Immunology and Infection

Fremstilling av perlestøttede Lipid Bilayers for å studere partikkelutgangen av T-celle immunsynapser

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130

¹Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Her presenterer vi protokollen for trinnvis rekonstituering av syntetiske antigen-presenting celler ved hjelp av Perle-støttede Lipid Bilayers og deres bruk for å forhøre synaptisk utgang fra aktiverte T-celler.

Abstract

Antigen-presenterende celler (APCer) presenterer tre aktiveringssignaler til T-celler engasjert i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation / corepression, og 3) oppløselige cytokiner. T-celler frigjør to typer effektorpartikler som svar på aktivering: henholdsvis transsynaptiske vesyrer (TSVer) og supramolekulære angrepspartikler, som overfører intercellulære budbringere og formidler cytotoksisitet. Disse enhetene blir raskt internalisert av APC-er som er engasjert i fysisk kontakt med T-celler, noe som gjør karakteriseringen skremmende. Dette dokumentet presenterer protokollen for å fremstille og bruke Perlestøttede Lipid Bilayers (BSLD-er) som antigen-presenting celle (APC) mimetics for å fange og analysere disse transsynaptiske partiklene. Også beskrevet er protokollene for absolutte målinger av proteintettheter på celleoverflater, rekonstituering av BSLD-er med slike fysiologiske nivåer, og strømningscytometriprosedyren for sporing av synaptisk partikkelfrigjøring av T-celler. Denne protokollen kan tilpasses for å studere effekten av individuelle proteiner, komplekse ligandblandinger, patogene virulens determinanter og legemidler på effektorutgangen av T-celler, inkludert hjelper T-celler, cytotoksiske T-lymfocytter, regulatoriske T-celler og chimeric antigenreseptor-uttrykkende T-celler (CART).

Introduction

Den immunologiske synapsen (IS) er en pivotal molekylær struktur dannet ved grensesnittet av celler engasjert i fysisk kontakt som letter regulert utveksling av jukstracrininformasjon. Ulike ISer har blitt beskrevet i litteraturen, og en voksende mengde bevis tyder på at disse molekylære knutepunktene er et bevart trekk ved mobilnettverk. Ulike immunceller, inkludert B-celler, naturlige morderceller, dendrittiske celler, makrofager og T-celler, utveksler informasjon via montering av kortvarige ^kontakter1. Multiomiske studier fremmer forståelsen av nye undergrupper av leukocytter og stromale celler som driver patogene cellulære nettverk og uttrykker overflateproteiner med ukjente funksjoner. Som syntetiske APC-er tillater BSLD-er direkte undersøkelse av enkeltproteinenes funksjonelle rolle i integreringen av aktiveringssignaler, nemlig antigener og kostimulering /kjernetrykk, av T-celler og den resulterende frigjøringen av effektorpartikler referert til som signal fire.

Dette dokumentet beskriver protokollene og kritiske tekniske punkter du bør vurdere når du bruker BSLD-er til å etterligne overflatesammensetningen til modell-APCer. Protokollene for kvantitativ måling av immunreseptorer og andre overflateproteiner på APC-er presenteres sammen med protokollen for rekonstituering av syntetiske APC-er som inneholder disse målte mengdene. Deretter presenteres trinnene som kreves for kokulturerende T-celler og BSLB sammen med protokollen for kvantitativ måling av transsynaptisk partikkeloverføring ved hjelp av strømningscytometri. Mest bemerkelsesverdig er BSLD-er lette å studere en plasmamembran-avledet populasjon av TV-er kalt synaptiske ektosomer (SE). T-celle antigenreseptorberiket (TCR ⁺) SE kastes som svar på TCR-utløser2 og effektivt fanget av BSLBs3, som representerer en utmerket avlesning for å vurdere de agonistiske egenskapene til antigener og den modellerte membransammensetningen. CD63⁺ eksosomer og supramolekulære angrepspartikler (SMAPer) frigjøres også av stimulerte T-celler og fanges opp av BSLD-er. De kan brukes som ytterligere avlesninger av aktivering og den resulterende eksocytiske og lytiske granulatsekresjonen av T-celler. Mobiliseringen av eksocytiske vesikler til den interagerende polen til T-cellen letter også retningsutløsningen av cytokiner, som IL-2, IFN-γ og IL-10 som svar på aktivering4,5,6,7,8. Selv om T-celle utgitt cytokiner også kan påvises på BSLD-er, er en mer dedikert studie for tiden under utvikling for å validere den kvantitative analysen av cytokinfrigjøring ved immunologisk synapse.

For å forhøre hvordan spesifikke membransammensetninger påvirker T-cellenes synaptiske utgang, må du definere den fysiologiske tettheten til målmembrankomponenten. Strømningscytometribaserte kvantifiseringer av celleoverflateproteiner er et viktig skritt i denne protokollen og krever: 1) bruk av antistoffer med kjent antall fluorokromer per antistoff (F/P) og 2) benchmarkperler som gir en standardreferanse for interpolerende fluorokrommolekyler fra målte gjennomsnittlige fluorescensintensiviteter (MFIer).

Disse referansestandardene består av fem perlepopulasjoner, som hver inneholder et økende antall tilsvarende løselige fluorokromer (MESFer), som spenner over det dynamiske spekteret av vilkårlig fluorescensdeteksjon. Disse standardpopulasjonene gir diskrete fluorescenstopper, noe som letter konverteringen av vilkårlige fluorescensenheter til MESFer ved enkel lineær regresjon. De resulterende MESF-ene brukes deretter sammen med antistoff F/P-verdier for å beregne gjennomsnittlig antall bundne molekyler per celle (eller BSLB i senere trinn). Anvendelsen av estimerte celleoverflateområder til gjennomsnittlig antall påviste molekyler muliggjør deretter beregning av fysiologiske tettheter som molekyler / ^μm2. Denne kvantifiseringsprotokollen kan også tilpasses måling av proteintettheter på T-celler og den biokjemiske rekonstitueringen av membransammensetninger som formidler dannelsen av homotypiske T-cellesynapser (dvs. T-T synapses9). Om nødvendig kan valensen av antistoffbinding videre estimeres ved å bruke rekombinante mål merket med kjent antall fluorokromer per molekyl. Deretter kan antistoffbindende valens beregnes for samme BSLB-populasjon ved samtidig å sammenligne antall bundne fluorescerende proteiner og kvantifiseringsantistoffer (ved hjelp av to forskjellige kvantifiseringsfluorikromer og MESF-standarder).

Rekonstituering av APC membraner krever montering av støttede lipid bilayers (SLD) på silikaperler1. Liposomebestander som inneholder forskjellige fosfolipidarter kan utnyttes til å danne en allsidig lipid-bilayermatrise, noe som muliggjør forankring av rekombinante proteiner med forskjellig bindende kjemi (fremstillingen av liposomer er detaljert i ¹⁰). Når den fysiologiske tettheten (eller tettheten) til den aktuelle liganden "på celler" er definert, er den samme strømningscytometriprotokollen tilpasset for å estimere konsentrasjonen av rekombinant protein som trengs for å belegge BSLD-er med målfysiologisk tetthet. To forskjellige forankringssystemer kan brukes enten i kombinasjon eller separat.

For det første er SLB som inneholder en endelig 12,5 mol% av ^{Ni2 +}-inneholdende fosfolipider tilstrekkelig til å gi omtrent 10.000 His-tag bindingssteder per kvadrat ^micron10 og fungerer godt for å dekorere BSLD-er med de fleste kommersielt tilgjengelige proteiner hvis fysiologiske tettheter ikke overstiger denne maksimale lastekapasiteten. Det andre lastesystemet utnytter biotinholdige fosfolipider (som mol%) for å laste biotinylerte anti-CD3e Fab (eller HLA / MHC monomerer) via streptavidinbroer. Kombinasjonen av disse to BSLB dekorasjonsmetodene muliggjør deretter fleksibel skreddersøm av BSLD-er som syntetiske APC-er. For svært komplekse APC-overflatesammensetninger kan mol% av fosfolipider og proteiner økes for å laste så mange proteiner som spørsmålet krever. Når arbeidskonsentrasjonene av proteiner og mol% av biotinylerte fosfolipider er definert, kan BSLD-er monteres for å forhøre den synaptiske utgangen av T-celler med multiparametrisk strømningcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Måling av celleoverflateproteintetthet med kvantitativ strømningscytometri

