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Immunology and Infection

एनोफिलीज मच्छर वैक्टर में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण का पता लगाने के लिए मानक झिल्ली खिला परख

Published: May 12, 2022 doi: 10.3791/63546
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Wits Research Institute for Malaria, School of Pathology, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2Centre for Emerging Zoonotic and Parasitic Diseases, National Institute for Communicable Diseases, National Health Laboratory Service

Summary

मानक झिल्ली खिला परख (एसएमएफए) को संभावित एंटीमलेरियल यौगिकों के मूल्यांकन और पहचान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है। इस कृत्रिम भोजन प्रणाली का उपयोग मच्छरों को संक्रमित करने के लिए किया जाता है ताकि प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी की तीव्रता और प्रसार पर ऐसे यौगिकों के प्रभावों का मूल्यांकन किया जा सके।

Abstract

मलेरिया दुनिया भर में सबसे विनाशकारी बीमारियों में से एक बना हुआ है और आज तक, अफ्रीकी क्षेत्र अभी भी दुनिया भर में सभी मामलों के 94% के लिए जिम्मेदार है। इस परजीवी रोग के लिए एक प्रोटोजोआ परजीवी, एक एनोफिलीज मच्छर वेक्टर और एक कशेरुक मेजबान की आवश्यकता होती है। एनोफिलीज जीनस में 500 से अधिक प्रजातियां शामिल हैं, जिनमें से 60 को परजीवी के वैक्टर के रूप में जाना जाता है। प्लाज्मोडियम परजीवी जीनस में 250 प्रजातियां होती हैं, और इनमें से 48 रोग संचरण में शामिल होती हैं। इसके अलावा, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी ने हाल के वर्षों में उप-सहारा अफ्रीका में अनुमानित 99.7% मलेरिया के मामलों में योगदान दिया है।

गैमेटोसाइट्स परजीवी के यौन चरण का हिस्सा बनते हैं और संक्रमित मानव मेजबान को खिलाने पर मादा मच्छर द्वारा निगला जाता है। मच्छर के भीतर परजीवी के आगे के विकास को मच्छर के मिडगट में अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों द्वारा बढ़ाया जाता है। यहां, मादा और नर युग्मकों का संलयन होता है, और गतिशील ओकिनेट्स की उत्पत्ति होती है। ऊकिनेट्स मच्छर के मिडगट उपकला में प्रवेश करते हैं, और परिपक्व ओकिनेट्स ओओसिस्ट बनाते हैं, जो बदले में, मोटाइल स्पोरोज़ोइट्स का उत्पादन करते हैं। ये स्पोरोज़ोइट्स मच्छर की लार ग्रंथियों में चले जाते हैं और इंजेक्शन लगाए जाते हैं क्योंकि मच्छर रक्त भोजन लेता है।

दवा की खोज के प्रयोजनों के लिए, मच्छरों को कृत्रिम रूप से मानक झिल्ली खिला परख (एसएमएफए) में गैमेटोसाइट-संक्रमित रक्त से संक्रमित किया गया था। मच्छर के भीतर संक्रमण का पता लगाने और / या एंटीमलेरियल यौगिकों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, मादा मच्छरों के मिडगट्स को संक्रमण के बाद हटा दिया गया था और मर्क्यूरोक्रोम के साथ दाग दिया गया था। इस विधि का उपयोग ओओसिस्ट प्रसार और तीव्रता के सटीक निर्धारण के लिए माइक्रोस्कोप के तहत ओओसिस्ट के दृश्य का पता लगाने को बढ़ाने के लिए किया गया था।

