Summary
Сосудистые реакции артериального легочного кровообращения могут быть изучены с использованием внутрилегочной артерии (IPA) и гладкомышечных клеток сосудов (VSMC). В настоящем исследовании подробно описывается изоляция IPA и протоколы, используемые для исследования вазорелаксации в ответ на физиологические стимулы.
Abstract
Внутрилегочная артерия (IPA) и сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC), выделенные из легких крыс, могут быть использованы для изучения основных механизмов сужения сосудов и вазорелаксации. После выделения IPA и VSMC характеристики сосудистых реакций при физиологических и патологических состояниях могут быть оценены при отсутствии внешних факторов, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины и т.д. Таким образом, IPA и VSMC служат отличными моделями для изучения сосудистой физиологии / патофизиологии, наряду с различными экспериментальными исследованиями, такими как модуляция фармакологическими агентами, электрофизиологический анализ, визуализация кальция и т. Д. Здесь мы использовали технику выделения IPA для исследования сосудистых реакций в органной ванне. Сегменты IPA были установлены на камере ванны органа через внутрипросветные провода и стимулировались различными фармакологическими средствами. Изменения сосудистого тонуса IPA (т.е. вазоконстрикция и вазорелаксация) регистрировались с помощью изометрического преобразователя силы и программного обеспечения для анализа физиологических данных. Мы внедрили несколько экспериментальных протоколов, которые могут быть адаптированы для исследования механизмов вазорелаксации/вазоконстрикции для изучения фармакологической активности фитохимических или синтетических препаратов. Протоколы также могут быть использованы для оценки роли лекарств в модуляции различных заболеваний, включая легочную артериальную гипертензию. Модель IPA позволяет исследовать кривую концентрация-реакция, которая имеет решающее значение при оценке фармакодинамических параметров лекарственных средств.
Introduction
Легочная сосудистая система представляет собой сосудистую систему низкого давления, в которой основной функцией является доставка дезоксигенированной крови в газообменную область легких. Легочные артерии в легких расположены в ветвях параллельно бронхиальному дереву, в конечном итоге образуя обширную сеть капилляров, которая непрерывна над несколькими альвеолами и, наконец, собирается вместе в венулы и вены. Сосудистый тонус легочной артерии контролируется несколькими факторами, включая взаимодействие между эндотелием и гладкомышечными клетками сосудов (VSMC)1.
В этом исследовании мы фокусируемся на эндотелий-зависимой и -независимой вазорелаксации внутрилегочной артерии (IPA). Что касается эндотелий-зависимой вазорелаксации, различные механизмы, происходящие на поверхности эндотелиальных клеток, могут увеличивать внутриклеточную концентрацию Ca2+ (например, ацетилхолин [ACh] связывается с мускариновым рецептором [M3]), что приводит к образованию оксида азота (NO), простациклина (PGl2) и гиперполяризующего фактора, полученного из эндотелия (EDHF) (рисунок 1 ). NO является основным эндотелиевым расслабляющим фактором, синтезируемым из L-аргинина эндотелиальной синтазой оксида азота (eNOS)2, который затем диссоциирует из эндотелиальных клеток в VSMC (рисунок 1) и стимулирует растворимый фермент гуанилилциклазы (sGC); этот фермент превращает гуанозинтрифосфат (GTP) в циклический гуанозинмонофосфат (cGMP), который активирует протеинкиназу G (PKG) и снижает цитозольный уровень Ca2+, вызывая тем самым вазорелаксацию (рисунок 1). PGl2 синтезируется эндотелиальными клетками через циклооксигеназный (ЦОГ) путь 3,4. Он связывается с простациклиновым рецептором (IP) на VSMC и стимулирует фермент аденилилциклазу (AC), который затем превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (Рисунок 1)3,4. цАМФ активирует протеинкиназу А (ПКА), снижая цитозольный уровень Ca2+ и вызывая вазорелаксацию5 (рисунок 1). Путь EDHF также участвует в эндотелий-зависимой вазорелаксации через различные эндотелиальные медиаторы и электрические события. Активация пути EDHF приводит к гиперполяризации VSMC, тем самым закрывая управляемые напряжением каналы Ca2+ (ЛОСК), снижая внутриклеточные уровни Ca2+ и индуцируя вазорелаксацию6. Эндотелий-независимое вазорелаксирование происходит непосредственно на VSMC с помощью нескольких механизмов, таких как снижение внутриклеточного уровня Ca2+, ингибирование миозин-тижной киназы (MLCK), активация миозин-фосфатазы легкой цепи (MLCP) и снижение чувствительности Ca2+ к сократительному механизму VSMC. В этом исследовании мы фокусируемся на вазорелаксации, вызванной открытием различных каналов K+, блокадой ЛОСЦ и ингибированием высвобождения Ca2+ из саркоплазматического ретикулума7, что приводит к снижению внутриклеточных уровней Ca2+, тем самым уменьшая фосфорилирование легкой цепи миозина VSMC и связывание миозина или образование поперечных мостов, соответственно, в конечном итоге приводит к вазорелаксации.
