Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, zu beschreiben, wie bei der intrazellulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die Entwicklungsbiologie von Hühnerembryonen zu untersuchen.
Abstract
Als klassisches Modellsystem der Embryonenbiologie wurde der Hühnerembryo verwendet, um die Entwicklung und Differenzierung von Embryonen zu untersuchen. Die Abgabe exogener Materialien in Hühnerembryonen hat einen großen Vorteil für die Untersuchung der Genfunktion, der transgenen Zucht und der Chimärenvorbereitung während der Embryonalentwicklung. Hier zeigen wir die Methode der intravaskulären In-Ovo-Injektion , bei der exogene Materialien wie Plasmidvektoren oder modifizierte primordiale Keimzellen (PGCs) in frühen Entwicklungsstadien in Spenderhühnerembryonen übertragen werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass die intravaskuläre Injektion durch die dorsale Aorta und den Kopf es ermöglicht, injizierte Materialien durch das Blutkreislaufsystem in den gesamten Embryo zu diffundieren. Im vorgestellten Protokoll wurden die Wirksamkeit der exogenen Plasmid- und Lentiviralvektoreinführung sowie die Besiedlung injizierter exogener PGCs in der Empfängergonade durch Beobachtung der Fluoreszenz in den Embryonen bestimmt. Dieser Artikel beschreibt detaillierte Verfahren dieser Methode und bietet damit einen hervorragenden Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion, der Embryonen- und Entwicklungsbiologie sowie der Gonaden-chimären Hühnerproduktion. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Artikel es den Forschern ermöglichen wird, bei der intravaskulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen mit großem Erfolg und Reproduzierbarkeit durchzuführen.
Introduction
Hühnerembryonen werden seit Jahrhunderten in entwicklungspolitischen, immunologischen, pathologischen und anderen biologischen Anwendungen eingesetzt 1,2,3. Sie haben viele inhärente Vorteile gegenüber anderen Tiermodellen in der Erforschung der Toxikologie und Zellbiologie4. Hühnerembryonen sind leicht zugänglich und können in vitro manipuliert und in jedem Entwicklungsstadium direkt beobachtet werden, was ein praktisches Modellsystem für die Embryonenforschung bietet.
Im Allgemeinen haben aktuelle Hühnerembryo-Abgabemethoden wie Elektrotransfektion und Subkeimkavitäteninjektion Einschränkungen wie die Anforderung einer speziellen Ausrüstung und eines entworfenen Programms sowie Ineffizienz aufgrund des Vorhandenseins von Eigelb und Eiweiß 5,6,7. Hier zeigen wir eine einfache und effiziente Handhabungsmethode, um exogene Materialien in Hühnerembryonen zu bringen. Dies kann ein mächtiges Werkzeug sein, das beim Studium der Entwicklungsbiologie verwendet wird. Die injizierten Materialien breiten sich über den Blutkreislauf auf den gesamten Embryo aus. Während der frühen Entwicklung von Hühnerembryonen konnten die PGCs durch Blut wandern, den Genitalkamm besiedeln und sich dann zu Gameten entwickeln, die einen wertvollen möglichen Weg zur Abgabe exogener Materialien bieten8. Jetzt wurde diese Methode bei der Untersuchung der Genfunktion, der Embryonen- und Entwicklungsbiologie sowie der chimären und transgenen Hühnerproduktionweit verbreitet 9,10,11.
Bei der intravaskulären Injektion in Hühnerembryonen ist eine etablierte und häufig verwendete Methode12,13,14. In diesem Artikel zeigen wir eine umfassende Beschreibung dieses Protokolls, einschließlich Injektionsmaterialien, Stellen, Dosierung und repräsentativer Ergebnisse.
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Protocol
Alle Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren beinhalten, entsprachen den Richtlinien des U.S. National Institute of Health (NIH Pub. Nr. 85-23, überarbeitet 1996) und die Hühnerembryo-Protokolle wurden vom Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee der Yangzhou University, China, genehmigt (Nr. 201803124).
1. Entnahme und Aufbereitung befruchteter Eier
HINWEIS: Im Gegensatz zu Säugetieren hat das Huhn Millionen von Follikeln in einem einzigen Eierstock, aber nur wenige dieser Follikel sind reif genug, um zu ovulieren. Jeder Follikel enthält eine Eizelle oder Keimzelle. Sobald der Follikel reift und sein Eigelb freigibt, wird er in den Trichter des Eileiters eingebaut. Wenn der Follikel in den Jugularabdomen des Eileiters eintritt, bindet sich der Samen an das Ei im Körper der Henne, und das Kalzium im Körper der Henne bildet eine Schale, die das befruchtete Ei umhüllt und ein weichschaliges Ei im Körper bildet. Die Kalziumschale verdickt sich allmählich, bis das Ei produziert ist.
