Summary
动脉肺循环的血管反应可以使用肺内动脉 （IPA） 和血管平滑肌细胞 （VSMC） 进行探索。本研究详细描述了IPA的分离以及用于研究对生理刺激的反应的血管松弛的方案。
Abstract
从大鼠肺分离的肺内动脉（IPA）和血管平滑肌细胞（VSMC）可用于研究血管收缩和血管松弛的潜在机制。分离IPA和VSMC后，可以在没有神经信号，激素，细胞因子等外在因素的情况下评估生理和病理条件下血管反应的特征。因此，IPA和VSMC是研究血管生理学/病理生理学以及各种实验研究的优秀模型，例如药物调节，膜片钳电生理分析，钙成像等。在这里，我们使用了一种分离IPA的技术来研究器官浴设置中的血管反应。通过腔内导线将IPA段安装在器官浴室上，并受到各种药物的刺激。使用等长力传感器和生理数据分析软件程序记录IPA血管张力的变化（即血管收缩和血管松弛）。我们实施了几种实验方案，可以调整用于研究血管松弛/血管收缩的机制，以研究植物化学或合成药物的药理活性。这些协议还可用于评估药物在调节各种疾病中的作用，包括肺动脉高压。IPA模型使我们能够研究浓度-反应曲线，这对于评估药物的药效学参数至关重要。
Introduction
肺脉管系统是一种低压血管系统，其主要功能是将脱氧血液输送到肺部的气体交换区域。肺中的肺动脉排列在平行于支气管树的分支中，最终形成一个广泛的毛细血管网络，该网络在几个肺泡上连续，最后汇聚成小静脉和静脉。肺动脉的血管张力受多种因素控制，涉及内皮和血管平滑肌细胞（VSMC）之间的相互作用1。
在这项研究中，我们专注于肺内动脉（IPA）的内皮依赖性和非依赖性血管松弛。关于内皮依赖性血管松弛，内皮细胞表面发生的各种机制可以增加细胞内Ca2+浓度（例如乙酰胆碱[ACh]与毒蕈碱受体[M3]结合），导致一氧化氮（NO），前列环素（PGl 2）和内皮衍生的超极化因子（EDHF）的形成（图1).NO是主要的内皮衍生松弛因子，由L-精氨酸通过内皮一氧化氮合酶（eNOS）2合成，然后从内皮细胞解离为VSMC（图1）并刺激可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）酶;这种酶将鸟苷三磷酸（GTP）转变为环鸟苷单磷酸（cGMP），其激活蛋白激酶G（PKG）并降低胞质Ca 2+水平，从而导致血管松弛（图1）。PGl 2 由内皮细胞通过环加氧酶 （COX） 途径3，4 合成。它与VSMC上的前列环素受体（IP）结合并刺激腺苷环化酶（AC）酶，然后将三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP）（图1）3，4。cAMP激活蛋白激酶A（PKA），降低胞质Ca2+水平并引起血管松弛5（图1）。EDHF通路还通过各种内皮介质和电事件参与内皮依赖性血管松弛。EDHF途径的激活导致VSMC的超极化，从而关闭电压操作的Ca 2+通道（VOCC），降低细胞内Ca 2+水平，并诱导血管松弛6。内皮非依赖性血管松弛通过多种机制直接发生在VSMC上，例如细胞内Ca 2+水平的降低，肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的抑制，肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的活化以及Ca2+对VSMC收缩机制的敏感性降低。在本研究中，我们重点关注各种K+通道的打开，VOCC的阻断以及抑制肌质网7释放的Ca 2+引起的血管松弛，导致细胞内Ca 2+水平降低，从而分别降低VSMC肌球蛋白轻链磷酸化和肌球蛋白-肌动蛋白结合或交叉桥形成， 最终导致血管松弛。
在孤立的IPA中评估血管收缩和血管松弛测量的技术对于啮齿动物来说已经很成熟，但数据因实验方案而异。本研究描述了用于评估 体外大鼠IPA制剂血管反应性的方法，该方法是在没有调节 体内血管反应的外部因素（如神经信号、激素、细胞因子、血压等）的情况下进行的。