Introduction

मलेरिया, जिसे दुनिया भर में सबसे विनाशकारी बीमारियों में से एक के रूप में जाना जाता है, अभी भी कई देशों के लिए एक बड़ा खतरा है- विशेष रूप से अफ्रीकी क्षेत्र के भीतर- और दुनिया भर में लगभग 95% मामलों में योगदान देताहै 1. यह बीमारी एक प्रोटोजोआ परजीवी के कारण होती है और, इसके एनोफिलीज मच्छर वेक्टर के साथ, ये अपराधी मानव मेजबान को बहुत नुकसान पहुंचा सकते हैं2. अधिक विशेष रूप से, प्लास्मोडियम परजीवी जीनस की फाल्सीपेरम प्रजातियां उप-सहारा अफ्रीका में अनुमानित 99% मलेरिया के मामलों के लिए जिम्मेदार हैं1. इसके अलावा, कई प्रमुख एनोफिलीज मच्छर वैक्टर (सहित) ए गाम्बिया जाइल्स, एन अरबियन्सिस पैटन, एन कोलुज़ी कोएट्ज़ी और विल्करसन एसपीएन, और एन फनेस्टस जाइल्स) को विश्व स्तर पर परजीवी संचरण के 95% से अधिक के लिए दोषी ठहराया जा सकता है 3,4,5,6,7,8 . आदर्श परजीवी-वेक्टर साहचर्य स्थापित करने के लिए, मच्छर वेक्टर परजीवी के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए और इसे संचारित करने में सक्षम होना चाहिए9. इसके अलावा, वेक्टर और परजीवी दोनों को सही संक्रामक संयोजन बनाने के लिए भौतिक बाधाओं को दूर करना चाहिए- मच्छर वेक्टर परजीवी विकास को बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए, और परजीवी में मेजबान के रक्षा तंत्र10,11 को दूर करने की क्षमता होनी चाहिए।

फाल्सीपेरम परजीवी का यौन चरण गैमेटोसाइट्स, वेक्टर और परजीवी भागीदारों को जोड़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं12. विवो में यौन विकास होता है, और गैमेटोसाइटोजेनेसिस परिपक्व गैमेटोसाइट्स के भेदभाव की प्रक्रिया का वर्णन करता है मोटाइल नर माइक्रोगैमेट्स और मादामैक्रोगैमेट्स 13. मच्छर के भीतर होने वाली एक अन्य प्रक्रिया एक्सफ्लैगलेशन है- वह प्रक्रिया जिसके दौरान नर गैमेटोसाइट युग्मकों में बदल जाता है और रक्त भोजन11 के दौरान ली गई लाल रक्त कोशिकाओं से उभरता है। एक्सफ्लैगलेशन प्रक्रिया को आगे मच्छर मिडगट14 के वातावरण में अनुकूल परिवर्तन द्वारा बढ़ाने का सुझाव दिया जाता है। एक्सफ्लैगलेशन के बाद, नर और मादा युग्मकों के संलयन से एक युग्मनज बनता है13. युग्मनज से, एक मोटाइल ऊकिनेट उत्पन्न होता है और रक्त भोजन से मच्छर मिडगट13 के उपकला में जाता है। यहां, ऊकिनेट परिपक्व हो जाता है, और एक ओओसिस्ट बनता है, जो बदले में, मोटाइल स्पोरोज़ोइट्स13,15 का उत्पादन करता है। स्पोरोज़ोइट्स तब मच्छर लार ग्रंथियों में चले जाते हैं और, जैसा कि मच्छर अपने मेजबान से रक्त भोजन लेता है, इन स्पोरोज़ोइट्स को मेजबान के रक्तप्रवाह15 में इंजेक्ट किया जाता है।

मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेप, वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों और प्रभावी मलेरियारोधी दवाओं का उपयोग, इस बीमारी का मुकाबला करने में महत्वपूर्ण हो गयाहै। परजीवी और मच्छर प्रतिरोध में वृद्धि के साथ, उपन्यास एंटीमलेरियल यौगिकों की पहचान के लिए तात्कालिकता बढ़ रही है16. इसलिए, संचरण-अवरुद्ध यौगिकों का विवो मूल्यांकन महत्वपूर्ण है16. इस तरह के प्रभावी संचरण-अवरुद्ध दवाओं के विकास के बाद, एसएमएफए का उपयोग यह आकलन करने के लिए किया गया है कि क्या ये यौगिक एनोफिलीज मच्छर17,18,19 में पी फाल्सीपेरम के यौन विकास को रोकते हैं। इस परख ने 1970-1980 के दशक के बाद से20,21 को अवरुद्ध करने वाले ट्रांसमिशन के मूल्यांकन के लिए स्वर्ण मानक के रूप में मान्यता प्राप्त की है। यह परख आरटी-क्यूपीसीआर जैसे अन्य परखों की तुलना में एक सस्ता विकल्प प्रदान करता है, जिसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रयोगों को निष्पादित करने के लिए किसी भी रोगी की आवश्यकता नहीं है। इस परख में मादा मच्छरों को गैमेटोसाइट-प्रेरित रक्त का प्रावधान भी शामिल है, जिसे तब यह मूल्यांकन करने के लिए विच्छेदित किया जाता है कि क्या ओओसिस्ट विकास मौजूद है21. यह यौगिकों के कारण गैमेटोसाइट परिमाणीकरण और विकृत ओओसिस्ट का पता लगाने की अनुमति देताहै 22. एक यौगिक को प्रभावी के रूप में वर्गीकृत करने के लिए, प्रसार (मच्छरों का अनुपात जो मिडगट में कम से कम एक ओओसिस्ट को बंद कर देता है) और मच्छर मिडगट में ओओसिस्ट (तीव्रता) की संख्या का मूल्यांकन संक्रमण निषेध17,21,22 का आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए।

