Summary
O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.
Abstract
O tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais, que causam sérias perdas agrícolas. Para entender a biologia dessas mariposas de pragas, técnicas fundamentais têm sido de alta demanda. Aqui, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares são desenvolvidos usando duas tortrix de chá, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Os insetos foram criados em massa com dieta artificial fatiada e mantidos pela endogamia por mais de 100 gerações, considerando suas características biológicas. Insetos têm vários dimorfismos sexuais; portanto, é difícil distinguir o sexo durante os estágios de desenvolvimento, que impediram ensaios subsequentes. O presente trabalho destacou que o sexo das larvas de tortricóides poderia ser determinado observando testículos ou coloração de orceina láctica-actic para visualizar o cromossomo W específico feminino. Além disso, utilizando os métodos de determinação sexual, o presente estudo possibilitou extrações de ácido nucleico a partir de embriões determinados por sexo e aplicação para sequenciamento de alto rendimento. Essas dicas são aplicáveis para outros insetos pragas e facilitarão estudos morfológicos e genéticos.
Introduction
Os insetos lepidopteranos representam mais de 10% de todas as espécies vivas descritas1, e certas espécies de taxas causam danos graves às plantas e graves perdas agrícolas 2,3. Embora estudos moleculares e genéticos tenham sido desenvolvidos usando insetos modelo, como o bicho-da-seda Bombyx mori 4,5, os insetos pragas permanecem sem investigação, em parte devido às dificuldades para criar e manusear 6,7. Portanto, estudos e técnicas fundamentais são necessários para entender a biologia desses insetos pestes não-modelo.
O Tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais8. Da taxa de insetos, a tortrix oriental Homona magnanima Diakonoff e a tortrix de frutas de verão Adoxophyes honmai Yasuda são pragas polifagosas graves conhecidas por danificar árvores de chá no leste da Ásia7. As duas espécies estavam agrupamentos de ovos planos e ovais (ou massas de ovos) consistindo de ovos finos, macios e frágeis cobertos por secreções maternas. Embora os estágios de embriogênese sejam cruciais para o desenvolvimento de insetos e determinações sexuais9, as estruturas dos ovos impedem que uma análise mais aprofundada entenda a biologia dos insetos. É importante superar as dificuldades para um estudo mais aprofundado sobre pragas que oviposim essa complexa massa de ovos.
Aqui, para entender a biologia dos tortricídeos, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares foram desenvolvidos usando A. honmai e H. magnanima. Primeiro, os métodos de criação em massa mantêm os dois tortricídeos acima de 100 gerações por inserção. A separação dos ovos da massa de ovos em escala concatenada facilitou a observação embrigênese dos tortricídeos usando solventes alcalinos e orgânicos previamente desenvolvidos a partir de técnicas usadas em moscas10. Além disso, o presente estudo estabeleceu a discriminação sexual de pequenos embriões, desenvolvendo métodos de coloração da cromatina sexual de fêmeas lepidopteranas utilizando orceina láctica-acética11. Combinando esses métodos, ácidos nucleicos de alta qualidade e quantidade foram extraídos de embriões determinados por sexo, o que de outra forma era difícil de estabelecer6. O RNA extraído foi utilizado para sequenciamento de próxima geração. Coletivamente, os métodos aqui apresentados aplicam-se a outros insetos lepidopteranos e outros insetos taxa.
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Protocol
1. Coleta de insetos e criação em massa
- Coletar insetos tortricídeos de campos após referênciaspublicadas anteriormente 8,12.
NOTA: As larvas H. magnanima e A. honmai são coletadas de folhas de chá danificadas (Figura 1A); adultos são atraídos usando luz UV portátil de 4 W (comprimento de onda de 365 nm, ver Tabela de Materiais, Figura 1B). - Colete as larvas coletadas (Figura 1C,D) individualmente em um pedaço de dieta artificial em um copo de 1/2 oz por 2-3 semanas até a eclosão adulta (Figura 1E,F). Confirme o sexo de pupas e adultos por traços morfológicos (Figura 1G,I).
- Mate os machos e fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar massas de ovos em um papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque uma fêmea e dois machos em um copo de plástico de 120 mL com um pedaço de papel de parafina para estabelecer uma matrilina.
