Summary
Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo's te bestuderen.
Abstract
Als een klassiek modelsysteem van embryobiologie is het kippenembryo gebruikt om embryonale ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken. Het afleveren van exogene materialen in kippenembryo's heeft een groot voordeel voor het bestuderen van genfunctie, transgene fokkerij en chimaerapreparatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Hier tonen we de methode van in ovo intravasculaire injectie waarbij exogene materialen zoals plasmidevectoren of gemodificeerde primordiale geslachtscellen (PPC's) in vroege ontwikkelingsstadia kunnen worden overgebracht naar donorkippyo's. De resultaten tonen aan dat de intravasculaire injectie via de dorsale aorta en het hoofd het geïnjecteerde materiaal via de bloedsomloop in het hele embryo laat diffunderen. In het gepresenteerde protocol werden de werkzaamheid van exogene plasmide en lentivirale vectorintroductie en de kolonisatie van geïnjecteerde exogene PGB's in de ontvangende gonade bepaald door fluorescentie in de embryo's te observeren. Dit artikel beschrijft gedetailleerde procedures van deze methode, waardoor een uitstekende benadering wordt geboden voor het bestuderen van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en gonade-chimere kippenproductie. Kortom, dit artikel zal onderzoekers in staat stellen om in ovo intravasculaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's met groot succes en reproduceerbaarheid uit te voeren.
Introduction
Kippenembryo's worden al eeuwenlang op grote schaal gebruikt in ontwikkelings-, immunologische, pathologische en andere biologische toepassingen 1,2,3. Ze hebben veel inherente voordelen ten opzichte van andere diermodellen in de studie van toxicologie en celbiologie4. Kippenembryo's zijn gemakkelijk toegankelijk en kunnen in vitro worden gemanipuleerd en direct worden geobserveerd in elk ontwikkelingsstadium, wat een handig embryo-onderzoeksmodelsysteem biedt.
Over het algemeen hebben de huidige methoden voor het afleveren van kippenembryo's zoals elektrotransfectie en subgerminale holte-injectie beperkingen zoals de vereiste van gespecialiseerde apparatuur en een ontworpen programma, en inefficiëntie als gevolg van de aanwezigheid van dooier en albumine 5,6,7. Hier tonen we een eenvoudige en efficiënte behandelingsmethode voor het afleveren van exogene materialen in kippenembryo's. Dit kan een krachtig hulpmiddel zijn dat wordt gebruikt bij de studie van ontwikkelingsbiologie. De geïnjecteerde materialen verspreiden zich via de bloedcirculatie naar het hele embryo. Tijdens de vroege ontwikkeling van kippenembryo's konden de PPC's door bloed migreren, de genitale richel koloniseren en zich vervolgens ontwikkelen tot gameten, die een waardevol mogelijk pad bieden om exogene materialen af te leveren8. Nu is deze methode op grote schaal gebruikt in de studie van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en chimere en transgene kippenproductie 9,10,11.
In ovo is intravasculaire injectie in kippenembryo's een gevestigde en veelgebruikte methode 12,13,14. In dit artikel tonen we een uitgebreide beschrijving van dit protocol, inclusief injectiematerialen, plaatsen, dosering en representatieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren voldeden aan de richtlijnen van het Amerikaanse National Institute of Health (NIH Pub. No. 85-23, herzien in 1996) en de protocollen voor kippenembryo's werden goedgekeurd door de Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee van Yangzhou University, China (nr. 201803124).
1. Verzameling en bereiding van bevruchte eieren
OPMERKING: In tegenstelling tot zoogdieren heeft de kip miljoenen follikels in een enkele eierstok, maar slechts een paar van deze follikels zijn volwassen genoeg om te ovuleren. Elke follikel bevat één eicel of kiemcel. Zodra de follikel rijpt en zijn dooier loslaat, wordt deze opgenomen in de trechter van de eileider. Terwijl de follikel de halsbuik van de eileider binnendringt, bindt sperma zich aan het ei in het lichaam van de kip en vormt het calcium in het lichaam van de kip een schaal die het bevruchte ei omhult en een ei met zachte schaal in het lichaam vormt. De calciumschaal wordt geleidelijk dikker totdat het ei is geproduceerd.
- Verzamel bevruchte eieren bij een lokale verkoper of instelling, die gedurende 1 week bij 16 °C kunnen worden bewaard.
OPMERKING: De hoge opslagtemperatuur zal het embryo helpen zich te ontwikkelen, terwijl de lage temperatuur de levensvatbaarheid van het embryo zal verminderen. De embryo's zullen zich niet ontwikkelen als de bewaartijd te lang is. - Schrob de eierschaal zacht en langzaam met 75% ethanol voordat u de eieren overbrengt naar de broedmachine.
- Leg de eieren zijwaarts, netjes op een rooster in een broedmachine bij 37,8 °C en 60% luchtvochtigheid. Na 60 uur incubatie (HH stadium 17) zullen embryo's zichtbare bloedvaten ontwikkelen en begint het hart15 te kloppen.
OPMERKING: Na 2 dagen incubatie verschijnen kleine primordiale stippen, het vroege stadium van het hart. Dit proces wordt cherrybeading genoemd. Na ~ 2,5 dag worden hart- en andere lichaamssegmenten gevormd met zichtbare bloedvaten.
2. Voorbereiding vóór injectie
- Bereid glazen haarvaten voor die als naalden worden gebruikt. Trek vóór de injectie met behulp van de trekker 90 mm glazen haarvaten met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,6 mm. Breek tips met behulp van een tang (de hoek van het glazen capillair is meestal 45 °) en steriliseer de haarvaten onder UV-licht gedurende 2 uur.
- Bereid exogene materialen zoals plasmiden, verpakte lentivirussen en PPC's voor.
- Meng voorzichtig het plasmide pEGFP-N1 (een verbeterde GFP-tot expressie brengende plasmide, 1μg/μL) met liposoom in een verhouding van 1:3 (m/v). Voeg water toe om een uiteindelijke DNA-concentratie van 10 ng/μL te verkrijgen. Laat het DNA-mengsel vóór de injectie gedurende 20 minuten bij 37 °C zitten.
- Ontdooi virussen op ijs vóór injectie. De titer van lentivirus die voor injectie wordt gebruikt, moet meer dan 5 x 106 Tu / ml zijn.
- Verdun ouderlijke of gemodificeerde gonade PPC's (E4.5, HH stadium 24) tot 2.000-5.000 cellen/μL.
OPMERKING: Hier hebben we de injectieprocedure met trypan blue getoond.
3. Vensters
- Voordat u de embryo's blootstelt, steriliseert u ze door voorzichtig en zacht het oppervlak van de eierschalen af te vegen met 75% alcohol met behulp van een watje, zodat de stompe rand van de eieren grondig wordt gesteriliseerd.
- Tik na de sterilisatie voorzichtig met een tang op het stompe uiteinde om een klein venster (0,5 cm x 0,5 cm) op het oppervlak van de eierschaal te creëren om het embryo bloot te leggen. Verwijder het embryomembraan en leg het ei op de houder onder de dissectiemicroscoop.
4. Injectie
- Zoek naar bloedvaten onder de microscoop en pas de focus van de dissectiemicroscoop aan om het embryo te lokaliseren en zoek vervolgens het bloedvat klaar voor injectie.
- Vul de glazen naald met de exogene oplossing (plasmide, lentivirus of PPC's) langzaam met behulp van een pipet, waarbij luchtbellen in de naald worden vermeden.
- Richt de naald met exogene oplossing op het bloedvat, waarbij de naald parallel aan het bloedvat wordt geïnjecteerd.
- Steek de gevulde naald voorzichtig in het vat en zet de pomp aan om de oplossing uit te werpen (meestal is het geïnjecteerde volume ~ 1-5 μL) onder de microscoop. De luchtpompdruk moet laag genoeg zijn om de vernietiging van bloedvaten te voorkomen, omdat de te hoge luchtdruk de bloedvaten zou beschadigen, wat leidt tot een hoge snelheidsstroom.
- Zodra de exogene oplossing in het vat is geïnjecteerd, moet u ervoor zorgen dat de kleur van het vat verandert in de kleur van de oplossing en zich herstelt tot rood in 2-5 s, wat aangeeft dat de exogene oplossing met succes aan het vat wordt afgeleverd. Op dit punt komt de oplossing de slagader binnen en met het kloppen van het hart wordt het terug naar het embryo gecirculeerd via de slagader en vervolgens naar de ader.
OPMERKING: Er zijn twee injectieplaatsen voor vasculaire injectie (figuur 1B): één is het hoofd, waar de exogene oplossing wordt geïnjecteerd vanuit de ader in het hoofd van het embryo en in het hart via de bloedstroom en vervolgens circuleert naar het hele embryo met kloppend hart (figuur 1B, pijl 1). Een andere is via de dorsale aorta van embryobloed; de exogene oplossing wordt geïnjecteerd en verspreidt zich naar het hele embryo (figuur 1B. Pijl 2) met het kloppen van het embryonale hart.
- Zodra de exogene oplossing in het vat is geïnjecteerd, moet u ervoor zorgen dat de kleur van het vat verandert in de kleur van de oplossing en zich herstelt tot rood in 2-5 s, wat aangeeft dat de exogene oplossing met succes aan het vat wordt afgeleverd. Op dit punt komt de oplossing de slagader binnen en met het kloppen van het hart wordt het terug naar het embryo gecirculeerd via de slagader en vervolgens naar de ader.
- Verwijder na de injectie het ei uit de stereomicroscoop en laat 200 μL penicilline-oplossing in de eierschaal vallen. Knip een 3 cm lang stuk medische tape en sluit het raam af. Schraap de tape voorzichtig met een schaar om eventuele luchtbellen eruit te persen en knip vervolgens een ander stuk om de opening over te sluiten.
- Label en plaats het geïnjecteerde ei terug in de incubator en incubeer tot het vereiste ontwikkelingsstadium of uitkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen hier de in ovo intravasculaire injectie van kippenembryo's. Een schematisch proces van de intravasculaire injectie is weergegeven in figuur 1; in onze studie gebruikten we verschillende exogene oplossingen om injectie te testen en te verifiëren.
Om de geïnjecteerde materialen beter te visualiseren, werd Trypan Blue (0,4%) als tracer in het embryo geïnjecteerd. De tracer (blauw) werd waargenomen om via de bloedcirculatie naar het hele embryo te diffunderen door dorsale aorta of hoofdinjectie (figuur 2). Materialen die op twee verschillende plaatsen werden geïnjecteerd, konden zich verspreiden naar het hele embryo, wat wijst op de diffusie door de bloedcirculatie. De visualisatie van de blauwe kleur bevestigt het succes van de injectie.
De pEGFP-N1-vector werd omwikkeld met PEI om een concentratie van 1 μg/μL te bereiken, terwijl de lentivirale vector pLVX-EGFP werd ingepakt met PEI en na titratie werd verdund om een virusconcentratie van 5 x 106 Tu/μL te bereiken. De embryo's van 2,5 dagen (HH-stadium 14-15) werden geïnjecteerd met gewikkelde pEGFP-N1 of pLVX-EGFP. Na 4,5 dagen (HH stadium 24) werden de embryo's geobserveerd met behulp van stereoscopische fluorescentiemicroscopie. Groene fluorescentie werd waargenomen in het embryo, wat wijst op de vectorexpressie na injectie. De resultaten laten zien dat ingekapselde plasmiden door liposomen (PEI) en verpakt lentivirus 2 dagen na injectie tot expressie kwamen in het kippenembryo (figuur 3). De plasmide- en lentivirale vectorinjectieresultaten bewezen de exogene genexpressie in het embryo, wat de mogelijke toepassing bij genoverdracht impliceert.
De PPC's werden geïsoleerd uit de genitale richel van embryo's (E4.5, HH stadium 24) en gekweekt voor zuivering zoals in de vorige publicatie16. De geïnjecteerde PPC's werden gelabeld met het rode fluorescerende eiwit (RFP). Na E6,0 dagen (HH stadium 28) werd de gonade van ontvangende embryo's geïsoleerd en geobserveerd. De resultaten toonden aan dat de donor-PPC's (rode punten) in staat waren om de gonaden van de ontvanger effectief binnen te gaan en te koloniseren (figuur 4).
Figuur 1: Het schema van de intravasculaire injectie. (A) de tijdlijn van de intravasculaire injectie; (B) twee injectieplaatsen aangegeven met zwarte pijlen, de kop (1) en de dorsale aorta (2); (C) Het proces van de intravasculaire injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diffusie van de traceerkleurstof op verschillende injectieplaatsen. Boven: dorsale aorta; Onder: Hoofd. Schaalbalk = 50 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressie van GFP in embryo's 2 dagen na lentivirale vector en ingekapselde plasmide-injectie. Schaalbalk = 100 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visualisatie van geïnjecteerde rode fluorescentie-gelabelde PPC's in het ontvangende kippenembryo. (E6.0, HH stadium 28) gonade. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van in ovo intravasculaire injectie van kippenembryo's is geoptimaliseerd voor exogene materialen (vector, virale of PPC's) die in het embryo moeten worden overgebracht. Op basis van deze methode construeerden we kippenembryomodellen met stabiele genoverexpressie of interferentie (SpinZ, JUN, UBE2I, enz.) 17,18,19. Deze gevestigde modellen bewijzen de haalbaarheid van deze aanpak. Bovendien hebben we niet alleen geïsoleerde PPC's overgebracht naar de embryonale gonade van de ontvanger, maar ook met succes de levensvatbare nakomelingen geproduceerd met embryo gonade getransplanteerd met geïnduceerde PPC's, wat de grote toepassing van deze methode in de toekomst impliceert20.
De kritieke stap van de methode is de injectie. De exogene materialen moeten direct in de bloedvaten worden geïnjecteerd, niet te diep of te ondiep. Het vereist dus ervaring met het werken met kippenembryo's en hoge injectievaardigheden die gemakkelijk door oefening kunnen worden verkregen. In vergelijking met de luchtcelinjectie worden met deze methode een hoge injectie-efficiëntie en nauwkeurigheid gemakkelijker bereikt. Naast de beperkingen van hoge kosten en gecompliceerde stappen, wordt elektrotransfectie niet toegepast wanneer een groot venster wordt gemaakt, omdat dit kan leiden tot een lage overlevingskans.
Als methode voor genmanipulatie bij kippenembryo's heeft de methode ook enkele beperkingen. Ongeveer de helft van de eieren was dood tijdens de incubatie na injectie met een overlevingskans van 40%-60%. Ondertussen is de leveringsefficiëntie een andere belangrijke factor om te overwegen, vooral voor PGC-injectie (in ons geval is de efficiëntie van plasmide- en lentivirusinjectie ~ 50% -60%, en die van PGC-injectie is ~ 30% -40%). In de toekomst kan het protocol worden geoptimaliseerd en kan de overlevingskans aanzienlijk worden verhoogd, waardoor het toepassingsgebied van deze methode verder wordt verbeterd.
Concluderend toont dit protocol aan dat de intravasculaire injectie van het in ovo-kippenembryo specifiek is voor exogene materialen (vectoren of PPC's) die in de embryo's moeten worden overgebracht. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden geleerd en toegepast op vele gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31972547). We waarderen de copyediting door Jing Wang en de voice-over door Malik Donlic aan de Washington State University, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
