氷上で30分間インキュベートする。光から保護します。
- 細胞およびBSLBを氷冷2%BSA-PBS、pH7.4、および500× g の沈降ステップを用いて4°Cで5分間2回洗浄する。 洗浄した共培養物を100 μLのPBSに再懸濁し、直ちに取得する。
- 固定が必要な場合は、PBS中のPFAの0.5%w/vを使用して10分間固定し、1回洗浄し、取得までPBSに保管してください。光から保護します。
- 補償する前に、MESF規格を取得して、最も暗い集団と最も明るい集団の両方が測定の線形範囲に入るようにします。
- 補正サンプルを取得し、補正を計算し、補正行列 (リンク) を実験に適用します。
- 定量化チャネルごとに、合計 2 × 104 の MESF 標準を取得して保存します。
- ハイスループットサンプラーを使用した取得の場合は、機器取得を標準に設定し、サンプル取得を80 μL(または総容量の80%)に設定し、サンプル流量を2.0~3.0 μL/s、サンプル混合容量を50 μL(混合中の気泡形成を避けるために総容量の50%)、サンプル混合を150 μL/s、ウェルあたり3~5の混合に設定します。
- サンプルあたり最小1~104 個のシングルBSLB×取得します(リファレンスゲーティング戦略については 、図3B のパネル(i)~(vi)を参照してください)。
- サイトメーターを洗浄液で5分間洗浄し、続いて超純水を5分間洗浄してから、装置をシャットダウンします。HTS を使用している場合は、[ HTS] タブと [クリーン] オプションの下にあるオプションに従います。
- FCS ファイルをエクスポートします。
7. BSLBへの粒子のシナプス移動の測定
- 実験の FCS ファイルを開きます。 図3B (i)に示すように、細胞およびBSLBの集団を、その側方および前方光散乱領域(SSC-A対FSC-A)に基づいて選択する。
- 連続集録ウィンドウ内のイベントを選択します(図3B (ii))。
- 細胞とBSLBの両方の単一のイベントに焦点を当てます。シーケンシャルゲートFSC-W/FSC-H(シングルス-1、 図3B パネル(iii))およびSSC-W/SSC-H(シングルス-2)の低Wに基づいて単一セルを最初に同定する。 図3B パネル(iv))。比例FSC-AとFSC-Hを持つ事象を選択して、追加のシングルス-3ゲートを定義します(図3B、パネル(v))。
- 各実験試料についてブランクおよび1~4のMESFおよび単一細胞およびMESFからMESF画分のMFIを抽出する。
- 各フラクションからブランクビーズ母集団のMFIを差し引くことによって、MESFフラクション1〜4の補正MFI(cMFI)値を生成します。
- 単一の BSLB およびセルの cMFI を生成します ( 図 3C パネル (i) を参照)。
- アイソタイプ対照抗体で染色したBSLBからのシグナルを使用して、関連するT細胞マーカーに対する抗体で染色したBSLBのMFIを補正する。cMFIを使用して、 図3C パネル(ii)に示す式を使用して正規化されたシナプス伝達パーセント(NST%)を計算します。
- TCR トリガに応答して特異的に転送されるパーティクルに関心がある場合は、アゴニスト性 BSLB の MFI からヌル BSLB からの信号を減算します。この cMFI を使用して、図 3C パネル (ii) に示す式を使用して TCR 駆動 NST% を計算します。
- T細胞-BSLB界面を横切って粒子貨物として移送される分子の総数を決定することに興味がある場合は、T細胞-BSLB共培養について同じ装置設定および取得セッションを使用してMESFベンチマークビーズを取得します。
- MESF ビーズ集団を分析し、プロトコルステップ 5.8.15 ~ 5.8.17 に示されているように、その cMFI を抽出します。cMFI に対する MESF の回帰分析に最も適した線の傾きを計算します。
- 計算された傾きを使用して、BSLB に沈着した MESF の数を抽出します。アイソタイプ コントロールまたはヌル BSLB のいずれかを使用して計算された cMFI をブランクとして使用して、BSLB を刺激するために特異的に転送された MESF の数を抽出します。
- BSLBあたりの計算された(平均)MESFを定量抗体のF/P値で割ることによって、BSLBに転写されたマーカーの分子数を計算する。
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Representative Results