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Protocol

प्रोटोकॉल के एक चित्रण के लिए चित्रा 1 का संदर्भ लें। मानव रक्त की निकासी और उपयोग के लिए प्रिटोरिया स्वास्थ्य विज्ञान आचार समिति (506/2018) विश्वविद्यालय से नैतिक मंजूरी प्राप्त की गई थी।

1. गैमेटोसाइट संस्कृति

नोट: एसएमएफए की स्थापना से पहले, प्रिटोरिया विश्वविद्यालय में एक गैमेटोसाइट संस्कृति तैयार की गई थी (पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए रीडर एट अल 22 देखें)।

  1. एक गैमेटोसाइट संस्कृति तैयार करें जिसमें एनएफ 54 परजीवी तनाव से चरण वी गैमेटोसाइट्स होते हैं।
  2. सुनिश्चित करें कि संस्कृति का गैमेटोसाइटमिया 1.5% और 2.5% के बीच है, ए + पुरुष सीरम में 50% हेमटोक्रिट के साथ, जिसमें ताजा लाल रक्त कोशिकाओं को जोड़ा जाता है।
  3. संस्कृति को अलग-अलग फ्लास्क में अलग करें और एसएमएफए का संचालन करने से 48 घंटे पहले प्रत्येक संबंधित उपचार के लिए प्रत्येक यौगिक के 2 μM जोड़ें। नियंत्रण समूह अनुपचारित छोड़ दें।
  4. 3: 1 महिला: पुरुष अनुपात की उपस्थिति के साथ, पुरुष युग्मकों के निष्कासन को सुनिश्चित करने के लिए एसएमएफए का संचालन करने से कुछ समय पहले गैमेटोसाइट संस्कृति का आकलन करें।

2. एसएमएफए के माध्यम से मच्छरों का कृत्रिम संक्रमण

नोट: जैव सुरक्षा: संक्रमित मच्छरों को प्रतिबंधित पहुंच के साथ जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) सुविधा में रखा जाना चाहिए।