Методика оценки измерений вазоконстрикции и вазорелаксации в изолированных IPA хорошо зарекомендовала себя для грызунов, но данные варьировались в зависимости от экспериментальных протоколов. В настоящем исследовании описан метод, используемый для оценки сосудистой реактивности препаратов IPA для крыс in vitro, которые были сделаны в отсутствие внешних факторов, модулирующих сосудистый ответ in vivo, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины, артериальное давление и т. Д.
Мы использовали несколько экспериментальных протоколов, используя растительный экстракт в качестве примера для изучения сосудистой реактивности IPA. Различные блокаторы (рисунок 1) использовали для идентификации механизмов эндотелий-зависимого и -независимого вазорелаксирования, индуцированного растительным экстрактом. Тем не менее, те же протоколы могут быть адаптированы для оценки сосудистых реакций МПА на любые препараты, экстракты или фитохимические вещества, используемые для лечения различных легочных патологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике Комитета по уходу и использованию животных Университета Наресуан (NUACUC), номер протокола NU-AE620921, для ухода и использования животных в научных целях.
1. Состав физиологических растворов
- Формулируют раствор Кребса путем растворения химических веществ в дистиллированной воде для достижения конечных концентраций следующим образом: 122 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 5 мМ KCl, 0,5 мМ KH2PO4, 0,5 мМ NaHPO4, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2 и 11 мМ глюкозы8. Отрегулируйте рН раствора до 7,3 с 1 М NaOH и разогрейте до 37 °C перед использованием.
- Приготовьте холодный раствор Кребса аналогично тому, как указано в шаге 1.1. для использования в качестве изоляционной среды IPA, как описано в шаге 2.
2. Изоляция внутрилегочной артерии (ИПА)
- Обезболить 8-недельного самца крыс Wistar внутрибрюшинной инъекцией тиопентала натрия (100 мг/кг)9. Проверьте крыс на их реакцию на болезненные раздражители в глубоком сне, используя щипцы, прижатые к их ногам, а затем убедитесь, что у крыс нет реакции отката ноги, прежде чем усыплять их на шаге 2.2.
- Разрезайте ножницами среднюю грудную клетку крысы и сердечную оконечность (размер 14 см). Затем расположите корень легкого ножницами (размер 14 см). Соберите все легкое, разрезав ножницами и погрузив его в холодный раствор Кребса10,11.
- Нарежьте ножницами одну долю легкого (размер 11 см) и положите на чашку Петри (размер 9 см) медиальной стороной/корнем легкого лицом вверх (рисунок 2A, B). Наблюдайте и идентифицируйте выравнивание вены, бронхов и артерий сверху вниз (рисунок 2B).
- Разрезать бронх продольно ножницами (размер 11 см). Затем используйте щипцы (размер 11 см), чтобы захватить кончик бронха. Аккуратно рассекните и удалите бронхи и вены из легкого. Обратите внимание, что IPA всегда анатомически выровнен под бронхом.
- После этого можно визуализировать основной МПА (рисунок 2С). Используйте щипцы (размер 11 см), чтобы схватить кончик МФА и аккуратно рассекнуть его из легочной ткани ножницами (размер 11 см).
- Держите изолированный IPA в холодном растворе Кребса до тех пор, пока не будет установлен органная ванна (рН 7,3 и температура 4 °C)1.
3. Выделение гладкомышечных клеток сосудов (VSMC)
- Изолируйте IPA, как описано ранее в шаге 2. Разрезать ножницами основную ветвь МПА продольно (размер 11 см) и разрезать небольшими полосками (2 мм) (рисунок 3А).
