Summary
Общей целью данной работы является описание того, как выполнить внутриклеточную инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Такой подход очень полезен для изучения биологии развития куриных эмбрионов.
Abstract
В качестве классической модельной системы биологии эмбрионов куриный эмбрион был использован для исследования эмбрионального развития и дифференцировки. Доставка экзогенных материалов в куриные эмбрионы имеет большое преимущество для изучения функции генов, трансгенного разведения и подготовки химер во время эмбрионального развития. Здесь мы показываем метод внутрисосудистой инъекции in ovo, при котором экзогенные материалы, такие как плазмидные векторы или модифицированные первичные половые клетки (PGC), могут быть перенесены в донорские куриные эмбрионы на ранних стадиях развития. Результаты показывают, что внутрисосудистая инъекция через дорсальную аорту и головку позволяет введенным материалам диффундировать во весь эмбрион через кровеносную систему. В представленном протоколе эффективность введения экзогенных плазмидных и лентивирусных векторов, а также колонизация вводимых экзогенных ПГК в гонаду-реципиента определялись путем наблюдения флуоресценции у эмбрионов. В данной статье подробно описаны процедуры этого метода, тем самым обеспечивая отличный подход к изучению функции генов, биологии эмбриона и развития, а также производства гонадно-химерной курицы. В заключение данная статья позволит исследователям с большим успехом и воспроизводимостью выполнить внутрисосудистую инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы.
Introduction
Куриные эмбрионы широко использовались на протяжении веков в развитии, иммунологическом, патологическом и других биологических применениях 1,2,3. Они имеют много неотъемлемых преимуществ перед другими животными моделями в изучении токсикологии и клеточной биологии4. Куриные эмбрионы легко доступны и могут манипулироваться in vitro и непосредственно наблюдаться на любой стадии развития, что обеспечивает удобную систему моделирования эмбрионов.
В целом, современные методы доставки куриного эмбриона, такие как электротрансфекция и инъекция в подгерминальную полость, имеют ограничения, такие как потребность в специализированном оборудовании и разработанной программе, а также неэффективность из-за наличия желтка и белка 5,6,7. Здесь мы показываем простой и эффективный метод транспортировки экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Это может быть мощным инструментом, используемым при изучении биологии развития. Введенные материалы распространяются на весь эмбрион через кровообращение. Во время раннего развития куриных эмбрионов PHC могут мигрировать через кровь, колонизировать генитальный хребет, а затем развиваться в гаметы, которые обеспечивают ценный возможный путь для доставки экзогенных материалов8. В настоящее время этот метод широко используется при изучении функции генов, биологии эмбриона и развития, а также химерного и трансгенного производствакурицы 9,10,11.
Внутрисосудистая инъекция в куриные эмбрионы является хорошо зарекомендовавшим себя и широко используемым методом 12,13,14. В этой статье мы показываем всестороннее описание этого протокола, включая инъекционные материалы, места, дозировку и репрезентативные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с уходом и использованием животных, соответствовали руководящим принципам Национального института здравоохранения США (NIH Pub. No. 85-23, пересмотренный в 1996 году), а протоколы куриных эмбрионов были одобрены Комитетом по управлению лабораторными животными и экспериментальной этике животных Университета Янчжоу, Китай (No 201803124).
1. Сбор и подготовка оплодотворенных яйцеклеток
Примечание: В отличие от млекопитающих, курица имеет миллионы фолликулов в одном яичнике, но только некоторые из этих фолликулов достаточно зрелые, чтобы овулировать. Каждый фолликул содержит одну яйцеклетку или зародышевую клетку. Как только фолликул созревает и высвобождает свой желток, он включается в воронку маточной трубы. Когда фолликул попадает в яремное брюшко яйцевода, сперма связывается с яйцом в организме курицы, а кальций в организме курицы образует оболочку, которая обволакивает оплодотворенное яйцо, образуя в организме яйцо с мягкой скорлупой. Кальциевая оболочка постепенно утолщается до тех пор, пока не получится яйцо.
- Соберите оплодотворенные яйцеклетки у местного продавца или учреждения, которые можно хранить при 16°C в течение 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая температура хранения поможет эмбриону развиваться, в то время как низкая температура снизит жизнеспособность эмбриона. Эмбрионы не будут развиваться, если время хранения слишком долгое. - Очистите яичную скорлупу мягко и медленно с 75% этанолом перед переносом яиц в инкубатор.
- Поместите яйца боком, аккуратно на стойку в инкубаторе при температуре 37,8 °C и влажности 60%. После 60 ч инкубации (стадия HH 17) у эмбрионов разовьются видимые кровеносные сосуды и сердце начнет биться15.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 2 дней инкубации появляются небольшие первичные точки, ранняя стадия сердца. Этот процесс называется вишневым бисером. Через ~2,5 дня сердце и другие сегменты тела формируются с видимыми сосудами.