  1. मुंह एस्पिरेटर का उपयोग करके, 25 अनफेड मादा ए गैम्बिया मच्छरों को 350 एमएल फीडिंग कप में रखें। प्रत्येक उपचार कप के लिए भी ऐसा ही करें और कप को स्पष्ट रूप से लेबल करें कि क्या उन्हें नियंत्रण या उपचार समूहों के रूप में उपयोग किया जाना है। शामिल तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या के अनुसार प्रति उपचार कप की संख्या चुनें।
    नोट: 5 से 7 दिनों के बीच कॉलोनी मच्छरों का उपयोग एक विशिष्ट संचरण-अवरुद्ध यौगिक मूल्यांकन में किया जाता है। रक्त खिलाने से पहले 3-4 घंटे या उससे अधिक समय तक मच्छरों को भूखा रखने से एसएमएफए के दौरान रक्त के उत्थान की सुविधा होगी।
  2. ग्लास फीडर सिस्टम को पानी के स्नान से कनेक्ट करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    नोट: ग्लास फीडर में दो हथियार होते हैं, जो सिलिकॉन टयूबिंग से जुड़े होते हैं जिससे पानी का स्नान जुड़ा होता है (चित्रा 2)। फीडर की खोखली संरचना पानी को रक्त के तापमान के माध्यम से प्रसारित करने और रखरखाव करने की अनुमति देती है।
  3. गाय की आंत (या सिंथेटिक झिल्ली) को नल के पानी में कुल्ला करके तैयार करें और इसे टुकड़ों में काट लें जो प्रत्येक फीडर के लिए फिट हैं। प्रत्येक फीडर को कवर करें और झिल्ली को लोचदार बैंड के साथ जकड़ें।
    नोट: आंत के लिए कोई नैतिक निकासी की आवश्यकता नहीं थी, क्योंकि इसे एक स्थानीय कसाई से खरीदा गया था, जहां इसे भोजन तैयार करने के लिए जनता को बेचा जाता है।
  4. फीडर के नीचे संक्रमण कप रखें, झिल्ली कप के जाल के ऊपर बिछाएं।
  5. प्रत्येक संबंधित यौगिक फीडर और कप में अतिरिक्त यौगिक के साथ नियंत्रण कप और गैमेटोसाइट-संक्रमित रक्त के फीडरों में 1 एमएल गैमेटोसाइट-संक्रमित रक्त जोड़ें।
  6. मच्छरों को फीडर के साथ लगभग 40 मिनट के लिए खिलाने के लिए छोड़ दें।
    नोट: फीडिंग अंधेरे में कीटनाशक स्थितियों (25 डिग्री सेल्सियस, 80% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत होती है। एक फीडर का व्यास लगभग 13 मिमी है।
  7. खिलाने के बाद, कप से फीडर निकालें, फीडरों को कुल्लाएं, और हाइपोक्लोराइट के साथ अतिरिक्त रक्त का इलाज करें।
  8. सभी मच्छरों को बर्फ पर (1-2 मिनट के लिए) दस्तक देकर और रक्त भोजन लेने वालों से अनफेड मच्छरों को अलग करके कप से अनफेड मच्छरों को हटा दें। सूजन और लाल पेट (रक्त का संकेत) के लिए देखो खिलाया, पूरी तरह से उलझे हुए मच्छरों को अनफेड लोगों (चित्रा 3) से अलग करने के लिए।
  9. जैव सुरक्षा कक्ष (पूरक चित्रा एस 1) में संक्रमण कप रखें और प्रत्येक कप को 10% चीनी पानी पैड प्रदान करें, 8-10 दिनों के लिए वैकल्पिक दिनों में चीनी पानी की जगह।

3. संक्रमित मच्छरों की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा बीएसएल 2 संक्रमण कक्ष के भीतर होता है। केवल अधिकृत, प्रशिक्षित कर्मचारियों को संक्रमण कक्ष में प्रवेश करने की अनुमति है जहां संक्रमित मच्छरों को रखा जाता है। मच्छरों को संशोधित कपों में रखा जाता है जिसमें केवल एक प्रवेश बिंदु होता है, जो मुंह एस्पिरेटर को हटाने पर स्वचालित रूप से सील हो जाता है। इन कपों को भागने से रोकने के लिए एक पारदर्शी, थर्माप्लास्टिक कंटेनर के अंदर रखा जाता है। कंटेनर एक डबल-डोर सिस्टम के पीछे संक्रमण कक्ष में स्थित है। संक्रमित मच्छरों (पूरक फ़ाइल एस 1) के आकस्मिक संपर्क के लिए सभी आवश्यक प्रोटोकॉल जगह में होना चाहिए। प्रोटोकॉल देश-विशिष्ट हैं और संस्थान की आवश्यकताओं पर निर्भर करते हैं।

  1. संक्रमण-खिला के बाद 8-10 दिनों में, संक्रमित मच्छरों को बर्फ पर रखकर और उन्हें 70% इथेनॉल के साथ लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करके नीचे दस्तक दें (प्रत्येक नियंत्रण और उपचार समूह के मच्छरों को अलग रखते हुए)।
  2. संक्रमण कक्ष छोड़ने से पहले सुनिश्चित करें कि सभी मच्छर मर चुके हैं।

4. संक्रमित मच्छरों का विच्छेदन

नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा प्रयोगशाला में आयोजित किया जाता है।