- Погрузить полоски IPA в диссоциационную среду (DM)10,12, содержащую 110 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,5 мМ KH2PO4, 0,5 мМ2PO4, 10 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,03 мМ фенола красного, 10 мМ таурина, 0,5 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 11 мМ глюкозы и 0,16 мМ CaCl2, и отрегулируйте pH до 7,0 с 1 М NaOH. Инкубируют полоски в течение 1 ч при 4 °C в СД, содержащие 1 мг/мл папаина, 0,04% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,4 мМ 1,4-дитиотрейтола (DTT), и далее инкубируют при 37 °C в течение 15 мин. Добавляют 1 мг/мл коллагеназы типа 1А в СД и далее инкубируют при 37 °C в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: DM - это раствор, используемый для сохранения жизнеспособности клеток. Папаин и коллагеназа типа 1А являются ферментами, которые расщепляют белки внеклеточного матрикса для выделения отдельных клеток. BSA представляет собой сывороточный альбуминовый белок, используемый для стабилизации ферментов во время хранения и ферментативных реакций. DTT является восстановителем, используемым для стабилизации и стимулирования активности ферментов во время процесса выделения клеток. Таурин - это аминосерная кислота, используемая для стабилизации клеточной мембраны и целостности клеток. - Переведите ткани в свежий DM и рассейте путем мягкой тритурации с использованием стеклянной пипетки Пастера (рисунок 3B). Продолжайте тритурацию до тех пор, пока изолированные VSMC не станут видимыми в растворе для купания под микроскопом (рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеизолированные VSMC могут быть использованы для изучения сосудистой физиологии / патофизиологии, наряду с различными экспериментальными исследованиями, такими как модуляция фармакологическими агентами, электрофизиологический анализ, визуализация кальция и т. Д. Однако настоящее исследование фокусируется только на вазорелаксации изолированного IPA с использованием техники органной ванны.
4. Техника органной ванны
- Изолируйте IPA, как описано ранее в шаге 2. Вырежьте основную ветвь МПА на кольца длиной ~2 мм (рисунок 2D)13.
- Прикрепите кольца IPA в камеры органной ванны (рисунок 4), нанизав их на две проволоки из нержавеющей стали диаметром 40 мкм (рисунок 2E)11,13,14.
- Прикрепите провода из нержавеющей стали, установленные с кольцами IPA, к изометрическим силовым преобразователям, подключенным к устройству сбора данных и компьютерной системе, установленной с помощью подходящего физиологического программного обеспечения для записи и анализа данных, затем осторожно поднимите напряжение кольца IPA до 1 g11.
- Дайте сегментам сосуда уравновеситься в течение примерно 45 мин при напряжении покоя 1 г. В течение периода уравновешивания следите за тем, чтобы раствор Кребса регулярно менялся каждые 15 минут. После этого периода равновесия проверьте жизнеспособность сосудов, измерив их вазоконстрикцию до высококлеточного раствора K+ (80 мМ), содержащего 47,4 мМ NaCl, 80 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 0,5 мМ KH2PO4, 0,5 мМ NaHPO4, 1,8 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2 и 11 мМ глюкозы10,11.
- Оценить наличие или отсутствие эндотелия путем вычисления реакции релаксации на ацетилхолин (1 х 10−5 М) в кольцах, предварительно сжатых фенилэфрином (ПЭ, 1 х 10−5 М) (обратите внимание, что сосудистые сокращения остаются стабильными в течение 1 ч после добавления ПЭ). Рассматривайте кольца как неповрежденные эндотелии, если они количественно оценивают более 70% релаксации (рисунок 5A). Если они имеют менее 10% расслабления, рассматривайте кольца как эндотелийно-оголенные13 (рисунок 5B). Механически удалите эндотелий, аккуратно втирая внутрь сосуда небольшой проволокой, чтобы вызвать денудацию.
- Снова уравновешивают артериальные кольца за 30 мин до начала тестовых экспериментов.
5. Реакция вазорелаксанта на растительный экстракт
- Исследуйте релаксирующий эффект растительного экстракта путем предварительного согласования колец IPA с ПЭ (1 х 10−5 М).
- Затем осторожно добавляют растительный экстракт (1-1000 мкг/мл) кумулятивно к эндотелий-интактным кольцам и эндотелий-оголенным кольцам, чтобы вызвать вазорелаксацию (рисунок 6A, B) и получить концентрационно-зависимую кривую ответа (рисунок 6C).