Forbered 0,22 μm-filtrert human strømningscytometribuffer (hFCB) ved å tilsette EDTA (til en endelig 2 mM konsentrasjon) og humant AB-serum (til en endelig 10%) til steril fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 (se tabell 1). Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm pore filterenhet for å fjerne serum urenheter og lagre ved 4 °C.
Gjenopprett cellene og sedimenter dem ved sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
Vask cellene to ganger med PBS. I hvert vasketrinn, resuspend cellene i PBS til det opprinnelige volumet (før sentrifugering) og spinn ned på 300 × g i 5 min på RT.
Tell trypan blåfargede celle suspensjoner i et hemocytometer11. Alternativt kan du telle celler ved hjelp av elektrisk strømekskludering. For sistnevnte, følg CASY-TT produsentens instruksjoner (se materialtabellen).
MERK: CASY-TT-celletelleren gjør det mulig å bestemme prosent levedyktige celler, cellestørrelse og cellevolum.
Beregn volumet av PBS som inneholder 1:1,000 fortynning av Fixable Viability Dye eFluor 780 eller lignende (se materialtabellen) som kreves for å resuspendere cellene til en fargekonsentrasjon på ¹⁰⁷ celler / ml.
Resuspend cellene ved hjelp av levedyktighet fargestoff-PBS løsning og inkubere på is i 30 min.
Fjern levedyktighetsfargen ved å tilsette ett volum iskald hFCB. Spinn ned ved 300 × g i 5 min ved 4 °C.
MERK: Hold kaldt kjedet ubrutt fra nå av.
Vask cellene med hFCB som inneholder 1:50 fortynning av Fc Receptor Blocking Solution (se materialtabellen). Bring volumet til en endelig konsentrasjon på ¹⁰⁷ celler / ml og inkuber i ytterligere 15 minutter for å oppnå effektiv FcgR-blokkering.
Fordel 100 μL av celleopphenget (dvs. ¹⁰⁶ celler) per brønn av en U-bunn- eller V-bunn 96-brønnsplate. Hold cellene på is og beskyttet mot lys (deksel med aluminiumsfolie).
Forbered en antistoffmesterblanding i hFCB ved å definere de optimale antistoffkonsentrasjonene for hvert fluorokromkonjugert antistoff, og viktigst av alt, for de antistoffene som brukes til å bestemme overflateproteintetthet. For eksempel, for kvantifisering av ICAM-1-uttrykk på tonsillarcellepopulasjoner, som vist i figur 1, lag en blanding som inneholder 1:200 fortynninger av anti-CD4, anti-CD19 og anti-CXCR5 sammen med mettende konsentrasjoner av et anti-ICAM-1 antistoff med kjente AF647 fluorokromer per antistoff (dvs. 10 μg/ml, som ble definert av uavhengige antistofftitreringseksperimenter).
Som tilleggskontroller, lag en antistoffmasterblanding som inneholder de relevante antistoffisotypekontrollene (i samme effektive konsentrasjoner som deres kolleger konjugert med de samme fluorokromene for bakgrunnsdeltraksjon), det vil si bruk 10 μg/ml av en relevant AF647 isotypekontroll.
MERK: I eksemplet ovenfor brukes en slik isotypekontroll til å trekke bakgrunnsfluorescens fra det sanne ICAM-1-signalet på celler.
Når du kvantifiserer proteintettheter på celleundersett som er tilstede ved lave frekvenser i vev, klargjør fluorescens minus en (FMO) kontroller som inneholder alle fargingsantistoffer bortsett fra interessemarkørene (se ytterligere detaljer i ¹²).
Spinn ned 96-brønnsplaten som inneholder cellene ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og bland cellene på nytt i 50 μL av enten kvantifiseringsantistoffmesterblandingen eller isotype antistoffmesterblandingen.
Inkuber cellene i minst 30 min ved 4 °C og 400 o/min ved hjelp av en plate shaker. Beskytt platene mot lys (deksel med aluminiumsfolie).
Vask cellene tre ganger med hFCB og sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C.
Resuspend cellepellet ved hjelp av 200 μL PBS (dvs. til en endelig konsentrasjon på 5 × ¹⁰⁶ celler / ml).
For anskaffelse:
1. Hvis du bruker en standard BD FACS Loader, overfør prøvene til 5 ml polystyren rundbunnsrør (se materialtabellen).
2. Hvis du bruker high-throughput Samplers (HTS, også referert til som platelesere), fortsett umiddelbart til trinn 1.19.
Før du fortsetter med datainnsamlingen for MESF-standardene, må du kontrollere fluorescensintensitetens linearitetsgrense og minimumsgrenser for kvantifiseringskanalene.
Før kompensasjon må du innhente data for MESF-standardene, slik at både de dimmeste og lyseste populasjonene faller i det lineære måleområdet.
Hent kompensasjonsprøvene. Hold fotomultiplierrørets (PMT) spenningsverdier for kvantifiseringskanalene uendret for å bevare det dynamiske deteksjonsområdet. Utfør små justeringer i PMT-spenningen til andre kanaler før du beregner kompensasjonsmatrisene.
Beregn og bruk kompensasjon.
Anskaffe og spare minimum 2 × ¹⁰⁴ totale MESF perler for hver av kvantifiseringskanalene.
Velg populasjonen av enkeltceller basert på deres side- og fremoverlysspredningsområder (henholdsvis SSC-A og FSC-A, som vist i figur 1A (i)), etterfulgt av valg av hendelser i tidskontinuumet (figur 1A (ii)) og lavt for flytidspunkt (W) i både FSC og SSC sammenlignet med høyden (dvs. FSC-W/FSC-H, etterfulgt av SSC-W/SSC-H-gating som vist i henholdsvis figur 1A (iii) og (iv). Definer en endelig enkelthendelsesport som inneholder hendelser med proporsjonal FSC-A- kontra FSC-H-distribusjon (figur 1A (v)).
Hent kontrollprøver (Isotype-merkede og FMO-kontroller).
Hent prøver og registrer til minst 10 000 målceller er anskaffet.
MERK: Den robuste bestemmelsen av gjennomsnittlige molekylære tettheter krever analyse av flere givere på tvers av uavhengige eksperimenter. Dette er avgjørende når du analyserer enten celleundergrupper som finnes i reduserte frekvenser eller avledet fra knappe biologiske materialer (f.eks. fra humane vevsbiopsier).
Vask cytometeret som går i 5 minutter med en FACS rengjøringsløsning etterfulgt av 5 min ultrarent vann før du slår av instrumentet. Hvis du bruker HTS, følger du alternativene under fanen HTS og Clean Plate-programmet.
MERK: For å redusere prøve-til-prøve-overføring, aktiver sitte (sampler) flush eller høy gjennomstrømning prøvevask , som automatisk vil vaske cytometeret mellom rør eller brønner. Før du starter oppkjøpet, kjør ultrapure vann i 10 min med høy strømningshastighet for å fjerne uvaskede biologiske forurensninger fra cytometerprøvelinjen.
Eksporter FCS-filene (Flow Cytometry Standard).

2. MESF overkorrigerte gjennomsnittlige (eller median) fluorescensintensitetsanalyser (MFI)

Åpne flyt cytometri analyse programvare og laste eksperiment fcs filer. Velg populasjonen av perler basert på deres side og fremover lys spredning områder (SSC-A versus FSC-A), som vist i figur 1A (i).
Kontroller datakvaliteten ved å kontrollere distribusjonen av enkelthendelser over tid, som angitt i trinn 1.24.
MERK: Bobler skaper hull i fordelingen av hendelser over tid; Dette skjer vanligvis i begynnelsen av oppkjøpet ved hjelp av HTS. Unngå å velge hendelser som flankerer hull i anskaffelsestiden, da disse legger til målefeil på grunn av optiske avvik.
Fokuser på enkelthendelsene.
1. Celler
  1. Identifiser enkeltceller først basert på SSC-A- og FSC-A-fordelingen (figur 1A (i)), etterfulgt av hendelser som er lave for W i de sekvensielle portene FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 1A-panel (iii)) og SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figur 1A-panelet (iv)). Definer en ekstra singlets-3-port ved å velge hendelser med proporsjonal FSC-A og FSC-H (figur 1A, panel (v)). Til slutt, identifiser levende celler som de negative for fikserbar levedyktighet fargestoff.
2. MESF perler
  1. Følg de samme singlets-1 til singlets-3 diskriminering som i trinn 2.3.1.1 (Figur 1B, paneler (i) til (v)). Identifiser hver av MESF-populasjonene (blanke, 1, 2, 3 og 4) basert på fluorescensintensitetsnivåene (se figur 1B, panel (vi)).
Trekk ut MFI for MESF-brøker tomme og 1 til 4.
Generer korrigerte MFI-verdier (cMFI) for MESF-brøker 1 til 4 ved å trekke MFIene for den tomme perlepopulasjonen fra hver brøk.
Beregn linjen med best tilpasning for relasjonen mellom CMFIer og MESF-verdiene fra leverandøren (uavhengig variabel, som er brøk tom lik null).
Trekk ut hellingen (b i ligningen nedenfor) av den lineære regresjonen av MESF over cMFI (figur 1B-panelet (viii) viser en regresjon der y = a + bx; med a = 0).
Trekk ut median (for bimodale fluorescensfordelinger) eller gjennomsnitt (for normale eller logg-normale fluorescensfordelinger) fluorescensintensiteter fra interessepopulasjonene (TFH- og B-celler i figur 1A-panelet (vii)).
Som i trinn 2.5-2.7 trekker du ut MFI-verdiene fra isotypemerkede kontrollceller.
Hvis F/P for isotypekontroller er det samme som kvantifiseringsantistoffene, korrigerer du MFIene til fargede celler ved å trekke MFIene fra isotypemerkede celler.
Hvis isotypenes F/P avviker fra kvantifiseringsantistoffene, trekker du ut MESF fra isotypene ved å dele MFIene til isotypemerkede celler med hellingen beregnet i trinn 2.7. Trekk Isotype MESF fra kvantifisering mesf før du estimerer bundet kvantifisering antistoffer.
Del MESF ved F/P av kvantifiseringsantistoffene for å estimere antall bundne molekyler per celle (Molec._somvist i flytskjemaet i figur 1C).
Del antall bundne molekyler med det estimerte celleoverflatearealet (CSA (^μm2)) for å trekke ut tettheten av proteiner som molec./^μm2 (figur 1C). Se delen for representative resultater hvis du vil ha mer informasjon.

