Isolatie van intrapulmonale slagader en gladde spiercellen om vasculaire reacties te onderzoeken

Summary

Vasculaire reacties van arteriële pulmonale circulatie kunnen worden onderzocht met behulp van intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's). De huidige studie beschrijft de isolatie van IPA in detail en de protocollen die worden gebruikt voor het onderzoeken van vasorelaxatie als reactie op fysiologische stimuli.

Abstract

De intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) geïsoleerd uit rattenlongen kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van vasoconstrictie en vasorelaxatie te bestuderen. Na het isoleren van de IPA en VSMC's kunnen de kenmerken van vasculaire reacties in fysiologische en pathologische omstandigheden worden beoordeeld in afwezigheid van extrinsieke factoren zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, enz. De IPA en VSMC's dienen dus als uitstekende modellen voor het bestuderen van vasculaire fysiologie / pathofysiologie, samen met verschillende experimentele onderzoeken, zoals modulatie door farmacologische middelen, patch-clamp elektrofysiologische analyse, calciumbeeldvorming, enz. Hier hebben we een techniek gebruikt voor het isoleren van de IPA om vasculaire reacties in een orgaanbadopstelling te onderzoeken. IPA-segmenten werden via intraluminale draden op de orgelbadkamer gemonteerd en gestimuleerd door verschillende farmacologische middelen. De veranderingen in de IPA vasculaire tonus (d.w.z. vasoconstrictie en vasorelaxatie) werden geregistreerd met behulp van een isometrische krachttransducer en fysiologische data-analysesoftwareprogramma. We hebben verschillende experimentele protocollen geïmplementeerd, die kunnen worden aangepast om de mechanismen van vasorelaxatie / vasoconstrictie te onderzoeken voor het bestuderen van de farmacologische activiteiten van fytochemische of synthetische geneesmiddelen. De protocollen kunnen ook worden gebruikt om de rol van geneesmiddelen bij het moduleren van verschillende ziekten, waaronder pulmonale arteriële hypertensie, te evalueren. Het IPA-model stelt ons in staat om de concentratie-responscurve te onderzoeken, die cruciaal is bij het beoordelen van de farmacodynamische parameters van geneesmiddelen.

Introduction

De pulmonale vasculatuur is een vasculair systeem onder lage druk waarbij de belangrijkste functie is om zuurstofarm bloed af te leveren aan het gasuitwisselingsgebied van de longen. De longslagaders in de longen zijn gerangschikt in takken parallel aan de bronchiale boom, waardoor uiteindelijk een uitgebreid netwerk van haarvaten wordt gevormd dat continu is over verschillende longblaasjes en uiteindelijk samenkomt in venules en aderen. De vasculaire tonus van de longslagader wordt gecontroleerd door verschillende factoren, waarbij de interactie tussen het endotheel en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's)¹ betrokken is.

In deze studie richten we ons op de endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie van de intrapulmonale slagader (IPA). Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vasorelaxatie kunnen verschillende mechanismen die optreden op het oppervlak van endotheelcellen de intracellulaire Ca²⁺ concentratie verhogen (bijv. acetylcholine [ACh] bindt met muscarinereceptor [M3]), wat leidt tot de vorming van stikstofmonoxide (NO), prostacycline (PGl₂) en van endotheel afgeleide hyperpolarisatiefactor (EDHF) (figuur 1 ). NO is de belangrijkste van endotheel afgeleide ontspannende factor gesynthetiseerd uit L-arginine door endotheel stikstofmonoxidesynthase (eNOS)², die vervolgens uit de endotheelcellen dissocieert naar VSMC's (figuur 1) en het oplosbare guanylcyclase (sGC) enzym stimuleert; dit enzym verandert guanosinetrifosfaat (GTP) in cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP), dat eiwitkinase G (PKG) activeert en cytosolische Ca²⁺ niveaus verlaagt, waardoor vasorelaxatie ontstaat (figuur 1). PGl₂ wordt gesynthetiseerd door endotheelcellen via de cyclo-oxygenase (COX) route ^3,4. Het bindt met de prostacyclinereceptor (IP) op VSMC's en stimuleert het adenylcyclase (AC) enzym, dat vervolgens adenosinetrifosfaat (ATP) omzet in cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) (figuur 1)^3,4. cAMP activeert eiwitkinase A (PKA), waardoor cytosolische Ca²⁺ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie⁵ wordt veroorzaakt (figuur 1). De EDHF-route neemt ook deel aan endotheelafhankelijke vasorelaxatie via verschillende endotheelmediatoren en elektrische gebeurtenissen. De activering van de EDHF-route leidt tot de hyperpolarisatie van VSMC's, waardoor spanningsgestuurde Ca²⁺ kanalen (VOCCs) worden gesloten, intracellulaire Ca²⁺ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie⁶ wordt geïnduceerd. De endotheelonafhankelijke vasorelaxatie vindt direct op VSMC's plaats via verschillende mechanismen, zoals de verlaging van het intracellulaire Ca²⁺ niveau, de remming van myosine light chain kinase (MLCK), de activering van myosine light chain phosphatase (MLCP) en de vermindering van Ca²⁺ gevoeligheid voor de contractiele machinerie van VSMC's. In deze studie richten we ons op de vasorelaxatie veroorzaakt door het openen van verschillende K ⁺ -kanalen, de blokkade van VOCC's en de remming van Ca^{2 +} -afgifte van het sarcoplasmatisch reticulum⁷, wat leidt tot de vermindering van intracellulaire Ca^{2 +} -niveaus, waardoor VSMC-myosine lichte ketenfosforylering en myosine-actinebinding of dwarsbrugvorming respectievelijk afnemen, uiteindelijk resulterend in vasorelaxatie.