- Убедитесь, что эффект диметилсульфоксида (ДМСО), используемого в качестве растворителя, также оценивается аналогичным образом, чтобы служить отрицательным контролем (рисунок 6C).
6. Механизм вазорелаксации, вызванной растительным экстрактом, через эндотелий
- Оценить вазорелаксантный механизм действия растительного экстракта через эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS), циклооксигеназу (COX)13 и пути гиперполяризующего фактора, полученного из эндотелия (EDHF), путем инкубации эндотелий-интактных IPA-колец в течение 30 мин со следующими ингибиторами (рисунок 7A): 1 x 10−4 M NG-нитро-L-аргининовый метиловый эфир (L-NAME, ингибитор eNOS)9, 1 x 10−5 M индометацин (ингибитор ЦОГ)9, или комбинацию 1 х 10−7 М апамина (небольшой блокатор калиевых каналов, активированный кальцием) и 1 х 10−7 М харибдотоксина (блокатор калиевых каналов с промежуточной и повышенной проводимостью, активированный кальцием), до индуцирования сокращений МФА с 1 х 10−5 М ПЭ.
- Затем, после того, как сокращения стабилизируют ПЭ, добавляют кумулятивные концентрации (0,1-1000 мкг/мл) растительного экстракта.
- Представить эффекты растительного экстракта в виде процентного расслабления колец МФА в присутствии ингибиторов по сравнению с реакцией колец МФА без ингибиторов (рисунок 7B-D) и построить кривую концентрация-реакция.
7. Механизм вазорелаксации, вызванной растительным экстрактом, через каналы K+ гладкой мускулатуры сосудов
- Предварительно инкубированные эндотелий-оголенные IPA кольца в течение 30 мин с 1 х 10−3 М 4-аминопиридином (4-АП), блокатором калиевого канала с напряжением (КВ) (Рисунок 8А), 1 х 10−5 М глибенкламида, блокатором АТФ-чувствительного калиевого канала (КАТФ), или 1 х 10−7 М ибериотоксина, блокатора большой проводимости Ca2+-активированных K+ каналов (KCa), до индуцирования сокращений МПА с 1 х 10−5 М ПЭ.
- Затем добавьте кумулятивные концентрации растительного экстракта.
- Представить эффекты растительного экстракта в виде процентного расслабления колец МФА с ингибитором по сравнению с кольцами МФА без ингибитора (рисунок 8B-D) и построить кривую концентрация-реакция.
8. Механизм вазорелаксации, индуцированной растительным экстрактом, путем ингибирования притока внеклеточного кальция (Ca2+) в VSMC
- Предварительно инкубированные кольца IPA с эндотелием в течение 30 мин в ca2+-свободном растворе Кребса, содержащем 1 мМ этиленгликоля-биса (2-аминоэтилетра)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) (Рисунок 9A).
- Затем замените раствор для купания раствором Ca2+ free-80 mM K+ в течение 10 мин для деполяризации VSMC, которые затем открывают ЛОСК (рисунок 9А).
- Кумулятивно добавляютCaCl2 (0,01-10 мМ), чтобы индуцировать вазоконстрикцию МПА и строят кривую концентрация-реакция (рисунок 9А).
- Повторите этот протокол в тех же кольцах IPA, но предварительно инкубируйте их растительным экстрактом или 1 мкМ никардипина (блокатор каналов L-типа Ca2+ ) в Ca2+ , содержащем 80 мМ K+ раствор в течение 10 мин с последующим кумулятивным добавлением CaCl28.
- Наконец, сравните сократительную реакцию с максимальным сокращением, ранее вызванным контрольными вызовами CaCl2 (рисунок 9B).
9. Механизм вазорелаксации, вызванной растительным экстрактом, путем ингибирования внутриклеточного высвобождения кальция (Ca2+) из саркоплазматического ретикулума (SR)
- Подвергайте эндотелиевые кольца IPA воздействию 80 мМ раствора K+ в течение приблизительно 5 мин, деполяризуя VSMC, открывая ЛОСЦ и в конечном итоге генерируя нагрузку Ca2+ в SR (рисунок 10A).
- Замените раствор для купания на 10 мин раствором Кребса без Ca2+, содержащим 1 мМ EGTA (рисунок 10A).
- Затем бросьте вызов кольцам IPA с 1 x 10−5 M PE, которые активируют путь фосфолипазы C/IP3 , в конечном итоге высвобождая Ca2+ из SR и вызывая переходное сокращение IPA (рисунок 10A).
