Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Abstract

Слой пигментированного эпителия сетчатки (RPE) находится непосредственно за фоторецепторами и содержит сложную метаболическую систему, которая играет несколько критических ролей в поддержании функции фоторецепторов. Таким образом, структура и функция RPE необходимы для поддержания нормального зрения. В этой рукописи представлен установленный протокол для первичной изоляции клеток RPE мыши. Изоляция RPE является отличным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии RPE в различных мышиных моделях глазных расстройств. Кроме того, изоляция RPE может помочь в сравнении первичных клеток RPE мышей, выделенных у диких и генетически модифицированных мышей, а также в тестировании лекарств, которые могут ускорить разработку терапии зрительных расстройств. В рукописи представлен пошаговый протокол изоляции RPE; вся процедура, от энуклеации до посева, занимает примерно 4 часа. Среда не должна быть изменена в течение 5-7 дней после посева, чтобы обеспечить рост изолированных клеток без нарушения. За этим процессом следует характеристика морфологии, пигментации и специфических маркеров в клетках посредством иммунофлуоресценции. Клетки могут быть пройдены максимум три или четыре раза.

Introduction

Клетки пигментированного эпителия сетчатки (RPE) расположены между сосудистой оболочкой и нервной сетчаткой, образуя простой монослой кубоидальных клеток, который лежит за фоторецепторными (PR) клетками1. RPE играет решающую роль в поддержании здоровой окружающей среды для PR-клеток, главным образом путем уменьшения чрезмерного накопления активных форм кислорода (АФК) и последующего окислительного повреждения1. Клетки RPE контролируют многие функции, такие как преобразование и хранение ретиноидов, поглощение рассеянного света, транспорт жидкости и ионов и фагоцитоз сброшенной PR наружной сегментной мембраны 2,3. Изменения в RPE (морфология / функция) могут ухудшить их функцию, ведущую к ретинопатии, и это общая черта, общая для многих глазных расстройств4. Многие глазные заболевания связаны с изменениями в морфологии и функции клеток RPE, включая некоторые генетические заболевания, такие как пигментный ретинит, врожденный амавроз Лебера и альбинизм 4,5,6, а также возрастные глазные расстройства, такие как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастная макулярная дегенерация (AMD)7,8 . Клетки человека являются наиболее желательными, поэтому было бы идеально изучать нарушения RPE в первичных клетках RPE человека для формирования монослоев RPE. Однако этические вопросы и ограниченная доступность человеческих доноров обусловлены тем, что большинство из этих расстройств приводят к заболеваемости9, но не обязательно к смертности10, тем самым предотвращая выделение первичных клеток РПЭ человека. Это делает культивирование клеток RPE от нечеловеческих доноров животных предпочтительной альтернативой. Грызуны, особенно мыши, считаются отличной моделью для изучения различных глазных заболеваний, поскольку трансгенная технология более широко распространена у этих видов11. Несмотря на то, что использование культивируемых первичных клеток RPE предлагает много преимуществ, было трудно поддерживать растущие клетки в течение многих проходов или хранить и повторно использовать клетки. Основным ограничением этого протокола является возраст мышей; мыши, которые используются для изоляции RPE, должны быть очень молодого возраста (оптимально 18-21 день), так как было трудно культивировать клетки RPE у взрослых мышей 11,12,13. Клетки RPE могут быть выделены из глаз мыши в любом возрасте, однако до четырех клеточных проходов были успешными только у молодых мышей (18-21 день). Изоляция RPE от сетчатки мышей с использованием как мышей C57BL6, так и трансгенных мышей с делецией рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAR) в клетках RPE была выполнена для изучения влияния повышенного уровня аминокислотного гомоцистеина на развитие и прогрессирование AMD14. Кроме того, изолированные первичные клетки RPE помогли предложить терапевтическую мишень для ВМД путем ингибирования NMDAR в клетках RPE14. Существуют некоторые блокаторы NMDAR, которые одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и в настоящее время используются для лечения умеренной и тяжелой путаницы (деменции), связанной с болезнью Альцгеймера (БА), таких как мемантин16, который может быть потенциальной терапевтической мишенью для ВМД14. Кроме того, изолированные первичные мышиные клетки RPE были использованы для обнаружения воспалительных маркеров и предполагаемой индукции воспаления в качестве основного механизма гомоцистеин-индуцированных признаков ВМД и AD с использованием генетически модифицированной мыши (CBS), которая представляет высокий уровень гомоцистеина16,17.