De techniek voor het evalueren van vasoconstrictie- en vasorelaxatiemetingen in geïsoleerde IPA is goed ingeburgerd voor knaagdieren, maar de gegevens varieerden afhankelijk van de experimentele protocollen. De huidige studie beschrijft de methode die wordt gebruikt om de vasculaire reactiviteit van IPA-preparaten van ratten in vitro te evalueren, die werden gemaakt in afwezigheid van externe factoren die de vasculaire respons in vivo moduleren, zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, bloeddruk, enz.

We gebruikten verschillende experimentele protocollen met het plantenextract als voorbeeld voor het bestuderen van de vasculaire reactiviteit van IPA. Verschillende blokkers (figuur 1) werden gebruikt om de mechanismen van endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract te identificeren. Niettemin kunnen dezelfde protocollen worden aangepast om de vasculaire reacties van IPA op geneesmiddelen, extracten of fytochemicaliën te evalueren die worden gebruikt voor de behandeling van verschillende pulmonale pathologieën.

Protocol

De experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protocolnummer NU-AE620921, voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden.

1. Samenstelling van fysiologische oplossingen

1. Formuleer Krebs-oplossing door chemicaliën op te lossen in gedestilleerd water om de uiteindelijke concentraties als volgt te bereiken: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH₂PO₄, 0,5 mM NaHPO₄, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂ en 11 mM glucose⁸. Stel de pH van de oplossing in op 7,3 met 1 M NaOH en verwarm voor op 37 °C voor gebruik.
2. Bereid koude Krebs-oplossing op dezelfde manier als vermeld in stap 1.1. voor gebruik als isolatiemedium van IPA, zoals beschreven in stap 2.

2. Isolatie van de intrapulmonale slagader (IPA)

1. Verdoof 8 weken oude mannelijke Wistar-ratten met een intraperitoneale injectie van natriumthiopental (100 mg/kg)⁹. Controleer de ratten op hun reactie op pijnlijke stimuli in de diepe slaap door een tang te gebruiken die aan hun voeten is geklemd, zorg er vervolgens voor dat de ratten geen terugtrekreactie hebben voordat ze in stap 2.2 worden geëuthanaseerd.
2. Knip de middelste thorax van de rat en de hartterminal open met een schaar (maat 14 cm). Lokaliseer vervolgens de wortel van de long met een schaar (maat 14 cm). Oogst de hele long door met een schaar te knippen en dompel deze onder in koude Krebs oplossing ^10,11.
3. Snijd een enkele kwab van de long met een schaar (maat 11 cm) en leg op een petrischaaltje (maat 9 cm) met de mediale zijde/wortel van de long naar boven gericht (figuur 2A, B). Observeer en identificeer de uitlijning van de ader, bronchia en slagader van boven naar beneden (figuur 2B).
4. Knip de bronchus in de lengterichting open met een schaar (maat 11 cm). Gebruik vervolgens de tang (maat 11 cm) om de punt van de bronchus te pakken. Ontleed en verwijder voorzichtig de bronchus en aderen uit de long. Merk op dat de IPA altijd anatomisch is uitgelijnd onder de bronchus.
5. Daarna kan de belangrijkste IPA worden gevisualiseerd (figuur 2C). Gebruik de tang (maat 11 cm) om de punt van de IPA te pakken en deze voorzichtig met een schaar (maat 11 cm) uit het longweefsel te ontleden.
6. Bewaar de geïsoleerde IPA in koude Krebs-oplossing totdat het orgaanbad is ingesteld (pH 7,3 en temperatuur 4 °C)¹¹.

