Summary
Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .
Abstract
Le paludisme reste l’une des maladies les plus dévastatrices au monde et, à ce jour, la Région africaine est toujours responsable de 94% de tous les cas dans le monde. Cette maladie parasitaire nécessite un parasite protozoaire, un moustique vecteur anophèle et un hôte vertébré. Le genre Anopheles comprend plus de 500 espèces, dont 60 sont connues comme vecteurs du parasite. Le genre de parasites Plasmodium comprend 250 espèces, dont 48 sont impliquées dans la transmission de maladies. En outre, le parasite Plasmodium falciparum a contribué à environ 99,7% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne ces dernières années.
Les gamétocytes font partie du stade sexuel du parasite et sont ingérés par le moustique femelle lorsqu’il se nourrit d’un hôte humain infecté. Le développement ultérieur du parasite dans le moustique est renforcé par des conditions environnementales favorables dans l’intestin moyen du moustique. Ici, la fusion des gamètes femelles et mâles a lieu, et les oocinètes mobiles sont originaires. Les oocinètes pénètrent dans l’épithélium de l’intestin moyen du moustique et les oocinètes matures forment des oocystes, qui, à leur tour, produisent des sporozoïtes mobiles. Ces sporozoïtes migrent vers les glandes salivaires du moustique et sont injectés lorsqu’un moustique prend un repas de sang.
À des fins de découverte de médicaments, les moustiques ont été artificiellement infectés par du sang infecté par des gamétocytes dans le test standard d’alimentation par membrane (SMFA). Pour détecter l’infection chez le moustique et/ou évaluer l’efficacité des composés antipaludiques, l’intestin moyen des moustiques femelles a été enlevé après l’infection et a été coloré avec du mercurochrome. Cette méthode a été utilisée pour améliorer la détection visuelle des oocystes au microscope afin de déterminer avec précision la prévalence et l’intensité des oocystes.
Introduction
Le paludisme, connu comme l’une des maladies les plus destructrices au monde, constitue toujours une grande menace pour plusieurs pays, en particulier ceux de la région africaine, et contribue à environ 95% des cas dans le monde1. Cette maladie est causée par un parasite protozoaire et, avec son moustique vecteur Anopheles, ces coupables peuvent causer de grands dommages à l’hôte humain2. Plus précisément, l’espèce falciparum du genre parasite Plasmodium est responsable d’environ 99% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne1. En outre, plusieurs vecteurs majeurs de moustiques anophèles (y compris An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., et An. funestus Giles) pourraient être blâmés pour plus de 95% de la transmission du parasite dans le monde 3,4,5,6,7,8 . Pour que la compagnie parasite-vecteur idéale soit établie, le moustique vecteur doit être sensible au parasite et être capable de le transmettre9. En outre, le vecteur et le parasite doivent surmonter les barrières physiques pour former la combinaison infectieuse parfaite - le moustique vecteur doit être capable de soutenir le développement du parasite, et le parasite doit avoir la capacité de surmonter les mécanismes de défense de l’hôte10,11.
Les gamétocytes, le stade sexuel du parasite P. falciparum, jouent un rôle crucial dans la connexion des partenaires vecteurs et parasites12. Le développement sexuel a lieu in vivo, et la gamétocytogenèse décrit le processus de différenciation des gamétocytes matures en microgamètes mâles mobiles et macrogamètes femelles13. Un autre processus qui a lieu à l’intérieur du moustique est l’exflagellation - le processus au cours duquel le gamétocyte mâle se transforme en gamètes et émerge des globules rouges absorbés lors d’un repas de sang11. Le processus d’exflagellation est en outre suggéré d’être amélioré par un changement favorable dans l’environnement de l’intestin moyendu moustique 14. Après exflagellation, un zygote est formé par la fusion des gamètes mâle et femelle13. Du zygote, un oocinète mobile apparaît et se déplace du repas de sang à l’épithélium de l’intestin moyen du moustique13. Ici, l’oocinète mûrit et un oocyste se forme, qui, à son tour, produit des sporozoïtes mobiles13,15. Les sporozoïtes migrent ensuite vers les glandes salivaires du moustique et, comme le moustique prend un repas de sang de son hôte, ces sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine de l’hôte15.
