Summary
الهدف العام من هذه الورقة هو وصف كيفية إجراء الحقن داخل الخلايا في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج. هذا النهج مفيد جدا لدراسة البيولوجيا التنموية لأجنة الدجاج.
Abstract
كنظام نموذجي كلاسيكي لبيولوجيا الأجنة ، تم استخدام جنين الدجاج للتحقيق في التطور الجنيني والتمايز. إن توصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج له ميزة كبيرة لدراسة وظيفة الجينات ، والتربية المعدلة وراثيا ، وإعداد الوهم أثناء التطور الجنيني. نوضح هنا طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة حيث يمكن نقل المواد الخارجية مثل ناقلات البلازميد أو الخلايا الجرثومية البدائية المعدلة (PGCs) إلى أجنة الدجاج المانحة في مراحل النمو المبكرة. تظهر النتائج أن الحقن داخل الأوعية الدموية من خلال الشريان الأورطي الظهري والرأس يسمح للمواد المحقونة بالانتشار في الجنين بأكمله من خلال الدورة الدموية. في البروتوكول المقدم ، تم تحديد فعالية إدخال البلازميد الخارجي وناقلات الفيروسات الخيطية ، واستعمار PGCs الخارجية المحقونة في الغدد التناسلية المتلقية ، من خلال مراقبة التألق في الأجنة. تصف هذه المقالة الإجراءات التفصيلية لهذه الطريقة ، وبالتالي توفر نهجا ممتازا لدراسة وظيفة الجينات ، وبيولوجيا الجنين والنمو ، وإنتاج الدجاج الوهمي للغدد التناسلية. في الختام ، ستسمح هذه المقالة للباحثين بإجراء الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج بنجاح كبير وقابلية للتكرار.
Introduction
تم استخدام أجنة الدجاج على نطاق واسع لعدة قرون في التطبيقات التنموية والمناعية والمرضية وغيرها من التطبيقات البيولوجية1،2،3. لديهم العديد من المزايا المتأصلة على النماذج الحيوانية الأخرى في دراسة علم السموم وبيولوجيا الخلية4. يمكن الوصول بسهولة إلى أجنة الدجاج ويمكن التلاعب بها في المختبر ومراقبتها مباشرة في أي مرحلة من مراحل النمو ، مما يوفر نظاما مفيدا لنموذج أبحاث الأجنة.
بشكل عام ، فإن طرق توصيل جنين الدجاج الحالية مثل النقل الكهربائي والحقن تحت الجرثومي لها قيود مثل متطلبات المعدات المتخصصة وبرنامج مصمم ، وعدم الكفاءة بسبب وجود صفار البيض والزلال5،6،7. نعرض هنا طريقة معالجة بسيطة وفعالة لتوصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج. هذا يمكن أن يكون أداة قوية تستخدم في دراسة علم الأحياء التنموي. تنتشر المواد المحقونة إلى الجنين بأكمله عن طريق الدورة الدموية. خلال التطور المبكر لأجنة الدجاج ، يمكن أن تهاجر PGCs عبر الدم ، وتستعمر التلال التناسلية ، ثم تتطور إلى أمشاج ، والتي توفر مسارا ممكنا قيما لتوصيل المواد الخارجية8. الآن ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في دراسة وظيفة الجينات ، والبيولوجيا الجنينية والتنموية ، وإنتاج الدجاج الوهمي والمعدل وراثيا9،10،11.
في البويضة الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج هي طريقة راسخة وشائعة الاستخدام12،13،14. في هذه الورقة ، نعرض وصفا شاملا لهذا البروتوكول بما في ذلك مواد الحقن والمواقع والجرعة والنتائج التمثيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على رعاية واستخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني الأمريكي للصحة (NIH Pub. No. 85-23 ، المنقحة عام 1996) وبروتوكولات جنين الدجاج من قبل لجنة إدارة المختبر وأخلاقيات التجارب بجامعة يانغتشو ، الصين (رقم 201803124).
1. جمع البيض المخصب وإعداده
ملاحظة: على عكس الثدييات ، يحتوي الدجاج على ملايين البصيلات في مبيض واحد ، ولكن القليل فقط من هذه البصيلات ناضجة بما يكفي للإباضة. يحتوي كل جريب على بويضة واحدة أو خلية جرثومية. بمجرد أن ينضج الجريب ويطلق صفار البيض ، يتم دمجه في قمع قناة فالوب. عندما يدخل الجريب إلى البطن الوداجي لقناة البيض ، يرتبط السائل المنوي بالبويضة في جسم الدجاجة ، ويشكل الكالسيوم في جسم الدجاجة قشرة تغلف البويضة المخصبة ، وتشكل بيضة ذات قشرة ناعمة في الجسم. تزداد سماكة قشرة الكالسيوم تدريجيا حتى يتم إنتاج البيضة.