3. Isolatie van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's)

1. Isoleer IPA zoals eerder beschreven in stap 2. Knip de hoofdtak van de IPA in de lengterichting open met een schaar (maat 11 cm) en knip in kleine stroken (2 mm) (figuur 3A).
2. Dompel de IPA-strips onder in een dissociatiemedium (DM)^10,12 met 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH₂PO₄, 0,5 mM NaH₂PO₄, 10 mM NaHCO₃, 10 mM HEPES, 0,03 mM fenolrood, 10 mM taurine, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl₂, 11 mM glucose en 0,16 mM CaCl₂, en stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH. Incubeer de strips gedurende 1 uur bij 4 °C in DM met 1 mg/ml papaïne, 0,04% runderserumalbumine (BSA) en 0,4 mM 1,4- dithiothreitol (DTT) en incubeer verder bij 37 °C gedurende 15 minuten. Voeg 1 mg/ml collagenase type 1A toe aan DM en incubeer verder bij 37 °C gedurende 5 min.
   OPMERKING: DM is een oplossing die wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te behouden. Papaïne en collagenase type 1A zijn enzymen die de extracellulaire matrixeiwitten afbreken om enkele cellen te isoleren. BSA is een serumalbumine-eiwit dat wordt gebruikt voor de stabilisatie van enzymen tijdens opslag en enzymatische reacties. DTT is een reductiemiddel dat wordt gebruikt om de activiteit van enzymen tijdens het celisolatieproces te stabiliseren en te bevorderen. Taurine is aminozwavelzuur dat wordt gebruikt voor het stabiliseren van het celmembraan en de celintegriteit.
3. Breng de weefsels over in verse DM en dispergeer door zachte trituratie met behulp van een glazen Pasteur-pipet (figuur 3B). Blijf tritureren totdat geïsoleerde VSMC's zichtbaar worden in de badoplossing onder de microscoop (figuur 3C).
   OPMERKING: Vers geïsoleerde VSMC's kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van vasculaire fysiologie / pathofysiologie, samen met verschillende experimentele onderzoeken, zoals modulatie door farmacologische middelen, patch-clamp elektrofysiologische analyse, calcium beeldvorming, enz. De huidige studie richt zich echter alleen op de vasorelaxatie van geïsoleerde IPA met behulp van de orgelbadtechniek.

4. Orgelbad techniek

1. Isoleer IPA zoals eerder beschreven in stap 2. Snijd de hoofdtak van de IPA in ringen van ~2 mm lengte (figuur 2D)¹³.
2. Bevestig de IPA-ringen in orgaanbadkamers (figuur 4) door ze op twee roestvrijstalen draden met een diameter van 40 μm te rijgen (figuur 2E)11,13,14.
3. Bevestig roestvrijstalen draden gemonteerd met IPA-ringen aan de isometrische krachtomvormers die zijn aangesloten op het gegevensacquisitieapparaat en het computersysteem dat is geïnstalleerd met de geschikte fysiologische software voor gegevensregistratie en -analyse, en verhoog vervolgens voorzichtig de spanning van de IPA-ring tot 1 g¹¹.
4. Laat de segmenten van het vat gedurende ongeveer 45 minuten in evenwicht zijn bij een rustspanning van 1 g. Zorg er tijdens de evenwichtsperiode voor dat de Krebs-oplossing regelmatig om de 15 minuten wordt vervangen. Test na deze periode van equilibratie de levensvatbaarheid van de vaten door hun vasoconstrictie te meten tot een hoge extracellulaire K⁺ (80 mM) oplossing die 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH₂PO₄, 0,5 mM NaHPO₄, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ en 11 mM glucose^10,11 bevat.
5. Beoordeel de aan- of afwezigheid van endotheel door de ontspanningsrespons op acetylcholine (1 x 10⁻⁵ M) te berekenen in ringen die vooraf zijn samengetrokken met fenylefrine (PE, 1 x 10⁻⁵ M) (Merk op dat vasculaire contracties stabiel blijven gedurende 1 uur na toevoeging van PE). Beschouw de ringen als endotheel-intact als ze kwantificeren voor meer dan 70% ontspanning (figuur 5A). Als ze minder dan 10% ontspanning hebben, beschouw de ringen dan als endotheel-denuded¹³ (figuur 5B). Verwijder het endotheel mechanisch door voorzichtig met een kleine draad in het vat te wrijven om denudatie te induceren.
6. Nogmaals de arteriële ringen gedurende 30 minuten in evenwicht brengen voordat de testexperimenten beginnen.

5. Vasorelaxante reactie op plantenextract

1. Onderzoek het relaxerende effect van het plantenextract door IPA-ringen vooraf samen te trekken met PE (1 x 10⁻⁵ M).
2. Voeg vervolgens voorzichtig het plantenextract (1-1.000 μg / ml) cumulatief toe aan endotheel-intacte ringen en endotheel-gedenudeerde ringen om vasorelaxatie te induceren (figuur 6A, B) en om een concentratieafhankelijke responscurve te verkrijgen (figuur 6C).
3. Zorg ervoor dat het effect van dimethylsulfoxide (DMSO) dat als oplosmiddel wordt gebruikt, ook op dezelfde manier wordt geëvalueerd om als negatieve controle te dienen (figuur 6C).