NOTA: É importante fazer vincos no papel parafina. Para H. magnanima, o papel de parafina precisa estar no fundo do caso. Enquanto isso, para A. honmai, coloque um papel no teto da caixa para coletar ovos (Figura 1L) desde h. magnanima oviposit massa de ovos no lado superior das folhas de chá, mas A. honmai coloca ovos na parte inferior das folhas8. Os procedimentos também foram verificados em outras espécies de tortricida, e é melhor colocar documentos de ambos os lados se a ecologia e o comportamento das espécies-alvo não forem inclarizados. - Corte as massas de ovos (aproximadamente 100-200 ovos por massa de ovo12, Figura 1M) no papel de parafina com uma tesoura. Coloque os ovos em uma xícara de 1/2 oz com papel despejado por 5-7 dias.
NOTA: O embrião amadurecido exibe uma cápsula de cabeça negra (Figura 1N). Os períodos de embriogênese são diversas mente atribuídos a espécies tortricidas, mas geralmente 5 dias após a oviposição (dpo) para H. magnanima e 4 dpo para A. honmai a 25 °C com 60% de umidade relativa, 16 h luz/8 h ciclos escuros7. - Armazene as massas de ovos mostrando cápsulas de cabeça preta a 4-8 °C durante 7 dias.
- Corte ~60 g dietas artificiais usando um ralador para criação em massa. Coloque a massa de ovos cheia de embriões maduros na dieta artificial fatiada em um recipiente plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque os papéis de parafina na massa de ovos com as dietas fatiadas (Figura 10).
NOTA: Abaixo de 30% a umidade relativa é considerada mais seca, enquanto mais de 70% é muito úmida. Criar furos na tampa do recipiente de plástico é melhor para permitir uma melhor ventilação. Encha os buracos com algodão para evitar as fugas de pequenas larvas. - Para eliminar contaminantes superficiais dos ovos, mergulhe a massa de ovos em 3% de formalina e 0,2% de solução de cloreto de benzalkonium por 5 min, respectivamente12. Para erradicar bactérias intestinais ou intracelulares, utilize uma dieta artificial suplementada com 0,05% (w/w) cloridrato de tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina em vez de uma dieta artificial normal (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Esta etapa é opcional. É importante amassar o Mate de Seda 2S e 0,05% (w/w) Cloridrato de Tetraciclina ou 0,06% (w/w) rifampicina equificadamente para consistência. - Recolhe a pupa do recipiente plástico e distingue o sexo com base nas características morfológicas12 (Figura 1G-I).
NOTA: Geralmente, os tortricídeos apresentam 5-6 instars até a pupação12. As larvas H. magnanima e A. honmai levam 3 semanas e 2 semanas, respectivamente, depois de eclodir até a pupação. - Coloque 15 machos e 10 fêmeas em uma caixa de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para acasalamento com 25 °C, 16 L/8 D. Coletar ovos por 5-7 dias e repetir as etapas 1.4-1.9. para cada geração.
NOTA: Se for necessário coletar massas de ovos recém-ovipositados para análise subsequente, defina o início e o fim do período escuro, por exemplo, das 9:00 às 17:00. Nesta condição, H. magnanima e A. honami geralmente oviposit ovos após 5 h (2 PM).
2. Separação de ovos e larvas de pharate de massas de ovos para fixação, permeabilização e coloração
- Mergulhe a massa de ovos em 1.000 μL de 1,2% de solução aquosa hipoclorito de sódio por 10 min ou em 1.000 μL de solução aquosa de hidróxido de potássio de 5 M por 30 minutos para separar os ovos.
- Lave os ovos separados em 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% de Polioximetileno (20) Monolaurate Sorbitano [Tween-20] pH 7.4, ver Tabela de Materiais) após o relatório publicado anteriormente7.
- Mergulhe ovos em uma mistura de 500 μL de heptano 100% e 500 μL de solução paraformaldeída-PBSt de 4% (c/v). Misture por 10 min a 1.500 rpm usando um misturador de vórtice.
- Mergulhe os ovos em uma mistura de 500 μL de 100% de heptano e 500 μL de 100% de metanol. Misture por 10 min a 1.500 rpm.
- Lave os ovos duas vezes com 1.000 μL de 100% de metanol e armazene a 4 °C em 100% de metanol até novos experimentos (Figura 2A).
NOTA: Os ovos podem ser armazenados por pelo menos 1 ano a 4 °C. - Mergulhe os ovos sequencialmente em 99%, 70%, 50% etanol e PBSt por 5 min cada para hidrofilização seguindo o relatório publicado anteriormente7.