3. Funksjonelle fosfolipidarter som skal brukes til kalibrering av proteiner som belegges BSLD-er

Bruk 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) som hovedkomponent i lipidmatrisen som danner den støttede lipidbilayeren. Fortynn alle andre lipidarter i denne DOPC-løsningen.
Bruk mellom 0,2 og 1 mol% av 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin) konjugert til fargestoffer, inkludert ATTO 390, 488 eller 565 (se materialtabellen), for å generere BSLIB-er med innebygd fluorescens.
MERK: Den iboende fluorescensen til BSLD-er letter identifiseringen av enkle BSLD-er og enkeltceller i synaptiske overføringseksperimenter.
Bruk 12,5 mol% av 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentyl) iminodiacetisk syre) succinyl]) for å forankre hans taggede proteiner. Hold mol% av DGS-NTA (Ni) konstant og utfør 2 ganger titrasjoner av de hismerkede proteinene som starter med 100 nM som den høyeste konsentrasjonen. La en tilstand uten protein som en negativ kontroll for absolutte kvantifiseringer.
MERK: Tilbehørssignaler og vedheftsmolekyler, som ICAM-1, er designet med en 12-Hans tag for å øke affiniteten til proteinet for DGS-NTA (Ni).
Bruk Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin-N-(cap biotinyl)) for å forankre biotinylerte proteiner via biotin-streptavidin-biotin broer. Bruk en 5 ganger seriell titrering på 0,4 mM Biotinyl Cap PE-belegg mellom 10 mol% og 0 mol% (som negativ kontroll). Hold konsentrasjonen av streptavidin og biotinylerte proteiner konstant (200 nM) i både kalibreringsforsøk og rekonstituering av syntetiske APCer for synaptiske overføringsforsøk.
MERK: Regresjonsanalysene av empiriske tettheter av biotinylerte proteiner over den endelige mol% av Biotinyl Cap PE i lipidmatrisen (som også inneholder DGS-NTA(Ni) for å forankre hans taggede proteiner) vil definere mol% som skal brukes til å rekonstituere måltetthetene til antigen.

4. Tilberedning av supplert HEPES bufret saltvann som inneholder 1% serumalbumin

MERK: Supplert HEPES-bufret saltvann som inneholder 1% humant serumalbumin (HBS/HSA) eller 1% bovint serumalbumin (HBS/BSA) kreves i vaske- og proteinbelastningstrinnene til BSLD-er (tabell 1). Forbered en 10x HBS lagerløsning og arbeidsbufferen så frisk som mulig; oppbevares nedkjølt og brukes innen en måned. Mens BSA er et billigere alternativ til HSA, gir det effektiv blokkering av Ni-chelaterende ^lipider13 og anbefales for eksperimenter med høy gjennomstrømning.

Forbered en 10x lagerbufferløsning av supplert HBS som inneholder 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glukose, 10 mM _CaCl2 og 20 mM _MgCl2.
MERK: Oppløsning av _MgCl2er svært eksotermisk og en brannfare. Tilsett dette saltet sakte og på et stort volum løsningsmiddel. Unngå å tilberede konsentrerte løsninger (dvs. 1 M) av disse saltene, da de har en tendens til å utfelle over tid, noe som gjør deres presise tillegg til arbeidsbufferen vanskelig.
Filtrer 10x-oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm filterenhet og hold den steril ved 4 °C.
For 500 ml HBS/has, ta 50 ml av den ekstra 10x HBS-oppløsningen, juster pH til 7,4 om nødvendig, og utgjør volumet til 483,4 ml med ultrarent vann.
Tilsett 16,6 ml 30 % HSA-oppløsning til 483,4 ml HBS, pH 7,4.
For 500 ml HBS/BSA oppløses 5 g BSA i HBS og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Bland deretter forsiktig på RT ved å invertere flasken med jevne mellomrom til det ikke er synlige proteinkrystaller eller klumper.
Filtrer den resulterende løsningen fra trinn 4.5 ved hjelp av en 0,22 μm filterenhet (se materialtabellen) og oppbevar den ved 4 °C.