Les interventions de lutte contre le paludisme, combinant des stratégies de lutte antivectorielle et l’utilisation de médicaments antipaludiques efficaces, sont devenues cruciales dans la lutte contre cette maladie15. Avec l’augmentation de la résistance aux parasites et aux moustiques, l’urgence d’identifier de nouveaux composés antipaludiques augmente16. Par conséquent, l’évaluation in vivo des composés bloquant la transmission est importante16. Après la mise au point de tels médicaments efficaces bloquant la transmission, le SMFA a été utilisé pour évaluer si ces composés inhibent le développement sexuel de P. falciparum chez le moustique anophèle 17,18,19. Ce test a été reconnu depuis les années 1970-1980 comme l’étalon-or pour évaluer le blocage de transmission20,21. Ce test offre une alternative moins chère que d’autres tests tels que la RT-qPCR, qui nécessite un équipement spécialisé. De plus, aucun patient n’est nécessaire pour exécuter les expériences. Ce test implique également l’apport de sang induit par les gamétocytes aux moustiques femelles, qui sont ensuite disséqués pour évaluer si le développement d’oocystes est présent21. Cela permet la quantification des gamétocytes et la détection des oocystes déformés à cause des composés22. Pour qu’un composé soit classé comme efficace, la prévalence (la proportion de moustiques qui hébergent au moins un oocyste dans l’intestin moyen) et le nombre d’oocystes (intensité) dans l’intestin moyen du moustique doivent être évalués pour évaluer l’inhibition de l’infection 17,21,22.
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Protocol
Reportez-vous à la figure 1 pour une illustration du protocole. L’autorisation éthique a été obtenue du Comité d’éthique des sciences de la santé de l’Université de Pretoria (506/2018) pour le prélèvement et l’utilisation de sang humain.
1. Culture de gamétocytes
NOTE: Avant la mise en place de la SMFA, une culture de gamétocytes a été préparée à l’Université de Pretoria (voir Reader et al.22 pour le protocole complet).
- Préparer une culture de gamétocytes composée de gamétocytes de stade V de la souche du parasite NF54.
- S’assurer que la gamétocytémie de la culture est comprise entre 1,5% et 2,5%, avec un hématocrite de 50% dans le sérum mâle A +, auquel des globules rouges frais sont ajoutés.
- Séparer la culture en différents flacons et ajouter 2 μM de chaque composé pour chaque traitement respectif 48 h avant de procéder à la SMFA. Laissez le groupe témoin non traité.
- Évaluer la culture des gamétocytes peu de temps avant la réalisation de l’AMSM pour assurer l’exflagellation des gamètes mâles, avec la présence d’un ratio femelle/mâle de 3:1.
2. Infection artificielle des moustiques par le biais de la SMFA
REMARQUE : Biosécurité : les moustiques infectés doivent être hébergés dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL2) à accès restreint.
- À l’aide d’un aspirateur buccal, placer 25 moustiques femelles An. gambiae non nourries dans une tasse d’alimentation de 350 mL. Faites de même pour chaque gobelet de traitement et étiquetez clairement les gobelets selon qu’ils doivent être utilisés comme groupe témoin ou groupe de traitement. Choisissez le nombre de tasses par traitement en fonction du nombre de répétitions techniques incluses.
REMARQUE: Les moustiques de la colonie âgés de 5 à 7 jours sont utilisés dans une évaluation typique du composé bloquant la transmission. Affamer les moustiques pendant 3-4 heures ou plus avant l’alimentation en sang facilitera l’absorption du sang pendant la SMFA. - Connectez le système d’alimentation en verre au bain-marie et maintenez la température à 37 °C.
REMARQUE : Le chargeur en verre se compose de deux bras reliés au tube en silicone auquel le bain-marie est connecté (Figure 2). La structure creuse de la mangeoire permet à l’eau de circuler et de maintenir la température du sang. - Préparez l’intestin de vache (ou la membrane synthétique) en le rinçant à l’eau du robinet et coupez-le en morceaux adaptés à chaque mangeoire. Couvrir chaque mangeoire et fixer la membrane avec une bande élastique.