- Lave os ovos com PBSt, mergulhe os ovos em 1 μg/mL de solução DAPI por 5 minutos e depois lave os ovos com 1x PBS duas vezes. Mergulhe os ovos em 20 μL de 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-acética (ver Tabela de Materiais)11 para visualizar heterocromatina até que os núcleos exerçam uma cor vermelha brilhante (isso varia de 5 a 60 min) (Figura 2B,C).
NOTA: Os períodos de coloração de orceínia láctica-acética dependem da temperatura e umidade. É melhor verificar se há uma coloração adequada usando um microscópio com ampliação de 4x-10x. - Transfira os ovos manchados usando uma pipeta para um slide de vidro. Inclua os ovos manchados com reagente antifade (ver Tabela de Materiais) e um copo de cobertura7.
- Extraia as larvas de pharate H. magnanima e A. honmai (4-5 dias pós oviposition (dpo)) das massas de ovos usando fórceps (Figura 2D). Larvas de bissecto em uma lâmina de vidro (Figura 2E).
- Fixar todos os tecidos (por exemplo, gânglio suboesofágico, gânglio torácico, túbulo malpighiano, etc.) com uma mistura de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% metanol por 5 min. Colora aqueles com 1,25% (w/w) solução de orceina láctica-actic11 até que os núcleos estejam manchados (isso pode levar de 5 a 60 minutos, dependendo da temperatura e umidade).
- Determine o sexo de cada espécime observando a presença (feminina) ou ausência (masculina) de heterocromatina (o cromossomo W, Figura 2F,G) sob um microscópio.
NOTA: O sexo é determinado visualizando a cromatina sexual. Cada célula representa a cromatina sexual como ponto em fêmeas11,12, enquanto a porção restante de tecidos larvais de pharate (não fixo) deve ser imediatamente imersa no tampão de lise celular12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0) ou reagentes de extração de RNA contendo fenol para extração de DNA ou RNA. Antes das dissecções, dispense 20 μL dos reagentes em tubos PCR de 0,2 mL com antecedência (Figura 3A). Mergulhe e armazene amostras a -80 °C até uma extração adicional. As amostras podem ser armazenadas por pelo menos 3 meses, mas é melhor prosseguir com os experimentos a jusante para evitar a degradação dos ácidos nucleicos.
3. Extrações de DNA e RNA de larvas de pharate determinadas por sexo
- Piscina 12 larvas de pharate masculino ou feminino determinadas por sexo (5 embriões dpo) e adicionar tampão de lise celular ou reagentes de extração de RNA (ver passo 2.11 e Tabela de Materiais) em um tubo de 1,5 mL.
NOTA: Siga as etapas 3.2-3.7 para extração de DNA e etapas 3.8-3.11 para extração de RNA. - Homogeneize tecidos em 600 μL do tampão de lise celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8.0), e centrifugar as amostras a 10.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Colete o supernante (500 μL) usando uma pipeta e incubar a 50 °C com 1,5 μL de Proteinase K (20 mg/mL, ver Tabela de Materiais) por 5h em um bloco de calor.
- Trate as amostras com 1,0 μL de 10 mg/mL de solução RNase (ver Tabela de Materiais) a 37 °C por 30 min.
- Adicione 200 μL de solução de precipitação proteica (ver Tabela de Materiais) aos tubos7, seguido de uma centrífuga a 17.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Misture o supernatante (500 μL) com 500 μL de isopropanol de 100% e, em seguida, centrífuga a 20.400 x g por 10 min a 4 °C.
- Lave o DNA de pelotas duas vezes com 1.000 μL de 70% de etanol. Em seguida, ar-seco (5-10 min à temperatura ambiente), dissolva o DNA em 30 μL de 10 mM tris-cl tampão (pH 8.5).
- Homogeneize os tecidos em 600 μL de reagentes de extração de RNA e adicione 240 μL de água destilada ultra-pura ao tubo. Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Misture o supernasciente (600 μL) com 600 μL de isopropanol de 100% e transfira a mistura para uma coluna de giro de sílica (ver Tabela de Materiais). Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C.
- Lave a coluna com 750 μL de 70% de etanol, e centrifugar a coluna duas vezes a 17.900 x g por 1 min cada a 4 °C.
- Carregue 15 μL de água destilada ultra-pura para a coluna. Centrifugar os tubos a 17.900 x g por 1 min a 4 °C para elute o RNA.