- Повторите тот же протокол, чтобы установить аналогичные переходные схватки с ПЭ.
- Снова испытайте кольца IPA раствором K+ 80 мМ в течение примерно 5 минут, затем замените раствор для купания раствором Кребса без Ca2+, содержащим 1 мМ EGTA с растительным экстрактом или без него в течение 10 минут.
- Опять же, бросьте вызов кольцам IPA с 1 x 10−5 M PE.
- Сравните сокращения IPA, индуцированные ПЭ, между состоянием с растительным экстрактом и без него (рисунок 10B).
10. Статистический анализ
- Выразите результаты как среднее ± SEM. Сравните эти значения с помощью t-теста студента или проанализируйте с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), за которым следует пост-специальный тест Туки-Крамера с использованием подходящего статистического программного обеспечения. Считать различия при p < 0,05 статистически значимыми. Здесь было n = 6 крыс/экспериментальный протокол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись вазоконстрикции и вазорелаксации может быть оценена с помощью соответствующего программного обеспечения, установленного на компьютере. Например, рисунок 5А показывает, что, когда кровеносные сосуды стимулируются ПЭ, вызывающим сокращение, это можно наблюдать по повышенному напряжению первоначального отслеживания. Трассировка стабилизируется через 20-30 мин, что считается 100% сокращением. После этого ACh стимулирует кровеносные сосуды, вызывая расслабление, которое можно было наблюдать от снижения напряжения исходного отслеживания. Таким образом, пониженное напряжение рассчитывается как процент по сравнению со 100% сокращением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол в настоящем исследовании разработан для определения оптимальных экспериментальных условий измерения физиологических явлений, наблюдаемых в сосудистых реакциях изолированных препаратов МПА. Пилотные эксперименты были проведены для описания потенциальных результатов, которые помогают понять сосудистые эффекты и механистическую основу вазорелаксантного действия растительного экстракта, следующим образом.
Вазорелаксантное действие растительного экстракта
Как показано на фиг.6A,B, в эндотелий-интактном IPA (E+) растительный экстракт вызывал зависящую от концентрации реакцию вазорелаксации (EC50 = 66,88 мкг/мл, рисунок 6C). Эрадикация эндотелия (E-) глубоко уменьшала вазорелаксацию, индуцированную растительным экстрактом (p < 0,01), о чем свидетельствует увеличение EC50 в 2,2 раза (E-, EC50 = 150,60 мкг/мл, рисунок 6C). Транспортное средство, DMSO, не обладало никаким эффектом. Таким образом, растительный экстракт продуцировал вазорелаксацию в основном через эндотелий-зависимый путь и частично через эндотелий-независимый путь.
Механизм вазорелаксантного действия растительного экстракта эндотелий-зависимыми путями
Как показано на рисунке 7, использование L-NAME для ингибирования eNOS (рисунок 7B) и комбинации апамина плюс харибдотоксина для блокирования EDHF (рисунок 7D), очевидно, уменьшало реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт. Это сместило кривую концентрация-отклик вправо и увеличило EC50 без изменениямаксимальных значений E. Напротив, индометацин (ингибитор ЦОГ) (рисунок 7C) не показал влияния на реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт.
Характеристика роли каналов K+ в вазорелаксантном действии растительного экстракта
В эндотелий-оголенных кольцах IPA блокатор каналов KCa (ибериотоксин) уменьшал реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт (рисунок 8C), в то время как блокаторы каналов Kv (4-AP) или KATP (глибенкламид) не модифицировали вазорелаксацию, индуцированную растительным экстрактом (рисунок 8B,D).
Механизм вазорелаксантного действия растительного экстракта посредством ингибирования внеклеточного притока Ca2+
Чтобы исследовать, включал ли механизм вазорелаксантного действия растительного экстракта ингибирование внеклеточного ингибирования притока Ca2+, вазоконстрикция эндотелийно-оголенных IPA-колец вызывалась 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 в Ca2+ свободном растворе Кребса, включенном с 80 мМ K+ для активации ЛОСК (рисунок 9A,B). Предварительная инкубация с растительным экстрактом (68 мкг/мл, значение EC50) ингибировала CaCl 2-индуцированное сокращение (p < 0,001 по сравнению с транспортным средством).