細胞表面上の絶対タンパク質定量のためのFCM
リガンドの生理学的密度を示すBSLBの再構成には、モデル化された細胞サブセット上の総タンパク質密度の推定が必要である。BSLBsを再構成するには、BSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質、例えばCD40、CD58、およびB7受容体(CD80およびCD86)などのBSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質と共に、目的のシグナル伝達軸において役割を果たすと予想される任意の関連リガンドが含まれる。ICOSL3、PD-L1、およびPD-L215などの共刺激分子を含む追加のタンパク質を、手元の質問に応じて追加することができる。他の分子については、定量的フローサイトメトリーで細胞を直接分析することによって決定された分子密度を使用してBSLBを再構成する。直接結合抗体の場合、BioLegend は各抗体ロット番号の F/P 値を提供します。抗体を社内で標識し、F/P比を分光光度法によって決定することもでき、所望の蛍光色素にコンジュゲートした市販の抗体がない場合の代替手段を提供します。細胞およびBSLBの表面上の組換えタンパク質の数を較正するために同じ抗体を使用するので、これは一定のままであるので、抗体結合価数を補正する必要はない。抗体結合価数が必要な場合は、組換えタンパク質と既知のF/Pを有する抗体の両方を使用してBSLBを装飾し、負荷された組換えタンパク質の分子を飽和条件下での染色後の結合抗体の数と比較する。
細胞当たりに結合した抗体分子は、専用の単色フローサイトメトリー測定または、パラチン扁桃腺などの関心組織内の比較的まれな細胞のサブセット上の絶対タンパク質密度を推定することを意図した抗体の多色パネルを使用して推定することができる。 図 1は、一例としてCXCR5+B細胞および濾胞性T細胞(TFH)におけるICAM-1の密度の代表的な測定値を示す。 図1A に示される同じ染色プロトコールおよびフローサイトメトリー分析原理を使用して、上皮細胞、間質細胞、単球、単球由来樹状細胞(moDC)、または他のヒトおよびマウス組織のBリンパ球およびTリンパ球上のタンパク質密度を測定することができる。血液や扁桃腺とは異なる組織の場合、消化酵素への細胞の長時間の曝露は細胞表面発現レベルを低下させるため、プロテアーゼカクテルを使用して細胞を単離する際には注意が必要である。
連続取得ウィンドウ内の単一の生細胞(図1A ii)に集録と解析を集中させ、連続時間外の事象が光を異常に散乱させ、定量化を損なうようにします。測定の精度を高めるために、FcγRsの効率的なブロッキングによってAPCsの非特異的染色を減少させる。hFCB中に存在するヒト血清およびEDTAは、遊離Ca2+ をキレートしながら効率的なFcγR遮断を可能にし、それらの操作および染色中の細胞の自発的凝集を減少させる( 図1A (iii)および(iv)の黒い矢印は、扁桃細胞の懸濁液中の残りのダブレットを示す)。
セットアップおよび追跡ビーズおよびソフトウェア(または類似のもの、 材料表を参照)を使用して機器の性能を追跡することは、特にBSLBへの粒子のシナプス移動がMFIのみを使用して測定される後のステップ(すなわち、MESF標準がない蛍光色素の場合)において、経時的な定量の再現性にとって重要である。同様に、MESF標準物質と一緒に使用する定量検出器の任意の蛍光単位の線形範囲(すなわち、 直線性最小値および直線性最大値)をチェックして、各較正点が蛍光と蛍光色素の数との間の線形関係を維持するようにする。
蛍光のためのサンプル「ブランク」の調製、またはバックグラウンド染色ノイズのアイデアを提供するサンプルは、非特異的蛍光シグナルを差し引くために不可欠である。アイソタイプ対照および/または生物学的にヌルサンプル(例えば、ノックアウト)は、細胞のバックグラウンドシグナルを補正し、定量抗体に由来する真のシグナルを抽出するために不可欠である(図1A パネル(viii))。同様に、標準的なMESFビーズは、専用のブランク集団を使用して、各真に正のビーズ集団からバックグラウンド信号を差し引く(図1B パネル(vii)および(viii))。回帰分析が実行され、MESFと補正されたMFIの関係を定義する傾きが抽出されると、絶対分子密度への変換は単純な数学的操作に従います(図1C)。