- Calcule e verifique a qualidade e quantidade de DNA e RNA usando um espectrômetro baseado em UV. Avalie a pureza dos ácidos nucleicos utilizando as razões A260/A280 (ácidos/proteínas nucleicas) e A260/A230 (ácidos/sais nucleicos e outros contaminantes)13.
NOTA: Para a extração do RNA, seguiu-se o procedimento publicado anteriormente12 , que resultou em contaminação do fenol (Tabela 1). O DNA extraído e RNA de um único embrião ou larvas de pharate produz amostras de baixa quantidade e baixa qualidade. Normalmente, a extração de DNA de 12 larvas de pharate produz 100-600 ng, enquanto a extração de RNA usando o método atual gera 900-1.500 ng, como mostra a Tabela 1.
NOTA: As etapas 3.13-3.15 são opcionais para outros ensaios de sequenciamentos de alto rendimento. - Calcule as quantidades de DNA e RNA usando um espectrofotômetro baseado em fluorescência.
NOTA: A razão das quantidades de RNA (concentração baseada em UV (ng/μL)/concentração baseada em fluorescência (ng/μL)) foi calculada para avaliar a qualidade para aplicação experimental posterior. Por exemplo, quando as concentrações baseadas em UV e fluorescência são de 80 ng/uL e 60 ng/uL, respectivamente, a razão será de 1,5 (80/60). Normalmente, as razões abaixo de 1,5 indicam pureza suficiente para aplicações a jusante usando sequenciamento de alto rendimento13. - Analise a qualidade do RNA usando a eletroforese de microchip14.
- Utilize as RNAs qualificadas para preparar a biblioteca RNA usando um kit de preparação da biblioteca RNA (ver Tabela de Materiais). Sequencie as bibliotecas usando uma plataforma adequada para as bibliotecas preparadas.
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Representative Results
Estabelecimento de linhas de hospedagem e sua manutenção
A viabilidade das larvas coletadas em campo é diferentemente atribuída à localização do campo, estações e condições de criação (por exemplo, 90% da viabilidade em Taiwan, Taoyuan, como mostrado em Arai et al.12). Aproximadamente 30%-50% dos pares gerarão a próxima geração como de costume. Para H. magnanima e A. honmai, as matrilinas foram mantidas por endogamia por mais de 100 gerações.
Observações morfológicas e determinações sexuais
O tratamento com hidróxido de potássio (3 ou 5 M KOH) ou hipoclorito de sódio (1,2% Cl2 ou NaClO) separa os ovos de suas massas de ovos concatenados (Figura 2A). A menor concentração dos reagentes não conseguiu a separação. Todas as etapas de fixação, permeabilização e coloração permitiram a visualização de núcleos com solução DAPI. Os ovos tratados apenas com KOH ou NaClO (separados) sem a fixação e as etapas de permeabilização não foram manchados com esses corantes7. As massas de ovos H. magnanima não foram manchadas. A orceina láctica-acética mancha heterocromatina (cromossomo W) com uma cor vermelha escura e núcleos com uma cor vermelha brilhante como de costume (Figura 3A). Esta coloração permite a determinação sexual fácil e rápida de 4 embriões dpo para sexta larvas instar. Embora os núcleos tenham sido visualizados em embriões dpo 0-3, foi difícil observar o cromossomo W com ampliação de 400x.
DNA e RNA de alta qualidade foram obtidos a partir de embriões determinados por sexo e agrupados
De 12 larvas de pharate, DNA de alta qualidade (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) foram extraídos com 100-600 ng em quantidade total (Tabela 1). Embora o RNA extraído seguindo o método12 publicado anteriormente rendeu 500-1.000 ng produto com baixa qualidade: A260/A280 = 1,7-2.1; A260/A230 = 0,1-0,5 (Tabela 1), os protocolos modificados utilizando uma coluna de spin melhoraram a qualidade do RNA, produzindo 900-1.500 ng produto com A260/A280 = 1,9-2,1 e A260/A230 = 1,9-2,3 (Tabela 1). Além disso, a razão de concentração de RNA (valores baseados em fluorescência baseada em UV/Qbit) para o protocolo modificado foi inferior a 1,2, atendendo aos requisitos de qualidade para sequenciamento de próxima geração13. Por outro lado, a qualidade e a quantidade de ácidos nucleicos extraídos de um único embrião eram muito baixos para serem calculados. A intactidade do RNA extraído de larvas de pharate determinadas por sexo usando o protocolo modificado também foi confirmada por meio de eletroforese de microchip (Figura 3B). As bibliotecas preparadas foram confirmadas para produzir leituras de pontuação do 30º trimestre (Tabela 2).
