Summary
Standardmembranfodringsanalysen (SMFA) betragtes som guldstandarden til vurdering og identifikation af potentielle malariaforbindelser. Dette kunstige fodringssystem bruges til at inficere myg for yderligere at evaluere virkningerne af sådanne forbindelser på intensiteten og forekomsten af Plasmodium falciparum-parasitten .
Abstract
Malaria er fortsat en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, og til dato er den afrikanske region stadig ansvarlig for 94% af alle tilfælde på verdensplan. Denne parasitære sygdom kræver en protozoan parasit, en Anopheles mygvektor og en hvirveldyr vært. Anopheles-slægten omfatter mere end 500 arter, hvoraf 60 er kendt som vektorer af parasitten. Plasmodium-parasitslægten består af 250 arter, og 48 af disse er involveret i sygdomsoverførsel. Desuden har Plasmodium falciparum-parasitten bidraget til anslået 99,7% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara i de senere år.
Gametocytter udgør en del af parasitens seksuelle stadium og indtages af den kvindelige myg ved fodring på en inficeret menneskelig vært. Yderligere udvikling af parasitten i myggen forbedres af gunstige miljøforhold i myggens midgut. Her finder fusionen af de kvindelige og mandlige gameter sted, og de bevægelige ookineter stammer fra. Ookineterne kommer ind i myggens midgutepitel, og modne ookineter danner oocyster, som igen producerer bevægelige sporozoitter. Disse sporozoitter migrerer til myggens spytkirtler og injiceres, da en myg tager et blodmåltid.
Til lægemiddelopdagelsesformål blev myg kunstigt inficeret med gametocytinficeret blod i standardmembranfodringsanalysen (SMFA). For at opdage infektion i myggen og / eller for at vurdere effektiviteten af malariaforbindelser blev midguts af de kvindelige myg fjernet efter infektion og blev farvet med mercurochrome. Denne metode blev brugt til at forbedre den visuelle påvisning af oocyster under mikroskopet til nøjagtig bestemmelse af oocystprævalens og intensitet.
Introduction
Malaria, kendt som en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, udgør stadig en stor trussel mod flere lande - især dem i den afrikanske region - og bidrager til ca. 95% af tilfældene på verdensplan1. Denne sygdom er forårsaget af en protozoisk parasit, og sammen med sin Anopheles mygvektor kan disse syndere forårsage stor skade på den menneskelige vært2. Mere specifikt er falciparum-arterne af Plasmodium-parasitslægten ansvarlig for anslået 99% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara1. Ud over dette kunne flere store Anopheles mygvektorer (herunder An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. og An. funestus Giles) skyldes mere end 95% af parasitoverførsel globalt 3,4,5,6,7,8 . For at det ideelle parasitvektorkammeratskab kan etableres, skal mygvektoren være modtagelig for parasitten og være i stand til at overføre den9. Desuden skal både vektoren og parasitten overvinde fysiske barrierer for at danne den perfekte infektiøse kombination - mygvektoren skal være i stand til at opretholde parasitudvikling, og parasitten skal have evnen til at overvinde værtsens forsvarsmekanismer10,11.
Gametocytter, det seksuelle stadium af P. falciparum-parasitten, spiller en afgørende rolle i forbindelsen mellem vektor- og parasitpartnerne12. Seksuel udvikling finder sted in vivo, og gametocytogenese beskriver processen med differentiering af modne gametocytter til bevægelige mandlige mikrogameter og kvindelige makrogameter13. En anden proces, der finder sted i myggen, er exflagellation - den proces, hvor den mandlige gametocyt omdannes til gameter og kommer ud af de røde blodlegemer, der optages under et blodmåltid11. Exflagellationsprocessen foreslås yderligere at blive forbedret ved en gunstig ændring i miljøet i myggen midgut14. Efter exflagellation dannes en zygote ved fusion af de mandlige og kvindelige gameter13. Fra zygoten opstår en bevægelig ookinete og bevæger sig fra blodmelet til epitelet af myggen midgut13. Her modnes ookineten, og der dannes en oocyst, som igen producerer bevægelige sporozoitter13,15. Sporozoitterne migrerer derefter til myggens spytkirtler, og da myggen tager et blodmåltid fra sin vært, injiceres disse sporozoitter i værtsens blodbane15.