図1CでCSAを推定するために、電流排除(CASY-TT)を用いて、数千の細胞から細胞体積および直径の測定を抽出した。球体の表面積(4pr2)の計算から推定されたCSAは、細胞の活性化状態によって変化し、非活性化B細胞ではそれぞれ170.37±4.91μm2、非活性化T細胞では234.52±1.53μm2および318±24.45μm2の観測値を有する。これらのCSAsは、非活性化リンパ球の3次元屈折率断層撮影法などの画像化技術によって推定されたものに匹敵する16。
生理学的密度の範囲が定義されると(例えば、異なる活性化プログラムを受けている細胞の表面密度を比較することによって)、BSLBを使用してそれらの表面をモデル化することができる。NIHテトラマー施設(またはモノビオチン化モノマー抗CD3ε-Fab)によって提供されるビオチン化抗原性HLAペプチドモノマーの滴定を、ICAM-1 12-Hisと共に使用して、正準APC膜を再構成することができる。6、9、12、および14 Hisでタグ付けされた市販のタンパク質を使用して、BSLBの表面を装飾することができます(ICAM-1 12-Hisの例については、図2A を参照のこと)。タンパク質滴定と定量的FCM分析は、生理学的APC表面を再構成し、異なるT細胞サブセットのシナプス出力に対するそれらの効果をテストするための堅牢な方法論を提供する。
T細胞シナプスの出力を研究するには、1:1のBSLB-to-T細胞比を使用して、平均して、1つの細胞が研究期間中に1つのBSLBと相互作用することを確認します。我々は、物質移動がインキュベーション時間に比例し、細胞:BSLB界面にわたって少量に転写された分子を検出するための汎用性の高いプラットフォームを提供することを観察しました。したがって、適切なパネル設計は、tSVの場合と同様に、シナプス貫通物質の検出の感度と信頼性を高めるために重要であり、出力は25〜36小胞/細胞/ 20分2,3の間で変化します。まず、各蛍光色素標識抗体および脂質のスペクトルスピルオーバーを試験する。高いスピルオーバーが観察された場合は、BSLBを構成する染色抗体と蛍光脂質の割合、および補償サンプルの拡散誤差を低減し、シグナルオーバーノイズ比を高めるためにPMT電圧ウォークをそれぞれ推奨します(被験者への専用紹介については12、14、17を参照)。
ヌルBSLB(抗原または抗CD3 Fabを欠損)およびノックアウト細胞またはアイソタイプ標識サンプル18を含む定量コントロールの使用は、SEなどのエフェクターtSVの移動、ならびにシナプス間隙内に放出される超分子攻撃粒子を正確に測定するために不可欠です。CD4、CD2、またはCD45などの非常に豊富な細胞表面タンパク質を合成蛍光脂質(DOPE Attoコンジュゲート)とともに使用して、コンジュゲートの低温ベースの解離時の単一細胞およびBSLBの集団を同定する。単一のBSLBおよび細胞における蛍光強度の幾何平均または中央値に分析を集中させる(CD4は図3Bで使用されている)。SEは原形質膜(PM)に由来する特殊なタイプのtSVであり、BSLBへのそれらの移動は、BSLB上のマーカーシグナルの利得と相互作用する細胞の表面上のシグナルの一貫した損失によって証明される(図2B、紫色の矢印に示すように、BSLB上のTCRを参照)。抗原または抗CD3のいずれかを欠くヌルBSLBは、それらのTCR複合体を介して相互作用する細胞を刺激することから生じるBSLB上のTCR(および他のT細胞マーカー)の特異的獲得を追跡するための優れた基準である。
図1:APCの表面上のタンパク質の絶対定量。 (a)扁桃B細胞の表面におけるICAM-1の定量フローサイトメトリー測定の例(Foll.Bc)およびヘルパーT細胞(TFH)。(i-vii)ヒト口蓋扁桃腺から単離された単一のCXCR5+ BcおよびTFHを分析するためのゲーティング戦略。図は、取得の連続ウィンドウ内に含まれる単一のライブイベントを識別するためのシーケンシャルゲーティング戦略です。(iii-iv)黒い矢印はダブレットを示す。(viii)関連するアイソタイプで標識されたFMO対照と比較したICAM-1の細胞表面発現を示す重ね合わせヒストグラム(青緑色ヒストグラム)および関連するアイソタイプで標識されたFMO対照(黒色のヒストグラム、灰色のヒストグラムと重なる)(vii)に示す集団。矢印は、CXCR5+ B細胞(Bc;CD19+)およびTFH(CD4+)。(B)MFIから扁桃腺細胞の表面上の絶対分子を抽出するには、Aに示す細胞と同じ装置設定を用いて取得したMESFベンチマークビーズの回帰分析が必要である。(i-v)図は、取得の連続ウィンドウ内に含まれる単一のライブイベントを識別するためのシーケンシャルゲーティング戦略です。