Summary
As respostas vasculares da circulação arterial pulmonar podem ser exploradas usando a artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS). O presente estudo descreve detalhadamente o isolamento da AFI e os protocolos utilizados para investigar o vasorelaxamento em resposta a estímulos fisiológicos.
Abstract
A artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS) isoladas dos pulmões de ratos podem ser usadas para estudar os mecanismos subjacentes de vasoconstrição e vasorelaxamento. Após o isolamento da AIP e dos CMVS, as características das respostas vasculares em condições fisiológicas e patológicas podem ser avaliadas na ausência de fatores extrínsecos, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, etc. Assim, o IPA e o VSMCs servem como excelentes modelos para o estudo da fisiologia / fisiopatologia vascular, juntamente com várias investigações experimentais, como modulação por agentes farmacológicos, análise eletrofisiológica patch-clamp, imagens de cálcio, etc. Aqui, utilizamos uma técnica de isolamento da AFI para investigar as respostas vasculares em uma configuração de banho de órgão. Os segmentos de AFI foram montados na câmara de banho do órgão através de fios intraluminais e estimulados por vários agentes farmacológicos. As alterações no tônus vascular da AIP (isto é, vasoconstrição e vasorelaxamento) foram registradas por meio de um transdutor de força isométrico e de um programa de análise de dados fisiológicos. Implementamos diversos protocolos experimentais, que podem ser adaptados para investigar os mecanismos de vasorelaxamento/vasoconstrição para o estudo das atividades farmacológicas de drogas fitoquímicas ou sintéticas. Os protocolos também podem ser usados para avaliar o papel dos medicamentos na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão arterial pulmonar. O modelo IPA permite investigar a curva concentração-resposta, que é crucial na avaliação dos parâmetros farmacodinâmicos dos fármacos.
Introduction
A vasculatura pulmonar é um sistema vascular de baixa pressão em que a principal função é entregar sangue desoxigenado para a área de troca de gases dos pulmões. As artérias pulmonares nos pulmões estão dispostas em ramos paralelos à árvore brônquica, formando uma extensa rede de capilares que é contínua sobre vários alvéolos e, finalmente, juntando-se em vênulas e veias. O tônus vascular da artéria pulmonar é controlado por diversos fatores, envolvendo a interação entre o endotélio e as células musculares lisas vasculares (CMVS)1.
Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento dependente e independente do endotélio da artéria intrapulmonar (AIP). Com relação ao vasorelaxamento dependente do endotélio, vários mecanismos que ocorrem na superfície das células endoteliais podem aumentar a concentração intracelular de Ca2+ (por exemplo, a acetilcolina [ACh] se liga ao receptor muscarínico [M3]), levando à formação de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (Figura 1 ). O NO é o principal fator relaxante derivado do endotélio sintetizado a partir da L-arginina pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)2, que então se dissocia das células endoteliais para VSMCs (Figura 1) e estimula a enzima guanililciclase solúvel (sGC); essa enzima transforma o trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), que ativa a proteína quinase G (PKG) e reduz os níveis citosólicos de Ca2+, causando vasorelaxamento (Figura 1). O PGl2 é sintetizado por células endoteliais através da via ciclo-oxigenase (COX) 3,4. Liga-se ao receptor de prostaciclina (IP) em VSMCs e estimula a enzima adenilil ciclase (AC), que então converte o trifosfato de adenosina (ATP) em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. O AMPc ativa a proteína quinase A (PKA), reduzindo os níveis citosólicos de Ca2+ e causando vasorelaxamento5 (Figura 1). A via EDHF também participa do vasorelaxamento dependente do endotélio através de vários mediadores endoteliais e eventos elétricos. A ativação da via EDHF leva à hiperpolarização dos CMVS, fechando assim os canais de Ca 2+ operados por voltagem (VOCCs), reduzindo os níveis intracelulares de Ca 2+ e induzindo vasorelaxamento 6. O vasorelaxamento independente do endotélio ocorre diretamente nos CMVS por meio de vários mecanismos, como a redução do nível intracelular de Ca 2+, a inibição da miosina quinase de cadeia leve (MLCK), a ativação da fosfatase de cadeia leve da miosina (MLCP) e a redução da sensibilidade de Ca2+ à maquinaria contrátil dos VSMCs. Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento causado pela abertura de vários canais K+, o bloqueio de VOCCs e a inibição da liberação de Ca 2+ do retículo sarcoplasmático7, o que leva à redução dos níveis intracelulares de Ca2+, diminuindo assim a fosforilação da cadeia leve da miosina VSMC e a ligação miosina-actina ou formação de ponte cruzada, respectivamente, em última análise, resultando em vasorelaxamento.