6. Mechanisme van door plantenextract geïnduceerde vasorelaxatie via het endotheel

1. Evalueer het vasorelaxant werkingsmechanisme van het plantenextract via endotheel stikstofmonoxidesynthase (eNOS), cyclo-oxygenase (COX)¹³ en van endotheel afgeleide hyperpolariserende factor (EDHF) routes door de endotheel-intacte IPA-ringen gedurende 30 minuten te incuberen met de volgende remmers (figuur 7A): 1 x 10⁻⁴ M NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME, een eNOS-remmer)⁹, 1 x 10⁻⁵ M indomethacine (een COX-remmer)⁹, of een combinatie van 1 x 10⁻⁷ M apamin (een kleine calcium-geactiveerde kaliumkanaalblokker) en 1 x 10⁻⁷ M charybdotoxine (een intermediaire en grootgeleidende calciumgeactiveerde kaliumkanaalblokker), voorafgaand aan het induceren van contracties van IPA met 1 x 10⁻⁵ M PE.
2. Voeg vervolgens, nadat de samentrekkingen tot PE stabiliseren, cumulatieve concentraties (0,1-1.000 μg / ml) van het plantenextract toe.
3. Presenteer de effecten van plantenextract als procentuele ontspanning van de IPA-ringen in aanwezigheid van remmers in vergelijking met de respons van de IPA-ringen zonder remmers (figuur 7B-D) en construeer de concentratie-responscurve.

7. Mechanisme van door plantenextract geïnduceerde vasorelaxatie via vasculaire gladde spieren K ^{+ -} kanalen

1. Voorinfabeer endothelium-gedenudeerde IPA-ringen gedurende 30 minuten met 1 x 10⁻³ M 4-aminopyridine (4-AP), een blokker van spanningsafhankelijk kaliumkanaal (K_V) (figuur 8A), 1 x 10⁻⁵ M glibenclamide, een blokker van ATP-gevoelig kaliumkanaal (K_ATP), of 1 x 10⁻⁷ M iberiotoxine, een blokker van grote geleiding Ca²⁺-geactiveerde K⁺ kanalen (K_Ca), voorafgaand aan het induceren van weeën van IPA met 1 x 10⁻⁵ M PE.
2. Voeg vervolgens cumulatieve concentraties van het plantenextract toe.
3. Presenteer de effecten van plantenextract als procentuele ontspanning van de IPA-ringen met remmer in vergelijking met de IPA-ringen zonder remmer (figuur 8B-D) en construeer de concentratie-responscurve.

8. Mechanisme van door plantenextract geïnduceerde vasorelaxatie via remming van extracellulaire calcium (Ca²⁺) instroom in VSMC's

1. Pre-incubeer endothelium-denuded IPA-ringen gedurende 30 minuten in Ca²⁺-vrije Krebs-oplossing met 1 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA) (figuur 9A).
2. Vervang vervolgens de badoplossing door Ca²⁺ vrije-80 mM K⁺ oplossing gedurende 10 minuten om de VSMC's te depolariseren, die vervolgens de VOCCs openen (figuur 9A).
3. Voeg cumulatief CaCl₂ (0,01-10 mM) toe om vasoconstrictie van de IPA te induceren en construeer de concentratie-responscurve (figuur 9A).
4. Herhaal dit protocol in dezelfde IPA-ringen, maar incubeer ze vooraf met plantenextract of 1 μM nicardipine (L-type Ca²⁺ kanaalblokker) in Ca²⁺ met 80 mM K⁺ oplossing gedurende 10 minuten gevolgd door de cumulatieve toevoeging van CaCl₂⁸.
5. Vergelijk ten slotte de contractiele respons met de maximale krimp die eerder werd uitgelokt door controle CaCl_{2-uitdagingen} (figuur 9B).

9. Mechanisme van door plantenextract geïnduceerde vasorelaxatie via remming van intracellulaire calcium (Ca²⁺) afgifte uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR)

1. Stel endotheel-gedenudeerde IPA-ringen bloot aan een K⁺ oplossing van 80 mM gedurende ongeveer 5 minuten, waarbij de VSMC's worden gedepolariseerd, de VOCCs worden geopend en uiteindelijk de Ca²⁺ belasting in de SR wordt gegenereerd (figuur 10A).
2. Vervang de badoplossing gedurende 10 minuten door Ca²⁺-vrije Krebs-oplossing die 1 mM EGTA bevat (figuur 10A).
3. Daag vervolgens de IPA-ringen uit met 1 x 10⁻⁵ M PE, die de fosfolipase C / IP_3-route activeert, waardoor uiteindelijk Ca^{2 +} van de SR wordt vrijgegeven en een voorbijgaande contractie van IPA wordt opgeroepen (figuur 10A).
4. Herhaal hetzelfde protocol om eveneens voorbijgaande contracties naar PE vast te stellen.
5. Daag de IPA-ringen opnieuw uit met 80 mM K⁺ oplossing gedurende ongeveer 5 minuten en vervang vervolgens de badoplossing door Ca²⁺-vrije Krebs-oplossing met 1 mM EGTA met of zonder het plantenextract gedurende 10 minuten.
6. Nogmaals, daag de IPA-ringen uit met 1 x 10⁻⁵ M PE.
7. Vergelijk de door PE geïnduceerde IPA-contracties tussen de conditie met en zonder het plantenextract (figuur 10B).