5. Kalibrering av proteintetthet på BSLD-er

Før du tar de 5,00 ±0,05 μm diameter ikke-funksjonaliserte silikaperler, bland lagerløsningen godt og resuspend noen store klumper av perler sedimentert på bunnen av kolber.
MERK: Silikaperler har en tendens til å sedimentere raskt, noe som kan føre til tellefeil. Bland kraftig ved å pipettere opp og ned halvparten av det maksimale volumet av en P1000 mikropipette.
Fortynn 1 μL perleoppløsning i 1000 μL PBS, tell perlene ved hjelp av et hemocytometerkammer, og beregn konsentrasjonen per ml.
MERK: Trypan blå flekker er ikke nødvendig for å visualisere silikaperler.
Beregn volumet av silikaperler som trengs for 5 × ¹⁰⁵ endelige BSLD-er per titreringspunkt.
Overfør det nødvendige volumet av silikaperler til et sterilt 1,5 ml mikrosenterrør.
Vask silikaperlene tre ganger med 1 ml steril PBS, sentrifuger perlene i 15 s på en stasjonær mikrosenter ved RT (ved fast turtall).
MERK: Når du fjerner vaskeløsningen, må du unngå å forstyrre perlepelleten. En liten bufferkolonne vil ikke påvirke spredningen av liposomene som komponerer liposomets mesterblanding, da disse også er i PBS.
Forbered tre bind av liposomets mesterblanding for å montere BSLB på de vaskede silikaperlene (f.eks. hvis det første totale volumet av silikaperler er 20 μL, lag minst 60 μL liposomblanding).
For Biotinyl Cap PE mol% titrasjoner
1. Forbered lipidmasterblandingene som inneholder 5 ganger fortynning av Biotinyl Cap PE.
  1. Fortynn 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% i en 100% DOPC-matrise.
  2. Bland hvert Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt med et 1:1 (vol:vol) forhold med en løsning på 0,4 mM 25% DGS-NTA (Ni) slik at en endelig 12,5 mol% av Ni-inneholdende lipider er til stede i alle titrasjoner.
    MERK: De 12,5 mol% (vol:vol%) av Ni-inneholdende lipider representerer den blandede lipidsammensetningen av BSLD-er som hansmerkede proteiner også kan testes i parallelle kalibreringer. For eksempel, siden alle liposomelagre er tilberedt ved samme molarkonsentrasjon, for å nå målmol% blandingen i 200 μL av endelig liposomblanding, bland bare 100 μL 25 mol% av Ni-inneholdende DGS-NTA med 100 μL 100 mol% DOPC.
2. Overfør 5 × ¹⁰⁵ vaskede silikaperler til 1,5 ml mikrosentrifugerør, slik at ett Biotinyl Cap PE mol% titreringspunkt monteres per rør.
3. Tilsett Biotinyl Cap PE mol% titreringsmesterblandinger til de vaskede silikaperlene og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av det totale volumet. Unngå å danne bobler, som i overkant ødelegger lipidbilayeren.
4. Tilsett Argon (eller Nitrogen) gass på røret som inneholder de nå dannende BSLD-ene for å fortrenge luft og beskytte lipidene mot oksidasjon under blanding.
5. Legg Argon til lipidlagrene på 0,4 mM før lagring og manipuler ved hjelp av en steril teknikk.
  MERK: Koble en liten slange til Argon/Nitrogen gassflaske. Før du tilsetter gass på rørene, må du justere gassflaskeregulatoren slik at trykket ikke er høyere enn 2 psi. Koble en steril pipettespiss til utløpsslangen for å lede gassstrømmen inne i liposomet i 5 s og lukk lokket raskt. Når det gjelder lipidlagre, forsegler du rørets lokk med parafinfilm før du lagrer det ved 4 °C.
6. Flytt BSLD-ene til en vertikal laboratoriemikser med variabel vinkel (se materialtabellen) og bland i 30 minutter ved RT ved hjelp av en orbital blanding på 10 o/min.
  MERK: Dette trinnet vil forhindre sedimentering av perler under dannelsen av den støttede lipid-bilayeren.
7. Spinn ned perlene ved å sentrifugere i 15 s på RT på en benktop minicentrifuge, og vask deretter tre ganger med 1 ml HBS / HSA (BSA) for å fjerne overflødige liposomer.
8. Blokker de dannede BSLD-ene ved å legge til 1 ml 5 % kasein eller 5 % BSA som inneholder 100 μM _NiSO4for å mette NTA-anlegg og 200 nM streptavidin for å belegge alle biotinforankringssteder på BSLD-ene jevnt. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av det totale volumet og inkubere i den vertikale mikseren i ikke mer enn 20 minutter ved RT og 10 rpm.
9. Spinn ned BSLD-ene ved å sentrifugere i 15 s ved RT på en benkplate minicentrifuge, og vask deretter tre ganger med 1 ml HBS/HSA (BSA)-buffer.
  MERK: Hold vasket perler vertikalt med et lite volum vaskebuffer som dekker BSLD-ene. Unngå dehydrering av BSLD-ene, da luft vil ødelegge lipid-bilayeren.
For titrering av hismerkede proteiner på 12,5 mol% av DGS-(Ni) NTA-inneholdende BSLD-er
1. Forbered tre bind liposom master mix som inneholder en endelig 12,5 mol% av DGS-NTA (Ni).
2. Bruk liposomets mesterblanding til å resuspendere de vaskede silikaperlene og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av det totale volumet. Unngå å danne bobler, noe som i overkant skader lipidbilayeren.
3. Tilsett Argon (eller Nitrogen) gass på røret som inneholder de nå dannende BSLD-ene for å fortrenge luft og beskytte lipidene mot oksidasjon under blanding.
4. Legg Argon til lipidlagrene på 0,4 mM før lagring og manipuler ved hjelp av en steril teknikk.
5. Flytt BSLD-ene til den vertikale mikseren og bland i 30 minutter ved RT ved hjelp av orbital blanding ved 10 o/min.
6. Spinn ned perlene ved å sentrifugere i 15 s på RT på en benktop minicentrifuge, og vask deretter tre ganger med 1 ml HBS / HSA (BSA) for å fjerne overflødige liposomer.
7. Blokker de dannede BSLD-ene ved å legge til 1 ml 5 % kasein (eller 5 % BSA) som inneholder 100 μM _NiSO4for å mette NTA-anlegg på BSLB-ene. Bland forsiktig og inkuber i den vertikale mikseren i ikke mer enn 20 minutter ved RT og 10 o/min.
8. Vask tre ganger med HBS/HSA (BSA) for å fjerne overflødig blokkeringsløsning.
9. I en ny U-bunn 96-brønns plate forberede 2 ganger seriell fortynning av proteinene.
  1. Forbered en startkonsentrasjon på 100 nM for proteinet av interesse i et totalt volum på 200 μL HBS/HSA (BSA) buffer, fordel 100 μL av denne løsningen i den første kolonnen, og de resterende 100 μL på toppen av kolonne #2 som inneholder 100 μL HBS/HSA (BSA) buffer.
  2. Fortsett med å overføre 100 μL serielt fra kolonne #2 til kolonne #3 og gjenta etter behov for å dekke alle titreringspunkter. La den siste kolonnen i serien uten protein, da dette vil bli brukt som den tomme referansen for kvantifisering.
10. Resuspend de forberedte BSLD-ene i et volum slik at 5 × ¹⁰⁵ BSLB finnes i 100 μL HBS/HSA (BSA)-buffer.
11. Overfør 100 μL av BSLB-suspensjonen til brønner av en annen U-bunn 96-brønnsplate, slik at hver brønn mottar 5 × ¹⁰⁵ BSLD-er.
12. Snurr ned den andre platen som inneholder BSLD-er i 2 min ved 300 × g og RT og kast supernatanten.
13. Overfør de 100 μL volumene fra proteintitreringsplaten til platen som inneholder de sedimenterte BSLD-ene. Bland forsiktig, unngå overflødig boblegenerering under pipettering, og inkuber i 30 min ved RT og 1000 rpm ved hjelp av en plate shaker. Beskytt mot lys med aluminiumsfolie.
14. Vask platen tre ganger med HBS/HSA (BSA)-buffer ved hjelp av sedimenteringstrinn på 300 × g i 2 min ved RT.
15. Hvis det rekombinante proteinet som brukes i kalibreringen, direkte bøyes til fluorokromer og har kjente F/P-verdier, går du videre til trinn 5.8.20.
16. Hvis det rekombinante proteinet som brukes i kalibreringen er umerket eller konjugert til fluorokromer eller ingen MESF-perlestandard er tilgjengelig, bruk Alexa Fluor 488 eller 647-konjugerte antistoffer med kjente F/P-verdier for å farge den proteinbelagte BSLB.
17. Flekk med mettende konsentrasjoner av kvantifiseringsantistoffer.
  MERK: Avhengig av måluttrykksnivået varierer disse områdene mellom 5 og 10 μg/ml.
18. Flekk i 30 min ved RT og 1000 rpm ved hjelp av en plate shaker. Beskytt mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
19. Vask to ganger med HBS/HSA (BSA)-buffer og en gang med PBS ved hjelp av sedimenteringstrinn på 300 × g i 2 min ved RT.
  MERK: Bruk PBS, pH 7.4 for å resuspendere de vaskede BSLD-ene før anskaffelse. Ikke bruk buffere som inneholder protein, da dette fører til dannelse av bobler under automatisk blanding av prøver med høygjennomstrømningsprøver.
20. Oppnå MESF-standardene, og sørg for at de lyseste toppene forblir i det lineære deteksjonsområdet for kvantifiseringsdetektoren (kanalen), som vist i figur 1B (vii).
21. Hent prøvene manuelt eller ved hjelp av HTS. Hvis du bruker sistnevnte, resuspend BSLB i 100 μL PBS og anskaffe 80 μL ved hjelp av en strømningshastighet mellom 2,5 og 3,0 μL/s, et blandingsvolum på 100 μL (eller 50% av det totale volumet hvis resuspensionvolumet er mindre), en blandingshastighet på 150 μL / s og fem blandinger for å sikre at BSLD-er er monodispersed.
22. Eksporter FCS-filene.
23. Fokus på enkelthendelser for analysene (figur 2A), da doble eller trillinger vil innføre feil i bestemmelsen. Bruk nestet identifikasjon av enkelthendelser som angitt i protokolltrinn 1.2.3.
24. Mål MFI for hver MESF-brøk (1-4) og trekk fra MFI for tomme perler for å trekke ut korrigerte MFIer (cMFI).
25. Utfør en lineær regresjonsanalyse for å trekke ut hellingen (b) til MESF over cMFI beregnet for MESF-standarder, som vil bli brukt i trinn 5.33.
26. Trekk ut MFI for hvert titreringspunkt og trekk fra MFI av perler uten protein for å oppnå cMFIer.
27. Del cMFIene med hellingen beregnet i trinn 5.31 for å trekke ut MESF bundet til BSLD-er for hvert titreringspunkt.
28. Del MESF bundet til BSLD-er etter F/P-verdien av kvantifiseringsantistoffet for å trekke ut gjennomsnittlig antall molekyler bundet per BSLB.
29. Bruk diameteren på BSLD-ene (5,00 ± 0,05 μm), trekk ut perleoverflateområdet (SA = 4pr2) for å beregne de endelige tetthetene av protein (molec./^μm2) per titreringspunkt (proteinkonsentrasjon).
30. Utfør en ny regresjonsanalyse av proteinkonsentrasjon over proteintetthet for å beregne hellingen (b) av linjen med best passform.
  MERK: Konsentrasjonen av 12,5 mol% av DGS-NTA(Ni) gir en maksimal forankringskapasitet på ca. 10 000 molec./^μm210 uten å indusere den ikke-spesifikke aktiveringen av T-celler eller påvirke SLD-enes laterale mobilitet.