  1. नियंत्रण और परीक्षण समूहों को अलग रखते हुए, फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध पेट्री व्यंजन लेबल करने के लिए मच्छरों को स्थानांतरित करें।
  2. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) की एक बूंद को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें (नियंत्रण / परीक्षण समूह के अनुसार चिह्नित) और फिल्टर पेपर से पीबीएस में एक व्यक्तिगत मच्छर को स्थानांतरित करें।
  3. संदंश के साथ 7पेट खंड खींचने, विदारक सुई के साथ मच्छर के वक्ष पिन करके स्थिर, संक्रमित नमूने से मिडगट निकालें।
  4. आंत को उजागर और दृश्यमान होने के साथ, अंडाशय से आंत को अलग करने के लिए माल्पीघियन नलिकाओं (चित्रा 4 ए, बी) की तलाश करें। इसे पीबीएस से निकालें, इसे एक नए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 0.1% मर्क्यूरोक्रोम की एक बूंद में स्थानांतरित करें, और आंत को 8-10 मिनट के लिए दागने के लिए छोड़ दें।
  5. धुंधला होने के बाद, दाग आंत पर एक कवरस्लिप रखें और 20x-40x आवर्धन (चित्रा 4 सी, डी) पर ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत आंत देखें।
  6. प्रत्येक नियंत्रण और उपचार समूह (पूरक फ़ाइल एस 2) के लिए मिडगट प्रति ओओसिस्ट की उपस्थिति और संख्या रिकॉर्ड करें।
  7. समीकरण (1) का उपयोग करके संचरण-अवरुद्ध गतिविधि की गणना करें:
    %TBA Equation 1 (1)
    जहां टीबीए = ट्रांसमिशन-अवरुद्ध गतिविधि (ओओसिस्ट प्रसार में कमी); पी = ओओसिस्ट प्रसार; सी = नियंत्रण; और टी = उपचार।
  8. समीकरण (2) का उपयोग करके संचरण को कम करने वाली गतिविधि की गणना करें:
    %TRA = Equation 2 (2)
    जहां टीआरए = ट्रांसमिशन-कम करने वाली गतिविधि (ओओसिस्ट तीव्रता में कमी); मैं = ओओसिस्ट तीव्रता; सी = नियंत्रण; और टी = उपचार।
    नोट: टीबीए को काफी कम नहीं किया जा सकता है, लेकिन टीआरए में एक महत्वपूर्ण अंतर देखा जा सकता है और इसके विपरीत। यह मूल्यांकन की जा रही रासायनिक सामग्री पर निर्भर है।
  9. गैर-पैरामीट्रिक टी-टेस्ट ( मान-व्हिटनी) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

विच्छेदित नियंत्रण नमूनों की कुल संख्या 47 थी, जिसमें औसतन 89% प्रसार और 9.5 ओओसिस्ट प्रति मिडगट की तीव्रता थी (तालिका 1, जैसा कि पहले22 प्रकाशित हुआ था)। यौगिक एमएमवी 1581558 के लिए, नमूना आकार 36% ओओसिस्ट प्रसार और 1.5 ओओसिस्ट की औसत तीव्रता के साथ कुल 42 नमूनों तक पहुंच गया। यह सभी तीन जैविक प्रतिकृतियों (तालिका 1) में 58% की ओओसिस्ट प्रसार में कमी और 82% के टीआरए को दर्शाता है।

एमएमवी 1581558 के लिए% टीआरए और% टीबीए दोनों 50% से ऊपर थे; इस प्रकार, इस यौगिक को संचरण-अवरुद्ध और कमी के लिए एक संभावित उम्मीदवार के रूप में माना जा सकता है। तीव्रता और प्रसार दोनों के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण ने नियंत्रण समूह और एमएमवी 1581558 (पी < 0.0001) (तालिका 1 और चित्रा 5) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया।

Figure 1
चित्रा 1: प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम गैमेटोसाइट्स के साथ एनोफिलीज मच्छरों की कृत्रिम संक्रमण प्रणाली का चित्रण। संक्षिप्त नाम: एसएमएफए = मानक झिल्ली खिला परख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: गैमेटोसाइट संस्कृति के तापमान को विनियमित करने के लिए ग्लास फीडर और सिलिकॉन ट्यूबों के माध्यम से घूमने वाले पानी के साथ झिल्ली खिला प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: रक्त भोजन के बाद पूरी तरह से एनोफिलीज मादा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एनोफिलीज मादा का मिडगट( ए) माल्पीघियन नलिकाओं के साथ; (बी) अंडाशय के साथ; (सी) प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम ओओसिस्ट के साथ; और (डी) असंक्रमित मिडगट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण समूह (एन = 47) और यौगिक एमएमवी 1581558 (एन = 42) के बीच ओओसिस्ट तीव्रता का सांख्यिकीय सारांश। त्रुटि सलाखों, ±एसई; तारांकन महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है (एनएस पी > 0.05, **** पी < 0.0001)। संक्षिप्त नाम: डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक प्रतिनिधि की संख्या। नमूना आकार एवी. प्रचलन एवी तीव्रता / %TBA %TRA पी-वैल्यू प्रचलन पी-मान तीव्रता
नियंत्रण 3 47 89% 9.5
एमएमवी 1581558 3 42 36% 1.5 58% 82% <0.0001 <0.0001