10. Statistische analyse

1. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± SEM. Vergelijk deze waarden met behulp van de Student's t-test of analyseer door een variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de Tukey-Kramer post hoc test met behulp van geschikte statistische software. Beschouw de verschillen op p < 0,05 als statistisch significant. Hier waren er n = 6 ratten/experimenteel protocol.
   OPMERKING: De opname van vasoconstrictie en vasorelaxatie kan worden beoordeeld met geschikte software die op de computer is geïnstalleerd. Figuur 5A laat bijvoorbeeld zien dat, wanneer de bloedvaten worden gestimuleerd door de PE die contractie veroorzaakt, dit kan worden waargenomen aan de verhoogde spanning van de oorspronkelijke tracering. De tracering stabiliseert zich in 20-30 minuten, wat als een 100% krimp wordt beschouwd. Daarna stimuleert de ACh de bloedvaten, waardoor ontspanning ontstaat, wat kon worden waargenomen door de verminderde spanning van de oorspronkelijke tracering. De verminderde spanning wordt dus berekend als het percentage ten opzichte van 100% krimp.

Representative Results

Het protocol in deze studie is ontwikkeld om de optimale experimentele omstandigheden te bepalen voor het meten van fysiologische verschijnselen waargenomen in de vasculaire reacties van geïsoleerde IPA-preparaten. De proefexperimenten werden uitgevoerd om de mogelijke uitkomsten te beschrijven die helpen bij het begrijpen van de vasculaire effecten en de mechanistische basis van de vasorelaxante werking van het plantenextract, als volgt.

Vasorelaxant effect van het plantenextract
Zoals te zien is in figuur 6A,B, veroorzaakte het plantenextract in endotheel-intact IPA (E+) een concentratieafhankelijke reactie van vasorelaxatie (EC₅₀ = 66,88 μg/ml, figuur 6C). Uitroeiing van endotheel (E-) verminderde de vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract sterk (p < 0,01), zoals blijkt uit de toename van de EC₅₀ met 2,2-voudig (E-, EC₅₀ = 150,60 μg/ml, figuur 6C). Het voertuig, DMSO, had geen effect. Het plantenextract produceerde dus vasorelaxatie voornamelijk via een endotheelafhankelijke route en gedeeltelijk via een endotheelonafhankelijke route.

Mechanisme van vasorelaxerende werking van het plantenextract via endotheelafhankelijke routes
Zoals te zien is in figuur 7, verminderde het gebruik van L-NAME voor de remming van eNOS (figuur 7B) en de combinatie van apamin plus charybdotoxine voor het blokkeren van EDHF (figuur 7D) duidelijk de vasorelaxante respons op het plantenextract. Hierdoor verschoof de concentratie-responscurve naar rechts en steeg de EC₅₀ zonder de E_max waarden te wijzigen. Integendeel, indomethacine (een COX-remmer) (figuur 7C) vertoonde geen effect op de vasorelaxante respons op het plantenextract.

Karakterisering van de rol van K⁺ kanalen in vasorelaxant werking van het plantenextract
In de endotheel-gedenudeerde IPA-ringen verminderde de K Ca-kanaalblokker (iberiotoxine) de vasorelaxante respons op het plantenextract (figuur 8C), terwijl blokkers van K_v (4-AP) of K_ATP (glibenclamide) kanalen de vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract niet wijzigden (figuur 8B, D).

Mechanisme van vasorelaxante werking van het plantenextract via extracellulaire Ca²⁺ instroomremming
Om te onderzoeken of het mechanisme van vasorelaxante werking van het plantenextract extracellulaire Ca²⁺ instroomremming betrof, werd de vasoconstrictie van endotheel-gedenudeerde IPA-ringen opgeroepen door 1 x 10^−5-1 x 10⁻² M CaCl₂ in Ca²⁺-vrije Krebs-oplossing opgenomen met 80 mM K⁺ om de VOCCs te activeren (Figuur 9A,B). Pre-incubatie met het plantenextract (68 μg/ml, EC_50-waarde) remde cacl 2-geïnduceerde contractie (p < 0,001 vs. voertuig).

Mechanisme van vasorelaxerende werking van het plantenextract via remming van intracellulaire Ca²⁺ afgifte uit de SR
Om te onderzoeken of het vrijkomen van intracellulaire Ca²⁺ uit de SR een rol speelde in het vasorelaxant effect, werden de endotheel-gedenudeerde IPA-ringen vooraf geïncubeerd met Ca²⁺-vrije Krebs-oplossing, gevolgd door de toevoeging van PE (1 x 10⁻⁵ M), waardoor een voorbijgaande contractie ontstond (figuur 10A). Vervolgens werd dit experiment in dezelfde IPA-ring gerepliceerd in de aanwezigheid van een voertuig of plantenextract. In vergelijking met het medium verminderde het plantenextract aanzienlijk (p < 0,001) de door PE geïnduceerde krimp (figuur 10B).