A técnica para avaliar as medidas de vasoconstrição e vasorelaxamento em TIP isolada está bem estabelecida para roedores, mas os dados variaram dependendo dos protocolos experimentais. O presente estudo descreve o método utilizado para avaliar as reatividades vasculares de preparações de AIP in vitro de ratos, que foram realizadas na ausência de fatores externos moduladores da resposta vascular in vivo, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, pressão arterial, etc.
Empregamos vários protocolos experimentais utilizando o extrato vegetal como exemplo para o estudo das reatividades vasculares da AIP. Vários bloqueadores (Figura 1) foram utilizados para identificar os mecanismos de vasorelaxamento endotélio-dependente e independente induzido pelo extrato vegetal. No entanto, os mesmos protocolos podem ser adaptados para avaliar as respostas vasculares da AIP a quaisquer fármacos, extratos ou fitoquímicos utilizados para o tratamento de várias patologias pulmonares.
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Protocol
Os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para o cuidado e uso de animais para fins científicos.
1. Composição das soluções fisiológicas
- Formular a solução de Krebs dissolvendo produtos químicos em água destilada para atingir as concentrações finais da seguinte forma: 122 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl 2e 11 mM de glicose8. Ajustar o pH da solução a 7,3 com 1 M de NaOH e pré-aquecer a 37 °C antes da utilização.
- Preparar a solução fria de Krebs de forma semelhante, tal como mencionado no passo 1.1. para uso como meio de isolamento do IPA, conforme descrito na etapa 2.
2. Isolamento da artéria intrapulmonar (AIP)
- Anestesiar ratos Wistar machos de 8 semanas de idade com injeção intraperitoneal de tiopental sódico (100 mg/kg)9. Verifique os ratos quanto à sua reação a estímulos dolorosos no sono profundo usando pinça presa aos pés e, em seguida, certifique-se de que os ratos não tenham uma reação de puxar o pé antes de eutanasiá-los na etapa 2.2.
- Abra o tórax médio do rato e o terminal cardíaco com uma tesoura (tamanho 14 cm). Em seguida, localize a raiz do pulmão com uma tesoura (tamanho 14 cm). Colha todo o pulmão cortando com tesoura e mergulhe-o em solução fria de Krebs10,11.
- Corte um único lobo do pulmão com uma tesoura (tamanho 11 cm) e coloque em uma placa de Petri (tamanho 9 cm) com o lado/raiz medial do pulmão voltado para cima (Figura 2A, B). Observe e identifique o alinhamento da veia, brônquios e artéria de cima para baixo (Figura 2B).
- Corte o brônquio longitudinalmente com uma tesoura (tamanho 11 cm). Em seguida, use a pinça (tamanho 11 cm) para agarrar a ponta do brônquio. Disseque suavemente e remova o brônquio e as veias para fora do pulmão. Note que o IPA está sempre alinhado anatomicamente abaixo do brônquio.
- Depois disso, o IPA principal pode ser visualizado (Figura 2C). Use a pinça (tamanho 11 cm) para pegar a ponta do IPA e dissecá-lo cuidadosamente para fora do tecido pulmonar com uma tesoura (tamanho 11 cm).
- Manter o IPA isolado em solução fria de Krebs até que o conjunto do banho do órgão esteja configurado (pH 7,3 e temperatura 4 °C)1 1.
3. Isolamento das células musculares lisas vasculares (VSMCs)
- Isole o IPA conforme descrito anteriormente na etapa 2. Cortar longitudinalmente o ramo principal do IPA longitudinalmente com uma tesoura (tamanho 11 cm) e cortar em pequenas tiras (2 mm) (Figura 3A).