REMARQUE: Aucune autorisation éthique n’était nécessaire pour l’intestin, car il a été acheté dans une boucherie locale, où il est vendu au public pour la préparation des aliments. - Placez les gobelets d’infection sous les mangeoires, la membrane reposant sur le filet de la tasse.
- Ajouter 1 mL de sang infecté par les gamétocytes aux mangeoires des gobelets témoins et du sang infecté par les gamétocytes avec un composé ajouté à chaque mangeoire et tasse de composé correspondant.
- Laissez les moustiques se nourrir pendant environ 40 minutes avec les mangeoires découvertes.
NOTE: L’alimentation a lieu dans des conditions insectifiantes (25 °C, 80% d’humidité relative) dans l’obscurité. Le diamètre d’un chargeur est d’environ 13 mm. - Après l’alimentation, retirez les mangeoires des tasses, rincez les mangeoires et traitez l’excès de sang avec de l’hypochlorite.
- Retirez les moustiques non nourris de la tasse en renversant tous les moustiques sur la glace (pendant 1-2 minutes) et en séparant les moustiques non nourris de ceux qui ont pris un repas de sang. Recherchez les abdomens enflés et rouges (indiquant du sang) pour distinguer les moustiques nourris et complètement engorgés des moustiques non nourris (Figure 3).
- Placez les gobelets d’infection dans la chambre de biosécurité (figure supplémentaire S1) et fournissez à chaque tasse un coussinet d’eau sucrée à 10%, en remplaçant l’eau sucrée un jour sur deux pendant 8 à 10 jours.
3. Préparation des moustiques infectés
REMARQUE: Cette partie du protocole se déroule dans la salle d’infection BSL2. Seul le personnel autorisé et formé est autorisé à entrer dans la salle d’infection où sont hébergés les moustiques infectés. Les moustiques sont conservés dans des tasses modifiées qui ne contiennent qu’un seul point d’entrée, qui se ferme automatiquement lorsque l’aspirateur buccal est retiré. Ces gobelets sont placés à l’intérieur d’un récipient en thermoplastique transparent pour empêcher toute fuite. Le conteneur est situé dans la salle d’infection derrière un système à double porte. Tous les protocoles nécessaires doivent être en place en cas d’exposition accidentelle à des moustiques infectés (dossier supplémentaire S1). Les protocoles sont spécifiques à chaque pays et dépendent des exigences de l’institution.
- Les jours 8 à 10 après l’infection, abattre les moustiques infectés en les plaçant sur de la glace et en les transférant dans des tubes étiquetés contenant 70% d’éthanol (en séparant les moustiques de chaque groupe témoin et de chaque groupe de traitement).
- Assurez-vous que tous les moustiques sont morts avant de quitter la salle d’infection.
4. Dissections de moustiques infectés
REMARQUE : Cette partie du protocole est effectuée en laboratoire.
- Transférez les moustiques dans des boîtes de Petri étiquetées doublées de papier filtre, en séparant les groupes de contrôle et de test.
- Placer une gouttelette de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur une lame de microscope (marquée selon le groupe témoin/test) et transférer un moustique individuel du papier filtre au PBS.
- Retirez l’intestin moyen de l’échantillon infecté immobilisé en épinglant le thorax du moustique avec l’aiguille à dissection tout en tirant le 7èmesegment abdominal avec la pince.
- L’intestin étant exposé et visible, recherchez les tubules de Malpighi (Figure 4A,B) pour distinguer l’intestin des ovaires. Retirez-le du PBS, transférez-le dans une gouttelette de mercurochrome à 0,1% sur une nouvelle lame de microscope et laissez l’intestin se colorer pendant 8 à 10 minutes.
- Après la coloration, placez une lamelle de couverture sur l’intestin taché et visualisez l’intestin sous éclairage en fond clair à un grossissement de 20x-40x (Figure 4C,D).
- Noter la présence et le nombre d’oocystes par intestin moyen pour chaque groupe témoin et groupe de traitement (dossier supplémentaire S2).