Механизм вазорелаксантного действия растительного экстракта путем ингибирования внутриклеточного высвобождения Ca 2+ из SR
Чтобы изучить, играло ли высвобождение внутриклеточного Ca2+ из SR какую-либо роль в вазорелаксантном эффекте, эндотелий-оголенные кольца IPA предварительно инкубировали с ca2+ -свободным раствором Кребса с последующим добавлением ПЭ (1 х 10−5 М), что приводило к преходящему сокращению (рисунок 10А). Затем, в том же кольце IPA, этот эксперимент был воспроизведен в присутствии либо транспортного, либо растительного экстракта. По сравнению с транспортным средством растительный экстракт значительно уменьшал (p < 0,001) сокращение, вызванное ПЭ (рисунок 10В).
Рисунок 1: Регуляция тонуса сосудов эндотелий-зависимыми и -независимыми путями. AA = арахидоновая кислота, ACh = ацетилхолин, AC = аденилциклаза, АТФ = аденозин 5'-трифосфат, цАМФ = циклический аденозинмонофосфат, cGMP = циклический гуанозинмонофосфат, COX = циклооксигеназа, DAG = диацилглицерин, EDHF = эндотелий-производный гиперполяризующий фактор, eNOS = эндотелиальная синтаза оксида азота, Gq = G-белок типа q, Gs = G-белок типа s, GTP = гуанозинтрифосфат, IP = простациклиновый рецептор, IP3 = инозитол 1, 4, 5 трисфосфат, IP3 R = рецептор IP3 , IKCa = промежуточная проводимость Ca2+-активированный K+ канал, KV = калиевые каналы с напряжением, KATP = АТФ-чувствительные калиевые каналы, KCa = Большая проводимость Ca2+-активированные K+ каналы, M3 = мускариновый рецептор, MEGJ = Миоэндотелиальный габ-переход, NO = оксид азота, PE = фенилэфрин, PGI2 = простациклин, PGs = простагландины, PIP2 = Фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфат, PKA = Протеинкиназа A, PKG = Протеинкиназа G, PLA2 = Фосфолипаза A2, PLC = Фосфолипаза C, ROC = каналы Ca2+ , управляемые рецептором, RYR = рецептор Рианодина, sGC = Растворимая гуанилилциклаза, SKCa = Малая проводимость Ca2+-активированный K+ канал, SR = Саркоплазматический ретикулум, VOCCs = каналы Ca2+ , работающие напряжением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ключевые этапы изоляции внутрилегочной артерии крысы (IPA). (A) На рисунке изображено легкое крысы с IPA. (B) Рассечение медиальной стороны/корня легкого лицом вверх. (C) Визуализируется основной IPA после удаления вен и бронхов. d) изолированный АПИ. (E) Кольца IPA были установлены на паре проволок из нержавеющей стали для исследования сосудистого ответа с использованием метода органной ванны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ключевые этапы изоляции гладкомышечных клеток сосудов IPA (VSMC). (A) Изолированный IPA разрезали на мелкие полоски и погружали в диссоциационную среду (DM). (B) Тритурация сосудистых полосок для выделения VSMC. (C) Изолированные VSMC после мягкой тритурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схематическая иллюстрация оборудования, используемого для проверки сосудистой реактивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативная запись, показывающая вазорелаксацию колец МФА, предварительно сцепленных с 10 мкМ ПЭ на 10 мкМ ацетилхолина (ACh). (A) Эндотелий-интактное кольцо (E+) и (B) эндотелийно-оголенное (E-) кольцо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Вазорелаксация IPA растительным экстрактом. (A) Репрезентативная запись, показывающая вазорелаксацию колец IPA растительным экстрактом (1-1000 мкг/мл), предварительно законтрактованным с 10 мкМ ПЭ в эндотелий-интактных кольцах (E+) и (B) эндотелий-денудированных (E-) кольцах. (C) Кривые концентрации-реакции вазорелаксации, индуцированной растительным экстрактом в кольцах МФА (E+, n = 6 и E-, n = 6). Вазорелаксация выражается в процентах от сокращения, индуцированного ПЭ. Все данные выражены как среднее ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 по сравнению с транспортным средством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. Механизмы индуцированного растительным экстрактом вазорелаксации IPA через эндотелий-зависимый путь. (A) Репрезентативная запись, показывающая вазорелаксацию растительным экстрактом (1-1000 мкг/мл) эндотелий-интактных IPA-колец (E+), предварительно инкубированных L-NAME (ингибитор eNOS) и предварительно согласованных с 10 мкм ПЭ. (Б-Д) Кривые концентрации-ответа индуцированных растительным экстрактом вазорелаксаций эндотелий-интактных (E+) IPA-колец, предварительно