Этот протокол был использован для изоляции клеток RPE как от мышей дикого типа C57BL/6, так и от трансгенных мышей, разработанных в нашей лаборатории в качестве упрощенной адаптации других опубликованных протоколов изоляции 13,18,19 для достижения легко применимого и надежного протокола. В этом протоколе нет предпочтения пола. В то время как возраст мышей имеет решающее значение для процесса изоляции, молодые, пожилые мыши (18-21 день) и пожилые мыши в любом возрасте (до 12 месяцев) использовались для изоляции RPE. Тем не менее, мы заметили, что клетки RPE, выделенные у молодых мышей, жили дольше, и можно было выполнить до четырех проходов. Клетки RPE, выделенные у старых мышей, могут быть пройдены один или два раза, затем они перестанут расти с нормальной скоростью и изменят свою форму, чтобы быть более вытянутыми (фибробластоподобные клетки). Также наблюдалась потеря пигментации и снижение адгезии к тканевой культуральной пластине с последующим отслоением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животные использовались в соответствии с руководящими принципами оклендского университета IACUC для животных No 21063 и руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Приготовление раствора

  1. Подготовьте полную среду для культивирования клеток RPE, дополнив модифицированную смесь F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco 25% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1,5% пенициллина/стрептомицина и 0,02% гентамицина.
  2. Приготовьте фермент А, дополнив 741 мкл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) 127 мкл раствора коллагеназы и 132 мкл раствора гиалуронидазы. Это составляет конечный объем в 1 мл, который может обрабатывать четыре глаза.
    1. Приготовьте раствор коллагеназы путем растворения 1 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum в 41 мл HBSS (19,5 ед/мл).
    2. Готовят раствор гиалуронидазы путем растворения 1 мг гиалуронидазы из яичек крупного рогатого скота в 18,4 мл HBSS (38 единиц / мл).
  3. Приготовьте фермент B, добавив две части 0,25% трипсина-ЭДТА к трем частям HBSS. Отметим, что общий объем зависит от количества рассеченных глаз; 1 мл фермента B можно использовать для лечения четырех глаз.

2. Энуклеация

  1. Этически усыпить мышь с помощью вдыхания углекислого газа (CO2) в соответствии со стандартамиIACUC 21.
    1. Вкратце, поместите животное (животных) в камеру CO2 для введения 100% CO2 со скоростью заполнения 30%-70% объема камеры в минуту CO2 для достижения потери сознания в течение 2-3 мин, с минимальным стрессом для мышей.
    2. Подтвердите смерть (отсутствие дыхания и блеклый цвет глаз), затем переместите мышь из клетки в чистую стерилизованную хирургическую область (очищенную спиртом), оснащенную стерилизованным хирургическим оборудованием.
  2. Поместите мышь на стерильную нижнюю панель.
  3. Энуклеат глаз, нажимая пинцет в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз, с последующим перемещением пинцета к задней части глаза. Извлеките глаза, с неповрежденным зрительным нервом, осторожно вытягивая глаза из орбитальной полости.
  4. Используя щипцы, погрузите глаза в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 1 мл 5% повидона-йода. Инкубировать глаза при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
  5. Извлеките глаза из раствора повидона-йода и поместите их в чашку Петри. Используя стерильную передаточную пипетку, промывайте глаза HBSS до тех пор, пока оранжевый цвет повидона-йода не исчезнет. Это занимает около двух или трех стирок.
  6. Поместите глаза в новую чашку Петри толщиной 60 мм и погрузите их в холодную (2-8 °C) полную среду для культивирования клеток RPE, приготовленную на этапе 1.1.