- Imergir as tiras de IPA em um meio de dissociação (DM)10,12 contendo 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de NaHCO3, 10 mM de HEPES, 0,03 mM de vermelho de fenol, 10 mM de taurina, 0,5 mM de EDTA, 2 mM de MgCl 2, 11 mM de glicose e 0,16 mM de CaCl 2, e ajustar o pH para 7,0 com 1 M de NaOH. Incubar as tiras por 1 h a 4 °C em MS contendo 1 mg/mL de papaína, albumina sérica bovina (BSA) a 0,04% e 0,4 mM 1,4- ditiotreitol (TDT), e incubar a 37 °C por 15 min. Adicionar 1 mg/ml de colagenase tipo 1A em MS e incubar a 37 °C durante 5 min.
NOTA: O DM é uma solução utilizada para preservar a viabilidade celular. A papaína e a colagenase tipo 1A são enzimas que quebram as proteínas da matriz extracelular para isolar células individuais. A BSA é uma proteína de albumina sérica usada para a estabilização de enzimas durante o armazenamento e reações enzimáticas. A TDT é um agente redutor utilizado para estabilizar e promover a atividade das enzimas durante o processo de isolamento celular. A taurina é o ácido aminossulfúrico usado para estabilizar a membrana celular e a integridade celular. - Transfira os tecidos para DM fresco e disperse por trituração suave usando uma pipeta Pasteur de vidro (Figura 3B). Manter a trituração até que os VSMCs isolados se tornem visíveis na solução de banho ao microscópio (Figura 3C).
NOTA: VSMCs recém-isolados podem ser usados para estudar fisiologia / fisiopatologia vascular, juntamente com várias investigações experimentais, como modulação por agentes farmacológicos, análise eletrofisiológica patch-clamp, imagens de cálcio, etc. No entanto, o presente estudo enfoca apenas o vasorelaxamento da APP isolada utilizando a técnica de banho de órgãos.
4. Técnica de banho de órgãos
- Isole o IPA conforme descrito anteriormente na etapa 2. Corte o ramo principal do IPA em anéis de ~2 mm de comprimento (Figura 2D)13.
- Afixar os anéis IPA nas câmaras de banho do órgão (Figura 4) rosqueando-os em dois fios de aço inoxidável de 40 μm de diâmetro (Figura 2E)11,13,14.
- Anexe fios de aço inoxidável montados com anéis IPA aos transdutores de força isométricos conectados ao dispositivo de aquisição de dados e ao sistema de computador instalado com o software fisiológico adequado para gravação e análise de dados e, em seguida, eleve suavemente a tensão do anel IPA para 1 g11.
- Deixe que os segmentos do vaso se equilibrem por cerca de 45 minutos a uma tensão de repouso de 1 g. Durante o período de equilíbrio, certifique-se de que a solução de Krebs é trocada regularmente a cada 15 minutos. Após esse período de equilíbrio, testar a viabilidade dos vasos medindo sua vasoconstrição a solução extracelular alta de K+ (80 mM) contendo 47,4 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl 2 e 11 mM de glicose10,11.
- Avalie a presença ou ausência de endotélio calculando a resposta de relaxamento à acetilcolina (1 x 10−5 M) em anéis pré-contraídos com fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Observe que as contrações vasculares permanecem estáveis por 1 h após a adição de EP). Considere os anéis como intactos do endotélio se eles quantificarem para mais de 70% de relaxamento (Figura 5A). Se tiverem menos de 10% de relaxamento, considere os anéis como desnudados do endotélio13 (Figura 5B). Remova mecanicamente o endotélio esfregando suavemente dentro do vaso com um pequeno fio para induzir o desnudamento.
- Novamente equilibrar os anéis arteriais por 30 min antes do início dos experimentos de teste.
5. Resposta vasorelaxante ao extrato vegetal
- Investigue o efeito relaxante do extrato vegetal pré-contraindo anéis IPA com PE (1 x 10−5 M).
- Em seguida, adicione cuidadosamente o extrato da planta (1-1.000 μg/mL) cumulativamente aos anéis intactos do endotélio e aos anéis desnudos do endotélio para induzir vasorelaxamento (Figura 6A, B) e adquirir uma curva de resposta dependente da concentração (Figura 6C).