我们采用几种实验方案，以植物提取物为例来研究IPA的血管反应性。使用各种阻断剂（图1）来确定植物提取物诱导的内皮依赖性和非依赖性血管松弛的机制。然而，相同的方案可以用于评估IPA对用于治疗各种肺部病变的任何药物，提取物或植物化学物质的血管反应。
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Protocol
本研究中进行的实验已获得Naresuan大学动物护理和使用委员会（NUACUC）伦理委员会的批准，协议号为NU-AE620921，用于科学目的的动物护理和使用。
1.生理溶液的组成
- 通过将化学物质溶解在蒸馏水中来配制克雷布斯溶液，以达到以下最终浓度：122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO 4、0.5 mM NaHPO4、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl 2 和 11 mM 葡萄糖8。用1M NaOH将溶液的pH值调节至7.3，并在使用前预热至37°C。
- 制备冷克雷布斯溶液，如步骤1.1中所述。用作 IPA 的分离介质，如步骤 2 中所述。
2. 肺内动脉隔离
- 腹膜内注射硫喷妥钠（100mg / kg）麻醉8周龄雄性Wistar大鼠9。通过使用夹在脚上的镊子检查大鼠在深度睡眠中对疼痛刺激的反应，然后在步骤2.2中对大鼠实施安乐死之前确保大鼠没有脚拉回反应。
- 用剪刀（尺寸14厘米）切开大鼠的中胸和心脏末梢。然后，用剪刀（14厘米大小）找到肺的根部。用剪刀切割收获整个肺，并将其浸入冷克雷布斯溶液10，11中。
- 用剪刀（尺寸11厘米）切开肺的单个叶，然后放在培养皿（9厘米）上，肺的内侧/根部朝上（图2A，B）。观察并确定静脉，支气管和动脉从上到下的对齐方式（图2B）。
- 用剪刀（11厘米大小）纵向切开支气管。然后，用镊子（11厘米大小）抓住支气管的尖端。轻轻解剖并将支气管和静脉从肺部取出。请注意，IPA 始终在支气管下方的解剖学上对齐。
- 之后，可以可视化主要的IPA（图2C）。使用镊子（尺寸 11 厘米）抓住 IPA 的尖端，并用剪刀（尺寸 11 厘米）小心地将其从肺组织中解剖出来。
- 将分离的 IPA 保存在冷克雷布斯溶液中，直到器官浴组件设置好（pH 7.3 和温度 4 °C）1 1.
3. 血管平滑肌细胞（VSMC）的分离
- 按照前面的步骤 2 中所述隔离 IPA。用剪刀（尺寸 11 厘米）纵向切开 IPA 的主分支并切成小条（2 毫米）（图 3A）。
- 将 IPA 试纸浸入含有 110 mM NaCl、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO4、0.5 mM NaH2PO4、10 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.03 mM 酚红、10 mM 牛磺酸、0.5 mM EDTA、2 mM 氯化镁 2、11 mM 葡萄糖和 0.16 mM CaCl 2 的解离培养基 （DM）10，12 中， 并用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.0。将试纸在含有1mg / mL木瓜蛋白酶，0.04%牛血清白蛋白（BSA）和0.4mM 1，4-二硫苏糖醇（DTT）的DM中在4°C孵育1小时，并进一步在37°C孵育15分钟。在DM中加入1mg / mL1A型胶原酶，并在37°C下进一步孵育5分钟。
注意：DM是一种用于保持细胞活力的溶液。木瓜蛋白酶和1A型胶原酶是分解细胞外基质蛋白以分离单细胞的酶。BSA是一种血清白蛋白，用于在储存和酶促反应期间稳定酶。DTT是一种还原剂，用于在细胞分离过程中稳定和促进酶的活性。牛磺酸是用于稳定细胞膜和细胞完整性的氨基硫酸。 - 将组织转移到新鲜的DM中，并使用玻璃巴斯德移液管通过轻轻研磨分散（图3B）。继续研磨，直到在显微镜下的沐浴溶液中可见分离的VSMC（图3C）。