(vi)異なる標準MESF集団からのMFIのゲーティングおよび測定。(vii)(vi)で同定されたMESF集団のヒストグラムを重ね合わせて示す。右上に表示される値は、5 つの MESF 母集団 (空白、1、2、3、および 4) のそれぞれの MFI を表します。(viii)(vii)に示されるMESF集団に対するcMFIに対するMESFの線形回帰。Aのデータから細胞に結合したMESFを抽出するための傾き(b)を示す。(c)分子数の抽出にあたっては、測定されたMESF cMFI(cMFIM)および参照MESF値(MESFR)から(viii)で計算された傾きの適用から始まる簡単な数学的演算に従う。細胞(MESF細胞)に結合したMESFを抽出するには、補正したMFIの細胞(cMFI細胞)を計算傾きで分割する。そして、細胞に結合した分子数(Molec.細胞)、検出(定量)抗体のF/PによってMESF細胞を分裂させる。最後に、細胞(Dcells)の表面上の分子密度を計算するために、Molecを分割する。推定細胞表面積(CSAE)による細胞。略語: X = 独立変数;Y=従属変数(測定された蛍光)、cMFIM = 測定された補正されたMFI;MESFR = 参照 MESF 値;MESF細胞 = 細胞あたりの推定MESFcMFI細胞 = 補正されたMFI細胞;モレック。細胞 = 細胞あたりの推定分子。Dcells=セル上の推定密度;CSAE = 推定細胞表面積。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組換えICAM-1によるBSLBの再構成およびBSLBsへの微粒子移動の測定(A,i-vi)組換え単量体ICAM-1 12-His(rICAM-1)の密度の増加とともに再構成されたBSLBのフローサイトメトリー分析。(i-v)図1のように、ゲーティング戦略は、集録の連続ウィンドウ内の単一のBSLBに焦点を合わせます。なお、時間連続体ゲートの直前のギャップは、測定誤差を防止するために除外した。(vi)良好なタンパク質品質は、狭い蛍光分布の観察により、高濃度でのBSLBの均質なコーティングをもたらすことが多い(低い変動係数、viのヒストグラムを参照)。(B)測定濃度(DM)に対するICAM-1参照濃度(CR)の回帰分析。傾きを使用してタンパク質(CT)の標的濃度を計算し、図1の実験で測定された細胞(Dcells)の密度を達成します。略語: 12-His = 12-ヒスチジンタグ;DM = 測定された分子密度;CR=rICAM-1の基準濃度;CT = ターゲット濃度(補間される);Dcells=細胞で測定された密度(図1Cも参照)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:BSLBsに移されたT細胞シナプス粒子の測定。 (A; i-v)モデル膜を再構成するBSLBsとのT細胞の共培養およびその後のフローサイトメトリーによる粒子移動の測定のための重要なステップを示すフロー図。(iv)青および濃い黄色の図は、バイパラメトリックフローサイトメトリープロットにおける細胞およびBSLBの相対分布および位置を示す。(v)ヌルBSLB(灰色)と比較したアゴニスト性BSLB(濃い黄色)の蛍光の相対的利得を示す蛍光分布ヒストグラム。(b)例示的なシナプス伝達実験。(i-vi)図は、連続取得ウィンドウ内で単一のBSLBおよび細胞を識別するためのゲーティング戦略です。紫色の矢印は分析の方向を示し、C.(C)(i)単一細胞(青)および単一BSLB(黄色)のMFIに分析を集中させる。(ii)BSLBおよび細胞について計算されたcMFIから正規化されたシナプス伝達(NST%、上)およびTmax%(下)を計算する式。(ウ-6)非活性化(灰色)および250(ソフトカラー値)または1,000(高色値)モルc./μm2のいずれかで活性化することを含む、抗CD3ε-Fabを活性化するT細胞の異なる密度にわたる細胞(青色の色合い)およびBSLB(黄色の色合い)の蛍光強度分布の変化を示す重ね合わせヒストグラム。異なるカラー値の数字は、黄色で示されたBSLBヒストグラムについて測定されたNST%を表す。重ね合わせたヒストグラムは、異なるマーカーに対して陽性のT細胞小胞のシナプス転移における包括的な階層を示す。BSLBのこの組成(ICAM-1の200モル/μm2および抗CD3ε-Fabの密度の増加)のために、tSVはTCR+(iii)およ>CD81+(iv)およ>CD4+(v)およ>CD28+(vi)と共にBSLBに移される。