- Certifique-se de que o efeito do dimetilsulfóxido (DMSO) usado como solvente também seja avaliado de forma semelhante para servir como um controle negativo (Figura 6C).
6. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal através do endotélio
- Avaliar o mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal via vias endotelial óxido nítrico sintase (eNOS), ciclo-oxigenase (COX)13 e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF) incubando os anéis IPA intactos do endotélio por 30 min com os seguintes inibidores (Figura 7A): 1 x 10−4 M éster metílico NG-nitro-L-arginina (L-NAME, um inibidor da eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (um inibidor da COX)9, ou uma combinação de 1 x 10−7 M apamin (um pequeno bloqueador dos canais de potássio ativado por cálcio) e 1 x 10−7 M charybdotoxin (um bloqueador dos canais de potássio ativado por cálcio intermediário e de grande condutividade), antes de induzir contrações de IPA com 1 x 10−5 M PE.
- Em seguida, após as contrações para a estabilização do PE, adicione concentrações cumulativas (0,1-1.000 μg/mL) do extrato da planta.
- Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis de AIP na presença de inibidores em comparação com a resposta dos anéis de AIP sem inibidores (Figura 7B-D) e construir a curva concentração-resposta.
7. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via canais K+ do músculo liso vascular
- Pré-incubar anéis IPA desnudados de endotélio por 30 min com 1 x 10−3 M 4-aminopiridina (4-AP), um bloqueador do canal de potássio dependente de voltagem (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamida, um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP (KATP), ou 1 x 10−7 M de iberiotoxina, um bloqueador de grande condutância Ca2+ canais K+ ativados (KCa), antes de induzir contrações de AIP com 1 x 10−5 M PE.
- Em seguida, adicione concentrações cumulativas do extrato da planta.
- Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis de IPA com inibidor em comparação com os anéis de IPA sem inibidor (Figura 8B-D) e construir a curva de concentração-resposta.
8. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via inibição do influxo extracelular de cálcio (Ca2+) em CMVS
- Pré-incubar anéis de IPA desnudados com endotélio por 30 min em solução de Krebs livre de Ca2+ contendo 1 mM de etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) (Figura 9A).
- Em seguida, substitua a solução de banho por uma solução de Ca2 + livre-80 mM K+ por 10 min para despolarizar os VSMCs, que então abrem os VOCCs (Figura 9A).
- Adicionar cumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) para induzir vasoconstrição da AFI e construir a curva concentração-resposta (Figura 9A).
- Repetir este protocolo nos mesmos anéis IPA, mas pré-incubá-los com extracto vegetal ou 1 μM de nicardipina (bloqueador de canais Ca 2+ tipo L) em solução de Ca2+ contendo 80 mM K+ durante 10 minutos, seguida da adição cumulativa de CaCl28.
- Por fim, compare a resposta contrátil com a contração máxima anteriormente provocada pelos desafios de CaCl2 de controle (Figura 9B).
9. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via inibição da liberação intracelular de cálcio (Ca2+) do retículo sarcoplasmático (SR)
- Expor os anéis IPA desnudados de endotélio a uma solução K+ de 80 mM por aproximadamente 5 min, despolarizando os VSMCs, abrindo os VOCCs e, finalmente, gerando a carga de Ca2+ no SR (Figura 10A).
- Substitua a solução de banho por 10 min por uma solução de Krebs isenta de Ca2+ contendo 1 mM EGTA (Figura 10A).
- Em seguida, desafie os anéis IPA com 1 x 10−5 M PE, que ativa a via da fosfolipase C/IP3 , liberando Ca2+ da SR e evocando uma contração transitória da IPA (Figura 10A).
- Repita o mesmo protocolo para verificar contrações igualmente transitórias para EP.
- Desafie os anéis IPA novamente com uma solução de K+ de 80 mM por cerca de 5 minutos e, em seguida, substitua a solução de banho por uma solução de Krebs livre de Ca2+ contendo EGTA de 1 mM com ou sem o extrato da planta por 10 minutos.