注意：新鲜分离的VSMC可用于研究血管生理学/病理生理学，以及各种实验研究，例如药物调节，膜片钳电生理分析，钙成像等。然而，本研究仅关注使用器官浴技术对分离性IPA的血管松弛。
4. 风琴浴技术
- 按照前面的步骤 2 中所述隔离 IPA。将 IPA 的主分支切成 ~2 mm 长度的环（图 2D）13。
- 通过将 IPA 环穿在两根直径为 40 μm 的不锈钢丝上（图 2E）11、13、14，将 IPA 环固定在风琴浴室中（图 4）。
- 将装有 IPA 环的不锈钢线连接到连接到数据采集装置的等距力传感器和安装了用于数据记录和分析的合适生理软件的计算机系统上，然后轻轻地将 IPA 环的张力提高到 1 g11。
- 让血管段在1g的静息张力下平衡约45分钟。在平衡期间，确保每15分钟定期更换一次克雷布斯溶液。在此平衡期之后，通过测量血管收缩到含有 47.4 mM NaCl、80 mM KCl、10 mM HEPES、0.5 mM KH 2 PO 4、0.5 mM NaHPO4、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2 和 11 mM 葡萄糖 10，11 的高细胞外 K+ （80 mM） 溶液的血管收缩来测试血管的活力。
- 通过计算用去氧肾上腺素（PE，1 x 10−5 M）预先收缩的环中对乙酰胆碱（1 x 10−5 M）的松弛反应来评估内皮的存在与否（注意，添加PE后血管收缩保持稳定1小时）。如果环定量超过70%的松弛，则将其视为内皮完整（图5A）。如果它们的松弛率低于10%，则将环视为内皮剥落的13（图5B）。通过用小线在血管内轻轻摩擦以诱导剥落来机械地去除内皮。
- 在测试实验开始之前再次平衡动脉环30分钟。
5. 血管松弛剂对植物提取物的反应
- 通过用PE（1 x 10−5 M）预收缩IPA环来研究植物提取物的松弛作用。
- 然后，小心地将植物提取物（1-1，000μg/ mL）累积添加到内皮完整环和内皮剥离环中，以诱导血管松弛（图6A，B）并获得浓度依赖性响应曲线（图6C）。
- 确保用作溶剂的二甲基亚砜（DMSO）的效果也经过类似的评估，以用作阴性对照（图6C）。
6. 植物提取物通过内皮诱导血管松弛的机制
- 通过将内皮完整的 IPA 环与以下抑制剂孵育 30 分钟，评估植物提取物通过内皮一氧化氮合酶 （eNOS）、环加氧酶 （COX）13 和内皮衍生的高极化因子 （EDHF） 途径的血管松弛作用机制（图 7A）： 1 x 10−4 M NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，一种 eNOS 抑制剂）9， 1 x 10−5 M 吲哚美辛（一种 COX 抑制剂）9， 或 1 x 10−7 M apamin（一种小钙激活钾通道阻滞剂）和 1 x 10−7 M charybdotoxin（一种中等和大电导钙激活钾通道阻滞剂）的组合，然后用 1 x 10−5 M PE 诱导 IPA 收缩。
- 然后，在收缩到PE稳定后，加入累积浓度（0.1-1，000μg/ mL）的植物提取物。
- 将植物提取物的效果呈现为存在抑制剂的情况下IPA环的百分比松弛与不含抑制剂的IPA环的反应（图7B-D）相比，并构建浓度 - 反应曲线。
7. 植物提取物通过血管平滑肌K+ 通道诱导血管松弛的机制
- 用 1 x 10−3 M 4-氨基吡啶 （4-AP）、电压门控钾通道阻断剂 （KV） 的阻断剂（图 8A）、1 x 10−5 M 格列本脲（ATP 敏感钾通道 （KATP） 的阻断剂）或 1 x 10−7 M 伊比利亚毒素（大电导 Ca 2+ 激活的 K+ 通道 （KCa） 的阻断剂）预孵育内皮剥离的 IPA 环 30 分钟， 在用 1 x 10−5 M PE 诱导 IPA 收缩之前。