6. Utføre synaptiske overføringsforsøk mellom T-celler og BSLD-er

Før du kjører det synaptiske overføringseksperimentet
1. Skaff deg ikke-fluorescerende BSLD-er, BSLD-er med fluorescerende lipider, ubegrunnede celler (eller kompensasjonsperler, se materialtabellen) og enkeltfargede celler (eller kompensasjonsperler) for å identifisere instrumentets fluorescensspektruminteraksjoner. Fokuser på de detektorene med høy smittespredning for å redesigne det polykromatiske panelet, øke følsomheten og redusere målefeilen på kritiske detektorer (se ¹⁴).
2. Titrate deteksjonsantistoffene for å finne den optimale konsentrasjonen, noe som muliggjør registrering av positive hendelser uten å gå på kompromiss med påvisning av negativer.
  MERK: Gjenta dette trinnet når det er en antistoff lot endring som F / P verdier og lysstyrke varierer fra batch til batch.
3. Valgfritt: Optimaliser PMT-spenningene ved å anskaffe prøven ved forskjellige spenningsområder (dvs. en spenningsvandring) for å finne PMT-ene som fører til optimal signal over støy (dvs. separasjon av negativer og positiver samtidig som signalet fra den lyseste populasjonen forblir i det lineære området).
Måling av T-celleutgangsoverføring til BSLD-er
1. Forbered supplert RPMI 1640 (heri R10 medium) som inneholder 10% av varmeinaktivert foster bovint serum (FBS), 100 μM ikke-essensielle aminosyrer, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyminitt, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Bruk R10 middels til kultur og utvid T-celler.
2. På dag 1 isolerer du T-celler fra perifert blod eller leukoreduksjonssystem (LRS) kamre. Bruk immunodensitetscelleisolasjons- og separasjonssett (se materialtabellen) for berikelse av humane CD4⁺ og CD8⁺ T-celler.
3. Frø cellene i en endelig konsentrasjon som spenner mellom 1,5 og 2,0 × ¹⁰⁶ celler / ml, ved hjelp av 6-brønnsplater med ikke mer enn 5 ml totalt per brønn.
4. Aktiver T-celler ved hjelp av et 1:1-forhold mellom human T-celleaktivering (anti-CD3/anti-CD28) magnetiske perler (se materialtabellen) og tilsett 100 IE rekombinant menneskelig IL-2 for å støtte celleproliferasjon og overlevelse.
5. På dag 3 fjerner du de aktiverende magnetiske perlene ved hjelp av magnetiske kolonner (se materialtabellen). Forsikre deg om at magnetiske perler forblir festet til sidene av røret før du gjenoppretter cellene for ytterligere vasketrinn.
6. Vask de magnetiske perlene igjen med 5 ml fersk R10 medium, bland godt og legg dem tilbake i magneten . Gjenopprett dette volumet og bland med cellene som ble gjenopprettet i trinn 6.2.5.
7. Bruk cellene på nytt til 1,5-2 × ¹⁰⁶ celler/ml i fersk R10 som inneholder 100 U/ml IL-2. Fyll på medium etter 48 timer, og sørg for at det siste tilskuddet av IL-2 er 48 timer før eksperimenteringsdagen (dag 7 til 14 av kulturen).
8. På dagen for det synaptiske overføringseksperimentet, forberede Synaptic Transfer Assay medium (se tabell 1) ved å supplere Phenol Red-free RPMI 1640 medium med 10% FBS, 100 μM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyuvat, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Ikke ta med rekombinant human IL-2.
9. Tell celler ved hjelp av enten trypan blå farging eller elektrisk strømekskludering og resuspend dem til en endelig konsentrasjon på 2,5 × ¹⁰⁶ celler / ml i medium. Hvis overdreven celledød observeres (>10%), fjern døde / døende celler ved hjelp av en blanding av polysakkarid og natriumdiatrizoat (se materialtabellen) som følger:
  1. Lag 15 ml cellekultur på toppen av 13 ml polysakkarid-natriumdiatrizoatoppløsning.
  2. Sentrifuge i 1250 × g i 20 min ved RT med minimal akselerasjon og deacceleration. Samle cellelaget (skyen) i grensesnittet mellom mediet og polysakkarid-natriumdiatrizoatoppløsningen.
  3. Vask cellene minst to ganger med forhåndsvarslet Synaptic Transfer Assay medium (fremstilt i trinn 6.2.7).
  4. Tell og resuspend cellene til en endelig konsentrasjon på 2,5 × ¹⁰⁶/ml ved hjelp av Synaptic Transfer Assay medium. Kokultur 100 μL av denne cellesuspensjonen med BSLD-er (se trinn 6.2.15).
10. Beregn antall BSLD-er som trengs for eksperimentet. vurdere alle de forskjellige protein master blandinger og antigen titrations som skal testes (enten biotinylated HLA / MHC-peptid monomerer eller monobiotinylated anti-CD3ε Fab).
11. Monter BSLD-ene ved å følge de samme trinnene fra protokolldel 5, men denne gangen kombinerer du alle titreringene av proteiner og lipider som kreves for å rekonstituere en kompleks APC-membran (figur 3A). Hold samme vol: vol relasjoner mellom de første silika perler volum og volumet av protein blanding som brukes under kalibreringer, samt tider og temperaturer som brukes i lasting av BSLD. For eksempel, hvis 0,5 μL silikaperler / brønn og 100 μL / brønn proteinblanding ble brukt til den første kalibreringen, opprettholde 5: 1,000 vol: vol forhold for å forberede BSLD-ene som skal kokultureres med T-celler.
12. Når BSLD-er er lastet med proteinblandingen av interesse, vask BSLD-ene to ganger med HBS / HSA (BSA) for å fjerne overflødige ubundne proteiner. Bruk sedimenteringshastigheter på 300 × g i 2 min ved RT i hvert vasketrinn og kast supernatantene.
13. Resuspend de 5 × ¹⁰⁵ BSLB per brønn i 200 μL.
14. Overfør 100 μL per brønn til en ny U-bunn 96-brønnsplate for å lage en duplikat, slik at den endelige mengden BSLB per brønn er 2,5 × ¹⁰⁵.
15. Spinn ned BSLD-ene ved 300 × g i 2 min og RT og kast supernatanten.
16. Resuspend BSLB-ene ved hjelp av 100 μL T celle suspensjon; bland forsiktig for å forhindre dannelse av bobler.
17. Inkuber kokulturene i 90 min ved 37 °C.
  MERK: Alternativt kan celler og perler brukes på nytt i HBS/HSA (BSA)-buffer i stedet for phenol-rød gratis RPMI for kokulturen. I dette tilfellet må inkubasjonen utføres i en ikke-CO2-inkubator, da denne gassen raskt vil surgjøre bufferen i fravær av bikarbonat.
18. Kjøl ned BSLB-T-cellekokulturene ved først å inkubere cellene på RT i minst 15 minutter. Beskytt dem mot lys.
19. Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 × g og RT; kast supernatanten.
20. Resuspend cellene i RT 2% BSA-PBS (^{Ca2 +} og ^{Mg2 +} -fri) for blokkering. Plasser cellene på is i 45 min. Beskyttes mot lys.
21. Mens du inkuberer cellene, klargjør antistoffmesterblandingen ved hjelp av iskald 0,22 μmfiltrert 2% BSA i PBS som en fargebuffer, noe som vil gi ekstra blokkering.
  MERK: Noen partier med antistoffer konjugert til Brilliant Violet fargestoffer har en tendens til å binde seg til BSLD-er ikke-spesifikk. Blokkering med 5% BSA-PBS bidrar til å redusere denne støyen. Fra nå av, sørg for å holde den kalde kjeden ubrutt.
22. Spinn ned kokulturene ved 500 × g i 5 min og 4 °C. Før du kaster supernatantene, må du kort sørge for at pelletsen er til stede ved å inspisere bunnen av 96-brønnsplaten ved hjelp av bakgrunnsbelysning.
23. Ved hjelp av en flerkanals pipette, resuspender cellene i farging master blandingen som inneholder optimaliserte antistoff konsentrasjoner.
  MERK: Bruk pipettespisser uten filter for å forhindre generering av bobler og feil i fordelingen av fargevolumer.
24. Inkluder isotypemerkede celler og BSLD-er, fluorescerende og ikke-fluorescerende BSLD-er, og celler og BSLD-er farget alene. Respekter det totale antallet hendelser per brønn for alle kontroller (dvs. bare BSLD-er som inneholder 5 × ¹⁰⁵ BSLB/brønn, og bare cellekontroller som inneholder 5 × ¹⁰⁵ celler/brønn for å unngå en relativ økning av antistoffer per farget hendelse).
25. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av volumet og inkubere i 30 min på is. Beskyttes mot lys.
26. Vask cellene og BSLD-ene to ganger med iskalde 2 % BSA-PBS, pH 7,4 og sedimenteringstrinn på 500 × g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend de vaskede kokulturene i 100 μL PBS og anskaffe umiddelbart.
27. Hvis fiksering er nødvendig, fikser du ved hjelp av 0,5% m / v PFA i PBS i 10 minutter, vask en gang og hold i PBS til oppkjøpet. Beskyttes mot lys.
28. Før kompensasjon, anskaffe MESF standarder, sikre både dimmest og lyseste populasjoner faller i det lineære måleområdet.
29. Hent kompensasjonsprøver, beregn kompensasjon og bruk kompensasjonsmatrisen (koblingen) på eksperimentet.
30. Anskaffe og lagre minimum 2 × ¹⁰⁴ totale MESF-standarder for hver av kvantifiseringskanalene.
31. For anskaffelse ved hjelp av prøvetakere med høy gjennomstrømning, sett instrumentanskaffelse til standard, sett prøveanskaffelse til 80 μL (eller 80 % av det totale volumet), prøvestrømningshastighet mellom 2,0 og 3,0 μL/s, prøveblandingsvolum på 50 μL (eller 50 % av det totale volumet for å unngå bobledannelse under blanding), prøveblanding på 150 μL/s og blanding per brønn mellom 3 og 5.
32. Skaff deg minimum 1 × ¹⁰⁴ enkle BSLD-er per prøve (se figur 3B paneler (i)-(vi) for referanseskalastrategien).
33. Vask cytometeret i drift i 5 minutter en rengjøringsløsning etterfulgt av 5 min ultrarent vann før du slår av instrumentet. Hvis du bruker HTS, følger du alternativene under fanen HTS og Alternativet Rengjør .
34. Eksporter FCS-filer.