- Novamente, desafie os anéis IPA com 1 x 10−5 M PE.
- Comparar as contrações de AIP induzidas pela EP entre a condição com e sem o extrato vegetal (Figura 10B).
10. Análise estatística
- Compare esses ±valores usando o teste t de Student de Student ou analise por uma análise de variância (ANOVA) seguida do teste post hoc de Tukey-Kramer usando um software estatístico adequado. Considere-se estatisticamente significativas as diferenças em p < 0,05. Aqui, havia n = 6 ratos/protocolo experimental.
NOTA: O registro de vasoconstrição e vasorelaxamento pode ser avaliado com software adequado instalado no computador. Por exemplo, a Figura 5A mostra que, quando os vasos sanguíneos são estimulados pela EP causando contração, isso pode ser observado a partir do aumento da tensão do traçado original. O traçado se estabilizará em 20-30 min, o que é considerado uma contração de 100%. Depois disso, o ACh estimula os vasos sanguíneos, causando relaxamento, o que pode ser observado a partir da diminuição da tensão do traçado original. Assim, a tensão reduzida é calculada como a porcentagem em comparação com a contração de 100%.
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Representative Results
O protocolo do presente estudo foi desenvolvido para determinar as condições experimentais ótimas para a mensuração de fenômenos fisiológicos observados nas respostas vasculares de preparações isoladas de AIP. Os experimentos piloto foram realizados para descrever os potenciais desfechos que auxiliam na compreensão dos efeitos vasculares e da base mecanicista da ação vasorelaxante do extrato vegetal, conforme a seguir.
Efeito vasorelaxante do extrato vegetal
Como mostra a Figura 6A,B, na AIP intacta ao endotélio (E+), o extrato vegetal provocou uma resposta de vasorelaxamento dependente da concentração (EC50 = 66,88 μg/mL, Figura 6C). A erradicação do endotélio (E-) reduziu profundamente o vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal (p < 0,01), como refletido pelo aumento da EC 50 em 2,2 vezes (E-, EC50 = 150,60 μg/mL, Figura 6C). O veículo, DMSO, não possuía qualquer efeito. Assim, o extrato vegetal produziu vasorelaxamento principalmente através de uma via dependente do endotélio e parcialmente através de uma via independente do endotélio.
Mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal através de vias dependentes do endotélio
Como mostrado na Figura 7, a utilização de L-NAME para a inibição da eNOS (Figura 7B) e a combinação de apamin mais caribdotoxina para bloqueio de EDHF (Figura 7D) evidentemente diminuiu a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal. Isso deslocou a curva concentração-resposta para a direita e aumentou a EC50 sem alterar os valores de Emax. Pelo contrário, a indometacina (um inibidor da COX) (Figura 7C), não mostrou efeito sobre a resposta vasorelaxante ao extrato da planta.
Caracterizando o papel dos canais K+ na ação vasorelaxante do extrato vegetal
Nos anéis de AIP desnudados com endotélio, o bloqueador de canais de KCa (iberiotoxina) diminuiu a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal (Figura 8C), enquanto os bloqueadores dos canais Kv (4-AP) ou KATP (glibenclamida) não modificaram o vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal (Figura 8B,D).
Mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal via inibição extracelular do influxo de Ca2+
Para investigar se o mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal envolvia a inibição extracelular do influxo de Ca 2+, a vasoconstrição dos anéis de IPA desnudados de endotélio foi evocada por 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 em solução de Krebs livre de Ca2+ incorporada com 80 mM K+ para ativar os VOCCs (Figura 9A,B). A pré-incubação com o extrato vegetal (68 μg/mL, valor EC50) inibiu a contração induzida por CaCl2 (p < 0,001 vs. veículo).
Mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal via inibição da liberação intracelular de Ca2+ da RS
Para examinar se a liberação de Ca 2+ intracelular a partir da RS desempenhou algum papel no efeito vasorelaxante, os anéis de IPA desnudados do endotélio foram pré-incubados com solução de Krebs livre de Ca2+, seguida da adição de EP (1 x 10−5 M), resultando em uma contração transitória (Figura 10A). Em seguida, no mesmo anel IPA, esse experimento foi replicado na presença de extrato de veículo ou planta. Em comparação com o veículo, o extrato vegetal reduziu significativamente (p < 0,001) a contração induzida pela EP (Figura 10B).