- جمع البيض المخصب من بائع محلي أو مؤسسة ، والتي يمكن تخزينها في 16 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
ملاحظة: ستساعد درجة حرارة التخزين العالية الجنين على التطور ، في حين أن درجة الحرارة المنخفضة ستقلل من صلاحية الجنين. سوف تفشل الأجنة في التطور إذا كان وقت التخزين طويلا جدا. - فرك قشر البيض بهدوء وببطء مع 75 ٪ من الإيثانول قبل نقل البيض إلى الحاضنة.
- ضع البيض جانبيا ، بدقة على رف في حاضنة عند 37.8 درجة مئوية ورطوبة 60٪. بعد 60 ساعة من الحضانة (المرحلة 17 من HH) ، ستطور الأجنة أوعية دموية مرئية ويبدأ القلب في النبض15.
ملاحظة: بعد 2 أيام من الحضانة ، تظهر نقاط بدائية صغيرة ، المرحلة المبكرة من القلب. وتسمى هذه العملية بتزيين الكرز. في ~ 2.5 يوم ، يتم تشكيل القلب وأجزاء الجسم الأخرى مع الأوعية المرئية.
2. التحضير قبل الحقن
- تحضير الشعيرات الدموية الزجاجية التي سيتم استخدامها كإبر. قبل الحقن ، اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية مقاس 90 مم بقطر خارجي يبلغ 1 مم وقطر داخلي يبلغ 0.6 مم باستخدام المسحوب. كسر النصائح باستخدام ملقط (زاوية الشعيرات الدموية الزجاجية عادة ما تكون 45 درجة) وتعقيم الشعيرات الدموية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
- قم بإعداد مواد خارجية المنشأ مثل البلازميدات وفيروسات lentivirus المعبأة و PGCs.
- امزج بلطف البلازميد pEGFP-N1 (بلازميد GFP محسن يعبر عن البلازميد ، 1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع الجسيمات الشحمية بنسبة 1: 3 (م / ف). أضف الماء للحصول على تركيز الحمض النووي النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر. دع خليط الحمض النووي يجلس على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الحقن.
- إذابة الفيروسات على الجليد قبل الحقن. يجب أن يكون عيار lentivirus المستخدم للحقن أكثر من 5 × 106 Tu / mL.
- تمييع PGCs الغدد التناسلية الأبوية أو المعدلة (E4.5 ، المرحلة HH 24) إلى 2000-5000 خلية / ميكرولتر.
ملاحظة: لقد أظهرنا هنا إجراء الحقن باستخدام التربان الأزرق.
3. النوافذ
- قبل تعريض الأجنة ، قم بتعقيمها عن طريق مسح سطح قشر البيض بلطف ونعومة باستخدام 75٪ من الكحول باستخدام كرة قطنية ، مما يضمن تعقيم الحافة الحادة للبيض جيدا.
- بعد التعقيم ، اضغط برفق على الطرف الحاد باستخدام الملقط لإنشاء نافذة صغيرة (0.5 سم × 0.5 سم) على سطح قشر البيض لفضح الجنين. قم بإزالة غشاء الجنين ثم ضع البويضة على حاملها تحت مجهر التشريح.
4. الحقن
- ابحث عن الأوعية الدموية تحت المجهر واضبط تركيز مجهر التشريح لتحديد موقع الجنين ، ثم ابحث عن الوعاء الدموي جاهزا للحقن.
- املأ الإبرة الزجاجية بالمحلول الخارجي (البلازميد أو الفيروس اللينتيفري أو PGCs) باستخدام ماصة ببطء ، وتجنب فقاعات الهواء في الإبرة.
- وجه الإبرة بمحلول خارجي المنشأ إلى الوعاء الدموي ، مع الإبرة الموازية للوعاء الدموي الذي يتم حقنه.