तालिका 1: मानक झिल्ली खिला परख के तीन जैविक प्रतिकृतियों के दौरान मूल्यांकन किए गए एक एंटीमलेरियल यौगिक, एमएमवी 1581558 का डेटासेट। प्रत्येक नियंत्रण और परीक्षण समूह के लिए, नमूना आकार (एन) का संकेत दिया जाता है, साथ ही औसत ओओसिस्ट प्रसार और प्रति मिडगट तीव्रता के साथ। ट्रांसमिशन-अवरुद्ध गतिविधि और संचरण-कम करने वाली गतिविधि का संकेत दिया जाता है। संक्षिप्त नाम: टीबीए = ट्रांसमिशन-अवरुद्ध गतिविधि; टीआरए = ट्रांसमिशन-कम करने वाली गतिविधि।

पूरक चित्रा एस 1: संक्रमित मच्छर कीटनाशक के संक्रमण कक्ष में एक कक्ष के भीतर निहित हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल एस 1: संक्रमित मच्छरों के आकस्मिक जोखिम के लिए प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल एस 2: ओओसिस्ट प्रसार और तीव्रता के लिए रिकॉर्डिंग शीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए, प्रत्येक चरण पर ध्यान दिया जाना चाहिए, भले ही यह एक थकाऊ और श्रमसाध्य प्रक्रिया हो। सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि गैमेटोसाइट संस्कृति अच्छी गुणवत्ता की है और इसमें एसएमएफए23,24 शुरू करने से पहले सही पुरुष: महिला अनुपात के साथ परिपक्व गैमेटोसाइट्स शामिल हैं। एसएमएफए के दौरान, मच्छर में प्रवेश करने से पहले नर युग्मकों को बाहर निकालने से रोकने के लिए गैमेटोसाइट संस्कृति को सही तापमान पर बनाए रखना भी महत्वपूर्ण है। एक अन्य कारक जो एक सफल कृत्रिम संक्रमण की स्थापना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, यह सुनिश्चित करना है कि मादा मच्छर रक्त भोजन लेने के लिए उत्सुक हैं क्योंकि मच्छरों का खिला व्यवहार भी परिणाम को बहुत प्रभावित कर सकताहै। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ओओसिस्ट विकसित होने के बाद केवल पूरी तरह से खिलाए गए मच्छरों को विच्छेदित किया जाता है, प्रत्येक कप से सभी अनफेड मच्छरों को हटाने पर ध्यान केंद्रित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह परिणामों को बहुत प्रभावित कर सकता है। मिडगट विच्छेदन यह सुनिश्चित करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है कि आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूने उपलब्ध हैं। मिडगट्स में फाड़ने की प्रवृत्ति होती है, जिससे मिडगट की सामग्री बाहर निकल सकती है। इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम माइक्रोस्कोप के तहत ओओसिस्ट का पता लगाने और गिनती के लिए महत्वपूर्ण है, जो मिडगट्स का धुंधला होना है।