Figura 1: Regulação do tônus vascular por vias dependentes e independentes do endotélio. AA = Ácido araquidônico, ACh = Acetilcolina, AC = Adenilil ciclase, ATP = Adenosina 5'-trifosfato, cAMP = Monofosfato de adenosina cíclica, cGMP = Monofosfato de guanosina cíclica, COX = Ciclooxigenase, DAG = Diacilglicerol, EDHF = Fator hiperpolarizante derivado do endotélio, eNOS = Óxido nítrico sintase endotelial, G q = Proteína G tipoq, G s = G-proteína tiposs, GTP = Guanosina trifosfato, IP = receptor de prostaciclina, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfato, IP3 R = receptor IP3, IK Ca = Condutância intermediária Ca 2+ canal K+ ativado, KV = Canais de potássio dependentes de voltagem, K ATP = canais de potássio sensíveis aATP, K Ca = Grande condutância Ca 2+ canais K+ ativados, M3 = receptor muscarínico, MEGJ = Junção mioendotelial gab, NO = óxido nítrico, PE = fenilefrina, PGI 2 = Prostaciclina, PGs = Prostaglandinas, PIP2 = Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato, PKA = Proteína quinase A, PKG = Proteína quinase G, PLA 2 = Fosfolipase A2, PLC = Fosfolipase C, ROCCs = Canais de Ca 2+ operados por receptor, RYR = Receptor de rianodina, sGC = Guanicilciclase solúvel, SK Ca = Pequena condutância Ca 2+ canal K+ ativado, SR = Retículo sarcoplasmático, VOCCs = Canais deCa 2+ operados por voltagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Principais etapas do isolamento da artéria intrapulmonar (AIP ) de ratos. (A) A imagem mostra o pulmão de rato com AIP. (B) Dissecção do lado/raiz medial do pulmão voltada para cima. (C) IPA principal visualizada após a remoção das veias e brônquios. (D) IPA isolada. (E) Os anéis IPA foram montados em um par de fios de aço inoxidável para um estudo de resposta vascular usando a técnica de banho de órgãos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Principais etapas do isolamento das células musculares lisas vasculares (CMVS) da AIP. (A) A AIP isolada foi cortada em pequenas tiras e imersa em meio de dissociação (DM). (B) Trituração de tiras vasculares para isolar VSMCs. (C) VSMCs isolados após trituração suave. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração esquemática do equipamento utilizado para testar a reatividade vascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Registro representativo mostrando vasorelaxamento de anéis de AIP pré-contraídos com 10 μM de EP por acetilcolina (ACh) de 10 μM. (A) Anel intacto do endotélio (E+) e (B) anel de desnudamento do endotélio (E-). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Vasorelaxamento da AIP pelo extrato vegetal. (A) Registro representativo mostrando vasorelaxamento dos anéis de AIP pelo extrato vegetal (1-1.000 μg/mL) pré-contraído com 10 μM de PE em anéis intactos do endotélio (E+) e (B) desnudados do endotélio (E-). (C) Curvas de concentração-resposta de vasorelaxamento induzidas pelo extrato vegetal em anéis de AIP (E+, n = 6 e E-, n = 6). O vasorelaxamento é expresso como uma porcentagem da contração induzida pela EP. Todos os dados são expressos como média ± EPM. **p < 0,01, ****p < 0,001 em comparação com o veículo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Os mecanismos do vasorelaxamento da AIP induzida pelo extrato vegetal através da via dependente do endotélio. (A) Registro representativo mostrando vasorelaxamento pelo extrato vegetal (1-1.000 μg/mL) de anéis de IPA intactos no endotélio (E+) pré-incubados com L-NAME (inibidor de eNOS) e pré-contraídos com 10 μM de PE. (B-D) Curvas de concentração-resposta dos vasorelaxamentos induzidos pelo extrato vegetal de anéis IPA intactos no endotélio (E+) pré-contraídos com PE e pré-incubados com inibidores de várias vias de sinalização endotelial, incluindo (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM de indometacina, ou (D) 0,1 μM apamin mais 0,1 μM de caribdotoxina. Os valores são médias ± MEV. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Efeito dos bloqueadores de canais K+ no vasorelaxamento da AIP induzido pelo extrato vegetal. (A) Registro representativo mostrando vasorelaxamento pelo extrato vegetal (1-1.000 μg/mL) de anéis IPA desnudados com endotélio (E-) incubados com 4-AP (bloqueadorde canais K V) e pré-contraídos com PE de 10 μM. (B-D) Curvas de concentração-resposta do vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal de anéis IPA desnudados de endotélio (E-) pré-contraídos com PE e pré-incubados com vários bloqueadores de canais K+, incluindo (B) 1 mM 4-AP, (C) glibenclamida 10 μM ou (D) iberiotoxina 30 nM. Os valores são médias ± MEV. (n = 6). p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. Efeito do extrato vegetal no influxo extracelular de Ca2+. (A) Registros representativos que mostram a contração induzida por CaCl2 dos anéis IPA na ausência (controle) ou presença do extrato vegetal. Os anéis de AIP foram banhados em Ca2+-solução de K+ alta livre (80 mM) contendo EGTA de 10 mM e a contração evocada por uma concentração cumulativa de CaCl2 foi medida. Esse protocolo foi então repetido isoladamente (controle, n = 6) ou na presença do extrato da planta (n = 6). (B) Curvas de concentração-resposta para contração induzida por CaCl2 de anéis IPA na ausência (controle) ou presença do extrato vegetal ou 1 μM de nicardipina (bloqueador de canais Ca2+ tipo L). A contração induzida por CaCl 2 foi calculada como porcentagem da contração máxima registrada a partir da primeira aplicação de CaCl2 e expressa como média ± EPM. *p < 0,05, ***p < 0,001 em comparação com a nicardipina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Efeito do extrato vegetal na liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (SR). (A) Registro representativo mostrando contração induzida por fenilefrina (PE) de anéis de IPA pela liberação de Ca2+ do SR de anéis de IPA desnudados de endotélio na presença de DMSO (controle) e 10 μM de extrato vegetal. Os dados são contrações percentuais para contrações induzidas por PE de 10 μM em comparação com contrações produzidas pelo protocolo inicial sem o extrato da planta. Os valores são médias ± SEM. **p < 0,01 em comparação com o veículo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Mecanismo proposto de ação vasodilatadora do extrato da planta na artéria intrapulmonar de ratos via vias dependentes de endotélio e independentes AA = ácido araquidônico, ACh = acetilcolina, AC = adenilciclase, ATP = adenosina 5'-trifosfato, cAMP = monofosfato de adenosina cíclico, cGMP = monofosfato de guanosina cíclico, COX = ciclooxigenase, DAG = Diacilglicerol, EDHF = Fator hiperpolarizante derivado do endotélio, eNOS = Óxido nítrico sintase endotelial, Gq = G-proteína tipo q, G s = G-proteína tipos, GTP = trifosfato de guanosina, IP = receptor de prostaciclina, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfato, IP 3 R = receptor IP 3, IK Ca = Condutância intermediária Ca 2+-canal K+ ativado, KV = Canais de potássio dependentes de voltagem, K ATP = canais de potássio sensíveis aATP, K Ca = Grande condutânciaCa 2+ K+ ativado canais, M3 = Receptor muscarínico, MEGJ = Junção mioendotelial do gab, NO = Óxido nítrico, PE = Fenilefrina, PGI 2 = Prostaciclina, PGs = Prostaglandinas, PIP 2 = Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato, PKA = Proteína quinase A, PKG = Proteína quinase G, PLA 2 = Fosfolipase A 2, PLC = Fosfolipase C, ROCCs = Canais Ca2+ operados por receptor, RYR = Receptor de rianodina, sGC = Guanicilciclase solúvel, SK Ca = Pequena condutânciaCa Canal K+ 2+-ativado, SR = retículo sarcoplasmático, VOCCs = Canais Ca2+ operados por tensão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste manuscrito, descrevemos a técnica de isolamento de IPA e VSMCs de ratos. Vários protocolos experimentais têm sido empregados para investigar a resposta vascular da AIP in vitro, que podem ser utilizados para caracterizar o efeito farmacológico e a base mecanicista do vasorelaxamento da AIP induzido pelo extrato vegetal.