- 然后，添加植物提取物的累积浓度。
- 将植物提取物的影响呈现为与不含抑制剂的IPA环相比，含抑制剂的IPA环的百分比松弛（图8B-D），并构建浓度 - 响应曲线。
8. 植物提取物抑制VSMC细胞外钙（Ca2+）内流诱导血管松弛的机制
- 在含有 1 mM 乙二醇双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA） 的不含Ca 2+ 的 Krebs 溶液中预孵育内皮剥离的 IPA 环 30 分钟（图 9A）。
- 然后，用Ca2 +游离-80 mM K + 溶液替换沐浴溶液10分钟以使VSMC去极化，然后打开VOCC（图9A）。
- 累积添加CaCl2 （0.01-10mM）以诱导IPA的血管收缩并构建浓度 - 反应曲线（图9A）。
- 在相同的IPA环中重复该协议，但将它们与植物提取物或1μM尼卡地平（L型Ca 2 +通道阻滞剂）在含有80mM K +溶液的Ca 2 +中预孵育10分钟，然后累积加入CaCl 28。
- 最后，将收缩响应与先前由对照CaCl2 挑战引起的最大收缩进行比较（图9B）。
9. 植物提取物通过抑制肌浆网（SR）释放的细胞内钙（Ca2+）诱导血管松弛的机制
- 将内皮剥离的 IPA 环暴露在 80 mM K+ 溶液中约 5 分钟，使 VSMC 去极化，打开 VOCC，并最终将 Ca2+ 负载生成到 SR 中（图 10A）。
- 用含有1mM EGTA的Ca2 +不含克雷布斯溶液替换沐浴溶液10分钟（图10A）。
- 然后，用 1 x 10−5 M PE 激发 IPA 环，激活磷脂酶 C/IP3 途径，最终从 SR 释放 Ca2+ 并引起 IPA 的瞬时收缩（图 10A）。
- 重复相同的方案以确定与PE相同的瞬时收缩。
- 用80mM K +溶液再次挑战IPA环约5分钟，然后用含有1mM EGTA的不含Ca2 +的克雷布斯溶液替换沐浴溶液，有或没有植物提取物10分钟。
- 同样，用 1 x 10−5 M PE 挑战 IPA 环。
- 比较有和没有植物提取物的条件之间由PE诱导的IPA收缩（图10B）。
10. 统计分析
- 将结果表示为平均值± SEM。 使用学生的t检验比较这些值，或通过方差分析（ANOVA）进行分析，然后使用合适的统计软件进行Tukey-Kramer事后检验。考虑 p < 0.05 处的差异具有统计显著性。在这里，有n = 6只大鼠/实验方案。
注意：血管收缩和血管松弛的记录可以使用计算机上安装的合适软件进行评估。例如， 图5A 显示，当血管受到PE刺激导致收缩时，可以从原始示踪的张力增加中观察到这一点。跟踪将在 20-30 分钟内稳定下来，这被认为是 100% 收缩。之后，ACh刺激血管，引起松弛，这可以从原始描摹的张力降低中观察到。因此，降低的张力计算为与100%收缩相比的百分比。
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Representative Results
本研究中的方案已被开发用于确定测量在分离的IPA制剂的血管反应中观察到的生理现象的最佳实验条件。进行试点实验以描述有助于理解植物提取物血管松弛作用的血管效应和机制基础的潜在结果，如下所示。
植物提取物的血管松弛作用
如图6A，B所示，在内皮完整IPA（E +）中，植物提取物引起血管松弛的浓度依赖性反应（EC50 = 66.88μg/ mL，图6C）。根除内皮（E-）大大降低了植物提取物诱导的血管松弛（p < 0.01），如EC 50增加2.2倍（E-，EC50 = 150.60μg/mL，图6C）所反映的那样。车辆DMSO没有任何效果。因此，植物提取物主要通过内皮依赖性途径产生血管松弛，部分通过内皮依赖性途径产生血管松弛。
植物提取物通过内皮依赖性途径的血管松弛作用机制
