Summary
ניתן לחקור תגובות וסקולריות של זרימת הדם הריאתית העורקית באמצעות עורק תוך פולמונרי (IPA) ותאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs). המחקר הנוכחי מתאר בפירוט את הבידוד של IPA ואת הפרוטוקולים המשמשים לחקר vasorelaxation בתגובה לגירויים פיזיולוגיים.
Abstract
ניתן להשתמש בעורק התוך-ריאתי (IPA) ובתאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs) שבודדו מריאות חולדות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התפשטות כלי דם ו-vasorelax. לאחר בידוד ה- IPA וה- VSMCs, ניתן להעריך את המאפיינים של תגובות כלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בהעדר גורמים חיצוניים כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים וכו '. לפיכך, ה- IPA וה- VSMCs משמשים מודלים מצוינים לחקר פיזיולוגיה / פתופיזיולוגיה של כלי הדם, יחד עם חקירות ניסיוניות שונות, כגון אפנון על ידי סוכנים פרמקולוגיים, ניתוח אלקטרופיזיולוגי של מהדק טלאי, הדמיית סידן וכו '. כאן, השתמשנו בטכניקה לבידוד ה-IPA כדי לחקור תגובות וסקולריות במערך אמבט איברים. מקטעי IPA הורכבו על תא אמבט האיברים באמצעות חוטים אינטראלומינליים ועוררו על ידי סוכנים פרמקולוגיים שונים. השינויים בטונוס כלי הדם של IPA (כלומר, vasoconstriction ו-vasorelax), תועדו באמצעות מתמר כוח איזומטרי ותוכנה לניתוח נתונים פיזיולוגיים. יישמנו מספר פרוטוקולים ניסיוניים, שניתן להתאים אותם כדי לחקור את המנגנונים של vasorelax/vasoconstriction לחקר הפעילות הפרמקולוגית של תרופות פיטוכימיות או סינתטיות. הפרוטוקולים יכולים לשמש גם להערכת תפקידן של תרופות בוויסות מחלות שונות, כולל יתר לחץ דם ריאתי עורקי. מודל IPA מאפשר לנו לחקור את עקומת תגובת הריכוז, שהיא חיונית בהערכת הפרמטרים הפרמקודינמיים של תרופות.
Introduction
כלי הדם הריאתיים הם מערכת כלי דם בלחץ נמוך שבה הפונקציה העיקרית היא לספק דם deoxygenated לאזור החלפת גז של הריאות. העורקים הריאתיים בריאות מסודרים בענפים מקבילים לעץ הסימפונות, ובסופו של דבר יוצרים רשת נרחבת של נימים שהיא רציפה על פני כמה נאדיות, ולבסוף, מתאחדת לתוך ורידים וורידים. הטון הווסקולרי של עורק הריאה נשלט על ידי מספר גורמים, המערבים את האינטראקציה בין האנדותל לבין תאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs)1.
במחקר זה אנו מתמקדים בכלי הדם התלויים-תלותיים והעצמאיים של העורק התוך-פולמונרי (IPA). בנוגע לווסורגנציה התלויה באנדותל, מנגנונים שונים המתרחשים על פני השטח של תאי האנדותל עשויים להגביר את ריכוז Ca2+ התוך-תאי (לדוגמה, קשירת אצטילכולין [ACh] עם קולטן מוסקריני [M3]), מה שמוביל להיווצרות תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGl 2) וגורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל (EDHF) (איור 1 ). NO הוא הגורם המרגיע העיקרי שמקורו באנדותל, המסונתז מ-L-ארגינין על-ידי סינתאז תחמוצת החנקן של האנדותל (eNOS)2, אשר לאחר מכן מתנתק מתאי האנדותל ל-VSMCs (איור 1) וממריץ את האנזים המסיס גואניליל ציקלאז (sGC); האנזים הזה משנה את הגואנוזין טריפוספט (GTP) לגואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP), שמפעיל את החלבון קינאז G (PKG) ומפחית את רמות Ca2+ הציטוזוליקיות, ובכך גורם לדלקת כלי הדם (איור 1). PGl 2 מסונתז על ידי תאי אנדותל דרך מסלול ציקלו-אוקסיגנאז (COX) 3,4. הוא נקשר לקולטן הפרוסטציקלין (IP) ב-VSMCs וממריץ את האנזים אדניליל ציקלאז (AC), אשר לאחר מכן ממיר אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) (איור 1)3,4. cAMP מפעיל את החלבון קינאז A (PKA), מפחית את רמות Ca2+ הציטוזולי וגורם לווזורגנציה5 (איור 1). מסלול ה-EDHF משתתף גם בוויסורגנציה תלוית אנדותל באמצעות מתווכי אנדותל שונים ואירועים חשמליים. ההפעלה של מסלול EDHF מובילה להיפרפולריזציה של VSMCs, ובכך סוגרת ערוצי Ca2+ (VOCCs) המופעלים באמצעות מתח, מפחיתה את רמותCa 2+ התוך-תאיות, וגורמת לוויסורגנציה6. הוויסורגנציה הבלתי תלויה באנדותל מתרחשת ישירות על VSMCs באמצעות מספר מנגנונים, כגון הפחתת רמתCa 2+ תוך-תאית, עיכוב של קינאז שרשרת אור מיוזין (MLCK), הפעלת פוספטאז שרשרת אור מיוזין (MLCP), והפחתת רגישות Ca2+ למנגנון ההתכווצות של VSMCs. במחקר זה, אנו מתמקדים בווזורגנציה הנגרמת על ידי פתיחת ערוצי K+ שונים, חסימת תרכובות אורגניות נדיפות ועיכוב שחרור Ca 2+ מהרשתית הסרקופלסמית7, מה שמוביל לירידה ברמות Ca 2+ תוך-תאיות, ובכך מפחית את זרחון שרשרת האור VSMC מיוזין וקשירת מיוזין-אקטין או היווצרות גשר צולב, בהתאמה, ובסופו של דבר התוצאה היא vasorelaxation.