3. Рассечение

  1. Под хирургическим микроскопом используйте пинцет в стиле M5S и ножницы Vannas для удаления соединительной ткани и экстраокулярных мышц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение проводится под тканевым капюшоном в полностью стерильной среде. Тем не менее, для видео целей рассекающий микроскоп был размещен за пределами капота для достижения более высокого качества демонстрации / съемки. Помещение небольшого кусочка безворсовой папиросной бумаги под глаз улучшает стабильность во время рассечения. Затем глаза можно временно удерживать (не более 1 часа) в холодной среде культивирования клеток RPE. Однако предпочтительнее переходить непосредственно к следующему шагу сразу после чистки глаз.
  2. Перенесите глаза в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 1 мл раствора фермента А на каждые четыре глаза. Затем высиживают глаза в инкубаторе при 37 °C в течение 40 мин.
  3. Извлеките глаза из инкубатора и микроцентрифужной трубки. Затем перенесите их в новую микроцентрифужную трубку, содержащую 1 мл раствора фермента В на каждые четыре глаза. Инкубируют трубку в инкубаторе при 37 °C в течение 50 мин.
  4. Поместите глаза в новую 60-миллиметровую суспензионную культуральную чашку, содержащую 10 мл полной среды роста клеток RPE. Затем инкубируют глаза при 4 °C в течение 30 мин.
  5. Поместите блюдо под хирургический микроскоп и начните рассечение.
  6. Удалите переднюю часть глаза (роговицу, радужную оболочку и хрусталик) из задней части подглазника (задняя сетчатка).
    1. Захватите глаз щипцами в стиле M5S и сделайте разрез в секции ora serrata (самая передняя часть сетчатки, где заканчивается светло-синий цвет) лезвием No 11 или иглой шприца.
    2. Захватите внутреннюю часть разреза одной парой щипцов, а другой парой щипцов обхватите роговицу. Начните медленно вытягивать или отрывать роговицу от сетчатки. Обязательно разрывайте небольшими шагами и двигайтесь вниз по разрыву при удалении роговицы, чтобы гарантировать, что RPE остается в основном неповрежденным и приводит к более чистому разрыву.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только роговица полностью отделится, можно увидеть радужную оболочку и хрусталик.
    3. Разделите роговицу и радужную оболочку.
  7. Отделите хрусталик от наглазника с помощью мягкого сжатия задней половины глаза.
  8. Чтобы удалить нервную сетчатку из слоя RPE, захватите внешний слой глазника одной парой пинцета и расположите руку второй пары пинцета между RPE и нейронными слоями. Оттуда осторожно потяните или зачерпните нервную сетчатку подальше от слоя RPE. Отбросьте нервную сетчатку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На видео нейронная сетчатка и хрусталик удалены вместе. Однако новичкам будет проще убрать каждый по отдельности. То, что остается, это RPE, сосудистая оболочка и склера.
  9. Отбросьте роговицу, радужную оболочку, хрусталик и нервную сетчатку. Переместите оставшийся наглазник в новую область на блюде, свободную от мусора.
  10. Чтобы отделить RPE от сосудистой оболочки и склеры, аккуратно соскоблите внутреннюю часть наглазника пинцетом в стиле 5/45, чтобы обеспечить разделение клеток RPE. Клетки RPE кажутся мутными при суспендировании в полной среде роста клеток RPE.
  11. Аспирируйте клетки с помощью стерильной трансферной пипетки объемом 3,2 мл и переносите в новую центрифужную трубку объемом 15 мл, содержащую полную среду роста клеток RPE.

4. Центрифугирование

  1. Поместите 15 мл центрифужной трубки, содержащей первичные ячейки RPE, внутрь центрифуги и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу с 10 мл полной питательной среды RPE. Полная среда роста RPE более специфична для роста RPE, чем другие загрязняющие клетки, такие как клетки Мюллера или хориоидальные эндотелиальные клетки. Клетки Мюллера требуют среды с высоким содержанием глюкозы, в то время как хориоидальные эндотелиальные клетки требуют специфических факторов роста. Изменяя среду и передавая культуру, только клетки RPE будут продолжать расти.