以前の記事で実証したように、TCRおよびCD81はSEの成分であり、CD4は比較的高い表面レベルで発現されるにもかかわらず、比較的高い効率でCD4に伝達される。SE脱落は、細胞表面CD81およびTCRの損失およびBSLB上のこれらのシグナルの利得をもたらす(黄色のヒストグラムでは、250モル/μm2の紫色の矢印が開き、黄色のヒストグラムでは1,000モル/μm2の紫色の矢印が閉じている)。(D)コンジュゲートの不適切な冷却は、投入ビーズ(左のバイパラメトリックプロット)と37°Cから4°Cまでの急速冷却を行ったコンジュゲート(右のバイパラメトリックプロット)を比較することからわかるように、細胞がシリカビーズからSLBをはぎ取ることにつながる。図3Bのパネル(vi)とも比較してください。略語: PRF1 = パーフォリン 1;NST% = 正規化されたシナプス伝達;Tmax% = 観測された最大転送の割合(制御条件または参照条件下)。tSVs:シナプス間小胞;SEs:シナプスエクトソーム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: このプロトコルで使用されるバッファこの表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
BSLBは、モデルAPC膜で刺激されたT細胞の粒子出力を研究するための汎用性の高いツールです。この方法の柔軟性により、複雑で還元主義的な膜組成物の再構成が、tSVおよび超分子攻撃粒子およびその成分の分泌に対するリガンドおよびそのシグナルの影響を研究することができる。我々は、この技術を、前活性化TH、CTL、Tregs、およびCART15を含む様々なT細胞でテストした。このプロトコルは、新しく単離された静止期のT細胞のシナプス粒子放出の測定にも機能する。新たに単離されたT細胞を使用することの1つの制限は、これらの静止した集団が、それらの細胞表面組成と相関するシナプス貫通粒子の異なるプロファイルを産生することである(詳細は 15 を参照されたい)。
単純なフローサイトメトリーパネルとして、抗TCRクローンIP26、抗CD81クローン5A6、抗パーフォリン(PRF1)クローンB-D48または抗CD40Lクローン24-31、およびATTO 390またはATTO 565含有脂質(BSLBに固有の蛍光を付与するため)の使用を推奨します。単一細胞を単一BSLBおよびコンジュゲートから識別するために、細胞表面で非常に高いレベルで発現しているにもかかわらず、限られたレベルでBSLBに転写される抗CD4クローンOKT4および/または抗CD45クローンHI30の使用を推奨します(蛍光色素および他の検証済み抗体の詳細については 、材料表 を参照)。より多くの蛍光色素を含むパネルを設計することができますが、分析された各蛍光色素の蛍光スペクトルスピルオーバーの体系的な評価が必要です。感度を高めるには、0.5 μg ~ 20 μg/mL の範囲の定量抗体のさまざまな滴定を最終的に試し、抗体の新しいストックが使用されるたびに繰り返します。粒子移動の絶対的および相対的測定の再現性を確保するために、ビオチン化リン脂質およびNi含有リン脂質の各新しいロットの結合能を滴定および計算する。T細胞-BSLBコンジュゲートの段階的な冷却は、存在量の少ない粒子の検出感度を高めるために重要です。共培養の急速な冷却は、脂質蛍光の著しい損失によって証明されるように、BSLBの破壊をもたらす(図3D)。
T細胞免疫シナプスの粒子出力を測定するために、手元にある実験的質問に応じて、異なる測定基準を使用することができる。例えば、出芽SEにソートされた表面タンパク質のベースライン発現レベルにわずかな差異が予想される場合、正規化シナプス伝達(NST%)メトリックを使用することができる(図3C パネル(ii)上段の式)。後者は、BSLBs上のパーセントMFIシグナルを、細胞とビーズの合計MFIの関数として定量化する。このアプローチからの1つの注意点は、超分子攻撃粒子19の成分など、PM上に発現していない転写マーカーの分析である。これらの要素は、細胞内ストアエキソサイトーシスなどのPMトランジットとは無関係の経路によってBSLBに到達するため、分子が比較的小さな分母(細胞表面発現レベル)で除算されるため、結果が膨張するため、NST%の計算は推奨されません。代わりに、補正されたMFIを使用して、抗原または抗CD3 Fabの密度の増加を示すヌルBSLBとBSLBとの間のパーフォリンおよびグランザイムの沈着を比較する。あるいは、BSLBsに伝達された細胞内要素を追跡するために、BSLBsに伝達された最大シグナルに関する推定絶対分子またはシグナルの割合(Tmax%)のいずれかを比較に使用する(図3C パネル(ii)下段の式)。Tmax%の場合、cMFIまたはBSLBサンプル(または条件)で測定された分子のいずれかを使用して、最も高い抗原濃度を基準Tmaxとして提示します。異なるドナーを分析する場合は、比較のためにドナー固有のTmax を使用してください。TCRの特異的トリガーに応答して転写された物質を研究する場合、MFIは抗原陰性(ヌル)BSLBで観察されるバックグラウンド転写のレベルに補正することもできる。