הטכניקה להערכת מדידות vasoconstriction ו vasorelaxation ב IPA מבודד מבוססת היטב עבור מכרסמים, אבל הנתונים השתנו בהתאם לפרוטוקולים הניסוי. המחקר הנוכחי מתאר את השיטה המשמשת להערכת תגובתיות כלי הדם של תכשירי IPA של חולדות במבחנה, שנעשו בהיעדר גורמים חיצוניים המווסתים את תגובת כלי הדם in vivo, כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים, לחץ דם וכו '.
השתמשנו במספר פרוטוקולים ניסיוניים תוך שימוש בתמצית הצמח כדוגמה לחקר תגובתיות כלי הדם של IPA. חוסמים שונים (איור 1) שימשו כדי לזהות את המנגנונים של כלי דם תלויי אנדותל ובלתי תלויים המושרים על-ידי תמצית הצמח. עם זאת, ניתן להתאים את אותם פרוטוקולים כדי להעריך את תגובות כלי הדם של IPA לכל תרופות, תמציות או פיטוכימיקלים המשמשים לטיפול בפאתולוגיות ריאתיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Naresuan (NUACUC), פרוטוקול מספר NU-AE620921, לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.
1. הרכב של פתרונות פיזיולוגיים
- צור תמיסת קרבס על ידי המסת כימיקלים במים מזוקקים כדי להשיג את הריכוזים הסופיים כדלקמן: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2ו- 11 mM גלוקוז8. יש להתאים את ה-pH של התמיסה ל-7.3 עם 1 M NaOH ולחמם מראש ל-37°C לפני השימוש.
- הכן תמיסת קרבס קרה באופן דומה כפי שצוין בשלב 1.1. לשימוש כאמצעי בידוד של IPA, כמתואר בשלב 2.
2. בידוד של עורק תוך פולמונרי (IPA)
- הרדימו חולדות Wistar זכרים בני 8 שבועות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של נתרן תיאופנטל (100 מ"ג/ק"ג)9. בדקו את תגובת החולדות לגירויים כואבים בשינה עמוקה על ידי שימוש במלקחיים המהודקים לכפות רגליהן, ולאחר מכן ודאו שלחולדות אין תגובת משיכה לאחור של כף הרגל לפני שהן מרדימות אותן בשלב 2.2.
- חותכים את בית החזה האמצעי של החולדה ואת מסוף הלב עם מספריים (גודל 14 ס"מ). לאחר מכן, אתר את שורש הריאה עם מספריים (גודל 14 ס"מ). קוצרים את כל הריאה על ידי חיתוך במספריים וטובלים אותה בתמיסת קרבס קרה10,11.
- פורסים אונה אחת של הריאה בעזרת מספריים (גודל 11 ס"מ) ומניחים על צלחת פטרי (גודל 9 ס"מ) כשהצד המדיאלי/שורש של הריאה פונה כלפי מעלה (איור 2A, B). שימו לב וזהו את היישור של הווריד, הסימפונות והעורק מלמעלה למטה (איור 2B).
- חותכים את הברונכוס לאורך עם מספריים (גודל 11 ס"מ). לאחר מכן, השתמש מלקחיים (גודל 11 ס"מ) כדי לתפוס את קצה ברונכוס. נתחו בעדינות והוציאו את הברונכוס והוורידים מהריאה. שים לב שה- IPA תמיד מיושר אנטומית מתחת לברונכוס.
- לאחר מכן, ניתן לדמיין את ה-IPA הראשי (איור 2C). השתמש במלקחיים (גודל 11 ס"מ) כדי לתפוס את קצה ה- IPA ולנתח אותו בזהירות מתוך רקמת הריאה עם מספריים (גודל 11 ס"מ).
- שמור את ה- IPA המבודד בתמיסת קרבס קרה עד להתקנת מכלול אמבט האיברים (pH 7.3 וטמפרטורה 4 ° C)1 1.
3. בידוד של תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs)
- בודד את IPA כפי שתואר קודם לכן בשלב 2. חותכים את הענף הראשי של ה-IPA לאורך המספריים (גודל 11 ס"מ) וחותכים לרצועות קטנות (2 מ"מ) (איור 3A).
- לטבול את רצועות ה-IPA במדיום דיסוציאציה (DM)10,12 המכיל 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.03 mM פנול אדום, 10 mM טאורין, 0.5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM גלוקוז ו-0.16 mM CaCl 2, ולהתאים את ה-pH ל-7.0 עם 1 M NaOH. דגרו את הרצועות במשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ב-DM המכילות פפאין 1 מ"ג/מ"ל, אלבומין בסרום בקר 0.04% (BSA), ו-0.4 mM 1,4- dithiothreitol (DTT), ודגרה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש להוסיף 1 מ"ג/מ"ל קולגן מסוג 1A ב-DM ולדגור עוד יותר בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
הערה: DM הוא פתרון המשמש לשמירה על כדאיות התאים. פפאין וקולגןאז מסוג 1A הם אנזימים המפרקים את חלבוני המטריצה החוץ-תאית כדי לבודד תאים בודדים. BSA הוא חלבון אלבומין בסרום המשמש לייצוב אנזימים במהלך אחסון ותגובות אנזימטיות. DTT הוא חומר מחזר המשמש לייצוב וקידום פעילותם של אנזימים במהלך תהליך בידוד התאים. טאורין היא חומצת אמינו גופרתית המשמשת לייצוב קרום התא ושלמות התא. - העבירו את הרקמות ל-DM טרי והתפזרו באמצעות טריטורציה עדינה באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית (איור 3B). המשיכו לטרטור עד ש-VSMCs מבודדים יופיעו בתמיסת הרחצה שמתחת למיקרוסקופ (איור 3C).
הערה: ניתן להשתמש ב- VSMCs מבודדים טריים לחקר פיזיולוגיה / פתופיזיולוגיה של כלי הדם, יחד עם חקירות ניסיוניות שונות, כגון אפנון על ידי סוכנים פרמקולוגיים, ניתוח אלקטרופיזיולוגי של מהדק מדבקה, הדמיית סידן וכו '. עם זאת, המחקר הנוכחי מתמקד רק על vasorelaxation של IPA מבודד באמצעות טכניקת אמבט איברים.
4. טכניקת אמבט איברים
- בודד את IPA כפי שתואר קודם לכן בשלב 2. חתכו את הענף הראשי של ה-IPA לטבעות באורך של ~2 מ"מ (איור 2D)13.
- הצמידו את טבעות ה-IPA לתאי אמבטיה של איברים (איור 4) על-ידי השחלתן על שני חוטי נירוסטה בקוטר 40 מיקרומטר (איור 2E)11,13,14.
- חבר חוטי נירוסטה המותקנים עם טבעות IPA למתמרים הכוח האיזומטריים המחוברים למכשיר איסוף הנתונים ולמערכת המחשב המותקנת עם התוכנה הפיזיולוגית המתאימה לרישום וניתוח נתונים, ולאחר מכן העלה בעדינות את המתח של טבעת ה- IPA ל -1 גרם11.
- אפשרו למקטעי כלי השיט להתאזן למשך כ-45 דקות במתח מנוחה של 1 גרם. במהלך תקופת שיווי המשקל, ודא כי פתרון קרבס משתנה באופן קבוע כל 15 דקות. לאחר תקופה זו של שיווי משקל, בדוק את הכדאיות של כלי הדם על ידי מדידת הווסו-קונסטריקציה שלהם לתמיסת K+ חוץ-תאית גבוהה (80 mM) המכילה 47.4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaHPO4, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2ו- 11 mM גלוקוז10,11.
- הערך את נוכחותו או היעדרו של אנדותל על ידי חישוב תגובת ההרפיה לאצטילכולין (1 x 10−5 M) בטבעות שנדבקו מראש בפנילפרין (PE, 1 x 10−5 M) (שים לב שהתכווצויות כלי הדם נשארות יציבות במשך שעה אחת לאחר הוספת PE). חשבו על הטבעות כעל אנדותל שלם אם הן מכמתות הרפיה של יותר מ-70% (איור 5A). אם יש להן פחות מ-10% הרפיה, חשבו על הטבעותכ-13 בעלות נטייה לאנדותל (איור 5B). באופן מכני להסיר את האנדותל על ידי שפשוף עדין בתוך כלי עם חוט קטן כדי לגרום denudation.
- שוב שיווי משקל טבעות העורקים במשך 30 דקות לפני תחילת ניסויי הבדיקה.
5. תגובת וזורקסנטים לתמצית צמחים
- חקרו את ההשפעה המרגיעה של תמצית הצמח על ידי חימום מראש של טבעות IPA עם PE (1 x 10−5 M).
- לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את תמצית הצמח (1-1,000 מיקרוגרם/מ"ל) באופן מצטבר לטבעות שלמות של אנדותל ולטבעות עם אנדותל כדי לגרום לדלקת כלי דם (איור 6A, B) ולרכוש עקומת תגובה תלוית ריכוז (איור 6C).
- ודא שגם ההשפעה של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) המשמש כממס מוערכת באופן דומה כדי לשמש כבקרה שלילית (איור 6C).
6. מנגנון של וזורגנציה הנגרמת על ידי תמצית צמחים באמצעות האנדותל
- הערך את מנגנון הפעולה של תמצית הצמח באמצעות סינתאז תחמוצת החנקן האנדותליאלית (eNOS), ציקלו-אוקסיגנאז (COX)13 ומסלולים של גורם היפר-קוטבי (EDHF) שמקורו באנדותל על-ידי דגירה של טבעות IPA שלמות באנדותל למשך 30 דקות עם המעכבים הבאים (איור 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-ארגינין מתיל אסטר (L-NAME, מעכב eNOS)9, 1 x 10−5 M אינדומתצין (מעכב COX)9, או שילוב של 1 x 10−7 M apamin (חוסם תעלות אשלגן קטן המופעל על ידי סידן) ו-1 x 10−7 M charybdotoxin (חוסם תעלות אשלגן המופעל על ידי סידן בינוני ומוליך גדול), לפני גרימת התכווצויות של IPA עם 1 x 10−5 M PE.
- לאחר מכן, לאחר ההתכווצויות לייצוב PE, יש להוסיף ריכוזים מצטברים (0.1-1,000 מיקרוגרם/מ"ל) של תמצית הצמח.
- הציגו את ההשפעות של תמצית צמחים כאחוז הרפיה של טבעות ה-IPA בנוכחות מעכבים בהשוואה לתגובה של טבעות IPA ללא מעכבים (איור 7B-D) ובנו את עקומת תגובת הריכוז.
7. מנגנון של וזורגנציה המושרה על ידי תמצית צמחים באמצעות תעלות K+ של שריר חלק וסקולרי
- טבעות IPA טרום-דגירה של אנדותל למשך 30 דקות עם 1 x 10−3 M 4-אמינופירידין (4-AP), חוסם של תעלת אשלגן מגודרת מתח (KV) (איור 8A), 1 x 10−5 M glibenclamide, חוסם של תעלת אשלגן רגישה ל-ATP (KATP), או 1 x 10−7 M iberiotoxin, חוסם של מוליכות גדולה Ca 2+-מופעל K+ ערוצים (K Ca), לפני גרימת התכווצויות של IPA עם 1 x 10−5 M PE.
- לאחר מכן, מוסיפים ריכוזים מצטברים של תמצית הצמח.
- הציגו את ההשפעות של תמצית צמחים כאחוז הרפיה של טבעות IPA עם מעכב בהשוואה לטבעות IPA ללא מעכב (איור 8B-D) ובנו את עקומת הריכוז-תגובה.
8. מנגנון של וזורגנציה הנגרמת על ידי תמצית צמחים באמצעות עיכוב של זרם סידן חוץ-תאי (Ca2+) ב-VSMCs
- טבעות IPA שעברו דגירה מוקדמת של אנדותל למשך 30 דקות בתמיסת קרבס נטולת Ca2+, המכילה 1 mM אתילן גליקול-ביס (2-אמינואתיל-ת'ר)-N,N,N',N'-חומצה טטראאצטית (EGTA) (איור 9A).
- לאחר מכן, החלף את תמיסת הרחצה בתמיסת Ca2 + free-80 mM K+ למשך 10 דקות כדי לבצע דה-פולריזציה של ה-VSMCs, אשר לאחר מכן פותחים את תרכובות אורגניות נדיפות (איור 9A).
- הוסיפו במצטבר את CaCl2 (0.01-10 מ"מ) כדי לגרום להתכווצות כלי הדם של ה-IPA ולבנות את עקומת תגובת הריכוז (איור 9A).
- חזור על פרוטוקול זה באותן טבעות IPA אך דגירה מראש עם תמצית צמחים או 1 μM nicardipine (חוסם ערוצים מסוג L Ca 2+) ב- Ca2+ המכיל תמיסת 80 mM K+ למשך 10 דקות ולאחר מכן תוספת מצטברת של CaCl2 8.
- לבסוף, השוו את תגובת ההתכווצות לתגובת ההתכווצות המרבית שנוצרה בעבר על ידי אתגרי CaCl2 של בקרה (איור 9B).
9. מנגנון של וזורגנציה הנגרמת על ידי תמצית צמחים באמצעות עיכוב של סידן תוך תאי (Ca2+) מהרשתית הסרקופלסמית (SR)
- חשוף טבעות IPA עם ניקוד אנדותל לתמיסת K+ של 80 mM למשך כ-5 דקות, תוך דה-פולריזציה של ה-VSMCs, פתיחת תרכובות אורגניות נדיפות, ובסופו של דבר יצירת העמסת Ca2+ לתוך ה-SR (איור 10A).
- החליפו את תמיסת הרחצה למשך 10 דקות בתמיסת Ca2+ ללא קרבס המכילה 1 mM EGTA (איור 10A).
- לאחר מכן, אתגרו את טבעות ה-IPA עם 1 x 10−5 M PE, מה שמפעיל את מסלול הפוספוליפאז C/IP3 , ובסופו של דבר משחרר את Ca2+ מה-SR ומעורר התכווצות חולפת של IPA (איור 10A).
- חזור על אותו פרוטוקול כדי לוודא גם התכווצויות חולפות ל- PE.
- אתגרו שוב את טבעות ה-IPA עם תמיסת K+ של 80 mM למשך כ-5 דקות, ולאחר מכן החליפו את תמיסת הרחצה בתמיסת קרבס נטולת Ca2+ המכילה EGTA של 1 mM עם או בלי תמצית הצמח למשך 10 דקות.
- שוב, אתגר את טבעות IPA עם 1 x 10−5 M PE.
- השוו את התכווצויות ה-IPA הנגרמות על-ידי PE בין המצב עם ובלי תמצית הצמח (איור 10B).
10. ניתוח סטטיסטי
- להביע את התוצאות כממוצע ± SEM. השווה ערכים אלה באמצעות מבחן t של התלמיד או נתח על ידי ניתוח של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן טוקי-קרמר פוסט הוק באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה. שקול את ההבדלים ב - p < 0.05 כמובהקים סטטיסטית. כאן, היו n = 6 חולדות / פרוטוקול ניסיוני.
הערה: ניתן להעריך את ההקלטה של vasoconstriction ו vasorelaxation עם תוכנה מתאימה המותקנת במחשב. לדוגמה, איור 5A מראה שכאשר כלי הדם מגורה על-ידי ה-PE הגורם להתכווצות, ניתן לראות זאת מהמתח המוגבר של העקיבה המקורית. העקיבה תתייצב תוך 20-30 דקות, מה שנחשב להתכווצות של 100%. לאחר מכן, ACh מגרה את כלי הדם, גרימת הרפיה, אשר ניתן לראות מן המתח המופחת של המעקב המקורי. לפיכך, המתח המופחת מחושב כאחוז לעומת 100% התכווצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול במחקר הנוכחי פותח כדי לקבוע את תנאי הניסוי האופטימליים למדידת תופעות פיזיולוגיות שנצפו בתגובות כלי הדם של תכשירי IPA מבודדים. ניסויי הפיילוט בוצעו כדי לתאר את התוצאות הפוטנציאליות המסייעות להבנת ההשפעות הווסקולריות והבסיס המכניסטי של פעולת הווזו-רלאקסנט של תמצית הצמח, כדלקמן.
אפקט Vasorelaxant של תמצית הצמח
כפי שניתן לראות באיור 6A,B, ב-IPA שלם של אנדותל (E+), תמצית הצמח עוררה תגובה תלוית ריכוז של כלי דם (EC50 = 66.88 מיקרוגרם/מ"ל, איור 6C). מיגור האנדותל (E-) הפחית באופן עמוק את כלי הדם המושרים על-ידי תמצית הצמח (p < 0.01), כפי שמשתקף על-ידי העלייה ב-EC 50 פי 2.2 (E-, EC50 = 150.60 מיקרוגרם/מ"ל, איור 6C). לרכב, DMSO, לא הייתה כל השפעה. לפיכך, תמצית הצמח ייצרה את כלי הדם בעיקר דרך מסלול תלוי אנדותל ובחלקו דרך מסלול שאינו תלוי באנדותל.
מנגנון הפעולה הווזורקסטנטית של תמצית הצמח דרך מסלולים תלויי אנדותל
כפי שניתן לראות באיור 7, השימוש ב-L-NAME לעיכוב eNOS (איור 7B) והשילוב של אפמין עם charybdotoxin לחסימת EDHF (איור 7D) הפחיתו ככל הנראה את התגובה הווזו-רלאקנטית לתמצית הצמח. פעולה זו הסיטה את עקומת תגובת הריכוז ימינה והגדילה את ה- EC50 מבלי לשנות את ערכיE max. להיפך, אינדומתצין (מעכב COX) (איור 7C) לא הראה השפעה על התגובה הווזו-רלאקנטית לתמצית הצמח.
אפיון תפקידן של תעלות K+ בפעולה הווזו-רלקסטנטית של תמצית הצמח
בטבעות ה-IPA עם האנדותל, חוסם תעלותK Ca (iberiotoxin) הפחית את התגובה הווזו-רלאקנטית לתמצית הצמח (איור 8C), בעוד שחוסמי תעלות Kv (4-AP) או KATP (glibenclamide) לא שינו את כלי הדם המושרים על-ידי תמצית הצמח (איור 8B,D).
מנגנון הפעולה הווזורקסטנטית של תמצית הצמח באמצעות עיכוב זרם Ca 2+ חוץ-תאי
כדי לחקור אם מנגנון הפעולה הווזו-רלאקנטי של תמצית הצמח היה כרוך בעיכוב זרם Ca 2+ חוץ-תאי, נוצרה ההתכווצות כלי הדם של טבעות IPA בעלות ניוד אנדותל על-ידי 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 בתמיסת קרבס נטולת Ca2+ המשולבת עם 80 mM K+ להפעלת תרכובות אורגניות נדיפות (איור 9A,B). קדם-דגירה עם תמצית הצמח (68 מיקרוגרם/מ"ל, ערך EC50) עיכבה את ההתכווצות המושרהעל ידי CaCl 2 (p < 0.001 לעומת רכב).
מנגנון הפעולה הווזורקסטנטית של תמצית הצמח באמצעות עיכוב של שחרור Ca2+ תוך תאי מה-SR
כדי לבחון אם השחרור של Ca 2+ תוך-תאי מה-SR מילא תפקיד כלשהו באפקט הווזוריקנטי, טבעות ה-IPA שעברו דנדול של אנדותל הודגמו מראש עם תמיסת קרבס נטולתCa 2+, ולאחר מכן הוספת PE (1 x 10−5 M), מה שיצר התכווצות חולפת (איור 10A). לאחר מכן, באותה טבעת IPA, ניסוי זה שוכפל בנוכחות תמצית רכב או צמח. בהשוואה לרכב, תמצית הצמח הפחיתה באופן משמעותי (p < 0.001) את ההתכווצות הנגרמת על-ידי PE (איור 10B).
איור 1: ויסות טונוס כלי הדם באמצעות מסלולים תלויי אנדותל ובלתי תלויים. AA = חומצה ארכידונית, ACh = אצטילכולין, AC = אדניל ציקלאז, ATP = אדנוזין 5'-טריפוספט, cAMP = אדנוזין מונופוספט מחזורי, cGMP = גואנוזין מונופוספט מחזורי, COX = ציקלואוקסיגנאז, DAG = דיאצילגליצרול, EDHF = גורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל, eNOS = סינתאז תחמוצת החנקן האנדותליאלית, Gq = G-protein type q, G s = G-protein types, GTP = גואנוזין טריפוספט, IP = קולטן פרוסטציקלין, IP 3 = אינוזיטול 1, 4, 5 טריספוספט, IP3 R = קולטן IP3, IK Ca = מוליכות ביניים Ca 2 + ערוץ K מופעל, KV = ערוצי אשלגן מגודרים במתח, K ATP = תעלות אשלגן רגישות ל- ATP, KCa = מוליכות גדולה Ca 2 + ערוצי K מופעלים, M3 = קולטן מוסקריני, MEGJ = צומת gab מיואנדותליאלי, NO = תחמוצת החנקן, PE = פנילפרין, PGI 2 = פרוסטציקלין, PGs = פרוסטגלנדינים,PIP 2 = פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט, PKA = חלבון קינאז A, PKG = חלבון קינאז G, PLA 2 = פוספוליפאז A 2, PLC = פוספוליפאז C, ROCCs = ערוצי Ca 2+ המופעלים על ידי קולטן, RYR = קולטן ריאנודין, sGC = ציקלאז גואניליל מסיס, SK Ca = מוליכות קטנה Ca2 + מופעל ערוץ K+, SR = רשתית סרקופלסמית, VOCCs = ערוציCa 2+ המופעלים במתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שלבים מרכזיים בבידוד העורק התוך-פולמונרי של החולדה (IPA). (A) התמונה מתארת ריאה של חולדה עם IPA. (B) כריתה של הצד המדיאלי/שורש הריאה הפונה כלפי מעלה. (C) IPA ראשי חזותי לאחר הסרת הוורידים והסימפונות. (D) IPA מבודד. (E) טבעות ה-IPA הורכבו על זוג חוטי נירוסטה למחקר תגובת כלי דם בטכניקת אמבט האיברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: שלבים מרכזיים של בידוד תאי שריר חלק של כלי הדם (VSMCs). (A) IPA מבודד נחתך לרצועות קטנות ושקע במדיום דיסוציאציה (DM). (B) טריטורציה של רצועות כלי דם לבידוד VSMCs. (C) VSMCs מבודדים לאחר טריטורציה עדינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: המחשה סכמטית של הציוד המשמש לבדיקת תגובתיות כלי הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: רשומה מייצגת המציגה את כלי הדם של טבעות IPA שנדבקו מראש ב-10 μM PE על ידי 10 μM אצטילכולין (ACh ). (A) טבעת אנדותל שלמה (E+) ו-(B) טבעת עם אנדותל (E-). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: התפשטות של IPA על-ידי תמצית הצמח. (A) רשומה מייצגת המציגה את הווזוקולציה של טבעות IPA על ידי תמצית הצמח (1-1,000 מיקרוגרם/מ"ל) שהתכווצה מראש עם 10 μM PE בטבעות שלמות של אנדותל (E+) ו-(B) עם אנדותל (E-). (C) עקומות ריכוז-תגובה של וזוהרפיה המושרה על-ידי תמצית הצמח בטבעות IPA (E+, n = 6 ו-E-, n = 6). Vasorelax מתבטא כאחוז מההתכווצות המושרה על ידי PE. כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. **p < 0.01, ***p < 0.001 בהשוואה לרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 7. המנגנונים של ה-IPA המושרה על-ידי תמצית הצמח דרך המסלול התלוי באנדותל. (A) רשומה מייצגת המציגה את ה-vasorelax על ידי תמצית הצמח (1-1,000 מיקרוגרם/מ"ל) של טבעות IPA שלמות של אנדותל (E+) שהודגמו מראש עם L-NAME (מעכב eNOS) והודבקו מראש עם 10 μM PE. (ב-ד) עקומות תגובת ריכוז של וזוהרלפנטים המושרים על-ידי תמצית צמחים של טבעות IPA שלמות של אנדותל שלם (E+) שהודבקו מראש עם PE ודוגרו מראש עם מעכבים של מסלולי איתות אנדותל שונים, כולל (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indomethacin, או (D) 0.1 μM apamin בתוספת 0.1 μM charybdotoxin. ערכים הם אמצעי ± SEM. (n = 6). **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 8. ההשפעה של חוסמי תעלות K+ על ה-IPA המושרה על-ידי תמצית צמחים. (A) רשומה מייצגת המציגה את התפשטות כלי הדם על ידי תמצית הצמח (1-1,000 מיקרוגרם/מ"ל) של טבעות IPA עם אנדותל (E-) מודגרות עם 4-AP (חוסם ערוציםK V) ומזוהות מראש עם 10 μM PE. (ב-ד) עקומות תגובת ריכוז של כלי הדם הנגרמים על-ידי תמצית צמחים של טבעות IPA המושרות על ידי אנדותל (E-) עם PE ודגרה מראש עם חוסמי ערוץ K+ שונים, כולל (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenclamide, או (D) 30 nM iberiotoxin. ערכים הם אמצעי ± SEM. (n = 6). עמ' < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 9. השפעת תמצית הצמח על זרם Ca2+ חוץ-תאי. (א) רשומות מייצגות המראות התכווצות של טבעות IPA המושרה על ידי CaCl2 בהיעדר (בקרה) או נוכחות של תמצית הצמח. טבעות IPA נשטפו בתמיסת Ca2+Free High K+-(80 mM) המכילה 10 mM EGTA וההתכווצות שעורר ריכוז מצטבר של CaCl2 נמדדה. פרוטוקול זה חזר על עצמו לאחר מכן לבדו (בקרה, n = 6) או בנוכחות תמצית הצמח (n = 6). (B) עקומות תגובת ריכוז עבור CaCl 2 המושרה התכווצות של טבעות IPA בהיעדר (בקרה) או נוכחות של תמצית הצמח או 1 μM nicardipine (חוסם ערוצים מסוג LCa 2+). ההתכווצות המושרה של CaCl 2 חושבה כאחוז מההתכווצות המרבית שנרשמה מיישום CaCl2 הראשון והתבטאה כממוצע ± SEM. *p < 0.05, ***p < 0.001 בהשוואה לניקרדיפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10. השפעת תמצית הצמח על שחרור Ca2+ מהרשתית הסרקופלסמית (SR). (A) רשומה מייצגת המציגה התכווצות המושרה על ידי פנילפרין (PE) של טבעות IPA על ידי שחרור Ca2+ מה-SR של טבעות IPA עם ניוד אנדותל בנוכחות DMSO (בקרה) ו-10 μM של תמצית צמחים. הנתונים הם אחוזי התכווצות ל-10 μM הנגרמים על ידי PE התכווצויות בהשוואה להתכווצויות המיוצרות על ידי הפרוטוקול הראשוני ללא תמצית הצמח. ערכים הם אמצעי ± SEM. **p < 0.01 בהשוואה לרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 11: מנגנון מוצע של פעולת מרחיב כלי הדם של תמצית הצמח על עורק תוך-פולמונרי של חולדות דרך מסלולים תלויי אנדותל ובלתי תלויים AA = חומצה ארכידונית, ACh = אצטילכולין, AC = אדניל ציקלאז, ATP = אדנוזין 5'-טריפוספט, cAMP = אדנוזין מונופוספט מחזורי, cGMP = גואנוזין מונופוספט מחזורי, COX = ציקלואוקסיגנאז, DAG = דיאצילגליצרול, EDHF = גורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל, eNOS = סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל, Gq = G-protein type q, G s = G-protein types, GTP = טריפוספט גואנוזין, IP = קולטן פרוסטציקלין, IP 3 = אינוזיטול 1, 4, 5 טריספוספט, IP 3 R = קולטן IP 3, IK Ca = מוליכות ביניים Ca 2+-מופעל ערוץ K+, KV = תעלות אשלגן מגודרות מתח, K ATP = ערוצי אשלגן רגישים ל-ATP, K Ca = מוליכות גדולהCa 2+-מופעל K+ ערוצים, M3 = קולטן מוסקריני, MEGJ = צומת גאב מיואנדותל, NO = תחמוצת החנקן, PE = פנילפרין, PGI 2 = פרוסטציקלין, PGs = פרוסטגלנדינים, PIP 2 = פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט, PKA = חלבון קינאז A, PKG = חלבון קינאז G, PLA 2 = פוספוליפאז A 2, PLC = פוספוליפאז C, ROCCs = ערוצי Ca2+ המופעלים על ידי קולטן, RYR = קולטן ריאנודין, sGC = ציקלאז גואניליל מסיס, SK Ca = מוליכות קטנהCa ערוץ K+ מופעל 2+, SR = רשתית סרקופלסמית, VOCCs = ערוציCa 2+ המופעלים במתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה אנו מתארים את הטכניקה לבידוד של חולדות IPA ו- VSMCs. מספר פרוטוקולים ניסיוניים שימשו כדי לחקור את התגובה הווסקולרית של IPA במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את האפקט הפרמקולוגי ואת הבסיס המכניסטי של IPA vasorelaxation המושרה על ידי תמצית צמחים.
בנוגע לפעולת מרחיב כלי הדם התלוי באנדותל של תמצית הצמח, נעשה שימוש בחוסמים שונים כגון L-NAME (eNOS), אינדומתצין (COX) ואפמין+charybdotoxin (EDHF). הנתונים המייצגים הראו הן תוצאות חיוביות (כלומר, הפחתה משמעותית של תגובת מרחיבי כלי הדם בנוכחות מעכבי eNOS או EDHF) והן תוצאות שליליות (כלומר, ללא שינוי בתגובת מרחיב כלי הדם בנוכחות מעכב COX), מה שמרמז על כך שתמצית הצמח פועלת דרך מסלולי האנדותל eNOS ו-EDHF. ההשפעה הווזו-ארקולאקנטית שאינה תלויה באנדותל המושרה על-ידי תמצית הצמח נבדקה באמצעות מעורבות של ערוצי K+, זרם Ca 2+ חוץ-תאי ושחרור Ca2+ מה-SR. התוצאות הראו כי vasorelaxation בתגובה לתמצית הצמח הופחת על ידי חוסם של ערוצי K Ca (iberiotoxin) אך לא על ידי חוסם של ערוצי KV (4-AP) או חוסם של ערוצי KATP (glibenclamide), מה שמרמז על כך שהתמצית פועלת באמצעות פתיחת ערוציK Ca. יתר על כן, ה-CaCl 2-המושרה על ידי vasoconstriction הופחתה על ידי תמצית הצמח, מה שמרמז על כך שהמנגנון שלה כלל עיכוב של תרכובות אורגניות נדיפות ב-VSMCs או הפרעה לאינטראקציות של Ca2+ עם מכונות התכווצות. מחקרים משלימים צריכים להתבצע כדי לנתח עוד יותר את הפעולה המכניסטית המפורטת שלה. יתר על כן, ההתכווצות הארעית ל-PE בקרבס נטול Ca 2+ הופחתה, מה שמצביע על כך שתמצית הצמח עיכבה את שחרורו של Ca2+ מה-SR, מה שהוביל להפחתת התפשטות כלי הדם. סיכום של המנגנון המפורש של פעולת הווזורלאקסנט של תמצית הצמח מודגם באיור 11.
הפרוטוקולים הניסיוניים המוצעים במחקר הנוכחי הם אפשריים מבחינה טכנית ומראים יכולת שכפול טובה; עם זאת, צעדים חיוניים מסוימים חיוניים כדי להבטיח הצלחה. ראשית, הרכב הפתרון הפיזיולוגי חייב להישמר במדויק במהלך ההכנה כדי להבטיח את ההליך עובד כראוי. כמו כן, חשוב להימנע ממגע, מתיחה או פגיעה בעורק הריאה במהלך ההכנה. יש להחליף את המדיום ברציפות כל 15 דקות (3 פעמים) כדי לייצב את הבדיקה וההערכה ברגע שעורק הריאה מודבק בתא האמבטיה של האיברים. יש להגדיל את המתח המקדים של כלי השיט מעט מעל הרמה הנדרשת ולאחר מכן לרדת בהדרגה עד להשגת האופטימום (כלומר, 1 גרם).
מספר פרוטוקולים ניסיוניים, כגון הכדאיות של כלי הדם, נוכחות של תאי אנדותל, ואת ההשפעה של תמציות צמחים על הרפיה של כלי הדם, מוערכים על ידי טכניקה זו. ניתן לכוונן את הנוהל המובהק לבידוד IPA של חולדות למינים אחרים (למשל, עכבר, ארנב ואדם). עם זאת, התנאים האופטימליים הנדרשים להרכבת אמבט איברים עשויים להיות שונים בין דגמים שונים של בעלי חיים ועשויים להיות מותאמים בהתאם. חשוב לציין שתנאי הניסוי אינם שכפול מדויק של תנאים פיזיולוגיים, ולא ניתן לאקסטרפולציה ישירה של התוצאות לתופעת ה-in vivo .
שיטת בידוד IPA זו ומדידות תגובת כלי הדם הן גישות מעשיות להערכת פיזיולוגיה של כלי הדם, הפתולוגיה והפרמקולוגיה. היא מאפשרת לחוקרים לחקור את התפשטות כלי הדם ואת כלי הדם בסביבה מבודדת אך מבוקרת היטב. בנוסף, ניתן להתאים אותו לחקר הפעולה הטיפולית של תרופות המשמשות לפתולוגיה של כלי הדם הריאתיים, כגון יתר לחץ דם ריאתי עורקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למועצת המחקר הלאומית של תאילנד, למרכז המצוינות לחדשנות בכימיה (PERCH-CIC) ולרשת המחקר הבינלאומית (IRN61W0005) על מתן תמיכה כספית, ולמחלקה לפיזיולוגיה הפקולטה למדעי הרפואה, אוניברסיטת נארסואן, על תמיכה במתקני מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