Malariakontrolinterventioner, der kombinerer vektorkontrolstrategier og brugen af effektive malarialægemidler, er blevet afgørende for bekæmpelsen af denne sygdom15. Med en stigning i parasit- og mygresistens øges behovet for identifikation af nye malariaforbindelser16. Derfor er in vivo-evalueringen af transmissionsblokerende forbindelser vigtig16. Efter udviklingen af sådanne effektive transmissionsblokerende lægemidler er SMFA blevet brugt til at vurdere, om disse forbindelser hæmmer den seksuelle udvikling af P. falciparum i Anopheles-myggen 17,18,19. Dette assay har fået anerkendelse siden 1970-1980'erne som guldstandarden til evaluering af transmissionsblokering20,21. Dette assay giver et billigere alternativ end andre assays såsom RT-qPCR, som kræver specialudstyr. Desuden er der ikke behov for patienter til at udføre forsøgene. Dette assay involverer også tilvejebringelse af gametocytinduceret blod til kvindelige myg, som derefter dissekeres for at vurdere, om oocystudvikling er til stede21. Dette muliggør gametocytkvantificering og påvisning af deformerede oocyster på grund af forbindelserne22. For at en forbindelse skal klassificeres som effektiv, skal prævalensen (andelen af myg, der har mindst en oocyst i midgut) og antallet af oocyster (intensitet) i myggen midgut evalueres for at vurdere infektionsinhibering 17,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 for en illustration af protokollen. Etisk godkendelse blev opnået fra University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) til tilbagetrækning og brug af humant blod.
1. Gametocytkultur
BEMÆRK: Før oprettelsen af SMFA blev der udarbejdet en gametocytkultur ved University of Pretoria (se Reader et al.22 for den komplette protokol).
- Forbered en gametocytkultur, der består af trin V-gametocytter fra NF54-parasitstammen.
- Sørg for, at kulturens gametocytomi er mellem 1,5% og 2,5%, med en 50% hæmatokrit i A + mandligt serum, hvortil friske røde blodlegemer tilsættes.
- Adskil kulturen i forskellige kolber, og tilsæt 2 μM af hver forbindelse til hver respektive behandling 48 timer, før SMFA udføres. Lad kontrolgruppen være ubehandlet.
- Vurder gametocytkulturen kort før udførelse af SMFA for at sikre udryddelse af mandlige gameter med tilstedeværelsen af et 3: 1 kvindeligt: mandligt forhold.
2. Kunstig infektion af myg gennem SMFA
BEMÆRK: Biosikkerhed: inficerede myg skal anbringes i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) anlæg med begrænset adgang.
- Brug en mundaspirator til at placere 25 ufødte kvindelige An. gambiae myg i en 350 ml fodringskop. Gør det samme for hver behandlingskop og mærk kopperne tydeligt efter, om de skal bruges som kontrol- eller behandlingsgrupper. Vælg antallet af kopper pr. behandling i henhold til antallet af inkluderede tekniske replikater.
BEMÆRK: Kolonimyg mellem 5 og 7 dage gamle bruges i en typisk transmissionsblokerende forbindelsesevaluering. Sultende myg i 3-4 timer eller længere før blodfodring vil lette optagelsen af blod under SMFA. - Tilslut glasfødersystemet til vandbadet, og hold temperaturen ved 37 °C.
BEMÆRK: Glasføderen består af to arme, som er forbundet til silikoneslangen, som vandbadet er forbundet til (figur 2). Feederens hule struktur tillader vand at cirkulere gennem og vedligeholdelse af blodets temperatur. - Forbered koens tarm (eller syntetiske membran) ved at skylle den i ledningsvand og skære den i stykker, der er monteret til hver feeder. Dæk hver feeder og fastgør membranen med et elastikbånd.