связанных с ПЭ и преинкубированных ингибиторами различных эндотелиальных сигнальных путей, включая (B) 100 мкМ L-NAME, (C) 10 мкМ индометацина или (D) 0,1 мкМ апамина плюс 0,1 мкМ харибдотоксина. Значения являются средними ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8. Влияние блокаторов каналов K+ на вазорелаксацию IPA, индуцированную растительным экстрактом. (A) Репрезентативная запись, показывающая вазорелаксацию растительным экстрактом (1-1000 мкг/мл) эндотелиевых (E-) колец IPA, инкубированных с 4-AP (блокатор каналов KV) и предварительно законтрактованных 10 мкм ПЭ. (Б-Д) Кривые концентрации-ответа индуцированного растительным экстрактом вазорелаксации эндотелий-оголенных (E-) IPA колец, предварительно сцепленных с ПЭ и предварительно инкубированных различными блокаторами каналов K+, включая (B) 1 мМ 4-AP, (C) 10 мкМ глибенкламид или (D) 30 нМ ибериотоксина. Значения являются средними ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9. Влияние растительного экстракта на внеклеточный приток Ca2+. (A) Репрезентативные записи, показывающие caCl 2-индуцированное сокращение колец IPA в отсутствие (контроль) или присутствие растительного экстракта. Кольца IPA купали в Ca2+ свободном высоком K+-растворе (80 мМ), содержащем 10 мМ EGTA, и измеряли сокращение, вызванное кумулятивной концентрацией CaCl2. Затем этот протокол повторяли отдельно (контроль, n = 6) или в присутствии растительного экстракта (n = 6). (B) Кривые концентрации-отклика для CaCl2-индуцированного сокращения колец IPA в отсутствие (контроль) или присутствия растительного экстракта или 1 мкМ никардипина (блокатор каналов Ca2+ L-типа). Сокращение, индуцированное CaCl2, рассчитывали как процент от максимального сокращения, зарегистрированного в первом применении CaCl2, и выражали как среднее ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 по сравнению с никардипином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10. Влияние растительного экстракта на высвобождение Ca2+ из саркоплазматического ретикулума (SR). (A) Репрезентативная запись, показывающая вызванное фенилэфрином (ПЭ) сокращение колец МФА высвобождением Ca2+ из SR эндотелиевых денурованных колец IPA в присутствии DMSO (контроль) и 10 мкМ растительного экстракта. Данные представляют собой процентное сокращение до 10 мкМ ПЭ-индуцированных сокращений по сравнению со сокращениями, полученными по первоначальному протоколу без растительного экстракта. Значения являются средними ± SEM. **p < 0,01 по сравнению с транспортным средством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Предлагаемый механизм сосудорасширяющего действия растительного экстракта на внутрилегочную артерию крыс через эндотелий-зависимые и -независимые пути AA = арахидоновая кислота, ACh = ацетилхолин, AC = аденилциклаза, АТФ = аденозин 5'-трифосфат, цАМФ = циклический аденозинмонофосфат, цГМФ = циклический гуанозинмонофосфат, ЦОГ = циклооксигеназа, DAG = диацилглицерин, EDHF = гиперполяризующий фактор, полученный из эндотелия, eNOS = эндотелиальная синтаза оксида азота, Gq = G-белок типа q, Gs = G-белок типа s, GTP = гуанозинтрифосфат, IP = простациклиновый рецептор, IP3 = инозитол 1, 4, 5 трисфосфат, IP3R = рецептор IP3, IKCa = промежуточная проводимость Ca2+-активированный K+ канал, KV = калиевые каналы с напряжением, KATP = АТФ-чувствительные калиевые каналы, KCa = Большая проводимость Ca2+-активированный K+ каналы, M3 = мускариновый рецептор, MEGJ = миоэндотелиальный габ-переход, NO = оксид азота, PE = фенилэфрин, PGI2 = простациклин, PGs = простагландины, PIP2 = фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфат, PKA = протеинкиназа A, PKG = протеинкиназа G, PLA2 = фосфолипаза A2, PLC = фосфолипаза C, ROC = рецепторные каналы Ca2+, RYR = рецепторный рецептор, sGC = растворимая гуанилилциклаза, SKCa = Малая проводимость Ca 2+-активированный K+ канал, SR = саркоплазматический ретикулум, ЛОСК = каналы Ca2+, работающие напряжением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описываем технику выделения крыс iPA и VSMC. Несколько экспериментальных протоколов были использованы для исследования сосудистого ответа IPA in vitro, который может быть использован для характеристики фармакологического эффекта и механистической основы вазорелаксации IPA, вызванной растительным экстрактом.