5. Клеточная культура

  1. Нанесите повторно суспендированные первичные клетки RPE на стерильную 100-миллиметровую чашку Петри и перенесите их в инкубатор (после проверки чистоты путем окрашивания клеток специфическими маркерами клеток RPE/Müller, как показано на рисунке 1E-N). Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые маркеры указаны в Таблице материалов. Этот шаг выполняется после создания языка и региональных параметров.
  2. Инкубируйте клетки в течение примерно 5 дней, чтобы расти. В течение этого времени не изменяйте среду, не тревожайте клетки и не перемещайте пластинку клеточной культуры (это критический шаг в протоколе; после выделения клетки должны быть инкубированы и не беспокоиться в течение 5 дней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток зависит от количества глаз, используемых для изоляции. Большее количество изолированных глаз даст большее количество клеток. Изоляция RPE от двух глаз даст ~ 440 000-880 000 клеток, или 5%-10% от 100 мм чашки Петри, которая может вместить 8,8 миллиона клеток.

6. Пассаж

  1. Аспирировать носитель и промыть 2 мл PBS. Затем аспирируйте PBS.
  2. Добавьте 4 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (1x), или достаточно, чтобы покрыть основу блюда. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте 8 мл предварительно нагретой среды RPE или в два раза больше объема, чем было использовано на этапе 6.2. Затем соберите клетки и поместите их в центрифужную трубку объемом 15 мл.
  4. Центрифуга при 300 х г в течение 7 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 10 мл полной клеточной культуральной среды RPE. Выложите всю суспензию в стерильную чашку Петри толщиной 100 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть пройдены до четырех или пяти раз18. Однако наиболее последовательные результаты эксперимента обнаруживаются после двух-трех проходов. После двух-четырех проходов клетки изменили свою форму (как показано на рисунке 1D), чтобы стать более вытянутыми, накапливались в середине пластины, перестали расти и отделились.
  5. Используйте протоколы иммунофлуоресценции, в соответствии с ранее опубликованными методами 8,14,15,16, для окрашивания и проверки специфичности RPE.

7. Иммунофлуоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресценцию проводили в соответствии с ранее опубликованными методами 8,14,15,16,17,18 для окрашивания и подтверждения специфичности RPE. Окрашивание первичных клеток RPE обычно проводилось в проходах P1 и P2. Здесь представлен краткий обзор иммунофлуоресцентного протокола.