Figuur 1: Vasculaire tonusregulatie via endotheelafhankelijke en -onafhankelijke routes. AA = Arachidonzuur, ACh = Acetylcholine, AC = Adenylylcyclase, ATP = Adenosine 5'-trifosfaat, cAMP = Cyclisch adenosinemonofosfaat, cGMP = Cyclisch guanosinemonofosfaat, COX = Cyclooxygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Van endotheel afgeleide hyperpolariserende factor, eNOS = Endotheel stikstofmonoxidesynthase, G_q = G-eiwittype q, G_s = G-eiwittype s, GTP = Guanosinetrifosfaat, IP = Prostacyclinereceptor, IP₃ = Inositol 1, 4, 5 trisfosfaat, IP₃ R = IP₃ receptor, IK_Ca = Intermediaire geleiding Ca²⁺-geactiveerd K⁺ kanaal, K_V = Voltage-gated kaliumkanalen, K_ATP = ATP-gevoelige kaliumkanalen, K_Ca = Grote geleiding Ca²⁺-geactiveerde K⁺ kanalen, M3 = Muscarine receptor, MEGJ = Myoendothelial gab junction, NO = Stikstofmonoxide, PE = Fenylefrine, BGA₂ = Prostacyclin, PG_s = Prostaglandinen, PIP₂ = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfaat, PKA = Eiwitkinase A, PKG = Eiwitkinase G, PLA₂ = Fosfolipase A₂, PLC = Fosfolipase C, ROCC's = Receptor-operated Ca²⁺ kanalen, RYR = Ryanodine receptor, sGC = Oplosbare guanylcyclase, SK_Ca = Small conductance Ca²⁺-geactiveerd K⁺ kanaal, SR = Sarcoplasmatisch reticulum, VOCCs = Voltage-operated Ca²⁺ kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Belangrijkste stappen van de intrapulmonale slagader (IPA) isolatie bij ratten. (A) De foto toont rattenlong met IPA. (B) Dissectie van de mediale zijde/wortel van de long naar boven gericht. (C) Gevisualiseerde hoofd-IPA na het verwijderen van de aderen en bronchia. D) Geïsoleerde IPA. (E) De IPA-ringen werden op een paar roestvrijstalen draden gemonteerd voor een vasculair responsonderzoek met behulp van de orgelbadtechniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Belangrijkste stappen van de IPA vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) isolatie. (A) Geïsoleerde IPA werd in kleine stroken gesneden en ondergedompeld in dissociatiemedium (DM). (B) Trituratie van vasculaire strips om VSMC's te isoleren. (C) Geïsoleerde VSMC's na zachte trituratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Schematische illustratie van de apparatuur die wordt gebruikt om de vasculaire reactiviteit te testen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Representatief record met vasorelaxatie van IPA-ringen vooraf gecontracteerd met 10 μM PE door 10 μM acetylcholine (ACh). (A) Endotheel-intacte ring (E +) en (B) endotheel-gedenudeerde (E-) ring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vasorelaxatie van IPA door het plantenextract. (A) Representatief verslag met vasorelaxatie van IPA-ringen door het plantenextract (1-1.000 μg/ml) vooraf gecontracteerd met 10 μM PE in endotheel-intacte ringen (E+) en (B) endotheel-gedenudeerde (E-) ringen. (C) Concentratie-responscurven van vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract in IPA-ringen (E+, n = 6 en E-, n = 6). Vasorelaxatie wordt uitgedrukt als een percentage van de door PE geïnduceerde contractie. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 ten opzichte van het voertuig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. De mechanismen van de door plantenextract geïnduceerde IPA-vasorelaxatie via de endotheelafhankelijke route. (A) Representatief verslag waaruit vasorelaxatie door het plantenextract (1-1.000 μg/ml) van endotheel-intacte IPA-ringen (E+) blijkt, vooraf geïncubeerd met L-NAME (eNOS-remmer) en vooraf gecontracteerd met 10 μM PE. (B-D) Concentratie-responscurven van de door plantenextract geïnduceerde vasorelaxaties van endotheel-intacte (E+) IPA-ringen vooraf gecontracteerd met PE en vooraf geïncubeerd met remmers van verschillende endotheelsignaleringsroutes, waaronder (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indomethacine, of (D) 0,1 μM apamin plus 0,1 μM charybdotoxine. Waarden zijn middelen ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. Effect van K⁺ kanaalblokkers op de door plantenextract geïnduceerde IPA vasorelaxatie. (A) Representatief verslag waaruit vasorelaxatie door het plantenextract (1-1.000 μg/ml) van geëdothelium-gedenudeerde (E-) IPA-ringen geïncubeerd met 4-AP (K V-kanaalblokker) en vooraf gecontracteerd met 10 μM PE. (B-D) Concentratie-responscurven van de door plantenextract geïnduceerde vasorelaxatie van endotheel-gedenudeerde (E-) IPA-ringen vooraf gecontracteerd met PE en vooraf geïncubeerd met verschillende K⁺ kanaalblokkers, waaronder (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenclamide, of (D) 30 nM iberiotoxine. Waarden zijn middelen ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9. Effect van het plantenextract op extracellulaire Ca²⁺ instroom. (A) Representatieve gegevens waaruit blijkt dat cacl 2-geïnduceerde contractie van IPA-ringen ontbreekt (controle) of aanwezigheid van het plantenextract. IPA-ringen werden gebaad in Ca²⁺-vrije hoge K⁺-oplossing (80 mM) met 10 mM EGTA en de contractie die werd opgeroepen door een cumulatieve concentratie van CaCl₂ werd gemeten. Dit protocol werd vervolgens alleen herhaald (controle, n = 6) of in aanwezigheid van het plantenextract (n = 6). (B) Concentratie-responscurven voor CaCl 2-geïnduceerde contractie van IPA-ringen in afwezigheid (controle) of aanwezigheid van het plantenextract of 1 μM nicardipine (L-type Ca²⁺ kanaalblokker). De CaCl 2-geïnduceerde contractie werd berekend als percentage van de maximale contractie geregistreerd vanaf de eerste CaCl_2-toepassing en uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 in vergelijking met nicardipine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10. Effect van het plantenextract op Ca²⁺ afgifte uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR). (A) Representatief verslag waaruit blijkt dat fenylefrine (PE)-geïnduceerde contractie van IPA-ringen door Ca²⁺ afgifte uit de SR van endothelium-gedenudeerde IPA-ringen in aanwezigheid van DMSO (controle) en 10 μM plantenextract. De gegevens zijn procentuele contractie tot 10 μM PE-geïnduceerde contracties in vergelijking met contracties geproduceerd door het initiële protocol zonder het plantenextract. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. **p < 0,01 in vergelijking met voertuig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Voorgesteld werkingsmechanisme van vaatverwijdende werking van het plantenextract op intrapulmonale slagader van ratten via endotheelafhankelijke en -onafhankelijke routes AA = Arachidonzuur, ACh = Acetylcholine, AC = Adenylylcyclase, ATP = Adenosine 5'-trifosfaat, cAMP = Cyclisch adenosinemonofosfaat, cGMP = Cyclisch guanosinemonofosfaat, COX = Cyclooxygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Van endotheel afgeleide hyperpolarisatiefactor, eNOS = Endotheelnitriumnitoxidesynthase, G_q = G-eiwit type q, G_s = G-eiwit type s, GTP = Guanosinetrifosfaat, IP = Prostacycline receptor, IP₃ = Inositol 1, 4, 5 trisfosfaat, IP₃R = IP₃ receptor, IK_Ca = Intermediaire geleiding Ca²⁺-geactiveerd K⁺ kanaal, K_V = Voltage-gated kaliumkanalen, K_ATP = ATP-gevoelige kaliumkanalen, K_Ca = Grote geleiding Ca²⁺-geactiveerd K⁺ kanalen, M3 = Muscarinereceptor, MEGJ = Myoendothelial gab junction, NO = Stikstofmonoxide, PE = Fenylefrine, BGA₂ = Prostacycline, PG_s = Prostaglandinen, PIP₂ = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfaat, PKA = Eiwitkinase A, PKG = Eiwitkinase G, PLA₂ = Fosfopase A₂, PLC = Fosfolipase C, ROCCs = Receptor-bediende Ca²⁺ kanalen, RYR = Ryanodine receptor, sGC = Oplosbare guanylylcyclase, SK_Ca = Kleine geleiding Ca ²⁺-geactiveerd K⁺ kanaal, SR = Sarcoplasmatisch reticulum_, VOCCs = Voltage-operated Ca²⁺ kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In dit manuscript beschrijven we de techniek voor de isolatie van ratten IPA en VSMC's. Verschillende experimentele protocollen zijn gebruikt om de vasculaire respons van IPA in vitro te onderzoeken, die kan worden gebruikt om het farmacologische effect en de mechanistische basis van IPA-vasorelaxatie geïnduceerd door plantenextract te karakteriseren.

Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vaatverwijdende werking van het plantenextract werden verschillende blokkers zoals L-NAME (eNOS), indomethacine (COX) en apamin + charybdototoxine (EDHF) gebruikt. De representatieve gegevens toonden zowel positieve resultaten (d.w.z. significante vermindering van vaatverwijdende respons in aanwezigheid van eNOS- of EDHF-remmers) als negatieve resultaten (d.w.z. geen verandering in vaatverwijdende respons in aanwezigheid van de COX-remmer), wat suggereert dat het plantenextract werkt via de eNOS- en EDHF-endotheelroutes. Het endotheelonafhankelijke vasorelaxant effect geïnduceerd door het plantenextract werd geëvalueerd via de betrokkenheid van de K ⁺ -kanalen, extracellulaire Ca^{2 +} instroom en Ca^{2 +} -afgifte van de SR. De resultaten toonden aan dat vasorelaxatie als reactie op het plantenextract werd verminderd door een blokker van K_Ca-kanalen (iberiotoxine), maar niet door een blokker van K_V-kanalen (4-AP) of een blokker van K_ATP-kanalen (glibenclamide), wat suggereert dat het extract werkt via de opening van K_Ca-kanalen. Bovendien werd de CaCl 2-geïnduceerde vasoconstrictie verminderd door het plantenextract, wat suggereert dat het mechanisme ervan de remming van VOCCs op de VSMC's of interferentie met de interacties van Ca²⁺ met contractiele machines inhield. Aanvullende studies moeten worden uitgevoerd om de gedetailleerde mechanistische werking verder te analyseren. Bovendien werd de voorbijgaande contractie naar PE in Ca²⁺-vrije Krebs verminderd, wat aangeeft dat het plantenextract de afgifte van Ca²⁺ uit de SR remde, wat leidde tot de vermindering van vasoconstrictie. Een samenvatting van het geïnterpreteerde mechanisme van de vasorelaxerende werking van het plantenextract wordt geïllustreerd in figuur 11.