- Sammeln Sie befruchtete Eier von einem lokalen Verkäufer oder einer Institution, die 1 Woche lang bei 16 ° C gelagert werden können.
HINWEIS: Die hohe Lagertemperatur hilft dem Embryo, sich zu entwickeln, während die niedrige Temperatur die Lebensfähigkeit des Embryos verringert. Die Embryonen entwickeln sich nicht, wenn die Lagerzeit zu lang ist. - Schrubben Sie die Eierschale sanft und langsam mit 75% Ethanol, bevor Sie die Eier in den Inkubator geben.
- Legen Sie die Eier seitlich, ordentlich auf ein Gestell in einem Inkubator bei 37,8 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit. Nach 60 h Inkubation (HH-Stadium 17) entwickeln Embryonen sichtbare Blutgefäße und das Herz beginnt15 zu schlagen.
HINWEIS: Nach 2 Tagen Inkubation erscheinen kleine Urpunkte, das frühe Stadium des Herzens. Dieser Vorgang wird als Kirschperlstickerei bezeichnet. Nach ~ 2,5 Tagen werden Herz- und andere Körpersegmente mit sichtbaren Gefäßen gebildet.
2. Vorbereitung vor der Injektion
- Bereiten Sie Glaskapillaren vor, die als Nadeln verwendet werden. Ziehen Sie vor der Einspritzung 90 mm Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1 mm und einem Innendurchmesser von 0,6 mm mit dem Abzieher. Brechen Sie die Spitzen mit einer Pinzette (der Winkel der Glaskapillare beträgt normalerweise 45 °) und sterilisieren Sie die Kapillaren unter UV-Licht für 2 h.
- Bereiten Sie exogene Materialien wie Plasmide, verpackte Lentiviren und PGCs vor.
- Mischen Sie vorsichtig das Plasmid pEGFP-N1 (ein verstärktes GFP-exprimierendes Plasmid, 1μg/μL) mit einem Liposom im Verhältnis 1:3 (m/v). Fügen Sie Wasser hinzu, um eine endgültige DNA-Konzentration von 10 ng / μL zu erhalten. Lassen Sie die DNA-Mischung vor der Injektion 20 Minuten lang bei 37 °C einwirken.
- Tauwetterviren vor der Injektion auf Eis auf. Der Titer des zur Injektion verwendeten Lentivirus sollte über 5 x 106 Tu/ml betragen.
- Verdünnen Sie elterliche oder modifizierte Gonaden-PGCs (E4.5, HH-Stadium 24) auf 2.000-5.000 Zellen/μL.
HINWEIS: Hier haben wir das Injektionsverfahren mit Trypanblau gezeigt.
3. Fenstern
- Bevor Sie die Embryonen freilegen, sterilisieren Sie sie, indem Sie die Oberfläche der Eierschalen vorsichtig und sanft mit 75% Alkohol mit einem Wattebausch abwischen, um sicherzustellen, dass der stumpfe Rand der Eier gründlich sterilisiert wird.
- Klopfen Sie nach der Sterilisation vorsichtig auf das stumpfe Ende mit einer Pinzette, um ein kleines Fenster (0,5 cm x 0,5 cm) auf der Eierschalenoberfläche zu schaffen, um den Embryo freizulegen. Entfernen Sie die Embryomembran und legen Sie dann das Ei auf den Halter unter dem Dissektionsmikroskop.
4. Injektion
- Suchen Sie nach Blutgefäßen unter dem Mikroskop und stellen Sie den Fokus des Dissektionsmikroskops ein, um den Embryo zu lokalisieren, und finden Sie dann das Blutgefäß für die Injektion.
- Füllen Sie die Glasnadel mit der exogenen Lösung (Plasmid, Lentivirus oder PGCs) mit einer Pipette langsam, um Luftblasen in der Nadel zu vermeiden.
- Zielen Sie die Nadel mit exogener Lösung auf das Blutgefäß, wobei die Nadel parallel zum Blutgefäß injiziert wird.