BEMÆRK: Der var ikke behov for etisk godkendelse af tarmen, da den blev købt fra et lokalt slagteri, hvor den sælges til offentligheden til madlavning. - Placer infektionskopperne under fødefoderne, med membranen liggende oven på koppens net.
- Der tilsættes 1 ml gametocytinficeret blod til foderautomaterne i kontrolkopperne og gametocytinficeret blod tilsat forbindelse til hver tilsvarende foderblanding og kop.
- Lad myggene fodre i ca. 40 minutter med foderautomaterne afdækket.
BEMÆRK: Foder finder sted under insektforhold (25 ° C, 80% relativ fugtighed) i mørke. Diameteren af en feeder er ca. 13 mm. - Efter fodring skal du fjerne fødefoderne fra kopperne, skylle fødefoderne og behandle overskydende blod med hypochlorit.
- Fjern de ufødte myg fra koppen ved at slå alle myggene ned på is (i 1-2 minutter) og adskille de ufødte myg fra dem, der har taget et blodmåltid. Se efter hævede og røde maver (indikerer blod) for at skelne de fodrede, fuldt engorged myg fra de ufødte (figur 3).
- Placer infektionskopperne i biosikkerhedskammeret (supplerende figur S1) og giv hver kop en 10% sukkervandpude, der erstatter sukkervandet på alternative dage i 8-10 dage.
3. Forberedelse af inficerede myg
BEMÆRK: Denne del af protokollen finder sted i BSL2-infektionsrummet. Kun autoriseret, uddannet personale må komme ind i infektionsrummet, hvor inficerede myg er anbragt. Myg opbevares i modificerede kopper, der kun indeholder et indgangspunkt, som automatisk forsegles, når mundaspiratoren fjernes. Disse kopper placeres inde i en gennemsigtig, termoplastisk beholder for at forhindre flugt. Containeren er placeret i infektionsrummet bag et dobbeltdørssystem. Alle nødvendige protokoller skal være på plads for utilsigtet eksponering for inficerede myg (supplerende fil S1). Protokollerne er landespecifikke og afhænger af institutionens krav.
- På dag 8-10 efter infektionsfodring skal du slå de inficerede myg ned ved at lægge dem på is og overføre dem til mærkede rør med 70% ethanol (holde myggene i hver kontrol- og behandlingsgruppe adskilt).
- Sørg for, at alle myg er døde, inden de forlader infektionsrummet.
4. Dissektioner af inficerede myg
BEMÆRK: Denne del af protokollen udføres i laboratoriet.
- Overfør myggene til mærkede petriskåle foret med filterpapir, og hold kontrol- og testgrupperne adskilt.
- Anbring en dråbe fosfatbufferet saltvand (PBS) på et mikroskopglas (markeret i henhold til kontrol-/testgruppen), og overfør en individuel myg fra filterpapiret til PBS.
- Fjern midgut fra den immobiliserede, inficerede prøve ved at fastgøre myggens brystkasse med dissekeringsnålen, mens du trækker det 7. abdominale segment med tangen.
- Når tarmen er udsat og synlig, skal du kigge efter de malpighiske tubuli (figur 4A, B) for at skelne tarmen fra æggestokkene. Fjern det fra PBS, overfør det til en dråbe på 0,1% mercurochrome på et nyt mikroskopglas, og lad tarmen plette i 8-10 minutter.
- Efter farvning skal du placere en dæksel på den farvede tarm og se tarmen under lysfeltbelysning ved 20x-40x forstørrelse (figur 4C, D).
- Registrer tilstedeværelsen af og antallet af oocyster pr. midgut for hver kontrol- og behandlingsgruppe (supplerende fil S2).
- Beregn transmissionsblokerende aktivitet ved hjælp af ligning (1):
%TBA
(1)
hvor TBA = transmissionsblokerende aktivitet (reduktion i oocystprævalens) p = oocyst prævalens; C = kontrol; og T = behandling. - Beregn den transmissionsreducerende aktivitet ved hjælp af ligning (2):
%TRA =
(2)
hvor TRA = transmissionsreducerende aktivitet (reduktion i oocystintensitet); I = oocystintensitet; C = kontrol; og T = behandling.