  1. Посейте клетки на слайд камеры клеточной культуры (30 000 клеток на лунку для слайда с 8-луночной камерой).
  2. Культивируйте клетки в полной среде для культивирования клеток RPE при 37 °C и 5% CO2 в течение 24-48 ч.
  3. Когда клетки будут на 80%-90% сливаться, аспирируйте среду и промывайте слайд камеры с 1x PBS.
  4. Зафиксируйте слайд 4% параформальдегидом в течение 10-15 мин.
  5. Аспирировать 4% параформальдегид, а затем блокировать блокирующим раствором (см. Таблицу материалов).
  6. Аспирировать блокирующий раствор и добавить первичное антитело, RPE65, и инкубировать в течение трех часов при 37 °C (с концентрацией антител в диапазоне от 1:200-1:250 в блокирующем буфере, в объеме 150-200 мкл/слайд). Затем трижды вымойте PBS/TX-100 (по 5-10 мин каждая стирка).
  7. Аспирировать первичное антитело и добавить вторичное антитело (с концентрацией антител 1:1000 в блокирующем буфере, в объеме 150-200 мкл/слайд). Инкубировать в течение одного часа при 37 °C.
  8. Аспирировать выводится из вторичного антитела. Трижды мойте PBS/Trtion X-100 (5-10 мин каждая стирка).
  9. Добавьте каплю монтажного носителя DAPI, чтобы обозначить ядра, и поместите крышку поверх слайда. Убедитесь, что под крышкой нет пузырьков.
  10. Затем делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа в сопровождении камеры микроскопа высокого разрешения (HRM) и программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции/формирования изолированных клеток RPE
Изолированные клетки исследовали под световым микроскопом, чтобы проверить их жизнеспособность, морфологию и пигментацию. Были получены изображения из P0 и P1 (рисунок 1A,B) и изображения из P0 и P4 (рисунок 1C,D), чтобы показать изменения в ячейках; форма, размер и пигментация по мере того, как проходы переходили к четвертому проходу (черные стрелки указывают на изолированные клетки RPE в P4). Антитело к белку RPE65 использовалось для проверки идентичности изолированных клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание изолированных клеток проводили антителом против RPE65 с последующим исследованием под флуоресцентным микроскопом (Рисунок 1E,F: низкое увеличение и Рисунок 1G,H: высокое увеличение, показывающее положительно окрашенные клетки RPE в зеленый цвет и ядерный маркер, DAPI, в синем). RPE65 представляет собой изомерогидролазу, экспрессируемую в RPE. Он необходим для регенерации зрительного пигмента, необходимого для палочко- и конусно-опосредованного зрения21 . Проверка барьерной функции изолированного
клетки, как цитоскелетный белок F-актин, так и плотное соединение белка ZO-1 иммунофлуоресцентное окрашивание8 для изолированных клеток (Рисунок 1I,J: зеленый ZO-1 и синее ядерное окрашивание). и рисунок 1K,L: красный F-актин и синее ядерное окрашивание). Тем не менее, типичная булыжниковая форма RPE очень очевидна, когда клетки полностью сливаются.

Отрицательный контроль использовался в экспериментах, где вторичное антитело добавляли к клеткам RPE без добавления первичного антитела, чтобы убедиться, что специфичность антитела и результирующий цвет специфичны к антителам, которые были использованы (не показано).

Чтобы подтвердить чистоту и загрязнение изолированного RPE клетками Мюллера, иммунофлуоресцентное окрашивание изолированных клеток специфическим клеточным маркером для клеток Мюллера, виментином, было использовано (зеленый и синий для ядерного окрашивания, как показано на рисунке 1M, N) с использованием клеток Мюллера в качестве положительного контроля. Изолированные клетки RPE показали отрицательное окрашивание виментина.

Изолированные клетки исследовали под световым микроскопом, чтобы проверить их жизнеспособность, морфологию и пигментацию. Изображения из P0 и P1 (рисунок 1K, L) и изображения из P0 и P4 были захвачены (рисунок 1M, N), чтобы показать изменения в форме, размере и пигментации клеток по мере того, как проходы переходили к четвертому проходу (черные стрелки указывают на изолированные ячейки RPE в P4).

Figure 1
Рисунок 1: Валидация изоляции RPE. (A) Световой микроскоп для нулевого прохождения RPE (P0). (B) Световой микроскоп для прохождения RPE one (P1). (C) Характеристика морфологии при P0. D) Характеристика морфологии на P4. (E) Иммуноокрашивание для RPE65 при низком увеличении. (F) Иммуноокрашивание для RPE65 с ядерным окрашиванием с помощью DAPI. (G) Иммуноокрашивание для RPE65 при большом увеличении. (H) Иммуноокрашивание для RPE65 с ядерным окрашиванием DAPI при большом увеличении. (I) Окрашивание ZO-1 для клеток RPE. (G) Окрашивание ZO-1 для клеток RPE с ядерным окрашиванием DAPI. (K) Окрашивание F-актином для клеток RPE. (L) Окрашивание F-актином для клеток RPE с ядерным окрашиванием DAPI. (M) Окрашивание виментином для клеток RPE. (N) Окрашивание виментином для клеток Мюллера в качестве положительного контроля (RMc-1) с ядерным окрашиванием с помощью DAPI. Шкала стержней равна 300 мкм, 20 мкм, 300 мкм, 300 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 50 мкм, 50 мкм и 50 мкм соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Текущий протокол представляет собой отчетную, модифицированную и упрощенную подробную процедуру изоляции RPE от глаз мыши. Протокол включает энуклеацию, рассечение, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток RPE, выделенных из глаз мыши.