2. Подготовка перед инъекцией
- Подготовьте стеклянные капилляры, которые будут использоваться в качестве игл. Перед инъекцией вытяните стеклянные капилляры диаметром 90 мм с наружным диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,6 мм с помощью съемника. Разбейте наконечники с помощью щипцов (угол наклона стеклянного капилляра обычно составляет 45°) и стерилизуйте капилляры под ультрафиолетовым светом в течение 2 ч.
- Приготовьте экзогенные материалы, такие как плазмиды, упакованные лентивирусы и PGC.
- Осторожно смешайте плазмиду pEGFP-N1 (усиленную плазмиду, экспрессирующую GFP, 1 мкг/мкл) с липосомой в соотношении 1:3 (м/об). Добавьте воду для получения конечной концентрации ДНК 10 нг/мкл. Дайте смеси ДНК постоять при 37 °C в течение 20 минут перед инъекцией.
- Оттаивайте вирусы на льду перед инъекцией. Титр лентивируса, используемого для инъекций, должен быть более 5 х 106 Ту/мл.
- Разбавляйте родительские или модифицированные ГОНАДные ПГК (E4.5, HH стадия 24) до 2000-5000 клеток/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы показали процедуру инъекции с использованием трипан синего цвета.
3. Окна
- Перед обнажением эмбрионов стерилизуйте их, аккуратно и мягко протирая поверхность яичной скорлупы 75% спиртом с помощью ватного тампона, обеспечив тщательную стерилизацию тупого края яиц.
- После стерилизации аккуратно постучите по тупому концу щипцами, чтобы создать небольшое окошко (0,5 см х 0,5 см) на поверхности яичной скорлупы, чтобы обнажить эмбрион. Удалите мембрану эмбриона, а затем поместите яйцеклетку на держатель под рассеченным микроскопом.
4. Инъекция
- Ищите кровеносные сосуды под микроскопом и регулируйте фокус рассеченного микроскопа, чтобы найти эмбрион, а затем найдите кровеносный сосуд, готовый к инъекции.
- Заполните стеклянную иглу экзогенным раствором (плазмидой, лентивирусом или PGC) с помощью пипетки медленно, избегая пузырьков воздуха в игле.
- Направьте иглу с экзогенным раствором на кровеносный сосуд, причем игла параллельна вводимому кровеносному сосуду.
- Аккуратно вставьте заполненную иглу в сосуд и включите насос, чтобы извлечь раствор (обычно вводимый объем составляет ~1-5 мкл) под микроскопом. Давление воздушного насоса должно быть достаточно низким, чтобы предотвратить разрушение сосудов, так как чрезмерно высокое давление воздуха повредит кровеносные сосуды, что приведет к высокоскоростному потоку.
- После того, как экзогенный раствор введен в сосуд, убедитесь, что цвет сосуда превращается в цвет раствора и восстанавливается до красного через 2-5 с, что указывает на то, что экзогенный раствор успешно доставлен в сосуд. В этот момент раствор поступает в артерию, и с биением сердца циркулирует обратно к эмбриону через артерию, а затем к вене.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два места инъекции для сосудистой инъекции (рисунок 1B): один - головка, где экзогенный раствор вводится из вены в головке эмбриона и в сердце через кровоток, а затем циркулирует ко всему эмбриону с сердцебиением (Рисунок 1B, Стрелка 1). Другой — через дорсальную аорту эмбриональной крови; экзогенный раствор вводится и распространяется на весь эмбрион (рис. 1В. Стрелка 2) с биением эмбрионального сердца.
- После того, как экзогенный раствор введен в сосуд, убедитесь, что цвет сосуда превращается в цвет раствора и восстанавливается до красного через 2-5 с, что указывает на то, что экзогенный раствор успешно доставлен в сосуд. В этот момент раствор поступает в артерию, и с биением сердца циркулирует обратно к эмбриону через артерию, а затем к вене.
- После инъекции извлеките яйцо из стереомикроскопа и опустите 200 мкл раствора пенициллина внутрь яичной скорлупы. Вырежьте кусок медицинской ленты длиной 3 см и заклейте окно. Аккуратно соскоблите ленту ножницами, чтобы выдавить пузырьки воздуха, а затем вырежьте еще один кусок, чтобы запечатать отверстие поперек.
- Маркируйте и поместите введенное яйцо обратно в инкубатор и инкубируйте до требуемой стадии развития или вылупления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы покажем внутрисосудистую инъекцию в ово куриных эмбрионов. Схематический процесс внутрисосудистой инъекции показан на рисунке 1; В нашем исследовании мы использовали различные экзогенные растворы для тестирования и проверки инъекций.