如图7所示，利用L-NAME抑制eNOS（图7B）和阿帕明加夏利多毒素联合阻断EDHF（图7D）明显降低了对植物提取物的血管松弛剂反应。这会将浓度-响应曲线向右移动，并在不改变E最大值的情况下增加EC50。相反，吲哚美辛（一种COX抑制剂）（图7C）对植物提取物的血管松弛剂反应没有影响。
表征K +通道在植物提取物的血管松弛作用中的作用
在内皮剥离的IPA环中，KCa通道阻滞剂（伊比利亚毒素）降低了对植物提取物的血管松弛反应（图8C），而Kv（4-AP）或KATP（格列本脲）通道的阻断剂不会改变植物提取物诱导的血管松弛（图8B，D）。
植物提取物通过细胞外Ca 2+内流抑制的血管松弛作用机制
为了研究植物提取物的血管松弛作用机制是否涉及细胞外Ca 2+内流抑制，在不含Ca 2+的克雷布斯溶液中，1 x 10−5-1 x 10−2M CaCl 2与80 mM K +掺入以激活VOCC，从而引起内皮剥落的IPA环的血管收缩（图9A，B）。与植物提取物（68 μg/mL，EC50 值）预孵育可抑制 CaCl2 诱导的收缩（p < 0.001 相比）。
植物提取物通过抑制SR释放的细胞内Ca 2+的血管松弛作用机制
为了检查从SR释放的细胞内Ca 2+是否在血管松弛作用中起任何作用，将内皮剥离的IPA环与不含Ca2+的Krebs溶液预孵育，然后加入PE（1 x 10−5 M），呈现瞬时收缩（图10A）。然后，在同一个IPA环中，在载体或植物提取物存在下重复该实验。与载体相比，植物提取物显着降低了PE诱导的收缩（p <0.001）（图10B）。
图 1：通过内皮依赖性和非依赖性途径调节血管张力。 AA = 花生四烯酸，ACh = 乙酰胆碱，AC = 腺苷酸环化酶，ATP = 腺苷 5'-三磷酸，cAMP = 环腺苷单磷酸，cGMP = 环鸟苷单磷酸，COX = 环氧合酶，DAG = 二酰基甘油，EDHF = 内皮衍生的超极化因子，eNOS = 内皮一氧化氮合酶，G q = G 蛋白类型q，G s = G 蛋白s 型，GTP = 鸟苷三磷酸，IP = 前列环素受体，IP 3 = 肌醇 1、4、5 三磷酸，IP3R = IP3 受体，IK Ca = 中间电导 Ca 2+ 激活的 K+ 通道，KV = 电压门控钾通道，K ATP =ATP 敏感钾通道，K Ca = 大电导Ca 2+ 激活的 K+ 通道，M3 = 毒蕈碱受体，MEGJ = 肌内皮间隙连接，NO = 一氧化氮，PE = 去氧肾上腺素，PGI 2 = 前列环素，PGs = 前列腺素，PIP2 = 磷脂酰肌醇 4，5 二磷酸，PKA = 蛋白激酶 A，PKG = 蛋白激酶 G，PLA 2 = 磷脂酶A 2，PLC = 磷脂酶 C，ROCC = 受体操作的 Ca 2+ 通道，RYR = 瑞诺定受体，sGC = 可溶性鸟苷环化酶，SK Ca = 小电导 Ca 2+ 激活的 K+ 通道，SR = 肌质网，VOCC = 电压操作的Ca 2+ 通道。请点击此处查看此图的大图。
图 2：大鼠肺内动脉 （IPA） 隔离的关键步骤。 （A）图片描绘了患有IPA的大鼠肺。（B）朝上解剖肺的内侧/根部。（C）去除静脉和支气管后可视化主IPA。（d） 孤立的异丙醇。（E）将IPA环安装在一对不锈钢丝上，使用器官浴技术进行血管反应研究。请点击此处查看此图的大图。
图 3：IPA 血管平滑肌细胞 （VSMC） 分离的关键步骤。 （A）将分离的IPA切成小条并浸入解离介质（DM）中。（B）对血管条进行研磨以分离VSMC。 （C）温和研磨后分离的VSMC。请点击此处查看此图的大图。
图 4：用于测试血管反应性的设备的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：代表性记录显示用 10 μM PE 预先收缩 10 μM 乙酰胆碱 （ACh） 的 IPA 环的血管松弛 。 （A） 内皮完整环 （E+） 和 （B） 内皮剥落 （E-） 环。 请点击此处查看此图的大图。
