Summary
El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .
Abstract
La malaria sigue siendo una de las enfermedades más devastadoras en todo el mundo y, hasta la fecha, la región africana sigue siendo responsable del 94% de todos los casos en todo el mundo. Esta enfermedad parasitaria requiere un parásito protozoario, un mosquito vector Anopheles y un huésped vertebrado. El género Anopheles comprende más de 500 especies, de las cuales 60 son conocidas como vectores del parásito. El género del parásito Plasmodium consta de 250 especies, y 48 de ellas están involucradas en la transmisión de enfermedades. Además, el parásito Plasmodium falciparum ha contribuido a un estimado del 99,7% de los casos de malaria en el África subsahariana en los últimos años.
Los gametocitos forman parte de la etapa sexual del parásito y son ingeridos por el mosquito hembra al alimentarse de un huésped humano infectado. El desarrollo adicional del parásito dentro del mosquito se ve reforzado por las condiciones ambientales favorables en el intestino medio del mosquito. Aquí, tiene lugar la fusión de los gametos femeninos y masculinos, y se originan los ookinetes móviles. Los ookinetes entran en el epitelio del intestino medio del mosquito, y los ookinetes maduros forman ooquistes, que, a su vez, producen esporozoítos móviles. Estos esporozoítos migran a las glándulas salivales del mosquito y se inyectan cuando un mosquito toma una comida de sangre.
Para fines de descubrimiento de fármacos, los mosquitos se infectaron artificialmente con sangre infectada con gametocitos en el ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA). Para detectar la infección dentro del mosquito y/o para evaluar la eficacia de los compuestos antipalúdicos, los intestinos medios de los mosquitos hembra se eliminaron después de la infección y se tiñeron con mercurocromo. Este método se utilizó para mejorar la detección visual de ooquistes bajo el microscopio para la determinación precisa de la prevalencia e intensidad del ooquiste.
Introduction
La malaria, conocida como una de las enfermedades más destructivas del mundo, todavía representa una gran amenaza para varios países, especialmente aquellos dentro de la región africana, y contribuye a aproximadamente el 95% de los casos en todo el mundo1. Esta enfermedad es causada por un parásito protozoario y, junto con su mosquito vector Anopheles, estos culpables pueden causar un gran daño al huésped humano2. Más específicamente, la especie falciparum del género parásito Plasmodium es responsable de aproximadamente el 99% de los casos de malaria en el África subsahariana1. Además de esto, varios vectores principales del mosquito Anopheles (incluidos An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. y An. funestus Giles) podrían ser culpados por más del 95% de la transmisión de parásitos a nivel mundial 3,4,5,6,7,8 . Para que se establezca la compañía ideal parásito-vector, el mosquito vector debe ser susceptible al parásito y ser capaz de transmitirlo9. Además, tanto el vector como el parásito deben superar las barreras físicas para formar la combinación infectiva perfecta: el mosquito vector debe ser capaz de mantener el desarrollo del parásito y el parásito debe tener la capacidad de superar los mecanismos de defensa del huésped10,11.
Los gametocitos, la etapa sexual del parásito P. falciparum, juegan un papel crucial en la conexión del vector y los socios parásitos12. El desarrollo sexual tiene lugar in vivo, y la gametocitogénesis describe el proceso de diferenciación de gametocitos maduros en microgametos masculinos móviles y macrogametos femeninos13. Otro proceso que tiene lugar dentro del mosquito es la exflagelación, el proceso durante el cual el gametocito masculino se transforma en gametos y emerge de los glóbulos rojos absorbidos durante una comida de sangre11. Se sugiere además que el proceso de exflagelación se vea reforzado por un cambio favorable en el entorno del intestino medio del mosquito14. Después de la exflagelación, un cigoto se forma por la fusión de los gametos masculino y femenino13. Del cigoto, surge un ookinete móvil que se mueve de la harina de sangre al epitelio del intestino medio del mosquito13. Aquí, el ookinete madura y se forma un ooquiste, que, a su vez, produce esporozoítos móviles13,15. Los esporozoítos luego migran a las glándulas salivales del mosquito y, a medida que el mosquito toma una comida de sangre de su huésped, estos esporozoítos se inyectan en el torrente sanguíneo del huésped15.