Чтобы лучше визуализировать введенные материалы, Trypan Blue (0,4%) вводили в качестве индикатора в эмбрион. Наблюдалось, что индикатор (синий) диффундирует на весь эмбрион через кровообращение либо путем дорсальной аорты, либо путем инъекции головы (рисунок 2). Материалы, введенные в два разных места, смогли распространиться на весь эмбрион, что указывает на диффузию через кровообращение. Визуализация синего цвета подтверждает успешность инъекции.
Вектор pEGFP-N1 обертывали PEI для достижения концентрации 1 мкг/мкл, в то время как лентивирусный вектор pLVX-EGFP оборачивали PEI и разбавляли после титрования для достижения концентрации вируса 5 x 106 Tu/μL. Эмбрионам 2,5 дня (стадия HH 14-15) вводили с обернутым pEGFP-N1 или pLVX-EGFP. Через 4,5 дня (стадия HH 24) эмбрионы наблюдались с помощью стереоскопической флуоресцентной микроскопии. У эмбриона наблюдалась зеленая флуоресценция, указывающая на векторную экспрессию после инъекции. Результаты показывают, что инкапсулированные плазмиды липосомами (PEI) и упакованный лентивирус были экспрессированы в курином эмбрионе через 2 дня после инъекции (рисунок 3). Результаты инъекций плазмидных и лентивирусных векторов доказали экзогенную экспрессию генов у эмбриона, подразумевая возможное применение в переносе генов.
PMC были выделены из генитального гребня эмбрионов (E4.5, HH стадия 24) и культивированы для очистки, как в предыдущей публикации16. Введенные ПГК были помечены красным флуоресцентным белком (RFP). На 6,0 дней (стадия HH 28) гонаду эмбрионов-реципиентов выделяли и наблюдали. Результаты показали, что донорские PPC (красные точки) смогли эффективно входить и колонизировать гонады реципиента (рисунок 4).
Рисунок 1: Схема внутрисосудистой инъекции. А) сроки внутрисосудистой инъекции; (B) два места инъекции, обозначенные черными стрелками: головка (1) и спинная аорта (2); (C) Процесс внутрисосудистой инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Диффузия трассирующего красителя в разных местах инъекций. Вверху: спинная аорта; Внизу: Голова. Шкала = 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия GFP у эмбрионов через 2 дня после линзовирусного вектора и инкапсулированной инъекции плазмиды. Шкала = 100 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Визуализация введенных красных флуоресцентно-меченых ПГК в курином эмбрионе-реципиенте ( E6.0, HH стадия 28) гонады. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод внутрисосудистой инъекции куриных эмбрионов оптимизирован для переноса в эмбрион экзогенных материалов (векторных, вирусных или ПГК). На основе этого метода мы построили модели куриного эмбриона со стабильной гиперэкспрессией или интерференцией генов (SpinZ, JUN, UBE2I и т.д.) 17,18,19. Эти устоявшиеся модели доказывают целесообразность такого подхода. Кроме того, мы не только перенесли изолированные ПГК в гонаду эмбриона реципиента, но и успешно произвели жизнеспособное потомство с эмбриональной гонадой, пересаженной индуцированными ПГК, что подразумевает грандиозное применение этого метода в будущих20.
Критическим этапом метода является инъекция. Экзогенные материалы должны быть непосредственно введены в кровеносные сосуды, не слишком глубоко или слишком мелко. Таким образом, это требует опыта работы с куриными эмбрионами и высоких инъекционных навыков, которые можно легко получить на практике. По сравнению с инъекцией в воздушные клетки, с помощью этого метода легче достичь высокой эффективности и точности инъекций. В дополнение к ограничениям высокой стоимости и сложным этапам, электротрансфекция не применяется при изготовлении большого окна, так как это может привести к низкой выживаемости.
Как метод манипуляции генами у куриных эмбрионов, метод также имеет некоторые ограничения. Около половины яйцеклеток были мертвы во время инкубации после инъекции с выживаемостью 40%-60%. Между тем, эффективность доставки является еще одним важным фактором, который следует учитывать, особенно для инъекций ПГК (в нашем случае эффективность инъекции плазмиды и лентивируса составляет ~ 50%-60%, а эффективности инъекции ПГК составляет ~ 30%-40%). В будущем протокол может быть оптимизирован и выживаемость может быть значительно увеличена, что еще больше улучшит область применения этого метода.
В заключение, этот протокол демонстрирует, что внутрисосудистая инъекция внутрисосудистого эмбриона курицы in ovo специфична для экзогенных материалов (векторов или PGC), которые должны быть перенесены в эмбрионы. Более того, этот метод может быть легко изучен и применен во многих областях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никаких конфликтов интересов объявлено не было.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31972547). Мы высоко ценим редактирование Цзин Вана и закадровый голос Малика Донлика в Университете штата Вашингтон, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