De in deze studie voorgestelde experimentele protocollen zijn technisch haalbaar en vertonen een goede reproduceerbaarheid; niettemin zijn bepaalde cruciale stappen essentieel om succes te garanderen. Ten eerste moet de samenstelling van de fysiologische oplossing tijdens de voorbereiding nauwkeurig worden gehandhaafd om ervoor te zorgen dat de procedure goed werkt. Ook is het van vitaal belang om te voorkomen dat u de longslagader aanraakt, uitrekt of beschadigt tijdens de voorbereiding. Het medium moet continu om de 15 minuten (3 keer) worden vervangen om het testen en evalueren te stabiliseren zodra de longslagader in de orgaanbadkamer is aangebracht. De voorspanning van het vat moet worden verhoogd tot iets boven het vereiste niveau en vervolgens geleidelijk worden verlaagd totdat het optimum is bereikt (d.w.z. 1 g).

Verschillende experimentele protocollen, zoals de levensvatbaarheid van bloedvaten, de aanwezigheid van endotheelcellen en het effect van plantenextracten op de ontspanning van bloedvaten, worden met deze techniek geëvalueerd. De opgehelderde procedure voor de isolatie van ratten-IPA kan worden afgestemd op andere soorten (bijv. Muis, konijn en mens). Niettemin kunnen de optimale omstandigheden die nodig zijn voor de montage van een orgelbad verschillen tussen verschillende diermodellen en dienovereenkomstig worden aangepast. Belangrijk is dat de experimentele omstandigheden geen exacte replicatie zijn van fysiologische omstandigheden en dat de resultaten niet direct kunnen worden geëxtrapoleerd naar het in vivo fenomeen.

Deze IPA-isolatiemethode en vasculaire responsmetingen zijn praktische benaderingen voor het evalueren van vasculaire fysiologie, pathologie en farmacologie. Het stelt onderzoekers in staat om vasoconstrictie en vasorelaxatie te bestuderen in een geïsoleerde maar goed gecontroleerde omgeving. Bovendien kan het worden aangepast voor het bestuderen van de therapeutische werking van geneesmiddelen die worden gebruikt voor pulmonale vasculaire pathologie, zoals pulmonale arteriële hypertensie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632 CAS NO. 348-12-3
4-aminopyridine (4-AP)	Aldrich Chemical	A78403 CAS NO. 504-24-5
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625 CAS NO. 60-31-1
Apamin	Sigma-Aldrich	A9459 CAS NO. 24345-16-2
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153 CAS NO. 9048-46-8
Calcium choride	Ajax Finechem	AJA960 CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin	Sigma-Aldrich	C7802 CAS NO. 95751-30-7
Collagenase type 1A	Sigma-Aldrich	C9891 CAS NO. 9001-12-1	From Clostridium histolyticum
D(+)-Glucose monohydrate	Millipore Corporation	K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540 CAS NO. 67-68-5
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889 CAS NO. 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884 CAS NO. 60-00-4
Forceps 11 cm.	Rustless Dumoxel	-
Forceps 14 cm.	Rustless Dumoxel	-
Glibenclamide	Sigma-Aldrich	G6039 CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism program	Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375 CAS NO. 7365-45-9
Iberiotoxin	Sigma-Aldrich	I5904 CAS NO. 1002546960	recombinant from Mesobuthus tamulus
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378 CAS NO. 53-86-1
Labchart Program	Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).
Magnesium chloride	Ajax Finechem	296 CAS NO. 1506254995
Male Wistar rats	Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand
NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)	Sigma-Aldrich	N5751 CAS NO. 51298-62-5
Nicardipine	Sigma-Aldrich	N7510 CAS NO. 54527-84-3
Organ bath 15 mL.	-	-	Specific order by the researchers
Papain	Sigma-Aldrich	P4762 CAS NO. 9001-73-4	FromPapaya Latex
Phenal red	Sigma-Aldrich	P5530 CAS NO. 34487-61-1
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126 CAS NO. 61-76-7
Potassium chloride	Kemaus	KA383 CAS NO. 7447-40-7
Potassium dihydrogenphosphate	Aldrich Chemical	EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0
S+A2:E36odium chloride	Kemaus	KA465 CAS NO. 7647-14-5
Scissors 11 cm.	Spall Stainless	-
Scissors 14 cm.	Spall Stainless	-
Sodium bicarbonate	Ajax Finechem	475 CAS NO. 912466
Sodium dihydrogenphosphate	Aldrich Chemical	33,198-8 CAS NO. 7558-80-7
Sodium hydroxide	Ajax Finechem	482 CAS NO. 1506196602
Sodium thiopental	Anesthal	JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625 CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45	Memmert	2766 CAS NO. -