Что касается эндотелий-зависимого сосудорасширяющего действия растительного экстракта, были использованы различные блокаторы, такие как L-NAME (eNOS), индометацин (COX) и апамин + харибдотоксин (EDHF). Репрезентативные данные показали как положительные результаты (т.е. значительное снижение вазодилататорного ответа в присутствии ингибиторов eNOS или EDHF), так и отрицательные результаты (т.е. отсутствие изменения реакции сосудорасширяющего средства в присутствии ингибитора ЦОГ), предполагая, что растительный экстракт действует через эндотелиальные пути eNOS и EDHF. Эндотелий-независимый вазорелаксантный эффект, индуцированный растительным экстрактом, оценивали через вовлечение каналов K+ , внеклеточный приток Ca2+ и высвобождение Ca2+ из SR. Результаты показали, что вазорелаксация в ответ на растительный экстракт была уменьшена блокатором каналов KCa (ибериотоксин), но не блокатором каналов KV (4-AP) или блокатором каналов KATP (глибенкламид), предполагая, что экстракт действует через открытие каналов KCa . Кроме того, индуцированнаяCaCl2 вазоконстрикция была уменьшена растительным экстрактом, предполагая, что ее механизм включал ингибирование ЛОС на VSMC или вмешательство во взаимодействия Ca2+ со сократительными механизмами. Дополнительные исследования должны быть проведены для дальнейшего анализа его детального механистического действия. Кроме того, преходящее сокращение до ПЭ в Ca2+ free Krebs было уменьшено, что указывает на то, что растительный экстракт ингибировал высвобождение Ca2 + из SR, что приводило к уменьшению сужения сосудов. Краткое изложение интерпретируемого механизма вазорелаксантного действия растительного экстракта проиллюстрировано на рисунке 11.
Экспериментальные протоколы, предложенные в настоящем исследовании, технически осуществимы и демонстрируют хорошую воспроизводимость; тем не менее для обеспечения успеха необходимы определенные важнейшие шаги. Во-первых, состав физиологического раствора должен точно поддерживаться во время приготовления, чтобы обеспечить правильную работу процедуры. Кроме того, важно избегать прикосновения, растяжения или повреждения легочной артерии во время подготовки. Среда должна непрерывно заменяться каждые 15 минут (3 раза) для стабилизации тестирования и оценки после того, как легочная артерия прикреплена в камере ванны органа. Предварительное натяжение сосуда следует увеличить до несколько выше требуемого уровня, а затем постепенно снижать до тех пор, пока не будет достигнут оптимум (т.е. 1 г).
Несколько экспериментальных протоколов, таких как жизнеспособность кровеносных сосудов, наличие эндотелиальных клеток и влияние растительных экстрактов на расслабление кровеносных сосудов, оцениваются с помощью этой техники. Выясненная процедура выделения IPA крыс может быть настроена на другие виды (например, мышь, кролик и человек). Тем не менее, оптимальные условия, необходимые для сборки органной ванны, могут отличаться среди различных моделей животных и могут быть соответствующим образом адаптированы. Важно отметить, что экспериментальные условия не являются точной репликацией физиологических состояний, и результаты не могут быть напрямую экстраполированы на феномен in vivo .
Этот метод изоляции IPA и измерения сосудистого ответа являются практическими подходами к оценке сосудистой физиологии, патологии и фармакологии. Это позволяет исследователям изучать вазоконстрикцию и вазорелаксацию в изолированной, но хорошо контролируемой среде. Кроме того, он может быть адаптирован для изучения терапевтического действия препаратов, применяемых при легочной сосудистой патологии, такой как легочная артериальная гипертензия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Национальный исследовательский совет Таиланда, Центр передового опыта по инновациям в химии (PERCH-CIC) и Международную исследовательскую сеть (IRN61W0005) за предоставление финансовой поддержки, а также Факультет физиологии факультета медицинских наук Университета Наресуан за поддержку исследовательского центра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