Las intervenciones de control de la malaria, que combinan estrategias de control de vectores y el uso de medicamentos antipalúdicos eficaces, se han vuelto cruciales para combatir esta enfermedad15. Con un aumento de la resistencia a los parásitos y mosquitos, la urgencia de la identificación de nuevos compuestos antipalúdicos está aumentando16. Por lo tanto, la evaluación in vivo de los compuestos bloqueadores de la transmisiónes importante 16. Después del desarrollo de tales fármacos eficaces bloqueadores de la transmisión, el SMFA se ha utilizado para evaluar si estos compuestos inhiben el desarrollo sexual de P. falciparum en el mosquito Anopheles 17,18,19. Este ensayo ha ganado reconocimiento desde los años 1970-1980 como el estándar de oro para evaluar el bloqueo de la transmisión20,21. Este ensayo proporciona una alternativa más barata que otros ensayos como RT-qPCR, que requiere equipo especializado. Además, no se necesitan pacientes para ejecutar los experimentos. Este ensayo también implica la provisión de sangre inducida por gametocitos a mosquitos hembra, que luego se diseccionan para evaluar si el desarrollo de ooquistes está presente21. Esto permite la cuantificación de gametocitos y la detección de ooquistes deformados debido a los compuestos22. Para que un compuesto sea clasificado como efectivo, la prevalencia (la proporción de mosquitos que albergan al menos un ooquiste en el intestino medio) y el número de ooquistes (intensidad) en el intestino medio del mosquito deben ser evaluados para evaluar la inhibición de la infección 17,21,22.
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Protocol
Consulte la figura 1 para obtener una ilustración del protocolo. Se obtuvo la autorización ética del Comité de Ética de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pretoria (506/2018) para la extracción y el uso de sangre humana.
1. Cultura de gametocitos
NOTA: Antes de establecer el SMFA, se preparó un cultivo de gametocitos en la Universidad de Pretoria (ver Reader et al.22 para el protocolo completo).
- Preparar un cultivo de gametocitos que consista en gametocitos en estadio V de la cepa del parásito NF54.
- Asegurar que la gametocitemia del cultivo esté entre el 1,5% y el 2,5%, con un hematocrito del 50% en suero masculino A+, al que se añaden glóbulos rojos frescos.
- Separar el cultivo en diferentes matraces y añadir 2 μM de cada compuesto para cada tratamiento respectivo 48 h antes de realizar el AMGN. Deje el grupo de control sin tratar.
- Evaluar el cultivo de gametocitos poco antes de realizar el AMAF para asegurar la exflagelación de gametos masculinos, con presencia de una relación hembra:macho de 3:1.
2. Infección artificial de mosquitos a través del SMFA
NOTA: Bioseguridad: los mosquitos infectados deben alojarse en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con acceso restringido.
- Usando un aspirador bucal, coloque 25 mosquitos hembra An. gambiae no alimentados en una taza de alimentación de 350 ml. Haga lo mismo para cada taza de tratamiento y etiquete las tazas claramente de acuerdo con si se van a usar como grupos de control o de tratamiento. Elija el número de tazas por tratamiento de acuerdo con el número de réplicas técnicas incluidas.
NOTA: Los mosquitos colonia entre 5 y 7 días de edad se utilizan en una evaluación típica del compuesto de bloqueo de la transmisión. Matar de hambre a los mosquitos durante 3-4 h o más antes de la alimentación con sangre facilitará la absorción de sangre durante SMFA. - Conecte el sistema de alimentación de vidrio al baño de agua y mantenga la temperatura a 37 °C.
NOTA: El alimentador de vidrio consta de dos brazos, que están conectados al tubo de silicona al que está conectado el baño de agua (Figura 2). La estructura hueca del alimentador permite que el agua circule y mantenga la temperatura de la sangre. - Prepare el intestino de vaca (o membrana sintética) enjuagándolo con agua del grifo y córtelo en trozos que se ajusten a cada alimentador. Cubra cada alimentador y sujete la membrana con una banda elástica.