Существуют некоторые ограничения и критические шаги, которые должны быть выполнены для успешной изоляции RPE, такие как возраст мышей, количество рассеченных глаз, размер тарелки или чашки для культуры тканей и предостережения после посева, хранения и прохождения. Чтобы иметь возможность проходить изолированные клетки до трех или четырех раз, лучшие мыши стареют между 18-21 днем. Чтобы иметь разумное количество изолированных клеток, способных расти и размножаться, для одиночной изоляции необходимо не менее двух глаз. Количество клеток, приводящих к изоляции, пропорционально количеству рассеченных глаз (~ 220 000 клеток на глаз). Стерильная 100 мм чашка Петри /колба рекомендуется для получения большего количества клеток в раннем прохождении (P0). После посева клетки не следует беспокоить при перемещении пластинки культуры тканей из инкубатора или путем изменения среды в течение не менее 5 дней. Также одним из ограничений этой методики является хранение и прохождение изолированных клеток. Клетки не могут быть сохранены (заморожены и повторно обработаны) и могут быть пройдены только три или четыре раза. После прохождения 4 клетки начинают менять свой размер и форму, чтобы стать вытянутыми (веретенообразная форма) с выраженным уменьшением пигментации клеток (рисунок 1D).

Этот протокол отличается от других ценных и надежных опубликованных протоколов для первичной изоляции RPE мыши1 3,19,20 тем, что он упрощен несколькими шагами, которые легко выполнить. Клетки RPE могут быть идентифицированы по их морфологии, пигментации и специфическим маркерам RPE, таким как RPE65 4,5,21. Валидация чистоты и загрязнения клеток Мюллера была достигнута путем окрашивания изолированных клеток специфическим клеточным маркером для клеток Мюллера (виментин)22. Многие методы были использованы для оценки целостности гемато-ретинального барьера (BRB) in vitro, такие как исследование электронного микроскопа (EM), оценка белков плотного соединения (TJP), анализ утечки декстрана FITIC и измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TER), которое оценивает физиологическую функцию RPE как монослоя 8,23 . Клетки RPE играют важную роль в поддержании внешнего BRB, и для проверки этой функции мы оценили белки плотного соединения (TJP), такие как Zona ocludin-1 (ZO-1) и цитоскелетные белки, такие как F-актин, как ранее опубликовано8. Оценка TJP является более удобным методом оценки целостности BRB и барьерной функции, который не требует дорогостоящего оборудования, которое может быть доступно не во всех исследовательских лабораториях, в отличие от оценки EM или TER.

Первичная изоляция RPE - это метод, который может быть важным инструментом для изучения основных механизмов и патогенеза, а также для предложения новых терапевтических применений для различных глазных заболеваний. Современная методика позволила изучить изменения в структуре и функции клеток RPE и их влияние на внешний BRB при возрастной макулярной дегенерации8. Кроме того, он помог в изучении изменений в клетках RPE, выделенных у мышей дикого типа C57BL6 и различных генетически модифицированных мышей, а также в тестировании различных фармакологических соединений, ищущих терапевтическую мишень для AMD14,16.

В заключение, многие доступные опубликованные протоколы продемонстрировали первичную изоляцию RPE мыши. Представленный протокол представляет собой упрощенную процедуру, полученную в результате модификации некоторых существующих протоколов с использованием материала, методов и оборудования, которые доступны в большинстве исследовательских лабораторий для изоляции первичных клеток RPE от глаз мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы заявить, что имеют отношение к содержанию данной статьи.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом Национального института глаз (NEI), Национального института глаз (NEI) R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Биология выпуск 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter