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Isolement de l’artère intrapulmonaire et des cellules musculaires lisses pour étudier les réponses vasculaires

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63686
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 4, 1, 1
1Department of Physiology, Faculty of Medical Science and Center of Excellence for Innovation in Chemistry, Naresuan University, 2Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 3Cosmetics and Natural Products Research Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 4Snyder Institute for Chronic Diseases, Airways Inflammation Research Group, Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary

Summary

Les réponses vasculaires de la circulation pulmonaire artérielle peuvent être explorées à l’aide de l’artère intrapulmonaire (API) et des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). La présente étude décrit en détail l’isolement de l’IPA et les protocoles utilisés pour étudier la vasorelaxation en réponse à des stimuli physiologiques.

Abstract

L’artère intrapulmonaire (API) et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) isolées des poumons de rat peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents de la vasoconstriction et de la vasorelaxation. Après avoir isolé l’IPA et les VSMC, les caractéristiques des réponses vasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être évaluées en l’absence de facteurs extrinsèques tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, etc. Ainsi, l’IPA et les VSMC sont d’excellents modèles pour l’étude de la physiologie/physiopathologie vasculaire, ainsi que diverses investigations expérimentales, telles que la modulation par des agents pharmacologiques, l’analyse électrophysiologique patch-clamp, l’imagerie calcique, etc. Ici, nous avons utilisé une technique pour isoler l’API afin d’étudier les réponses vasculaires dans une configuration de bain d’organes. Des segments d’IPA ont été montés sur la chambre du bain d’organes via des fils intraluminaux et stimulés par divers agents pharmacologiques. Les changements dans le tonus vasculaire de l’API (c.-à-d. vasoconstriction et vasorelaxation) ont été enregistrés à l’aide d’un transducteur de force isométrique et d’un logiciel d’analyse de données physiologiques. Nous avons mis en place plusieurs protocoles expérimentaux, qui peuvent être adaptés pour étudier les mécanismes de vasorelaxation/vasoconstriction pour étudier les activités pharmacologiques des médicaments phytochimiques ou synthétiques. Les protocoles peuvent également être utilisés pour évaluer le rôle des médicaments dans la modulation de diverses maladies, y compris l’hypertension artérielle pulmonaire. Le modèle IPA nous permet d’étudier la courbe concentration-réponse, ce qui est crucial pour évaluer les paramètres pharmacodynamiques des médicaments.

Introduction

Le système vasculaire pulmonaire est un système vasculaire à basse pression dont la fonction principale est de fournir du sang désoxygéné à la zone d’échange de gaz des poumons. Les artères pulmonaires dans les poumons sont disposées en branches parallèles à l’arbre bronchique, formant finalement un vaste réseau de capillaires qui est continu sur plusieurs alvéoles et, enfin, se rejoignant en veinules et veines. Le tonus vasculaire de l’artère pulmonaire est contrôlé par plusieurs facteurs, impliquant l’interaction entre l’endothélium et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC)1.

Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium de l’artère intrapulmonaire (API). En ce qui concerne la vasorelaxation dépendante de l’endothélium, divers mécanismes se produisant à la surface des cellules endothéliales pourraient augmenter la concentration intracellulaire de Ca2+ (p. ex., l’acétylcholine [ACh] se lie au récepteur muscarinique [M3]), conduisant à la formation d’oxyde nitrique (NO), de prostacycline (PGl2) et de facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) (Figure 1 ). Le NO est le principal facteur de relaxation dérivé de l’endothélium synthétisé à partir de la L-arginine par l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS)2, qui se dissocie ensuite des cellules endothéliales en VSMC (Figure 1) et stimule l’enzyme soluble guanylyl cyclase (sGC) ; cette enzyme transforme la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc), qui active la protéine kinase G (PKG) et réduit les niveaux cytosoliques de Ca2+, provoquant ainsi une vasorelaxation (Figure 1). PGl2 est synthétisé par les cellules endothéliales via la voie cyclo-oxygénase (COX) 3,4. Il se lie au récepteur de la prostacycline (IP) sur les VSMC et stimule l’enzyme adénylyl cyclase (AC), qui convertit ensuite l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (Figure 1)3,4. L’AMPc active la protéine kinase A (PKA), réduisant les taux cytosoliques de Ca2+ et provoquant une vasorelaxation5 (Figure 1). La voie EDHF participe également à la vasorelaxation dépendante de l’endothélium via divers médiateurs endothéliaux et événements électriques. L’activation de la voie EDHF conduit à l’hyperpolarisation des VSMC, fermant ainsi les canaux Ca 2+ (VOCC) actionnés par tension, réduisant les niveaux intracellulaires de Ca 2+ et induisant une vasorelaxation 6. La vasorelaxation indépendante de l’endothélium se produit directement sur les VSMC via plusieurs mécanismes, tels que la réduction du niveau intracellulaire de Ca 2+, l’inhibition de la myosine light chain kinase (MLCK), l’activation de la myosine phosphatase à chaîne légère (MLCP) et la réduction de la sensibilité Ca2+ à la machinerie contractile des VSMC. Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation causée par l’ouverture de divers canaux K+, le blocage des VOCC et l’inhibition de la libération de Ca 2+ par le réticulum sarcoplasmique7, ce qui conduit à la réduction des niveaux intracellulaires de Ca 2+, diminuant ainsi la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine VSMC et la liaison myosine-actine ou la formation de ponts croisés, respectivement, aboutissant finalement à une vasorelaxation.

La technique d’évaluation des mesures de vasoconstriction et de vasorelaxation dans l’IPA isolé est bien établie pour les rongeurs, mais les données variaient selon les protocoles expérimentaux. La présente étude décrit la méthode utilisée pour évaluer les réactivités vasculaires de préparations IPA in vitro de rat, qui ont été réalisées en l’absence de facteurs externes modulant la réponse vasculaire in vivo, tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, la pression artérielle, etc.

Nous avons utilisé plusieurs protocoles expérimentaux utilisant l’extrait de plante comme exemple pour étudier les réactivités vasculaires de l’API. Différents bloqueurs (Figure 1) ont été utilisés pour identifier les mécanismes de vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium induite par l’extrait de plante. Néanmoins, les mêmes protocoles peuvent être adaptés pour évaluer les réponses vasculaires de l’IPA à tout médicament, extrait ou phytochimique utilisé pour le traitement de diverses pathologies pulmonaires.

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Protocol

Les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Naresuan (NUACUC), numéro de protocole NU-AE620921, pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.

1. Composition des solutions physiologiques

  1. Formuler la solution de Krebs en dissolvant des produits chimiques dans de l’eau distillée pour obtenir les concentrations finales comme suit: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2et 11 mM glucose8. Ajuster le pH de la solution à 7,3 avec 1 M NaOH et préchauffer à 37 °C avant utilisation.
  2. Préparer la solution froide de Krebs de la même manière que celle mentionnée à l’étape 1.1. pour une utilisation comme milieu d’isolement de l’IPA, comme décrit à l’étape 2.

2. Isolement de l’artère intrapulmonaire (API)

  1. Anesthésier des rats Wistar mâles âgés de 8 semaines avec une injection intrapéritonéale de thiopental de sodium (100 mg/kg)9. Vérifiez la réaction des rats aux stimuli douloureux dans le sommeil profond en utilisant des forceps serrés à leurs pieds, puis assurez-vous que les rats n’ont pas de réaction de retrait du pied avant de les euthanasier à l’étape 2.2.
  2. Coupez le thorax moyen du rat et la terminaison cardiaque avec des ciseaux (taille 14 cm). Ensuite, localisez la racine du poumon avec des ciseaux (taille 14 cm). Récolter tout le poumon en le coupant avec des ciseaux et l’immerger dans la solution froide de Krebs10,11.
  3. Trancher un seul lobe du poumon avec des ciseaux (taille 11 cm) et placer sur une boîte de Petri (taille 9 cm) avec la face médiale/racine du poumon tournée vers le haut (Figure 2A, B). Observez et identifiez l’alignement de la veine, des bronches et de l’artère de haut en bas (Figure 2B).
  4. Couper la bronche longitudinalement avec des ciseaux (taille 11 cm). Ensuite, utilisez la pince (taille 11 cm) pour saisir le bout de la bronche. Disséquez doucement et retirez les bronches et les veines du poumon. Notez que l’API est toujours anatomiquement alignée sous la bronche.
  5. Après cela, l’API principale peut être visualisée (Figure 2C). Utilisez la pince (taille 11 cm) pour saisir la pointe de l’IPA et disséquez-la soigneusement hors du tissu pulmonaire avec des ciseaux (taille 11 cm).
  6. Conserver l’IPA isolée dans une solution froide de Krebs jusqu’à ce que l’ensemble de bain d’organes soit mis en place (pH 7,3 et température 4 °C)1 1.

3. Isolement des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC)

  1. Isolez l’IPA comme décrit précédemment à l’étape 2. Couper longitudinalement la branche principale de l’IPA avec des ciseaux (taille 11 cm) et couper en petites bandes (2 mm) (figure 3A).
  2. Immerger les bandelettes d’IPA dans un milieu de dissociation (DM)10,12 contenant 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,5 mM KH 2PO4, 0,5 mM NaH2PO4,10 mM de NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM de rouge phénol, 10 mM de taurine, 0,5 mM d’EDTA,2mM de MgCl2, 11 mM de glucose et 0,16 mM deCaCl2, et ajuster le pH à 7,0 avec 1 M NaOH. Incuber les bandelettes pendant 1 h à 4 °C dans du DM contenant 1 mg/mL de papaïne, 0,04 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,4 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT), puis incuber à 37 °C pendant 15 min. Ajouter 1 mg/mL de collagénase de type 1A dans le DM et incuber à 37 °C pendant 5 min.
    REMARQUE: DM est une solution utilisée pour préserver la viabilité cellulaire. La papaïne et la collagénase de type 1A sont des enzymes qui décomposent les protéines de la matrice extracellulaire pour isoler des cellules individuelles. BSA est une protéine d’albumine sérique utilisée pour la stabilisation des enzymes pendant le stockage et les réactions enzymatiques. Le DTT est un agent réducteur utilisé pour stabiliser et promouvoir l’activité des enzymes pendant le processus d’isolement cellulaire. La taurine est un acide aminé sulfurique utilisé pour stabiliser la membrane cellulaire et l’intégrité cellulaire.
  3. Transférer les tissus dans du DM frais et les disperser par trituration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en verre (figure 3B). Continuez à triturer jusqu’à ce que les VSMC isolés deviennent visibles dans la solution de bain au microscope (Figure 3C).
    NOTE: Les VSMC fraîchement isolés peuvent être utilisés pour étudier la physiologie / physiopathologie vasculaire, ainsi que diverses investigations expérimentales, telles que la modulation par des agents pharmacologiques, l’analyse électrophysiologique patch-clamp, l’imagerie calcique, etc. Cependant, la présente étude se concentre uniquement sur la vasorelaxation de l’IPA isolée à l’aide de la technique du bain d’organes.

4. Technique des bains d’organes

  1. Isolez l’IPA comme décrit précédemment à l’étape 2. Couper la branche principale de l’API en anneaux de ~2 mm de longueur (Figure 2D)13.
  2. Fixer les anneaux IPA dans les chambres des bains d’organes (Figure 4) en les enfilant sur deux fils d’acier inoxydable de 40 μm de diamètre (Figure 2E)11,13,14.
  3. Fixez des fils en acier inoxydable montés avec des anneaux IPA aux capteurs de force isométriques connectés au dispositif d’acquisition de données et au système informatique installé avec le logiciel physiologique approprié pour l’enregistrement et l’analyse des données, puis augmentez doucement la tension de l’anneau IPA à 1 g11.
  4. Laisser les segments du récipient s’équilibrer pendant environ 45 minutes à une tension au repos de 1 g. Pendant la période d’équilibration, assurez-vous que la solution de Krebs est régulièrement changée toutes les 15 minutes. Après cette période d’équilibre, tester la viabilité des vaisseaux en mesurant leur vasoconstriction à haute solution extracellulaire de K+ (80 mM) contenant 47,4 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO 4, 1,8 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2et 11 mM de glucose10,11.
  5. Évaluer la présence ou l’absence d’endothélium en calculant la réponse de relaxation à l’acétylcholine (1 x 10−5 M) dans les anneaux précontractés avec la phényléphrine (PE, 1 x 10−5 M) (Notez que les contractions vasculaires restent stables pendant 1 h après l’ajout d’EP). Considérez les anneaux comme intacts à l’endothélium s’ils quantifient une relaxation supérieure à 70% (Figure 5A). S’ils ont moins de 10% de relaxation, considérez les anneaux comme dénudés d’endothélium13 (Figure 5B). Retirer mécaniquement l’endothélium en frottant doucement à l’intérieur du vaisseau avec un petit fil pour induire la dénudation.
  6. Encore une fois, équilibrez les anneaux artériels pendant 30 minutes avant le début des expériences d’essai.

5. Réponse vasorelaxante à l’extrait de plante

  1. Étudier l’effet relaxant de l’extrait de plante en précontractant les anneaux IPA avec du PE (1 x 10−5 M).
  2. Ensuite, ajoutez soigneusement l’extrait de plante (1-1 000 μg/mL) cumulativement aux cycles intacts à l’endothélium et aux cycles dénudés de l’endothélium pour induire une vasorelaxation (Figure 6A, B) et acquérir une courbe de réponse dépendante de la concentration (Figure 6C).
  3. Assurez-vous que l’effet du diméthylsulfoxyde (DMSO) utilisé comme solvant est également évalué de la même manière pour servir de témoin négatif (figure 6C).

6. Mécanisme de vasorelaxation induite par l’extrait de plante via l’endothélium

  1. Évaluer le mécanisme d’action vasorelaxant de l’extrait de plante par les voies endothéliale de l’oxyde nitrique synthase (eNOS), de la cyclo-oxygénase (COX)13 et du facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) en incubant les cycles IPA intacts de l’endothélium pendant 30 minutes avec les inhibiteurs suivants (Figure 7A) : 1 x ester méthylique de NG-nitro-L-arginine de 10−4 M (L-NAME, un inhibiteur d’eNOS)9, 1 x indométacine 10−5 M (un inhibiteur de la COX)9, ou une combinaison de 1 x 10−7 M d’apamine (un petit bloqueur des canaux potassiques activé par le calcium) et de 1 x 10−7 M de charybdotoxine (un bloqueur des canaux potassiques activé par le calcium à conductance intermédiaire et à grande conductance), avant d’induire des contractions de l’IPA avec 1 x 10−5 M PE.
  2. Ensuite, après la stabilisation des contractions à l’EP, ajouter des concentrations cumulatives (0,1-1 000 μg/mL) de l’extrait de plante.
  3. Présenter les effets de l’extrait végétal en pourcentage de relaxation des cycles IPA en présence d’inhibiteurs par rapport à la réponse des cycles IPA sans inhibiteurs (Figure 7B-D) et construire la courbe concentration-réponse.

7. Mécanisme de vasorelaxation induite par l’extrait de plante via les canaux K+ des muscles lisses vasculaires

  1. Pré-incuber des cycles IPA dénudés par endothélium pendant 30 min avec 1 x 10−3 M 4-aminopyridine (4-AP), un bloqueur du canal potassique voltage-dépendant (KV) (Figure 8A), 1 x glibenclamide 10−5 M, un bloqueur du canal potassique sensible à l’ATP (KATP), ou 1 x 10−7 M iberiotoxine, un bloqueur des canaux K+ activés par Ca2+ à grande conductance (KCa), avant d’induire des contractions de l’IPA avec 1 x 10−5 M PE.
  2. Ensuite, ajoutez les concentrations cumulatives de l’extrait de plante.
  3. Présenter les effets de l’extrait végétal en pourcentage de relaxation des cycles IPA avec inhibiteur par rapport aux cycles IPA sans inhibiteur (Figure 8B-D) et construire la courbe concentration-réponse.

8. Mécanisme de vasorelaxation induite par l’extrait de plante via l’inhibition de l’afflux extracellulaire de calcium (Ca2+) dans les VSMC

  1. Pré-incuber des cycles IPA dénudés par endothélium pendant 30 min dans une solution de Krebs sans Ca2+ contenant 1 mM d’acide éthylèneglycol-bis (2-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-tétraacétique (EGTA) (Figure 9A).
  2. Ensuite, remplacez la solution de bain par unesolution de K + libre de 80 mM Ca pendant 10 min pour dépolariser les VSMC, qui ouvrent ensuite les COVC (Figure 9A).
  3. Ajouter cumulativement CaCl2 (0,01-10 mM) pour induire une vasoconstriction de l’IPA et construire la courbe concentration-réponse (Figure 9A).
  4. Répéter ce protocole dans les mêmes cycles IPA mais les pré-incuber avec de l’extrait de plante ou de la nicardipine 1 μM (inhibiteur du canal Ca 2+ de type L) dans une solution de Ca2+ contenant 80 mM K+ pendant 10 min suivie de l’addition cumulée de CaCl28.
  5. Enfin, comparez la réponse contractile à la contraction maximale précédemment provoquée par les provocations de CaCl2 de contrôle (Figure 9B).

9. Mécanisme de vasorelaxation induite par l’extrait de plante via l’inhibition de la libération intracellulaire de calcium (Ca2+) par le réticulum sarcoplasmique (SR)

  1. Exposer les anneaux IPA dénudés de l’endothélium à une solution K+ de 80 mM pendant environ 5 minutes, en dépolarisant les VSMC, en ouvrant les COV et, finalement, en générant la charge Ca2+ dans le SR (Figure 10A).
  2. Remplacer la solution de bain pendant 10 min par une solution de Krebs sans Ca2+ contenant 1 mM d’EGTA (figure 10A).
  3. Ensuite, défiez les anneaux IPA avec 1 x 10−5 M PE, qui active la voie phospholipase C/IP3 , libérant finalement Ca2+ du SR et évoquant une contraction transitoire de l’IPA (Figure 10A).
  4. Répétez le même protocole pour vérifier les contractions transitoires à l’EP.
  5. Défiez à nouveau les anneaux IPA avec une solution K+ de 80 mM pendant environ 5 min, puis remplacez la solution de bain par une solution de Krebs sans Ca2+ contenant 1 mM d’EGTA avec ou sans extrait de plante pendant 10 min.
  6. Encore une fois, défiez les anneaux IPA avec 1 x 10−5 M PE.
  7. Comparer les contractions IPA induites par l’EP entre la condition avec et sans extrait de plante (Figure 10B).

10. Analyse statistique

  1. Exprimez les résultats sous forme de moyenne ± SEM. Comparez ces valeurs à l’aide du test t de Student ou analysez par une analyse de variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey-Kramer à l’aide d’un logiciel statistique approprié. Considérez que les différences à p < 0,05 sont statistiquement significatives. Ici, il y avait n = 6 rats/protocole expérimental.
    REMARQUE: L’enregistrement de la vasoconstriction et de la vasorelaxation peut être évalué avec un logiciel approprié installé sur l’ordinateur. Par exemple, la figure 5A montre que, lorsque les vaisseaux sanguins sont stimulés par l’EP provoquant la contraction, cela pourrait être observé à partir de la tension accrue du tracé d’origine. Le traçage se stabilisera en 20-30 min, ce qui est considéré comme une contraction à 100%. Après cela, l’ACh stimule les vaisseaux sanguins, provoquant une relaxation, qui pourrait être observée à partir de la diminution de la tension du tracé d’origine. Ainsi, la tension réduite est calculée en pourcentage par rapport à 100% de contraction.

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Representative Results

Le protocole de la présente étude a été développé pour déterminer les conditions expérimentales optimales pour mesurer les phénomènes physiologiques observés dans les réponses vasculaires de préparations IPA isolées. Les expériences pilotes ont été réalisées pour décrire les résultats potentiels qui aident à comprendre les effets vasculaires et la base mécaniste de l’action vasorelaxante de l’extrait de plante, comme suit.

Effet vasorelaxant de l’extrait de plante
Comme le montre la figure 6A, B, dans l’IPA (E+) intacte à l’endothélium, l’extrait de plante a provoqué une réponse de vasorelaxation dépendante de la concentration (EC50 = 66,88 μg/mL, figure 6C). L’éradication de l’endothélium (E-) a profondément réduit la vasorelaxation induite par l’extrait végétal (p < 0,01), comme en témoigne l’augmentation de la CE 50 de 2,2 fois (E-, EC50 = 150,60 μg/mL, figure 6C). Le véhicule, DMSO, n’a eu aucun effet. Ainsi, l’extrait de plante a produit une vasorelaxation principalement via une voie dépendante de l’endothélium et partiellement via une voie indépendante de l’endothélium.

Mécanisme d’action vasorelaxante de l’extrait de plante via des voies dépendantes de l’endothélium
Comme le montre la figure 7, l’utilisation de L-NAME pour l’inhibition de l’eNOS (Figure 7B) et la combinaison d’apamine plus charybdotoxine pour bloquer l’EDHF (Figure 7D) ont évidemment diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante. Cela a déplacé la courbe concentration-réponse vers la droite et augmenté la CE50 sans modifier les valeurs Emax. Au contraire, l’indométacine (un inhibiteur de la COX) (Figure 7C), n’a montré aucun effet sur la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante.

Caractérisation du rôle des canaux K+ dans l’action vasorelaxante de l’extrait végétal
Dans les cycles IPA dénudés par endothélium, le bloqueur des canaux KCa (ibériototoxine) a diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante (Figure 8C), tandis que les bloqueurs des canaux Kv (4-AP) ou KATP (glibenclamide) n’ont pas modifié la vasorelaxation induite par l’extrait de plante (Figure 8B,D).

Mécanisme d’action vasorelaxante de l’extrait de plante via l’inhibition de l’afflux extracellulaire Ca 2+
Pour déterminer si le mécanisme d’action vasorelaxante de l’extrait de plante impliquait une inhibition extracellulaire de l’afflux de Ca 2+, la vasoconstriction des cycles IPA dénudés de l’endothélium a été évoquée par 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2dans une solution de Krebs libre de Ca2+ incorporée avec 80 mM K+ pour activer les COV (Figure 9A,B). La pré-incubation avec l’extrait de plante (68 μg/mL, valeur EC50) a inhibé la contraction induite par CaCl2 (p < 0,001 par rapport au véhicule).

Mécanisme d’action vasorelaxante de l’extrait de plante via l’inhibition de la libération intracellulaire de Ca2+ par le SR
Pour examiner si la libération intracellulaire de Ca 2+ par le SR a joué un rôle dans l’effet vasorelaxant, les anneaux IPA dénudés de l’endothélium ont été pré-incubés avec une solution de Krebs libre de Ca2+, suivie de l’ajout de PE (1 x 10−5 M), rendant une contraction transitoire (Figure 10A). Puis, dans le même anneau IPA, cette expérience a été reproduite en présence d’un véhicule ou d’un extrait de plante. Par rapport au véhicule, l’extrait végétal a significativement réduit (p < 0,001) la contraction induite par le PE (Figure 10B).

Figure 1
Figure 1 : Régulation du tonus vasculaire par des voies dépendantes et indépendantes de l’endothélium. AA = acide arachidonique, ACh = acétylcholine, AC = adénylylcyclase, ATP = adénosine 5'-triphosphate, AMPc = adénosine monophosphate cyclique, GMPc = guanosine monophosphate cyclique, COX = cyclooxygénase, DAG = diacylglycérol, EDHF = facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium, eNOS = oxyde nitrique synthase endothéliale, G q = protéine G de typeq, G s = protéine G de types, GTP = guanosine triphosphate, IP = récepteur de la prostacycline, IP3 = inositol 1, 4, 5 trisphosphate, IP3 R = récepteur IP3, IK Ca = canal K+ activé par conductance intermédiaire Ca 2+, KV = canaux potassiques voltage-dépendants, K ATP = canaux potassiques sensibles à l’ATP, KCa = canaux K+ activés parCa 2+ à grande conductance, M3 = récepteur muscarinique, MEGJ = jonction gab myoendothéliale, NO = oxyde nitrique, PE = phényléphrine, IGP 2 = prostacycline, PGs = prostaglandines,PIP 2 = Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate, PKA = Protéine kinase A, PKG = Protéine kinase G, PLA 2 = Phospholipase A2, PLC = Phospholipase C, ROCCs = canaux Ca 2+ opérés par récepteur, RYR = récepteur de la ryanodine, sGC = guanylylcyclase soluble, SK Ca = canal K+ activé par Ca 2+ à faible conductance, SR = réticulum sarcoplasmique, COVC = canauxCa 2+ actionnés par tension. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Principales étapes de l’isolement de l’artère intrapulmonaire (API) du rat. (A) L’image représente un poumon de rat avec IPA. (B) Dissection de la face médiale/racine du poumon tournée vers le haut. (C) IPA principale visualisée après avoir enlevé les veines et les bronches. d) IAP isolé. (E) Les anneaux IPA ont été montés sur une paire de fils d’acier inoxydable pour une étude de la réponse vasculaire utilisant la technique du bain d’organes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Étapes clés de l’isolement des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) IPA. (A) L’IPA isolé a été coupé en petites bandes et immergé dans un milieu de dissociation (MS). (B) Trituration des bandelettes vasculaires pour isoler les VSMC. (C) VSMC isolés après trituration douce. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Illustration schématique de l’équipement utilisé pour tester la réactivité vasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Enregistrement représentatif montrant la vasorelaxation des cycles IPA précontractés avec 10 μM PE par 10 μM d’acétylcholine (ACh). (A) Cycle endothélium intact (E+) et (B) cycle endothélium dénudé (E-). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Vasorelaxation de l’IPA par l’extrait de plante. (A) Enregistrement représentatif montrant la vasorelaxation des cycles IPA par l’extrait de plante (1-1 000 μg/mL) pré-contracté avec 10 μM PE dans les cycles intacts de l’endothélium (E+) et (B) anneaux (E-) dénudés de l’endothélium. (C) Courbes concentration-réponse de vasorelaxation induite par l’extrait végétal dans les cycles IPA (E+, n = 6 et E-, n = 6). La vasorelaxation est exprimée en pourcentage de la contraction induite par l’EP. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 par rapport au véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7. Les mécanismes de l’IPA extrait de plante induisent une vasorelaxation via la voie dépendante de l’endothélium. (A) Dossier représentatif montrant une vasorelaxation par l’extrait de plante (1-1 000 μg/mL) de cycles IPA (E+) intacts à l’endothélium préincubés avec L-NAME (inhibiteur de l’eNOS) et précontractés avec 10 μM d’EP. (B-D) Courbes concentration-réponse des vasorelaxations induites par l’extrait de plante de cycles IPA intacts à l’endothélium (E+) précontractés avec de l’EP et préincubés avec des inhibiteurs de diverses voies de signalisation endothéliale, y compris (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indométacine, ou (D) 0,1 μM apamine plus 0,1 μM charybdotoxine. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Graphique 8. Effet des bloqueurs de canaux K+ sur la vasorelaxation IPA induite par l’extrait de plante. (A) Enregistrement représentatif montrant la vasorelaxation par l’extrait de plante (1-1 000 μg/mL) de cycles (E-) IPA dénudés à l’endothélium incubés avec 4-AP (bloqueur du canal KV) et précontractés avec 10 μM PE. (B-D) Courbes concentration-réponse de la vasorelaxation induite par l’extrait de plante de cycles IPA (E-) dénudés d’endothélium précontractés avec du PE et préincubés avec divers inhibiteurs des canaux K+, y compris (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenclamide, ou (D) 30 nM ibériototoxine. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Graphique 9. Effet de l’extrait de plante sur l’afflux extracellulaire de Ca2+. (A) Enregistrements représentatifs montrant la contraction induite par CaCl2 des cycles IPA en l’absence (contrôle) ou la présence de l’extrait végétal. Les cycles IPA ont été baignés dans une solution de K+ haute libre Ca 2+ (80 mM) contenant 10 mM d’EGTA et la contraction provoquée par une concentration cumulée de CaCl2a été mesurée. Ce protocole a ensuite été répété seul (témoin, n = 6) ou en présence de l’extrait végétal (n = 6). (B) Courbes concentration-réponse pour la contraction induite par CaCl2 des cycles IPA en l’absence (témoin) ou la présence de l’extrait végétal ou de la nicardipine 1 μM (inhibiteur du canal Ca2+ de type L). La contraction induite par CaCl 2 a été calculée en pourcentage de la contraction maximale enregistrée à partir de la première application de CaCl2 et exprimée en moyenne ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 par rapport à la nicardipine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Graphique 10. Effet de l’extrait de plante sur la libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (SR). (A) Enregistrement représentatif montrant la contraction induite par la phényléphrine (PE) des cycles IPA par Ca2+ libérée par le SR de cycles IPA dénudés par l’endothélium en présence de DMSO (témoin) et de 10 μM d’extrait de plante. Les données sont des contractions induites par l’EP en pourcentage de 10 μM par rapport aux contractions produites par le protocole initial sans l’extrait de plante. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. **p < 0,01 par rapport au véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Mécanisme proposé de l’action vasodilatatrice de l’extrait de plante sur l’artère intrapulmonaire du rat par des voies dépendantes et indépendantes de l’endothélium AA = acide arachidonique, ACh = acétylcholine, AC = adénylylcyclase, ATP = adénosine 5'-triphosphate, AMPc = adénosine monophosphate cyclique, GMPc = guanosine monophosphate cyclique, COX = cyclooxygénase, DAG = diacylglycérol, EDHF = facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium, eNOS = oxyde nitrique synthase endothéliale, Gq = G-protéine de type q, G s = G-protéine de types, GTP = guanosine triphosphate, IP = récepteur de la prostacycline, IP 3 = inositol 1, 4, 5 trisphosphate, IP 3 R = récepteur IP 3,IK Ca = canal K+ activé par la conductance intermédiaireCa2+, KV = canaux potassiques voltage-dépendants, K ATP = canaux potassiques sensibles àl’ATP, KCa = K+ activé parCa 2+ à grande conductance canaux, M3 = récepteur muscarinique, MEGJ = jonction gab myoendothéliale, NO = oxyde nitrique, PE = phényléphrine, IGP 2 = prostacycline, PGs = prostaglandines, PIP 2 = phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate, PKA = protéine kinase A, PKG = protéine kinase G, PLA 2 = phospholipase A 2, PLC = phospholipase C, ROCCs = canaux Ca2+ opérés par les récepteurs, RYR = récepteur de la ryanodine, sGC = guanylylcyclase soluble, SK Ca = petite conductanceCa 2+ canal K+ activé, SR = réticulum sarcoplasmique, CORC = canaux Ca2+ actionnés en tension. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons la technique d’isolement des rats IPA et des VSMC. Plusieurs protocoles expérimentaux ont été utilisés pour étudier la réponse vasculaire de l’IPA in vitro, qui peut être utilisée pour caractériser l’effet pharmacologique et la base mécaniste de la vasorelaxation IPA induite par l’extrait de plante.

En ce qui concerne l’action vasodilatatrice dépendante de l’endothélium de l’extrait de plante, divers bloqueurs tels que L-NAME (eNOS), indométacine (COX) et apamine + charybdotoxine (EDHF) ont été utilisés. Les données représentatives ont montré à la fois des résultats positifs (c.-à-d. une réduction significative de la réponse vasodilatatrice en présence d’inhibiteurs de l’eNOS ou de l’EDHF) et des résultats négatifs (c.-à-d. aucun changement dans la réponse vasodilatatrice en présence de l’inhibiteur de la COX), suggérant que l’extrait de plante agit via les voies endothéliales eNOS et EDHF. L’effet vasorelaxant indépendant de l’endothélium induit par l’extrait de plante a été évalué via l’implication des canaux K +, l’afflux extracellulaire de Ca 2+ et la libération de Ca2+ par le SR. Les résultats ont montré que la vasorelaxation en réponse à l’extrait de plante était réduite par un bloqueur des canaux KCa (ibériototoxine) mais pas par un bloqueur des canaux KV (4-AP) ou un bloqueur des canaux KATP (glibenclamide), suggérant que l’extrait agit via l’ouverture des canaux KCa. De plus, la vasoconstriction induite par CaCl2 a été réduite par l’extrait de plante, ce qui suggère que son mécanisme impliquait l’inhibition des COV sur les VSMC ou l’interférence avec les interactions du Ca2+ avec la machinerie contractile. Des études complémentaires devraient être menées pour analyser plus avant son action mécaniste détaillée. De plus, la contraction transitoire en EP dans les Krebs sans Ca 2+ a été réduite, ce qui indique que l’extrait de plante inhibait la libération de Ca2+ par le SR, conduisant à la réduction de la vasoconstriction. Un résumé du mécanisme interprété de l’action vasorelaxante de l’extrait végétal est illustré à la figure 11.

Les protocoles expérimentaux proposés dans la présente étude sont techniquement réalisables et présentent une bonne reproductibilité; Néanmoins, certaines étapes cruciales sont essentielles pour assurer le succès. Tout d’abord, la composition de la solution physiologique doit être maintenue avec précision pendant la préparation pour assurer le bon fonctionnement de la procédure. En outre, il est essentiel d’éviter de toucher, d’étirer ou d’endommager l’artère pulmonaire pendant la préparation. Le milieu doit être remplacé en continu toutes les 15 minutes (3 fois) pour stabiliser les tests et l’évaluation une fois que l’artère pulmonaire est fixée dans la chambre du bain d’organes. La prétension du récipient doit être augmentée à un peu au-dessus du niveau requis, puis diminuée progressivement jusqu’à ce que l’optimum soit atteint (c.-à-d. 1 g).

Plusieurs protocoles expérimentaux, tels que la viabilité des vaisseaux sanguins, la présence de cellules endothéliales et l’effet des extraits de plantes sur la relaxation des vaisseaux sanguins, sont évalués par cette technique. La procédure élucidée pour l’isolement de l’API du rat peut être adaptée à d’autres espèces (par exemple, souris, lapin et humain). Néanmoins, les conditions optimales requises pour l’assemblage d’un bain d’organes peuvent différer selon les modèles animaux et peuvent être adaptées en conséquence. Il est important de noter que les conditions expérimentales ne sont pas une reproduction exacte des conditions physiologiques et que les résultats ne peuvent pas être directement extrapolés au phénomène in vivo .

Cette méthode d’isolement IPA et les mesures de la réponse vasculaire sont des approches pratiques pour évaluer la physiologie, la pathologie et la pharmacologie vasculaires. Il permet aux chercheurs d’étudier la vasoconstriction et la vasorelaxation dans un environnement isolé mais bien contrôlé. En outre, il peut être adapté pour étudier l’action thérapeutique des médicaments utilisés pour la pathologie vasculaire pulmonaire, tels que l’hypertension artérielle pulmonaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Conseil national de recherches de Thaïlande, le Centre d’excellence pour l’innovation en chimie (PERCH-CIC) et le Réseau international de recherche (IRN61W0005) pour leur soutien financier, ainsi que le Département de physiologie de la Faculté des sciences médicales de l’Université de Naresuan pour le soutien aux installations de recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632
CAS NO. 348-12-3
4-aminopyridine (4-AP) Aldrich Chemical A78403
CAS NO. 504-24-5
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
CAS NO. 60-31-1
Apamin Sigma-Aldrich A9459
CAS NO. 24345-16-2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
CAS NO. 9048-46-8
Calcium choride Ajax Finechem AJA960
CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin Sigma-Aldrich C7802
CAS NO. 95751-30-7
Collagenase type 1A Sigma-Aldrich C9891
CAS NO. 9001-12-1		 From Clostridium histolyticum
D(+)-Glucose monohydrate Millipore Corporation K50876942 924
CAS NO. 14431-43-7
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
CAS NO. 67-68-5
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
CAS NO. 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
CAS NO. 60-00-4
Forceps 11 cm. Rustless Dumoxel -
Forceps 14 cm. Rustless Dumoxel -
Glibenclamide Sigma-Aldrich G6039
CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism program Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CAS NO. 7365-45-9
Iberiotoxin Sigma-Aldrich I5904
CAS NO. 1002546960		 recombinant from Mesobuthus tamulus
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
CAS NO. 53-86-1
Labchart Program Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).
Magnesium chloride Ajax Finechem 296
CAS NO. 1506254995
Male Wistar rats Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand
NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) Sigma-Aldrich N5751
CAS NO. 51298-62-5
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
CAS NO. 54527-84-3
Organ bath 15 mL. - - Specific order by the researchers
Papain Sigma-Aldrich P4762
CAS NO. 9001-73-4		 FromPapaya Latex
Phenal red Sigma-Aldrich P5530
CAS NO. 34487-61-1
Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126
CAS NO. 61-76-7
Potassium chloride Kemaus KA383
CAS NO. 7447-40-7
Potassium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical EC231-913-4
CAS NO. 7778-77-0
S+A2:E36odium chloride Kemaus KA465
CAS NO. 7647-14-5
Scissors 11 cm. Spall Stainless -
Scissors 14 cm. Spall Stainless -
Sodium bicarbonate Ajax Finechem 475
CAS NO. 912466
Sodium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical 33,198-8
CAS NO. 7558-80-7
Sodium hydroxide Ajax Finechem 482
CAS NO. 1506196602
Sodium thiopental Anesthal JPN3010002
CAS NO. 1C 314/47
Taurine Sigma-Aldrich T0625
CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45 Memmert 2766
CAS NO. -

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References

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Médecine numéro 184
Isolement de l’artère intrapulmonaire et des cellules musculaires lisses pour étudier les réponses vasculaires
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To-on, K., Chatturong, U., Panklai,… More

To-on, K., Chatturong, U., Panklai, T., Palang, I., Inchan, A., Wisutthathum, S., Paracha, T. U., Apaikawee, P., Chootip, K. Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses. J. Vis. Exp. (184), e63686, doi:10.3791/63686 (2022).

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