BEMÆRK: TBA reduceres muligvis ikke væsentligt, men der kan observeres en betydelig forskel i TRA og omvendt. Dette afhænger af det kemiske materiale, der vurderes. - Udfør statistisk analyse ved hjælp af den ikke-parametriske t-test (Mann-Whitney).
(1)
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det samlede antal kontrolprøver, der blev dissekeret, var 47, med en gennemsnitlig prævalens på 89% og en intensitet på 9,5 oocyster pr. midgut (tabel 1, som tidligere offentliggjort22). For forbindelsen MMV1581558 nåede prøvestørrelsen i alt 42 prøver med en 36% oocystprævalens og en gennemsnitlig intensitet på 1,5 oocyster. Dette viser en reduktion i oocystprævalensen på 58% og en TRA på 82% på tværs af alle tre biologiske replikater (tabel 1).
Både %TRA og %TBA for MMV1581558 var over 50%; Således kan denne forbindelse betragtes som en potentiel kandidat til transmissionsblokering og reduktion. Den statistiske analyse for både intensitet og prævalens viste en signifikant forskel mellem kontrolgruppen og MMV1581558 (p < 0,0001) (tabel 1 og figur 5).
Figur 1: Illustration af det kunstige infektionssystem af Anopheles myg med Plasmodium falciparum gametocytter. Forkortelse: SMFA = standard membranfodringsassay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Membranfodringssystem med vand, der cirkulerer gennem glasfødere og silikonerør for at regulere temperaturen i gametocytkulturen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fuldt opsvulmet Anopheles kvinde efter et blodmåltid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Midgut af Anopheles kvinde. (A) Med Malpighian tubuli; B) med æggestokke C) med Plasmodium falciparum oocyst og (D) uinficeret midgut. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Statistisk oversigt over oocystintensitet mellem kontrolgruppen (n = 47) og forbindelsen MMV1581558 (n = 42). Fejlbjælker, ±SE; stjerner angiver signifikant forskel (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Forkortelse: DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Antal reps. | Stikprøvens størrelse | Av. Udbredelse | Av. Intensitet/tarm | %TBA | %TRA | P-værdi prævalens | P-værdi Intensitet |
| Kontrol | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0.0001 | <0.0001 |
Tabel 1: Datasæt af et malariamiddel, MMV1581558, evalueret under tre biologiske replikater af standardmembranfodringsassayet. For hver kontrol- og testgruppe angives prøvestørrelsen (n) sammen med den gennemsnitlige oocystprævalens og intensitet pr. Midgut. Den transmissionsblokerende aktivitet og transmissionsreducerende aktivitet er angivet. Forkortelser: TBA = transmissionsblokerende aktivitet; TRA = transmissionsreducerende aktivitet.
Supplerende figur S1: Inficerede myg indeholdt i et kammer i insektets infektionsrum. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S1: Protokol for utilsigtet eksponering for inficerede myg. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S2: Optagelsesark for oocystprævalens og intensitet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at denne protokol skal udføres med succes, skal der lægges vægt på hvert trin, selvom det kan være en kedelig og besværlig proces. Et af de vigtigste trin er at sikre, at gametocytkulturen er af god kvalitet, og at den består af modne gametocytter med det korrekte forhold mellem mand og kvinde, inden SMFA23,24 startes. Under SMFA er det også afgørende at opretholde gametocytkulturen ved den korrekte temperatur for at forhindre mandlige gameter i at udslette, før de kommer ind i myggen. En anden faktor, der spiller en afgørende rolle i etableringen af en vellykket kunstig infektion, er at sikre, at hunmyggene er ivrige efter at tage et blodmåltid, da myggenes fodringsadfærd også i høj grad kan påvirke resultatet25. For at sikre, at kun fuldt fodrede myg dissekeres, efter at oocysterne har udviklet sig, er det vigtigt at fokusere på at fjerne alle ufødte myg fra hver kop, da dette i høj grad kan påvirke resultaterne. Midgut dissektion er et andet vigtigt skridt for at sikre, at der er nok prøver til rådighed til yderligere analyse. Midguts har en tendens til at rive, hvilket kan få indholdet af midgut til at sive ud. Et andet vigtigt skridt i denne protokol er farvning af midguts, hvilket er afgørende for påvisning og tælling af oocysterne under mikroskopet.