图6：植物提取物对IPA的血管松弛。 （A） 代表性记录显示植物提取物 （1-1，000 μg/mL） 在内皮完整环 （E+） 和 （B） 内皮剥离 （E-） 环中预先收缩 10 μM PE，对 IPA 环的血管松弛。（C）植物提取物在IPA环中诱导的血管松弛的浓度 - 反应曲线（E +，n = 6和E-，n = 6）。血管松弛表示为PE诱导的收缩的百分比。与车辆相比，所有数据均表示为±平均值 SEM。 **p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图7.植物提取物通过内皮依赖性途径诱导IPA血管松弛的机制。（A） 代表性记录显示植物提取物 （1-1，000 μg/mL） 与 L-NAME（eNOS 抑制剂）预孵育并用 10 μM PE 预收缩的内皮完整 IPA 环 （E+） 的血管松弛。（乙-四）植物提取物诱导的内皮完整 （E+） IPA 环的血管松弛的浓度-反应曲线，用 PE 预收缩并与各种内皮信号通路的抑制剂预孵育，包括 （B） 100 μM L 名称、（C） 10 μM 吲哚美辛或 （D） 0.1 μM 阿帕明加 0.1 μM 查里布多毒素。值是 SEM ±平均值。 （n = 6）。**p < 0.01， ***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图8.K+ 通道阻滞剂对植物提取物诱导的IPA血管松弛的影响。 （A） 代表性记录显示植物提取物 （1-1，000 μg/mL） 内皮剥离 （E-） IPA 环与 4-AP（KV 通道阻滞剂）一起孵育并用 10 μM PE 预收缩的血管松弛。（乙-四）植物提取物诱导的内皮剥蚀（E-）IPA环的血管松弛的浓度 - 反应曲线，该环与PE预先收缩并用各种K + 通道阻滞剂（包括（B）1mM 4-AP，（C）10μM格列本脲或（D）30nM伊比利亚毒素。值是 SEM ±平均值。 （n = 6）。p < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图9.植物提取物对细胞外Ca2+内流的影响。（A）代表性记录显示CaCl2在不存在（对照）或存在植物提取物的情况下诱导的IPA环收缩。将IPA环沐浴在含有10 mM EGTA的Ca2+游离高K+溶液（80 mM）中，并测量由CaCl2累积浓度引起的收缩。然后单独重复该协议（对照，n = 6）或在植物提取物存在下（n = 6）。（B）在没有（对照）或存在植物提取物或1μM尼卡地平（L型Ca 2+通道阻滞剂）的情况下CaCl2诱导的IPA环收缩的浓度 - 响应曲线。CaCl 2诱导的收缩计算为第一次CaCl2应用记录的最大收缩的百分比，并表示为平均±SEM。 *p < 0.05，***p < 0.001与尼卡地平相比。请点击此处查看此图的大图。
图 10.植物提取物对肌质网（SR）中Ca2+ 释放的影响。 （A）代表性记录显示，在DMSO（对照）和10μM植物提取物存在下，内皮剥离的IPA环的SR释放Ca 2+ 诱导的去氧肾上腺素（PE）诱导的IPA环收缩。数据是收缩到10μM PE诱导的收缩的百分比，与没有植物提取物的初始方案产生的收缩相比。值是 SEM ±平均值。 **p 与车辆相比< 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图11：植物提取物通过内皮依赖性和非依赖性途径对大鼠肺内动脉的血管扩张作用的拟议机制 AA = 花生四烯酸，ACh = 乙酰胆碱，AC = 腺苷酸环化酶，ATP = 腺苷 5'-三磷酸，cAMP = 环腺苷单磷酸，cGMP = 环鸟苷单磷酸，COX = 环加氧酶，DAG = 二酰基甘油，EDHF = 内皮衍生的超极化因子，eNOS = 内皮一氧化氮合酶，Gq = G蛋白类型q，G s = G蛋白类型s，GTP =鸟苷三磷酸，IP =前列环素受体，IP 3 =肌醇1，4，5三磷酸，IP 3 R = IP 3受体，IKCa =中间电导Ca 2+激活的K +通道，KV =电压门控钾通道，K ATP =ATP敏感钾通道，K Ca =大电导Ca 2+激活的K + 通道，M3 = 毒蕈碱受体，MEGJ = 肌内皮 gab 连接，NO = 一氧化氮，PE = 去氧肾上腺素，PGI 2 = 前列环素，PGs = 前列腺素，PIP 2 = 磷脂酰肌醇 4，5 二磷酸，PKA = 蛋白激酶 A，PKG = 蛋白激酶 G，PLA 2 = 磷脂酶 A 2，PLC = 磷脂酶 C，ROCC = 受体操作的 Ca2+ 通道，RYR = 瑞诺定受体，sGC = 可溶性鸟苷酸环化酶，SKCa = 小电导 Ca。2+激活的K+通道，SR=肌质网，VOCC=电压操作的Ca2+通道。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这篇手稿中，我们描述了分离大鼠IPA和VSMC的技术。已经采用了几种实验方案来研究体 外IPA的血管反应，可用于表征植物提取物诱导的IPA血管松弛的药理作用和机制基础。
关于植物提取物的内皮依赖性血管扩张作用，采用了各种阻断剂，如L-NAME（eNOS），吲哚美辛（COX）和apamin+charybdotoxin（EDHF）。代表性数据显示阳性结果（即，在存在eNOS或EDHF抑制剂的情况下血管扩张剂反应显着降低）和阴性结果（即，在COX抑制剂存在下血管扩张剂反应没有变化），表明植物提取物通过eNOS和EDHF内皮途径起作用。通过参与K+通道，细胞外Ca 2+内流和SR释放的Ca2+来评估植物提取物诱导的内皮非依赖性血管松弛作用。结果表明，KCa通道阻断剂（伊比利亚毒素）降低了对植物提取物的血管松弛反应，但KV通道阻断剂（4-AP）或KATP通道阻断剂（格列本脲）没有减少，这表明提取物通过Kca通道的打开起作用。此外，植物提取物减少了CaCl2诱导的血管收缩，表明其机制涉及VSMC上VOCC的抑制或干扰Ca2+与收缩机制的相互作用。应进行补充研究，以进一步分析其详细的机理作用。此外，在不含Ca 2+的克雷布斯中对PE的瞬时收缩减少，表明植物提取物抑制了SR中Ca2+的释放，导致血管收缩减少。图11说明了植物提取物血管松弛作用的解释机制的摘要。
本研究提出的实验方案在技术上是可行的，并且具有良好的重现性;然而，某些关键步骤对于确保成功至关重要。首先，在制备过程中必须精确保持生理溶液的成分，以确保程序正常工作。此外，在准备过程中避免触摸、拉伸或损坏肺动脉至关重要。一旦肺动脉固定在器官浴室中，必须每 15 分钟（3 次）连续更换培养基，以稳定测试和评估。容器的预张力应增加到略高于所需水平，然后逐渐降低，直到达到最佳水平（即1g）。
通过该技术评估几种实验方案，例如血管的活力，内皮细胞的存在以及植物提取物对血管松弛的影响。分离大鼠IPA的阐明程序可以适应其他物种（例如，小鼠，兔子和人类）。然而，组装器官浴所需的最佳条件可能因各种动物模型而异，并且可以相应地进行调整。重要的是，实验条件不是生理条件的精确复制，结果不能直接外推到 体内 现象。
这种 IPA 分离方法和血管反应测量是评估血管生理学、病理学和药理学的实用方法。它使研究人员能够在隔离但控制良好的环境中研究血管收缩和血管松弛。此外，它可以适用于研究用于肺血管病理学的药物的治疗作用，例如肺动脉高压。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢泰国国家研究委员会，化学创新卓越中心（PERCH-CIC）和国际研究网络（IRN61W0005）提供财政支持，以及纳瑞宣大学生理学系医学科学学院的研究设施支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
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