- أدخل الإبرة المملوءة بلطف في الوعاء وقم بتشغيل المضخة لإخراج المحلول (عادة ما يكون الحجم المحقون ~ 1-5 ميكرولتر) تحت المجهر. يجب أن يكون ضغط مضخة الهواء منخفضا بما يكفي لمنع تدمير الأوعية ، لأن ضغط الهواء المرتفع بشكل مفرط من شأنه أن يتلف الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تدفق عالي السرعة.
- بمجرد حقن المحلول الخارجي في الوعاء ، تأكد من أن لون الوعاء يتحول إلى لون المحلول ويستعيد إلى اللون الأحمر في 2-5 ثوان ، مما يشير إلى تسليم المحلول الخارجي بنجاح إلى السفينة. عند هذه النقطة يدخل المحلول إلى الشريان ، ومع نبض القلب يتم تعميمه مرة أخرى إلى الجنين من خلال الشريان ، ثم إلى الوريد.
ملاحظة: هناك موقعان للحقن الوعائي (الشكل 1B): أحدهما هو الرأس ، حيث يتم حقن المحلول الخارجي من الوريد في رأس الجنين وإلى القلب من خلال تدفق الدم ، ثم يدور إلى الجنين بأكمله مع نبض القلب (الشكل 1B ، السهم 1). آخر هو من خلال الشريان الأورطي الظهري من دم الجنين. يتم حقن المحلول الخارجي وينتشر إلى الجنين بأكمله (الشكل 1B. السهم 2) مع نبض القلب الجنيني.
- بمجرد حقن المحلول الخارجي في الوعاء ، تأكد من أن لون الوعاء يتحول إلى لون المحلول ويستعيد إلى اللون الأحمر في 2-5 ثوان ، مما يشير إلى تسليم المحلول الخارجي بنجاح إلى السفينة. عند هذه النقطة يدخل المحلول إلى الشريان ، ومع نبض القلب يتم تعميمه مرة أخرى إلى الجنين من خلال الشريان ، ثم إلى الوريد.
- بعد الحقن ، قم بإزالة البويضة من المجهر الاستريو وأسقط 200 ميكرولتر من محلول البنسلين داخل قشر البيض. قطع قطعة طولها 3 سم من الشريط الطبي وختم النافذة. كشط الشريط بلطف باستخدام مقص للضغط على أي فقاعات هواء ثم قطع قطعة أخرى لإغلاق الفتحة عبرها.
- ضع البويضة المحقونة مرة أخرى في الحاضنة واحتضنها حتى مرحلة النمو أو الفقس المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نعرض هنا الحقن داخل الأوعية الدموية في البيضة لأجنة الدجاج. ويوضح الشكل 1 عملية تخطيطية للحقن داخل الأوعية الدموية؛ في دراستنا ، استخدمنا العديد من الحلول الخارجية لاختبار الحقن والتحقق منه.
لتصور المواد المحقونة بشكل أفضل ، تم حقن Trypan Blue (0.4٪) كمقتفي في الجنين. لوحظ أن المقتفي (الأزرق) ينتشر إلى الجنين بأكمله عن طريق الدورة الدموية إما عن طريق الشريان الأورطي الظهري أو حقن الرأس (الشكل 2). كانت المواد التي تم حقنها في موقعين مختلفين قادرة على الانتشار إلى الجنين بأكمله ، مما يشير إلى الانتشار عبر الدورة الدموية. يؤكد تصور اللون الأزرق نجاح الحقن.
تم تغليف ناقل pEGFP-N1 مع جزيرة برنس إدوارد لتحقيق تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، في حين تم لف ناقل pLVX-EGFP الفيروسي مع جزيرة برنس إدوارد وتخفيفه بعد المعايرة بالتحليل الحجمي لتحقيق تركيز فيروس قدره 5 × 106 Tu / μL. تم حقن الأجنة لمدة 2.5 يوم (المرحلة 14-15) مع pEGFP-N1 الملفوفة أو pLVX-EGFP. في 4.5 أيام (المرحلة 24 من HH) ، لوحظت الأجنة باستخدام المجهر الفلوري المجسم. لوحظ التألق الأخضر في الجنين مما يشير إلى التعبير الناقل بعد الحقن. أظهرت النتائج أن البلازميدات المغلفة بواسطة الجسيمات الشحمية (PEI) وفيروس lentivirus المعبأ تم التعبير عنها في جنين الدجاج بعد يومين من الحقن (الشكل 3). أثبتت نتائج حقن ناقلات البلازميد والفيروسات الطفيلية التعبير الجيني الخارجي في الجنين ، مما يعني ضمنا التطبيق المحتمل في نقل الجينات.