NOTA: No se necesitó autorización ética para el intestino, ya que se compró en una carnicería local, donde se vende al público para la preparación de alimentos. - Coloque las copas de infección debajo de los comederos, con la membrana colocada encima de la red de la taza.
- Agregue 1 ml de sangre infectada con gametocitos a los alimentadores de las copas de control y sangre infectada con gametocitos con compuesto agregado a cada comedero y taza compuestos correspondientes.
- Deje que los mosquitos se alimenten durante aproximadamente 40 minutos con los comederos descubiertos.
NOTA: La alimentación se realiza en condiciones insectarias (25 °C, 80% de humedad relativa) en la oscuridad. El diámetro de un alimentador es de aproximadamente 13 mm. - Después de la alimentación, retire los comederos de las tazas, enjuague los comederos y trate el exceso de sangre con hipoclorito.
- Retire los mosquitos no alimentados de la taza derribando todos los mosquitos en hielo (durante 1-2 minutos) y separando los mosquitos no alimentados de los que han tomado una comida de sangre. Busque abdómenes hinchados y rojos (que indican sangre) para distinguir los mosquitos alimentados y completamente hinchados de los no alimentados (Figura 3).
- Coloque las tazas de infección en la cámara de bioseguridad (Figura Suplementaria S1) y proporcione a cada taza una almohadilla de agua azucarada al 10%, reemplazando el agua azucarada en días alternos durante 8-10 días.
3. Preparación de mosquitos infectados
NOTA: Esta parte del protocolo tiene lugar dentro de la sala de infección BSL2. Solo el personal autorizado y capacitado puede ingresar a la sala de infección donde se alojan los mosquitos infectados. Los mosquitos se mantienen en vasos modificados que contienen solo un punto de entrada, que se sella automáticamente cuando se retira el aspirador bucal. Estas tazas se colocan dentro de un recipiente transparente y termoplástico para evitar el escape. El contenedor se encuentra en la sala de infección detrás de un sistema de doble puerta. Todos los protocolos necesarios deben estar en su lugar para la exposición accidental a mosquitos infectados (Archivo Suplementario S1). Los protocolos son específicos de cada país y dependen de los requisitos de la institución.
- En los días 8-10 después de la alimentación de la infección, derribe a los mosquitos infectados colocándolos en hielo y transfiriéndolos a tubos etiquetados con etanol al 70% (manteniendo separados los mosquitos de cada grupo de control y tratamiento).
- Asegúrese de que todos los mosquitos estén muertos antes de salir de la sala de infección.
4. Disecciones de mosquitos infectados
NOTA: Esta parte del protocolo se lleva a cabo en el laboratorio.
- Transfiera los mosquitos a placas de Petri etiquetadas forradas con papel de filtro, manteniendo separados los grupos de control y de prueba.
- Coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un portaobjetos de microscopio (marcado de acuerdo con el grupo de control/prueba) y transfiera un mosquito individual del papel de filtro al PBS.
- Extraer el intestino medio de la muestra infectada inmovilizada sujetando el tórax del mosquito con la aguja de disección mientras se tira del7º segmento abdominal con los fórceps.
- Con el intestino expuesto y visible, busque los túbulos de Malpighian (Figura 4A, B) para distinguir el intestino de los ovarios. Retírelo del PBS, transfiéralo a una gota de mercurocromo al 0,1% en un nuevo portaobjetos de microscopio y deje que el intestino se tiñe durante 8-10 minutos.
- Después de la tinción, coloque un cubreobjetos en el intestino teñido y vea el intestino bajo iluminación de campo claro con un aumento de 20x-40x (Figura 4C, D).
- Registre la presencia y el número de ooquistes por intestino medio para cada grupo de control y tratamiento (Archivo Suplementario S2).