Em relação à ação vasodilatadora endotélio-dependente do extrato vegetal, vários bloqueadores como L-NAME (eNOS), indometacina (COX) e apamina+caribdotoxina (EDHF) foram empregados. Os dados representativos mostraram resultados positivos (ou seja, redução significativa da resposta vasodilatadora na presença de inibidores de eNOS ou EDHF) e resultados negativos (ou seja, nenhuma alteração na resposta vasodilatadora na presença do inibidor da COX), sugerindo que o extrato da planta atua através das vias endoteliais eNOS e EDHF. O efeito vasorelaxante independente do endotélio induzido pelo extrato vegetal foi avaliado através do envolvimento dos canais K+, influxo extracelular de Ca 2+ e liberação de Ca2+ do SR. Os resultados mostraram que o vasorelaxamento em resposta ao extrato vegetal foi reduzido por um bloqueador dos canais KCa (iberiotoxina), mas não por um bloqueador dos canais KV (4-AP) ou um bloqueador dos canais KATP (glibenclamida), sugerindo que o extrato atua através da abertura dos canais KCa. Além disso, a vasoconstrição induzida por CaCl2 foi reduzida pelo extrato da planta, sugerindo que seu mecanismo envolvia a inibição de VOCCs nos VSMCs ou interferência com as interações de Ca2+ com máquinas contráteis. Estudos complementares devem ser realizados para analisar melhor sua ação mecanicista detalhada. Além disso, a contração transitória para EP em Krebs livres de Ca 2+ foi reduzida, indicando que o extrato da planta inibiu a liberação de Ca2+ da RS, levando à redução da vasoconstrição. Um resumo do mecanismo interpretado da ação vasorelaxante do extrato vegetal é ilustrado na Figura 11.
Os protocolos experimentais propostos no presente estudo são tecnicamente viáveis e apresentam boa reprodutibilidade; no entanto, certas medidas cruciais são essenciais para garantir o sucesso. Em primeiro lugar, a composição da solução fisiológica deve ser mantida com precisão durante a preparação para garantir que o procedimento funcione corretamente. Além disso, é vital evitar tocar, esticar ou danificar a artéria pulmonar durante a preparação. O meio deve ser continuamente substituído a cada 15 min (3 vezes) para estabilizar o teste e a avaliação, uma vez que a artéria pulmonar é afixada na câmara de banho do órgão. A pré-tensão do vaso deve ser aumentada para um pouco acima do nível necessário e, em seguida, gradualmente diminuída até que o ótimo seja atingido (ou seja, 1 g).
Vários protocolos experimentais, como a viabilidade dos vasos sanguíneos, a presença de células endoteliais e o efeito dos extratos vegetais no relaxamento dos vasos sanguíneos, são avaliados por essa técnica. O procedimento elucidado para o isolamento de IPA de ratos pode ser sintonizado com outras espécies (por exemplo, camundongo, coelho e humano). No entanto, as condições ideais necessárias para a montagem de um banho de órgão podem diferir entre vários modelos animais e podem ser adaptadas em conformidade. É importante ressaltar que as condições experimentais não são uma replicação exata das condições fisiológicas, e os resultados não podem ser diretamente extrapolados para o fenômeno in vivo.
Este método de isolamento de AIP e medidas de resposta vascular são abordagens práticas para avaliar a fisiologia, patologia e farmacologia vasculares. Ele permite que os pesquisadores estudem a vasoconstrição e o vasorelaxamento em um ambiente isolado, mas bem controlado. Além disso, pode ser adaptado para estudar a ação terapêutica de drogas utilizadas para patologia vascular pulmonar, como a hipertensão arterial pulmonar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Pesquisa da Tailândia, ao Centro de Excelência para Inovação em Química (PERCH-CIC) e à Rede Internacional de Pesquisa (IRN61W0005) por fornecer apoio financeiro, e ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Naresuan, pelo apoio às instalações de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
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