BSLBに転写された分子の絶対数を推定することは、エンドポイントとしての分子の測定と独立した実験のより良い比較を伴うMESF較正を含むため、より堅牢な方法です。Tmax%は、独立した実験にわたって同様の正規化を提供し、パーフォリンやグランザイムなどの細胞内マーカー、またはMESF標準が利用できないマーカーに多色FCMを使用する場合に特に有用です。Tmax%は、単に、対照条件において最も高い転移を有する状態(例えば、薬物研究のためのビヒクル/未処置対照、CRISPR/Cas9ライブラリーのための対照ガイドRNA)に対する任意の所与の条件におけるシグナルの割合である。さらに、Tmax%は、cMFIおよび絶対数の分子の両方に使用でき、T細胞のシナプス出力に対する遺伝子欠失の影響を並べて比較するために特に有用であった。後者は、遺伝子編集が独立したドナーおよび実験の間で免疫受容体発現のダイナミックレンジにおいて高い変動性をもたらし、絶対およびNST%測定に影響を与える可能性がある場合に明らかである。
BSLBは、APCs2による急速なインターナリゼーションのために単離が困難な、異なるT細胞型のシナプス出力の捕捉および特性評価を容易にしてきた。BSLBsの物理的安定性はまた、T細胞によって調査されたBSLBの蛍光活性化細胞選別のためのプラットフォームを提供し、質量分析および核酸シーケンシング技術による高純度粒子調製物の生化学的特性評価を可能にする。後者は、広範囲の実験条件下でT細胞によって流された細胞間メッセンジャーの詳細な特徴付けを容易にする。これらの粒子メッセンジャーが異なるT細胞型および活性化状態の間でどのように変化するか、正準および非正準抗原受容体(すなわち、キメラ抗原受容体)、およびアゴニスト性および拮抗性膜シグナルが粒子組成にどのように影響するかなど、異なる疑問に取り組むことができる。現在、刺激T細胞の免疫シナプスに分泌されるサイトカインの定量的特性評価のために、この技術をさらに発展させています。後者は、組換えサイトカイン受容体と抗体の組み合わせを慎重に研究し、T細胞活性化後にBSLBに沈着したインターロイキン、インターフェロン、およびケモカインの効率的な捕捉を提供する必要がある。BSLBは、間質および自然免疫細胞などのT細胞によるtSV放出を誘発する疑いのある他のAPCの表面組成をモデル化するために適合させることができる。BSLBはまた、癌および他の病状を治療するための外分泌機構およびtSV分泌機構の正および負の調節を求める新しい薬理学的化合物をスクリーニングするために適合させることができる。最後に、BSLBは、感染症におけるT細胞機能を調節する病原性決定因子を発見するためにも使用できます20。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
建設的な科学的議論をしてくれた研究室メンバーとケネディリウマチ研究所コミュニティ、特にフローサイトメトリー施設マネージャーのジョナサン・ウェバーに感謝しています。この研究は、Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z、ERC Advanced Grant(SYNECT AdG 670930)、Kennedy Trust for Rheumatology Research(KTRR)(3つともMLDに)から資金提供を受けました。PFCDは、欧州委員会(LTFCOFUND2013、GA-2013-609409)およびMarie Sklodowska-Curie Actionsと共同で、EMBO長期フェローシップ(ALTF 1420-2015)およびオックスフォード・ブリストル・マイヤーズスクイブ・フェローシップによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
References
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