- Calcula la actividad de bloqueo de transmisión usando la Ecuación (1):
%TBA
(1)
donde TBA = actividad de bloqueo de la transmisión (reducción de la prevalencia de ooquistes); p = prevalencia de ooquistes; C = control; y T = tratamiento. - Calcula la actividad reductora de la transmisión usando la ecuación (2):
%TRA =
(2)
donde TRA = actividad reductora de la transmisión (reducción de la intensidad del ooquiste); I = intensidad del ooquiste; C = control; y T = tratamiento.
NOTA: Es posible que la TBA no se reduzca significativamente, pero se puede observar una diferencia significativa en la TRA y viceversa. Esto depende del material químico que se evalúa. - Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t no paramétrica (Mann-Whitney).
(1)
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Representative Results
El número total de especímenes control disecados fue de 47, con una prevalencia promedio de 89% y una intensidad de 9,5 ooquistes por intestino medio (Tabla 1, como se publicó anteriormente22). Para el compuesto MMV1581558, el tamaño de la muestra alcanzó un total de 42 especímenes, con una prevalencia de ooquistes del 36% y una intensidad promedio de 1,5 ooquistes. Esto muestra una reducción en la prevalencia de ooquistes del 58% y un TRA del 82% en las tres réplicas biológicas (Tabla 1).
Tanto el %TRA como el %TBA para MMV1581558 fueron superiores al 50%; Por lo tanto, este compuesto podría considerarse como un candidato potencial para el bloqueo y la reducción de la transmisión. El análisis estadístico tanto para la intensidad como para la prevalencia mostró una diferencia significativa entre el grupo control y MMV1581558 (p < 0,0001) (Tabla 1 y Figura 5).
Figura 1: Ilustración del sistema de infección artificial de mosquitos Anopheles con gametocitos Plasmodium falciparum . Abreviatura: SMFA = ensayo de alimentación por membrana estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sistema de alimentación por membrana con agua que circula a través de los alimentadores de vidrio y tubos de silicona para regular la temperatura del cultivo de gametocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hembra de Anopheles completamente hinchada después de una comida de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Intestino medio de la hembra de Anopheles . a) Con túbulos de Malpighian; (B) con ovarios; (C) con ooquiste de Plasmodium falciparum ; y (D) intestino medio no infectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resumen estadístico de la intensidad del ooquiste entre el grupo control (n = 47) y el compuesto MMV1581558 (n = 42). Barras de error, ±SE; los asteriscos indican diferencia significativa (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Abreviatura: DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto | Número de repeticiones. | Tamaño de la muestra | Av. Prevalencia | Av. Intensidad/intestino | %TBA | %TRA | Prevalencia del valor p | Intensidad del valor p |
| Control | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0,0001 | <0,0001 |
Tabla 1: Conjunto de datos de un compuesto antipalúdico, MMV1581558, evaluado durante tres réplicas biológicas del ensayo de alimentación de membrana estándar. Para cada grupo de control y prueba, se indica el tamaño de la muestra (n), junto con la prevalencia e intensidad promedio de ooquistes por intestino medio. Se indican la actividad de bloqueo de la transmisión y la actividad reductora de la transmisión. Abreviaturas: TBA = actividad de bloqueo de transmisión; TRA = actividad reductora de la transmisión.
Figura suplementaria S1: Mosquitos infectados contenidos dentro de una cámara en la sala de infección del insectario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo Suplementario S1: Protocolo para la exposición accidental a mosquitos infectados. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo Suplementario S2: Hoja de registro para la prevalencia e intensidad del ooquiste. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para que este protocolo se ejecute con éxito, se debe prestar atención a cada paso, aunque pueda ser un proceso tedioso y laborioso. Uno de los pasos más importantes es asegurar que el cultivo de gametocitos sea de buena calidad y que esté formado por gametocitos maduros, con la proporción correcta macho:hembra, antes de iniciar el SMFA23,24. Durante el SMFA, también es crucial mantener el cultivo de gametocitos a la temperatura correcta para evitar que los gametos masculinos se exflagelen antes de entrar en el mosquito. Otro factor que juega un papel crucial en el establecimiento de una infección artificial exitosa es asegurar que los mosquitos hembra estén dispuestos a tomar una comida de sangre, ya que el comportamiento de alimentación de los mosquitos también puede influir en gran medida en el resultado25. Para garantizar que solo los mosquitos completamente alimentados se diseccionen después de que se hayan desarrollado los ooquistes, es fundamental centrarse en eliminar todos los mosquitos no alimentados de cada taza, ya que esto podría influir en gran medida en los resultados. La disección del intestino medio es otro paso importante para garantizar que haya suficientes muestras disponibles para su posterior análisis. Los intestinos medios tienen una tendencia a desgarrarse, lo que puede hacer que el contenido del intestino medio se desprenda. Otro paso importante en este protocolo es la tinción de los intestinos medios, que es crucial para la detección y el recuento de los ooquistes bajo el microscopio.