7. Måling av synaptisk overføring av partikler til BSLB

Åpne eksperimentet FCS filer. Velg populasjonen av celler og BSLD-er basert på deres side- og fremoverlysspredningsområder (SSC-A versus FSC-A), som vist i figur 3B (i).
Velg hendelsene i det kontinuerlige anskaffelsesvinduet (figur 3B (ii)).
Fokuser på enkelthendelser i både celler og BSLB; identifisere enkeltceller først basert på lav W i de sekvensielle portene FSC-W/FSC-H (singlets-1, figur 3B-panel (iii)) og SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figur 3B-panelet (iv)). Definer en ekstra singlets-3-port ved å velge hendelser med proporsjonal FSC-A og FSC-H (figur 3B, panel (v)).
Trekk ut MFI for MESF-brøker tomme og 1 til 4 og fra enkeltceller og MESF for hvert eksperimenteksempel.
Generer korrigerte MFI-verdier (cMFI) for MESF-brøker 1 til 4 ved å trekke MFI for den tomme perlepopulasjonen fra hver brøk.
Generer cMFIer for enkle BSLD-er og celler (se figur 3C-panelet (i)).
Bruk signalet fra BSLB farget med isotype kontroll antistoffer for å korrigere MFI av BSLB farget med antistoffer mot de relevante T cellemarkører. Bruk cMFI til å beregne den normaliserte synaptiske overføringsprosenten (NST%) ved hjelp av ligningen som vises i figur 3C-panelet (ii).
Hvis du i stedet er interessert i partiklene som er spesifikt overført som svar på TCR-utløsning, trekker du signalet fra null BSLD-er fra MFI for agonistiske BSLD-er. Bruk denne cMFI til å beregne TCR-drevet NST% ved å bruke ligningen vist i figur 3C-panelet (ii).
Hvis du er interessert i å bestemme det totale antallet molekyler som overføres som partikkellast over T-celle-BSLB-grensesnittet, anskaffe MESF-benchmarkperler ved hjelp av de samme instrumentinnstillingene og oppkjøpsøkten for T-celle-BSLB-kokulturer.
Analyser MESF-perlepopulasjoner og trekk ut cMFIene som angitt i protokolltrinnene 5.8.15 til 5.8.17. Beregn hellingen av linjen som passer best for regresjonsanalysen av MESF over cMFI.
Bruk den beregnede stigningstallet til å trekke ut antall MESF-avsatt på BSLBer. Bruk cMFIer beregnet ved hjelp av enten isotypekontroller eller null BSLB som tomme for å trekke ut antall MESF-overført spesifikt til stimulerende BSLD-er.
Beregn antall molekyler av markører overført til BSLD-er ved å dele de beregnede (gjennomsnittlige) MESF-ene per BSLB med F/P-verdien av kvantifiseringsantistoffet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FCM for absolutt protein kvantifisering på celleoverflaten
Rekonstituering av BSLD-er som presenterer fysiologiske tettheter av ligander krever estimering av totale proteintettheter på det modellerte celleundersettet. For å rekonstituere BSLD-er må du inkludere alle relevante ligander som forventes å spille en rolle i signalaksen av interesse sammen med proteiner som støtter vedheft og funksjonell interaksjon mellom BSLB og celler, for eksempel ICAM-1 og costimulatoriske molekyler, for eksempel CD40, CD58 og B7 reseptorer (CD80 og CD86). Ytterligere proteiner kan tilsetteres avhengig av spørsmålet, inkludert costimulatoriske molekyler som ^ICOSL3, PD-L1 og PD-L215. For andre molekyler, rekonstituere BSLD-er ved hjelp av molekylære tettheter bestemt ved å analysere celler direkte med kvantitativ strømningscytometri. For direkte konjugede antistoffer gir BioLegend F/P-verdier for hvert antistoffpartinummer. Antistoffer kan også merkes internt og F / P-forholdene bestemmes av spektrofotometri, noe som gir et alternativ når det ikke er kommersielle antistoffer som er konjugert til ønsket fluorokrom. Siden vi bruker de samme antistoffene for å kalibrere antall rekombinante proteiner på overflaten av celler og BSLD-er, er det ikke nødvendig å korrigere antistoffbindende valens da dette forblir konstant. Hvis antistoffbindende valens er nødvendig, bruk både rekombinante proteiner og antistoffer med kjent F / P for å dekorere BSLD-er og sammenligne molekyler av ladde rekombinante proteiner med antall bundne antistoffer etter farging under mettende forhold.

De bundne antistoffmolekylene per celle kan estimeres ved hjelp av en dedikert monokromatisk strømningscytometrisk måling eller et polykromatisk panel av antistoffer som er ment å estimere absolutte proteintettheter på en relativt sjelden undergruppe av celler i et vev av interesse, for eksempel palatinmandler. Figur 1 viser representative målinger av tettheter av ICAM-1 i CXCR5+ B-celler og follikulære T-celler (TFH) som eksempel. Den samme fargingsprotokollen og strømningscytometrianalyseprinsippene som er vist i figur 1A , kan brukes til å måle proteintetthet på epitelceller, stromale celler, monocytter, monocyttavledede dendrittiske celler (moDCer), eller på B- og T-lymfocytter i andre humane og musevev. For vev som er forskjellig fra blod og mandler, må det utvises forsiktighet ved isolering av celler ved hjelp av proteasecocktailer, da langvarig eksponering av celler for å fordøye enzymer reduserer celleoverflateuttrykksnivåer.

Fokuser oppkjøpet og analysene på enkeltceller i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet (figur 1A ii), som hendelser utenfor tidskontinuumet sprer lys og kompromitterer kvantifiseringen. For å øke nøyaktigheten av bestemmelsene, reduser den ikke-spesifikke fargingen av APCer ved effektiv blokkering av FcγRs. Det menneskelige serumet og EDTA som finnes i hFCB muliggjør effektiv FcγR-blokkering mens du chelaterer gratis ^Ca2+ for å redusere spontan aggregering av celler under manipulering og farging (svarte piler i figur 1A (iii) og (iv) viser gjenværende dobler i suspensjoner av tonsillarceller).

Å holde oversikt over instrumentets ytelse ved hjelp av oppsett og sporingsperler og programvaren (eller lignende, se materialtabellen) er avgjørende for reproduserbarheten av kvantifiseringer over tid, spesielt i senere trinn når den synaptiske overføringen av partikler til BSLB måles ved hjelp av bare MFIer (dvs. for fluorokromer der det ikke er mesf-standarder). På samme måte må du kontrollere det lineære området (dvs. linearitet minimum og linearitet maksimum) av vilkårlige fluorescensenheter for kvantifiseringsdetektoren som skal brukes sammen med MESF-standardene, slik at hvert kalibreringspunkt holder det lineære forholdet mellom fluorescens og antall fluorokromer.

Utarbeidelsen av prøver "blank" for fluorescens, eller prøver som gir en ide om bakgrunnsflekkestøy, er avgjørende for å trekke fra det ikke-spesifikke fluorescerende signalet. Isotypekontroller og/eller biologisk nullprøver (f.eks. knockouts) er avgjørende for å korrigere for bakgrunnssignalet til celler og trekke ut det sanne signalet som er avledet fra kvantifiseringsantistoffene (figur 1A-panelet (viii)). På samme måte bruker standard MESF-perler en dedikert tom populasjon for å trekke bakgrunnssignalet fra hver virkelig positive perlepopulasjon (figur 1B-paneler (vii) og (viii)). Når regresjonsanalysene er utført og skråningen som definerer forholdet mellom MESF og korrigerte MFIer er trukket ut, følger omdannelsen til absolutte molekylære tettheter enkle matematiske operasjoner (figur 1C).

For å estimere CSA i figur 1C ble utelukkelse av elektrisk strøm (CASY-TT) brukt til å trekke ut målinger av cellevolum og diameter fra tusenvis av celler. Den resulterende CSA estimert fra beregning av overflateareal for sfærer (^4pr2) varierer med aktiveringstilstanden til cellene, med observerte verdier på 170,37 ± 4,91 ^μm2 for ikke-aktiverte B-celler og 234,52 ± henholdsvis 1,53 ^μm2 og 318 ± 24,45 ^μm2 for ikke-aktiverte og aktiverte T-celler. Disse CSAene er sammenlignbare med de som er estimert ved avbildningsteknikker som tredimensjonal brytningsindekstomografi av ikke-aktiverte ^{lymfocytter16}.

Når utvalget av fysiologiske tettheter er definert (f.eks. ved å sammenligne overflatetettheter på celler som gjennomgår forskjellige aktiveringsprogrammer), kan BSLD-er brukes til å modellere disse overflatene. En titrering av biotinylerte antigene HLA-peptidmonomerer levert av NIH tetramer-anlegget (eller monobiotinylert monomerisk anti-CD3ε-Fab) kan brukes sammen med ICAM-1 12-His for å rekonstituere en kanonisk APC-membran. Kommersielle proteiner merket med 6, 9, 12 og 14 Hans kan brukes til å dekorere overflaten av BSLB (se figur 2A for eksempler med ICAM-1 12-His). Proteintitreringer sammen med kvantitative FCM-analyser gir en robust metodikk for å rekonstituere fysiologiske APC-overflater og teste effekten på synaptisk utgang av forskjellige T-celledelsett.

For å studere utgangen av T-cellesynapser, bruk et celleforhold på 1: 1 BSLB til T for å sikre at i gjennomsnitt en celle vil samhandle med en BSLB i løpet av den studerte perioden. Vi har observert at materialoverføringen er proporsjonal med inkubasjonstiden, og gir en allsidig plattform for å oppdage molekyler overført i lave mengder over celle: BSLB-grensesnittet. En passende paneldesign er derfor avgjørende for å øke følsomheten og påliteligheten til påvisning av transsynaptisk materiale, som i tilfelle av TSVer, varierer utgangen mellom 25 og 36 vesicles / celle / 20 ^min2,3. Test først spektralsølet av hvert fluorokrom-merket antistoff og lipid. Når høy smitte observeres, anbefaler vi titrering av farging av antistoffer og prosentandelen fluorescerende lipider som komponerer BSLB, samt PMT-spenningsvandringer for å redusere spredningsfeilen på kompenserte prøver og forbedre signalet over støyforholdet, henholdsvis (se ^henholdsvis 12,14,17 for en dedikert introduksjon til emnet).