- Calculer l’activité de blocage de la transmission à l’aide de l’équation (1) :
%À confirmer
(1)
où TBA = activité de blocage de la transmission (réduction de la prévalence des oocystes); p = prévalence des oocystes; C = contrôle; et T = traitement. - Calculer l’activité de réduction de transmission à l’aide de l’équation (2) :
%TRA =
(2)
où TRA = activité de réduction de la transmission (réduction de l’intensité des oocystes); I = intensité de l’oocyste; C = contrôle; et T = traitement.
REMARQUE : Le TBA pourrait ne pas être réduit de manière significative, mais une différence significative pourrait être observée dans la TRA et vice versa. Cela dépend de la matière chimique évaluée. - Effectuer une analyse statistique à l’aide du test t non paramétrique (Mann-Whitney).
(1)
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Representative Results
Le nombre total d’échantillons témoins disséqués était de 47, avec une prévalence moyenne de 89 % et une intensité de 9,5 oocystes par intestin moyen (tableau 1, tel que publié précédemment22). Pour le composé MMV1581558, la taille de l’échantillon a atteint un total de 42 spécimens, avec une prévalence d’oocystes de 36% et une intensité moyenne de 1,5 oocystes. Cela montre une réduction de la prévalence des oocystes de 58% et une TRA de 82% dans les trois réplicats biologiques (tableau 1).
Les %TRA et %TBA pour MMV1581558 étaient supérieurs à 50 %; Ainsi, ce composé pourrait être considéré comme un candidat potentiel pour le blocage et la réduction de la transmission. L’analyse statistique de l’intensité et de la prévalence a montré une différence significative entre le groupe témoin et MMV1581558 (p < 0,0001) (tableau 1 et figure 5).
Figure 1 : Illustration du système d’infection artificielle des moustiques anophèles avec des gamétocytes à Plasmodium falciparum. Abréviation : SMFA = essai standard d’alimentation par membrane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Système d’alimentation par membrane avec de l’eau circulant à travers les mangeoires en verre et les tubes en silicone pour réguler la température de la culture des gamétocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Femelle anophèle complètement engorgée après un repas de sang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Intestin moyen d’anophèles femelles. (A) Avec des tubules de Malpighi; (B) avec des ovaires; C) avec l’oocyste de Plasmodium falciparum; et (D) intestin moyen non infecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résumé statistique de l’intensité des oocystes entre le groupe témoin (n = 47) et le composé MMV1581558 (n = 42). Barres d’erreur, ±SE; les astérisques indiquent une différence significative (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Abréviation : DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composé | Nombre de répétitions. | Taille de l’échantillon | Av. Prévalence | Av. Intensité/intestin | %À confirmer | %TRA | Prévalence de la valeur p | Valeur de p Intensité |
| Contrôle | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0,0001 | <0,0001 |
Tableau 1 : Ensemble de données d’un composé antipaludique, MMV1581558, évalué au cours de trois répétitions biologiques du test standard d’alimentation par membrane. Pour chaque groupe témoin et groupe d’essai, la taille de l’échantillon (n) est indiquée, ainsi que la prévalence et l’intensité moyennes des oocystes par intestin moyen. L’activité de blocage de la transmission et l’activité de réduction de la transmission sont indiquées. Abréviations : TBA = activité bloquant la transmission; TRA = activité de réduction de la transmission.