विधि की कुछ सीमाओं में मच्छरों का छोटा नमूना आकार शामिल है, जो टीआरए अनुमान20,26 की सटीकता और विचरण को प्रभावित कर सकता है। यह ज्यादातर एसएमएफए के दौरान कम खिला दर का परिणाम है। चूंकि अधिकांश मच्छर कॉलोनियों को जानवरों के रक्त पर बनाए रखा जाता है, इसलिए एसएमएफए में गैमेटोसाइट-संक्रमित मानव रक्त संस्कृति का प्रावधान उप-इष्टतम भोजन दर में योगदान दे सकता है। यह कुछ यौगिकों के अलावा भी मनाया जाता है, जो मच्छरों के लिए रिपेलेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं। मर्क्यूरोक्रोम के साथ धुंधला ओओसिस्ट में कुछ कमियां हैं क्योंकि यह मिडगट27 के भीतर अन्य संरचनाओं को दाग देता है। यह ओओसिस्ट की खराब दृश्यता का कारण बनता है और गिनती ओओसिस्ट को चुनौतीपूर्ण बनाता है, परिणाम28 को प्रभावित करता है। एसएफएमए परख से वैकल्पिक परख29,30 तक उन लोगों की तुलना करते समय परस्पर विरोधी परिणाम भी उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, समय की कमी और श्रम-गहन विच्छेदन जैसी सीमाएं इस पद्धति का उपयोग करते समय उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण को प्रतिबंधित करतीहैं 31. इस कृत्रिम संक्रमण प्रक्रिया के दौरान मच्छरों द्वारा निगला गया गैमेटोसाइट्स की संख्या भी कुछ मामलों में कम पाई गई, संभवतः ओओसिस्ट तीव्रता32,33,34 को प्रभावित करती है।

अन्य वैकल्पिक विधियों को भी विकसित किया गया है, जिसमें बायोल्यूमिनेसेंस परख शामिल हैं, जिसमें जुगनू लूसिफेरेज़ को व्यक्त करने वाली परजीवी रेखाओं का उपयोग किया जाताहै। यद्यपि बाद की विधि नमूनों के थ्रूपुट को बढ़ाती है, लेकिन इसके अपने प्रतिबंध भी हैं, क्योंकि इस तरह की परजीवी लाइनों का उपयोग स्वाभाविक रूप से होने वाले संक्रमणों के संचरण का आकलन करने के लिए नहीं किया जा सकता है या जंगली प्रकार के परजीवीशामिल हैं 37. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) को शामिल करने वाले अन्य तरीकों का भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यद्यपि ये विधियां ओओसिस्ट डिटेक्शन की संवेदनशीलता को बढ़ाती हैं, लेकिन सभी पूरी तरह से मात्रात्मक38,39,40 नहीं हैं। ताकमैन क्यूपीसीआर परख पी फाल्सीपेरम ओओसिस्ट का पता लगाने के लिए एक और आशाजनक तरीका है, और यह विधि माइक्रोस्कोपी41,42,43,44 की तुलना में परजीवीमिया के बहुत कम स्तर को मापने के लिए पाई गई थी। हालांकि, इस परख के लिए महंगे उपकरण और जांच की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यौगिकों के कारण ओओसिस्ट आकृति विज्ञान में संभावित परिवर्तनक्यूपीसीआर के दौरान स्पष्ट रूप से पता नहीं लगाया जा सकता है। इन विधियों की तुलना में, एसएफएमए विधि संक्रमण का पता लगाने और यौगिक मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनी हुई है क्योंकि इस विधि की अधिकांश सीमाओं को दूर करना अपेक्षाकृत आसान है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रोफ को स्वीकार करना चाहते हैं। जेनेट रीडर जैव रसायन, आनुवंशिकी और सूक्ष्म जीव विज्ञान विभाग, सतत मलेरिया नियंत्रण संस्थान, प्रिटोरिया विश्वविद्यालय में, गैमेटोसाइट संस्कृति की संवर्धन और आपूर्ति के लिए। परजीवी तनाव बाद के विभाग (इस प्रकाशन का हिस्सा नहीं) से प्राप्त किया गया था। विज्ञान और नवाचार विभाग (डीएसआई) और राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ); दक्षिण अफ्रीकी अनुसंधान अध्यक्ष पहल (एलके के लिए यूआईडी 64763 और एलएमबी के लिए यूआईडी 84627); एनआरएफ कम्युनिटीऑफ प्रैक्टिस (यूआईडी एलएमबी और एलके के 110666); और दक्षिण अफ्रीकी चिकित्सा अनुसंधान परिषद रणनीतिक स्वास्थ्य नवाचार साझेदारी (एसएचआईपी) को भी डीएसआई से धन के लिए स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine intestine/ Butchery
Compound MMV1581558 MMV Pandemic response box
Dissecting needles WRIM Custom made
falcon tube Lasec
Glass feeders Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0) Graphpad
Mercurochrome Merck (Sigma-Aldrich) 129-16-8
Microscope slides Merch (Sigma-Aldrich) S8902
Parafilm Cleansafe
PBS tablets ThermoFisher Scientific BP2944
Perspex biosafety cabinet Wits University Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL) Plastic Land

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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