تم عزل PGCs من التلال التناسلية للأجنة (E4.5 ، المرحلة 24 من HH) وتم استزراعها للتنقية كما في المنشور السابق16. تم تصنيف PGCs المحقونة ببروتين الفلورسنت الأحمر (RFP). في أيام E6.0 (المرحلة 28 من HH) ، تم عزل الغدد التناسلية للأجنة المتلقية ومراقبتها. أظهرت النتائج أن PGCs المانحة (النقاط الحمراء) كانت قادرة على دخول واستعمار الغدد التناسلية للمتلقي بشكل فعال (الشكل 4).
الشكل 1: مخطط الحقن داخل الأوعية الدموية. (أ) الجدول الزمني للحقن داخل الأوعية الدموية؛ (ب) موقعان للحقن يشار إليهما بالأسهم السوداء، الرأس (1) والشريان الأورطي الظهري (2)؛ (ج) عملية الحقن داخل الأوعية الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: انتشار صبغة التتبع في مواقع الحقن المختلفة. أعلى: الشريان الأورطي الظهري. أسفل: الرأس. شريط المقياس = 50 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التعبير عن GFP في الأجنة بعد 2 أيام من الناقل الفيروسي وحقن البلازميد المغلف. شريط المقياس = 100 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصور PGCs المحقونة ذات العلامات الفلورية الحمراء في جنين الدجاج المتلقي. (E6.0 ، المرحلة 28) الغدد التناسلية شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تحسين طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة لأجنة الدجاج للمواد الخارجية (الناقلة أو الفيروسية أو PGCs) ليتم نقلها إلى الجنين. بناء على هذه الطريقة ، قمنا ببناء نماذج جنين الدجاج مع فرط التعبير الجيني المستقر أو التداخل (SpinZ ، JUN ، UBE2I ، إلخ.) 17,18,19. وتثبت هذه النماذج الراسخة جدوى هذا النهج. بالإضافة إلى ذلك ، لم ننقل PGCs المعزولة إلى الغدد التناسلية الجنينية للمتلقي فحسب ، بل نجحنا أيضا في إنتاج النسل القابل للحياة مع الغدد التناسلية الجنينية المزروعة باستخدام PGCs المستحثة ، مما يعني التطبيق الكبير لهذه الطريقة في المستقبل20.
الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي الحقن. يجب حقن المواد الخارجية مباشرة في الأوعية الدموية ، وليس عميقا جدا أو ضحلا جدا. وبالتالي ، فإنه يتطلب خبرة في العمل مع أجنة الدجاج ومهارات الحقن العالية التي يمكن الحصول عليها بسهولة من خلال الممارسة. بالمقارنة مع حقن خلايا الهواء ، يتم تحقيق فعالية الحقن العالية ودقته بسهولة أكبر باستخدام هذه الطريقة. بالإضافة إلى قيود التكلفة العالية والخطوات المعقدة ، لا يتم تطبيق النقل الكهربائي عند إنشاء نافذة كبيرة ، لأنه قد يؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة.
كطريقة للتلاعب الجيني في أجنة الدجاج ، فإن الطريقة لها أيضا بعض القيود. حوالي نصف البويضات ماتت أثناء الحضانة بعد الحقن بمعدل بقاء 40٪ -60٪. وفي الوقت نفسه ، تعد كفاءة التسليم عاملا مهما آخر يجب مراعاته ، خاصة بالنسبة لحقن PGC (في حالتنا ، تبلغ كفاءة حقن البلازميد والفيروس lentivirus حوالي 50٪ -60٪ ، وكفاءة حقن PGC ~ 30٪ -40٪). في المستقبل ، قد يتم تحسين البروتوكول ويمكن زيادة معدل البقاء على قيد الحياة بشكل كبير ، مما يزيد من تحسين مجال تطبيق هذه الطريقة.
في الختام ، يوضح هذا البروتوكول أن الحقن داخل الأوعية الدموية في جنين الدجاج في البيضة مخصص للمواد الخارجية (النواقل أو PGCs) التي سيتم نقلها إلى الأجنة. علاوة على ذلك ، يمكن تعلم هذه الطريقة وتطبيقها بسهولة في العديد من المجالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31972547). نحن نقدر تحرير النصوص من قبل جينغ وانغ والتعليق الصوتي من قبل مالك دونليك في جامعة ولاية واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