Figure supplémentaire S1 : Moustiques infectés contenus dans une chambre de la salle d’infection de l’insecte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire S1 : Protocole d’exposition accidentelle à des moustiques infectés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire S2 : Feuille d’enregistrement de la prévalence et de l’intensité des oocystes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Pour que ce protocole soit exécuté avec succès, une attention particulière doit être accordée à chaque étape, même s’il peut s’agir d’un processus fastidieux et laborieux. L’une des étapes les plus importantes est de s’assurer que la culture des gamétocytes est de bonne qualité et qu’elle est constituée de gamétocytes matures, avec le bon ratio mâle/femelle, avant de commencer le SMFA23,24. Pendant la SMFA, il est également crucial de maintenir la culture des gamétocytes à la bonne température pour éviter que les gamètes mâles ne s’exflagellent avant d’entrer dans le moustique. Un autre facteur qui joue un rôle crucial dans l’établissement d’une infection artificielle réussie est de s’assurer que les moustiques femelles sont désireuses de prendre un repas de sang, car le comportement alimentaire des moustiques peut également influencer considérablement le résultat25. Pour s’assurer que seuls les moustiques entièrement nourris sont disséqués après le développement des oocystes, il est essentiel de se concentrer sur l’élimination de tous les moustiques non nourris de chaque tasse, car cela pourrait grandement influencer les résultats. La dissection de l’intestin moyen est une autre étape importante pour s’assurer que suffisamment d’échantillons sont disponibles pour une analyse plus approfondie. Les intestins moyens ont tendance à se déchirer, ce qui peut provoquer un suintement du contenu de l’intestin moyen. Une autre étape importante de ce protocole est la coloration de l’intestin moyen, qui est cruciale pour la détection et le comptage des oocystes au microscope.
Certaines limites de la méthode comprennent la petite taille de l’échantillon des moustiques, ce qui peut influencer la précision et la variance de l’estimation TRA20,26. Ceci est principalement le résultat d’un faible taux d’alimentation pendant la SMFA. Comme la plupart des colonies de moustiques sont maintenues sur du sang animal, la fourniture d’une hémoculture humaine infectée par des gamétocytes dans la SMFA pourrait contribuer au taux d’alimentation sous-optimal. Ceci est également observé avec l’ajout de certains composés, qui peuvent agir comme répulsifs pour les moustiques. La coloration des oocystes avec du mercurochrome présente certains inconvénients car elle tache d’autres structures dans l’intestin moyen27. Cela provoque une mauvaise visibilité des oocystes et rend difficile le comptage des oocystes, affectant les résultats28. Des résultats contradictoires apparaissent également lorsque l’on compare ceux du test SFMA à d’autres dosages29,30. En outre, les limitations telles que les contraintes de temps et les dissections à forte intensité de main-d’œuvre limitent le traitement à haut débit lors de l’utilisation de cette méthode31. Le nombre de gamétocytes ingérés par les moustiques au cours de ce processus d’infection artificielle s’est également avéré faible dans certains cas, ce qui pourrait affecter l’intensité des oocystes32,33,34.
D’autres méthodes alternatives ont également été développées, y compris les tests de bioluminescence, dans lesquels des lignes parasitaires exprimant la luciférase de luciole sont utilisées36. Bien que cette dernière méthode augmente le débit des échantillons, elle a également ses propres restrictions, car ces lignées parasitaires ne pourraient pas être utilisées pour évaluer la transmission d’infections qui se produisent naturellement ou impliquent des parasites de type sauvage37. D’autres méthodes impliquant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) sont également largement utilisées. Bien que ces méthodes améliorent la sensibilité de la détection des oocystes, toutes ne sont pas entièrement quantitatives38,39,40. Le test TaqMan qPCR est une autre méthode prometteuse pour la détection des oocystes de P. falciparum, et cette méthode s’est avérée quantifier des niveaux beaucoup plus faibles de parasitémie que la microscopie41,42,43,44. Ce test, cependant, nécessite un équipement et des sondes coûteux. De plus, les changements possibles dans la morphologie des oocystes dus aux composés ne peuvent pas être détectés de manière visible lors de la qPCR. Par rapport à ces méthodes, la méthode SFMA reste un outil précieux pour la détection des infections et l’évaluation des composés, car la plupart des limites de cette méthode sont relativement faciles à surmonter.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercierProf. Lyn-Mari Birkholtz et le Dr Janette Reader du Département de biochimie, génétique et microbiologie de l’Institut de lutte durable contre le paludisme de l’Université de Pretoria pour la culture et la fourniture de la culture de gamétocytes. La souche parasitaire a été obtenue auprès de ce dernier département (ne faisant pas partie de cette publication). Le Département de la science et de l’innovation (DSI) et la Fondation nationale de la recherche (NRF); Initiative des chaires de recherche sud-africaines (UID 64763 à LK et UID 84627 à LMB); les communautés de pratique de la NRF (UID 110666 à LMB et LK); et le South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) sont également reconnus pour les fonds du DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
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