Algunas limitaciones del método incluyen el pequeño tamaño de la muestra de los mosquitos, que puede influir en la precisión y varianza de la estimación de TRA20,26. Esto es principalmente el resultado de una baja tasa de alimentación durante el SMFA. Como la mayoría de las colonias de mosquitos se mantienen con sangre animal, la provisión de un cultivo de sangre humana infectado con gametocitos en el SMFA podría contribuir a la tasa de alimentación subóptima. Esto también se observa con la adición de ciertos compuestos, que pueden actuar como repelentes para los mosquitos. La tinción de ooquistes con mercurocromo tiene algunos inconvenientes, ya que tiñe otras estructuras dentro del intestino medio27. Esto causa poca visibilidad de los ooquistes y hace que el conteo de ooquistes sea un desafío, afectando los resultados28. También surgen resultados contradictorios cuando se comparan los del ensayo SFMA con ensayos alternativos29,30. Además, limitaciones como las limitaciones de tiempo y las disecciones que requieren mucha mano de obra restringen el procesamiento de alto rendimiento cuando se utiliza este método31. El número de gametocitos ingeridos por los mosquitos durante este proceso de infección artificial también se encontró bajo en algunos casos, posiblemente afectando la intensidad del ooquiste32,33,34.
También se han desarrollado otros métodos alternativos, incluyendo ensayos de bioluminiscencia, en los que se utilizan líneas de parásitos que expresan luciferasa luciérnaga36. Aunque este último método aumenta el rendimiento de las muestras, también tiene sus propias restricciones, ya que tales líneas de parásitos no podrían ser utilizadas para evaluar la transmisión de infecciones que ocurren naturalmente o involucran parásitos de tipo silvestre37. Otros métodos que implican la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se utilizan ampliamente. Aunque estos métodos mejoran la sensibilidad de la detección de ooquistes, no todos son completamente cuantitativos38,39,40. El ensayo TaqMan qPCR es otro método prometedor para la detección de ooquistes de P. falciparum, y se encontró que este método cuantifica niveles mucho más bajos de parasitemia que la microscopía41,42,43,44. Este ensayo, sin embargo, requiere equipos y sondas costosas. Además, los posibles cambios en la morfología del ooquiste debido a los compuestos no se pueden detectar visiblemente durante la qPCR. En comparación con estos métodos, el método SFMA sigue siendo una herramienta valiosa para la detección de infecciones y la evaluación de compuestos, ya que la mayoría de las limitaciones de este método son relativamente fáciles de superar.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Prof. Lyn-Mari Birkholtz y la Dra. Janette Reader del Departamento de Bioquímica, Genética y Microbiología, Instituto para el Control Sostenible de la Malaria, en la Universidad de Pretoria, por cultivar y suministrar el cultivo de gametocitos. La cepa del parásito se obtuvo de este último departamento (no forma parte de esta publicación). El Departamento de Ciencia e Innovación (DSI) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF); Iniciativa de Cátedras de Investigación de Sudáfrica (UID 64763 a LK y UID 84627 a LMB); las Comunidades de Práctica de la NRF (UID 110666 a LMB y LK); y las Asociaciones de Innovación Estratégica en Salud (SHIP) del Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica también son reconocidas por los fondos del DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
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