Bruk av kvantifiseringskontroller, inkludert null BSLD-er (mangler antigen eller anti-CD3 Fab) og enten knockout-celler eller isotypemerkede ^prøver18, er avgjørende for å nøyaktig måle overføringen av effektor tSV, for eksempel SEer, samt supramolecular angrepspartikler utgitt i synaptisk kløft. Bruk svært rikelige celleoverflateproteiner som CD4, CD2 eller CD45 sammen med syntetiske fluorescerende lipider (DOPE Atto konjugater) for å identifisere populasjonen av enkeltceller og BSLB ved kaldbasert dissosiasjon av konjugater. Fokuser analysene på geometrisk gjennomsnitt eller median av fluorescensintensiteter i enkelt BSLB og celler (CD4 brukes i figur 3B). SE er en spesialisert type tSV avledet fra plasmamembranen (PM), og deres overføring til BSLB fremgår av gevinsten av markørsignal på BSLD-er med konsistent tap av signal på overflaten av de interagerende cellene (se TCR på BSLD-er som vist i figur 2B, fiolette piler). Null BSLD-er som mangler enten antigen eller anti-CD3 er en utmerket referanse for å holde oversikt over den spesifikke gevinsten av TCR (og andre T-cellemarkører) på BSLB som følge av stimulerende interagerende celler via TCR-komplekset.

Figur 1: Absolutt kvantifisering av proteiner på overflaten av APC-er. (A) Eksempel på kvantitative strømningscytometrimålinger av ICAM-1 på overflaten av tonsillar B-celler (Foll. bc) og hjelper T-celler (TFH). (i-vii) Gating strategi for å analysere enkelt CXCR5 ⁺ Bc og TFH isolert fra menneskelige palatin mandler. Vist er den sekvensielle gating-strategien for å identifisere enkelthendelser i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet. (iii-iv) svarte piler indikerer dobler. (viii) lagt over histogrammer som viser celleoverflateuttrykket til ICAM-1 (blågrønne histogrammer) sammenlignet med FMO-kontroller (grå histogrammer) og FMO-kontroller merket med relevante isotyper (svarte histogrammer, som overlapper med de grå histogrammer) av populasjonene vist i (vii). Piler angir retningen for den nestede gatingstrategien som brukes til å identifisere CXCR5^{+ B-celler} (Bc; CD19⁺) og TFH (CD4⁺). (B) Utvinning av absolutte molekyler på overflaten av tonsillarceller fra MFI krever regresjonsanalyser av MESF-benchmarkperler anskaffet ved hjelp av samme instrumentinnstilling som cellene vist i A. (i-v) Vist er den sekvensielle gating-strategien for å identifisere enkelthendelser i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet. (vi) Gating og måling av MFIer fra ulike standard MESF-populasjoner. (vii) vist er overlagt histogrammer av MESF-populasjonene identifisert i (vi). Verdiene som vises øverst til høyre, representerer MFIene for hver av de fem MESF-populasjonene (tomme, 1, 2, 3 og 4). (viii) Lineær regresjon av MESF over cMFI for MESF-populasjonene vist i (vii). Vist er stigningstallet (b) for å trekke ut MESF bundet til celler fra data i A. (C) I utvinningen av antall molekyler, følg enkle matematiske operasjoner som starter med anvendelsen av skråningen beregnet i (viii) fra målt MESF cMFI (cMFIM) og referanse MESF-verdier (MESFR). Hvis du vil trekke ut MESF-filen som er bundet til celler (_MESFcells), deler du den korrigerte MFI-filen for celler (cMFIcells) med den beregnede _{stigningstallet}. Deretter, for å beregne antall molekyler bundet til celler (Molec._celler), deler du _MESFcells med F/P for deteksjons-antistoffet (kvantifisering). Til slutt, for å beregne molekylær tetthet på overflaten av celler (_Dcells), del Molec. _cellene etter det estimerte celleoverflateområdet (_CSAE). Forkortelser: X = uavhengig variabel; Y = avhengig variabel (målt fluorescens), cMFIM = målt korrigert MFI; _MESFR = referanse MESF-verdier; _MESFcells = estimert MESF per celle; _cMFIcells = korrigerte MFI-celler; Molec. _celler= estimerte molekyler per celle. _Dcells = estimert tetthet på celler; _CSAE = estimert celleoverflateområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Rekonstituering av BSLB med rekombinant ICAM-1 og måling av svevestøvoverføring til BSLD-er (A, i-vi) Flowcytometrianalyse av BSLD-er rekonstituert med økte tettheter av rekombinant monomerisk ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Som i figur 1 fokuserer du gatingstrategien på enkelt-BSLD-er i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet. Legg merke til gapet rett før tidskontinuumsporten, som ble utelukket for å forhindre feil i målingen. (vi) God proteinkvalitet resulterer ofte i det homogene belegget av BSLB ved høye konsentrasjoner, med observasjon av smale fluorescensfordelinger (lav variasjonskoeffisient, se histogrammer i vi). (B) Regresjonsanalyser av ICAM-1 referansekonsentrasjon (_CR) over målt tetthet (_DM). Bruk hellingen til å beregne målkonsentrasjoner av protein (_CT) for å oppnå tettheten av celler (_Dcells) målt i forsøkene i figur 1. Forkortelser: 12-His = 12-histidines tag; _DM = målte molekylære tettheter; _CR = referansekonsentrasjoner av rICAM-1; _CT = målkonsentrasjon (skal interpoleres); _Dcells = tetthet målt i celler (se også fig. 1C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Måling av T-cellesynaptiske partikler overført til BSLD-er. (A; i-v) Strømningsskjema som viser de kritiske trinnene for kokulturering av T-celler med BSLD-er som rekonstituerer modellmembraner og den påfølgende målingen av partikkeloverføring med strømningscytometri. (iv) Blå og mørkegule diagrammer viser den relative fordelingen og plasseringen av celler og BSLD-er i toparametriske strømningscytometriplott. (v) Fluorescensfordeling histogrammer som viser den relative gevinsten av fluorescens av agonistiske BSLD-er (mørk gul) sammenlignet med null BSLD-er (grå). (B) Eksemplarisk synaptisk overføringseksperiment. (i-vi) Vist er gating strategien for å identifisere enkelt BSLD-er og celler i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet. Fiolett piler indikerer analyseretningen, som fortsetter i C. (C) (i) Fokuser analysene på MFI for enkeltceller (blå) og enkle BSLD-er (gul). (ii) Ligninger for å beregne normalisert synaptisk overføring (NST%, topp) og _Tmax% (bunn) fra cMFI beregnet for BSLB og celler. (iii-vi) Lagt histogrammer som viser endringen av fluorescensintensitetsfordelinger for celler (blå nyanser) og BSLD-er (gule nyanser) på tvers av forskjellige tettheter i T-cellen som aktiverer anti-CD3ε-Fab, inkludert ikke-aktiverende (grå) og aktiverer med enten 250 (myk fargeverdi) eller 1000 (høy fargeverdi) molec./^μm2. Tall i forskjellige fargeverdier representerer NST% målt for BSLB-histogrammer vist i gult. De overlagte histogrammene viser det overordnede hierarkiet i den synaptiske overføringen av T-celle vesicles positivt for forskjellige markører. For denne sammensetningen av BSLD-er (200 molec./^μm2 av ICAM-1 og økende tettheter av anti-CD3ε-Fab), overføres TV-er til BSLB med TCR⁺(iii) > CD81⁺(iv) > CD4⁺(v) > CD28⁺(vi). Som vist i tidligere artikler, er TCR og CD81 komponenter av SE og overføres med relativt høyere effektivitet til CD4, til tross for at sistnevnte uttrykkes på relativt høyere overflatenivåer. SE shedding resulterer i tap av celle overflate CD81 og TCR og forsterkning av disse signalene på BSLD (åpne lilla piler for 250 molec./^μm2, og lukket lilla piler for 1,000 molec./^μm2 i gule histogrammer). (D) Feil nedkjøling av konjugater fører til at celler av SLB fra silikaperler sett fra å sammenligne inngangsperler (venstre biparametrisk tomt) og konjugater utsatt for rask kjøling ned til 4 °C fra 37 °C (høyre biparametrisk plott). Sammenlign også med figur 3B-panelet (vi). Forkortelser: PRF1 = perforin 1; NST% = normalisert synaptisk overføring; _Tmax% = prosent av maksimal observert overføring (i kontroll- eller referansetilstand); TV-er: transsynaptiske vesicles; SEs: synaptiske ektosomer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Buffere som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BSLD-er er allsidige verktøy for å studere partikkelutgangen til T-celler stimulert med modell APC-membraner. Fleksibiliteten til metoden gjør det mulig for rekonstituering av komplekse og reduksjonistiske membransammensetninger å studere effekten av ligander og deres signaler på sekresjon av TSVer og supramolekulære angrepspartikler og deres komponenter. Vi har testet denne teknologien på forskjellige T-celler, inkludert forhåndsaktivert TH, CTL, Tregs og ^CART15. Denne protokollen fungerer også for måling av synaptisk partikkelfrigjøring av nyisolerte og passiviserte T-celler. En begrensning ved bruk av nyisolerte T-celler er at disse passiviserende populasjonene produserer en annen profil av transsynaptiske partikler, som korrelerer med celleoverflatesammensetningen (se ¹⁵ for flere detaljer).

Som et enkelt strømningscytometripanel, vi anbefaler bruk av anti-TCR klone IP26, anti-CD81 klone 5A6, anti-perforin (PRF1) klone B-D48 eller anti-CD40L klone 24-31, og ATTO 390 eller ATTO 565-inneholdende lipider (for å gi BSLB en egen fluorescens). For å bidra til å diskriminere enkeltceller fra enkelt BSLD-er og konjugater, anbefaler vi bruk av anti-CD4-klone OKT4 og/eller anti-CD45-klone HI30, som overføres til BSLD-er på begrensede nivåer til tross for at de uttrykkes på svært høye nivåer på celleoverflaten (se Tabell over materialer for ytterligere detaljer om fluorokromer og andre validerte antistoffer). Paneler med et høyere antall fluorokromer kan utformes, men krever en systematisk evaluering av fluorescensspekterets utslipp av hver fluorokrom analysert. For å øke følsomheten, prøv forskjellige titrasjoner av kvantifiseringsantistoffer fra 0,5 μg til 20 μg / ml endelig, og gjenta når nye lagre av antistoffer brukes. For å sikre reproduserbarhet av absolutte og relative målinger av partikkeloverføring, titrat og beregne bindingskapasiteten til hver nye masse biotinylerte og niholdige fosfolipider, da de kan avvike betydelig fra mye til mye. Den gradvise nedkjølingen av T-celle-BSLB-konjugater er avgjørende for å øke følsomheten for påvisning av partikler med lav overflod. Den raske nedkjølingen av kokulturer fører til ødeleggelse av BSLD-er, noe som fremgår av det betydelige tapet av lipidfluorescens (figur 3D).

Ulike beregninger kan brukes til å måle partikkelutgangen til T-celleimmunsynapser, avhengig av det eksperimentelle spørsmålet. For eksempel, når mindre forskjeller forventes i baseline uttrykk nivåer av overflateproteiner sortert i spirende SEer, en normalisert synaptisk overføring (NST%) metrisk kan brukes (Figur 3C panel (ii) toppligning). Sistnevnte kvantifiserer prosentandelen MFI-signal på BSLD-er som en funksjon av totalen, kombinert MFI av celler og perler. En advarsel fra denne tilnærmingen er analysen av overførte markører som ikke er uttrykt på statsministeren, for eksempel komponenter av supramolecular ^{angrepspartikler19}. Ettersom disse elementene når BSLD-er etter veier uavhengig av PM-transitt, for eksempel intracellulær butikkeksocytose, anbefales ikke beregningen av NST% da resultatet vil bli oppblåst fordi telleren vil bli delt med en relativt liten nevner (celleoverflateuttrykksnivå). Bruk i stedet korrigerte MFIer for å sammenligne avsetningen av perforin og granzymer mellom null-BSLD-er og BSLD-er som presenterer økende tettheter av antigen eller anti-CD3 Fab. Alternativt, for å spore intracellulære elementer overført til BSLD-er, bruk til sammenligning enten de estimerte absolutte molekylene som overføres eller prosentandelen av signalet med hensyn til det maksimale signalet overført til BSLD-er (_Tmax%) (figur 3C-panel (ii) bunnligning). For _Tmax% bruk enten cMFI eller molekyler målt på BSLB-prøven (eller tilstanden) som presenterer den høyeste antigentettheten som referanse _Tmax. Når du analyserer forskjellige givere, bruk donorspesifikk _Tmax til sammenligninger. Ved studier av materialet som overføres som svar på den spesifikke utløsningen av TCR, kan MFIer også korrigeres til nivået av bakgrunnsoverføring observert på antigen-negative (null) BSLD-er.

Estimering av absolutt antall molekyler overført til BSLD-er er en mer robust metode, da dette innebærer MESF-kalibrering med måling av molekyler som endepunkt og en bedre sammenligning av uavhengige eksperimenter. _Tmax% tilbyr en lignende normalisering på tvers av uavhengige eksperimenter og er spesielt nyttig når du bruker polykromatisk FCM for intracellulære markører, for eksempel perforin og granzymer, eller for markører som ingen MESF-standard er tilgjengelig for. _Tmax% er ganske enkelt prosentandelen signal i en gitt tilstand til tilstanden med høyest overføring i kontrolltilstanden (f.eks. kjøretøy / ubehandlede kontroller for narkotikastudier, kontrollveiledning RNAer for CRISPR / Cas9-biblioteker). Videre kan _Tmax% brukes til både cMFIer og et absolutt antall molekyler og har vært spesielt nyttig for side-ved-side sammenligninger av effekten av gensletting på synaptisk utgang av T-celler. Sistnevnte er tydelig når genredigering fører til høy variasjon i det dynamiske spekteret av immunreseptoruttrykk blant uavhengige givere og eksperimenter, noe som kan påvirke absolutte og NST% målinger.

BSLD-er har lagt til rette for fangst og karakterisering av synaptisk utgang av forskjellige T-celletyper, som ellers er vanskelige å isolere på grunn av deres raske internalisering av ^APCer2. Den fysiske stabiliteten til BSLD-er gir også en plattform for fluorescensaktivert cellesortering av BSLD-er som har blitt kartlagt av T-celler, og dermed muliggjør biokjemisk karakterisering av svært rene partikkelpreparater ved massespektrometri og nukleinsyresekvenseringsteknologier. Sistnevnte letter detaljert karakterisering av intercellulære budbringere skur av T-celler under et bredt spekter av eksperimentelle forhold. Ulike spørsmål kan tas opp, inkludert hvordan disse partikkelbringerne endres mellom forskjellige T-celletyper og aktiveringstilstander, hvordan kanoniske og ikke-kanoniske antigenreseptorer (dvs. chimeriske antigenreseptorer), og hvordan agonistiske og antagonistiske membransignaler påvirker partikkelsammensetningen. Vi utvikler for tiden denne teknologien videre for kvantitativ karakterisering av cytokiner utskilt ved immunsynapse av stimulerte T-celler. Sistnevnte krever nøye studie av kombinasjoner av rekombinante cytokinreseptorer og antistoffer, noe som gir effektiv fangst av interleukins, interferoner og kjemokiner avsatt på BSLD-er etter T-celleaktivering. BSLD-er kan tilpasses for å modellere overflatesammensetningen til andre APC-er som mistenkes å utløse tSV-frigjøring av T-celler, for eksempel stromale og medfødte immunceller. BSLD-er kan også tilpasses for å screene nye farmakologiske forbindelser som søker positiv og negativ modulering av eksocytiske og tSV-sekresjonsmaskiner for behandling av kreft og andre patologier. Til slutt kan BSLD-er også brukes til å oppdage virulens determinanter som modulerer T-cellefunksjon i smittsomme ^sykdommer20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til våre laboratoriemedlemmer og Kennedy Institute of Rheumatology samfunnet for konstruktive vitenskapelige diskusjoner, spesielt vår flyt cytometri anlegget leder Jonathan Webber. Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) og Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle tre til MLD). PFCD ble støttet av EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, i forbindelse med Europakommisjonen (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) og Marie Sklodowska-Curie Actions) og et Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack	Starlab	S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3799	For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3894	For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil	Any brand		For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 and 310818	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4	BioLegend	356934	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19	BioLegend	302234	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1	BioLegend		Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1	BioLegend	357414 and 357421	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4	BioLegend	317414 and 317422	PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3	BioLegend	334304	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5	BioLegend		Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30	BioLegend	304056 and 368516	Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 and 353015	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2	BioLegend	344002	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6	BioLegend	349512 and 349502	PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 and 311402	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 and 307622	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produced in house	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7	BioLegend	135230 and 329902	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 and 306714	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888	BioLegend	400902	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Company (BD)	23-14523-00	Acquisition software
Bovine Seum Albumin	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl₂, Calcium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Needs heat inactivation for 30 min at 56 ^oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo	Becton Dickinson & Company (BD)	Version 10.7.1	Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO₂ incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	51026282	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution	BioLegend	422302	Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT	Biovendis Products GmbH		For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl₂, Magessium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes	Keison Products	P-2-24	Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO₂
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11	BioLegend	400330 and 400355	Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma	Falcon	353046	For culturing and expanding purified CD4⁺ and CD8⁺ T cells.
Na₂HPO₄, Disodium Phosphate	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Sodium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO₄, Nickel(II) sulfate	Merck, Sigma-Aldrich	656895	For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca²⁺ or Mg²⁺ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	488	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	647	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15064	Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15361	Pre-enrichment of CD4+ CD127^Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO₂. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrifuge	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882