Nogle begrænsninger af metoden inkluderer myggenes lille prøvestørrelse, som kan påvirke nøjagtigheden og variansen af TRA-estimering20,26. Dette er for det meste resultatet af en lav fodringshastighed under SMFA. Da de fleste myggekolonier opretholdes på dyreblod, kan tilvejebringelsen af en gametocytinficeret human blodkultur i SMFA bidrage til den suboptimale fodringshastighed. Dette observeres også med tilsætning af visse forbindelser, som kan fungere som afstødningsmidler til myggene. Farvning af oocyster med mercurochrome har nogle ulemper, da det pletter andre strukturer inden for midgut27. Dette medfører dårlig synlighed af oocysterne og gør det udfordrende at tælle oocyster, hvilket påvirker resultaterne28. Modstridende resultater opstår også, når man sammenligner dem fra SFMA-analysen med alternative assays29,30. Desuden begrænser begrænsninger såsom tidsbegrænsninger og arbejdskrævende dissektioner behandling med høj kapacitet, når du bruger denne metode31. Antallet af gametocytter indtaget af myggene under denne kunstige infektionsproces viste sig også at være lavt i nogle tilfælde, hvilket muligvis påvirker oocystintensiteten32,33,34.
Andre alternative metoder er også blevet udviklet, herunder bioluminescensassays, hvor parasitlinjer, der udtrykker firefly luciferase, anvendes36. Selvom sidstnævnte metode øger gennemstrømningen af prøver, har den også sine egne begrænsninger, da sådanne parasitlinjer ikke kunne bruges til at vurdere overførslen af infektioner, der forekommer naturligt eller involverer vildtypeparasitter37. Andre metoder, der involverer polymerasekædereaktion (PCR), anvendes også i vid udstrækning. Selvom disse metoder øger følsomheden af oocystdetektion, er ikke alle fuldt kvantitative38,39,40. TaqMan qPCR-analysen er en anden lovende metode til påvisning af P. falciparum oocyster, og denne metode viste sig at kvantificere meget lavere niveauer af parasitæmi end mikroskopi41,42,43,44. Denne analyse kræver imidlertid dyrt udstyr og sonder. Desuden kan mulige ændringer i oocystmorfologi på grund af forbindelserne ikke påvises synligt under qPCR. Sammenlignet med disse metoder forbliver SFMA-metoden et værdifuldt værktøj til infektionsdetektion og sammensat evaluering, da de fleste af begrænsningerne ved denne metode er relativt lette at overvinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne kvittere for prof. Lyn-Mari Birkholtz og Dr. Janette Reader fra Institut for Biokemi, Genetik og Mikrobiologi, Institut for Bæredygtig Malariakontrol, ved University of Pretoria, til dyrkning og levering af gametocytkulturen. Parasitstammen blev opnået fra sidstnævnte afdeling (ikke en del af denne publikation). Institut for Naturvidenskab og Innovation (DSI) og Danmarks Grundforskningsfond (NRF); Sydafrikanske forskningsformænds initiativ (UID 64763 til LK og UID 84627 til LMB); NRF's praksisfællesskaber (UID-110666 til LMB og LK) og South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) anerkendes også for midler fra DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
- Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
- Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
- Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
- Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
- Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
- Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
- Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
- Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
- Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
- Oaks, S. C. Jr, Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. Malaria: Obstacles and Opportunities. , National Academic Press. ISBN 0-309-54389-4 (1991).
- Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
- Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
- Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
- Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. Boyd, M. F. , W.B. Saunders. Philadelphia. 608-697 (1949).
- Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
- Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
- Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
- Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission - An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
- Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
- Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
- Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
- Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
- Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
- Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
- Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
- Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
- vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
- van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
- Singh, M., et al. Plasmodium's journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
- Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
- Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
- Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
- Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
- Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
- Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
- Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
- Marquart, L., Baker, M., O'Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
- McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).