- Führen Sie die gefüllte Nadel vorsichtig in das Gefäß ein und schalten Sie die Pumpe ein, um die Lösung (normalerweise beträgt das injizierte Volumen ~ 1-5 μL) unter dem Mikroskop auszustoßen. Der Luftpumpendruck sollte niedrig genug sein, um die Zerstörung von Gefäßen zu verhindern, da der zu hohe Luftdruck die Blutgefäße schädigen und zu einem Hochgeschwindigkeitsfluss führen würde.
- Sobald die exogene Lösung in das Gefäß injiziert wurde, stellen Sie sicher, dass die Farbe des Gefäßes in die Lösungsfarbe übergeht und sich in 2-5 s rot erholt, was darauf hinweist, dass die exogene Lösung erfolgreich an das Gefäß abgegeben wurde. An diesem Punkt gelangt die Lösung in die Arterie und wird mit dem Schlagen des Herzens durch die Arterie und dann zur Vene zurück zum Embryo zirkuliert.
HINWEIS: Es gibt zwei Injektionsstellen für die vaskuläre Injektion (Abbildung 1B): Eine ist der Kopf, an dem die exogene Lösung aus der Vene im Kopf des Embryos und durch den Blutfluss in das Herz injiziert wird und dann mit schlagendem Herzen zum gesamten Embryo zirkuliert (Abbildung 1B, Pfeil 1). Ein anderer ist durch die dorsale Aorta von Embryonenblut; Die exogene Lösung wird injiziert und breitet sich auf den gesamten Embryo aus (Abbildung 1B. Pfeil 2) mit dem Schlagen des embryonalen Herzens.
- Sobald die exogene Lösung in das Gefäß injiziert wurde, stellen Sie sicher, dass die Farbe des Gefäßes in die Lösungsfarbe übergeht und sich in 2-5 s rot erholt, was darauf hinweist, dass die exogene Lösung erfolgreich an das Gefäß abgegeben wurde. An diesem Punkt gelangt die Lösung in die Arterie und wird mit dem Schlagen des Herzens durch die Arterie und dann zur Vene zurück zum Embryo zirkuliert.
- Nach der Injektion das Ei aus dem Stereomikroskop nehmen und 200 μL Penicillinlösung in die Eierschale geben. Schneiden Sie ein 3 cm langes Stück medizinisches Klebeband ab und versiegeln Sie das Fenster. Kratzen Sie das Band vorsichtig mit einer Schere, um Luftblasen herauszuquetschen, und schneiden Sie dann ein weiteres Stück ab, um die Öffnung zu versiegeln.
- Beschriften und legen Sie das injizierte Ei zurück in den Inkubator und inkubieren Sie es bis zum erforderlichen Entwicklungsstadium oder Schlüpfen.
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Representative Results
Wir zeigen hier die in ovo intravaskuläre Injektion von Hühnerembryonen. Ein schematischer Ablauf der intravaskulären Injektion ist in Abbildung 1 dargestellt; In unserer Studie haben wir verschiedene exogene Lösungen verwendet, um die Injektion zu testen und zu verifizieren.
Um die injizierten Materialien besser sichtbar zu machen, wurde Trypan Blue (0,4%) als Tracer in den Embryo injiziert. Es wurde beobachtet, dass der Tracer (blau) entweder durch dorsale Aorta oder Kopfinjektion über den Blutkreislauf in den gesamten Embryo diffundiert (Abbildung 2). Materialien, die an zwei verschiedenen Stellen injiziert wurden, konnten sich auf den gesamten Embryo ausbreiten, was auf die Diffusion durch den Blutkreislauf hinweist. Die Visualisierung der blauen Farbe bestätigt den Erfolg der Injektion.
Der pEGFP-N1-Vektor wurde mit PEI umhüllt, um eine Konzentration von 1 μg/μL zu erreichen, während der lentivirale Vektor pLVX-EGFP mit PEI umwickelt und nach Titration verdünnt wurde, um eine Viruskonzentration von 5 x 106 Tu/μL zu erreichen. Die 2,5-Tage-Embryonen (HH-Stadium 14-15) wurden mit verpacktem pEGFP-N1 oder pLVX-EGFP injiziert. Nach 4,5 Tagen (HH-Stadium 24) wurden die Embryonen mittels stereoskopischer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Im Embryo wurde eine grüne Fluoreszenz beobachtet, die auf die Vektorexpression nach der Injektion hinweist. Die Ergebnisse zeigen, dass verkapselte Plasmide durch Liposomen (PEI) und verpacktes Lentivirus 2 Tage nach der Injektion im Hühnerembryo exprimiert wurden (Abbildung 3). Die Ergebnisse der Plasmid- und lentiviralen Vektorinjektion bewiesen die exogene Genexpression im Embryo, was die mögliche Anwendung im Gentransfer impliziert.
Die PGCs wurden aus dem genitalen Kamm von Embryonen (E4.5, HH-Stadium 24) isoliert und zur Reinigung kultiviert, wie in der vorherigen Veröffentlichung16. Die injizierten PGCs wurden mit dem rot fluoreszierenden Protein (RFP) markiert. Nach E6,0 Tagen (HH-Stadium 28) wurde die Gonade der Empfängerembryonen isoliert und beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Spender-PGCs (rote Punkte) in der Lage waren, die Gonaden der Empfänger effektiv zu betreten und zu besiedeln (Abbildung 4).
Abbildung 1: Das Schema der intravaskulären Injektion. a) den Zeitplan der intravaskulären Injektion; B) zwei durch schwarze Pfeile gekennzeichnete Injektionsstellen, der Kopf (1) und die dorsale Aorta (2); (C) Der Prozess der intravaskulären Injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Diffusion des Rückverfolgungsfarbstoffs an verschiedenen Injektionsstellen. Oben: dorsale Aorta; Unten: Kopf. Maßstabsleiste = 50 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Expression von GFP in Embryonen 2 Tage nach lentiviralem Vektor und verkapselter Plasmidinjektion. Maßstabsleiste = 100 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Visualisierung von injizierten roten fluoreszenzmarkierten PGCs im Empfänger-Hühnerembryo . (E6.0, HH Stadium 28) Gonade. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Methode der intravaskulären In-Ovo-Injektion von Hühnerembryonen ist für exogene Materialien (Vektor-, Virus- oder PGCs) optimiert, die in den Embryo übertragen werden sollen. Basierend auf dieser Methode konstruierten wir Hühnerembryomodelle mit stabiler Genüberexpression oder -interferenz (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.). 17,18,19. Diese etablierten Modelle belegen die Machbarkeit dieses Ansatzes. Darüber hinaus haben wir nicht nur isolierte PGCs auf die Embryogonade des Empfängers übertragen, sondern auch erfolgreich die lebensfähigen Nachkommen mit Embryogonaden produziert, die mit induzierten PGCs transplantiert wurden, was die große Anwendung dieser Methode in der Zukunftimpliziert 20.
Der entscheidende Schritt der Methode ist die Injektion. Die exogenen Materialien müssen direkt in die Blutgefäße injiziert werden, nicht zu tief oder zu flach. Daher erfordert es Erfahrung in der Arbeit mit Hühnerembryonen und hohe Injektionsfähigkeiten, die durch Übung leicht erworben werden können. Im Vergleich zur Luftzellinjektion lassen sich mit dieser Methode eine hohe Injektionseffizienz und -genauigkeit leichter erreichen. Zusätzlich zu den Einschränkungen hoher Kosten und komplizierter Schritte wird die Elektrotransfektion nicht angewendet, wenn ein großes Fenster hergestellt wird, da dies zu einer niedrigen Überlebensrate führen kann.
Als Methode zur Genmanipulation bei Hühnerembryonen hat die Methode auch einige Einschränkungen. Etwa die Hälfte der Eier war während der Inkubation nach der Injektion mit einer Überlebensrate von 40% -60% tot. In der Zwischenzeit ist die Liefereffizienz ein weiterer wichtiger Faktor, der berücksichtigt werden muss, insbesondere für die PGC-Injektion (in unserem Fall beträgt die Effizienz der Plasmid- und Lentivirus-Injektion ~ 50% -60% und die der PGC-Injektion ~ 30% -40%). In Zukunft kann das Protokoll optimiert und die Überlebensrate erheblich erhöht werden, was das Anwendungsfeld dieser Methode weiter verbessert.
Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll, dass die intravaskuläre Injektion des In-Ovo-Hühnerembryos spezifisch für exogene Materialien (Vektoren oder PGCs) ist, die in die Embryonen übertragen werden sollen. Darüber hinaus kann diese Methode leicht erlernt und in vielen Bereichen angewendet werden.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte gemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31972547) unterstützt. Wir schätzen das Lektorat von Jing Wang und das Voiceover von Malik Donlic an der Washington State University, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
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