Figura 1: Visão geral da coleta de insetos e criação em massa de H. magnanima e A. honmai. (A) Folhas de chá e ninhos danificados por uma larva. (B) Armadilha leve com luz UV. (C,D) Uma fêmea (C) e uma larva masculina (D)6ª instar de H. magnanima. O triângulo laranja indica o testis. (E,F) As larvas coletadas foram criadas individualmente em um copo de 1/2 oz com um pedaço de dieta artificial. (G,H) Pupae de H. magnanima (G) e A. honmai (H). A fêmea é mostrada à esquerda, enquanto o macho é mostrado à direita. (I) Adultos de H. magnanima (acima) e A. honmai (abaixo). Tanto os machos quanto as fêmeas são mostrados à direita e à esquerda, respectivamente. (J,K) Um saco plástico (J) ou caixa de plástico (K) para coleta em massa de ovos. (L) Ovos de oviposit a. honmai em papel de parafina colocados na tampa, e H. magnanima coloca ovos em papel de parafina colocado no fundo da caixa. (M,N) Massa de ovos de H. magnanima. Os embriões maduros exibem cápsulas de cabeça preta indicadas com setas brancas (N). (O) Dietas artificiais fatiadas com um ralador para criação em massa. As larvas eclodidas a partir de ovos, colocadas na dieta fatiada, formarão pupas 3-4 semanas após a eclosão a 25 °C (abaixo de 16 h de ciclo escuro/8h). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Observações de embriões. (A) Os ovos separados, fixos e permeabilizados de H. magnanima utilizando 5 N KOH, 4% PFA / heptane, metanol/heptano e metanol. Um ovo separado é destacado com linhas quebradas. (B) O embrião 3 dpo foi manchado com orceina láctica-acética. A ponta da flecha preta indica o embrião. (C) O embrião de 4 dpos estava manchado com DAPI. A ponta da flecha branca indica o embrião. (D,E) Dissecção de larvas de pharate (5 dpo) usando fórceps. As larvas de pharate são extraídas da massa de ovos (D), bisseccionadas em uma lâmina de vidro (E). (F,G) Coloração de orceina láctica-acética usando as larvas dissecadas de pharate. As fêmeas exibem heterocromatina como ponto (indicado com ponta de flecha preta, (F), mas os machos não têm heterocromatina (G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resumo gráfico da extração de ácido nucleico utilizando larvas de pharate determinadas por sexo e qualidades de RNA de H. magnanima e A. honmai. (A) Os tecidos de larvas dissecadas em lâminas de vidro foram manchados com orceina láctica-actic para determinar seu sexo. Os demais tecidos foram encharcados em reagentes, agrupados em um tubo classificado pelo sexo dos indivíduos e, em seguida, submetidos à extração de DNA/RNA. (B) A qualidade do RNA extraído de 12 H. magnanima ou A. honmai masculino foi avaliada utilizando-se um sistema de eletroforese de microchip. Abreviaturas: [nt], tamanho nucleotídeo; [FU], unidade de fluorescência; M, marcador molecular; Hm, H. magnanima; Ad, A. honmai. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Concentração e qualidade de ácidos nucleicos extraídos de larvas de fárticos determinadas do sexo de H. magnanima. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Qualidades de dados brutos de sequenciamento de RNA. 1 O Q20 (%) indica a probabilidade de leituras com 99% de precisão de leitura. algarismo O Q30 (%) indica a probabilidade de leituras com 99,9% de precisão de leitura. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
O tortrida compreende várias pragas agrícolas e florestais; o presente estudo apresentou métodos para retrocoterar ao longo de gerações, observar a embriogênese e o sexo dos insetos e realizar análises moleculares utilizando embriões maduros.
Um dos obstáculos para o estudo de insetos de pragas é estabelecer métodos de criação. Especialmente, a endogamia às vezes afeta negativamente a aptidão da espécie. A redução do condicionamento físico pelo inerido, chamada de depressão endogamia, tem sido amplamente observada em diversas plantas e animais, incluindo insetos 15,16,17,18. Como observado, tanto H. magnanima quanto A. honmai foram mantidos por mais de 100 gerações (mais de 10 anos) sem custos aparentes de aptidão. Embora não seja suficiente avaliar se outros tortricídeos também têm alta tolerância à endogamia em geral, as duas espécies podem ter desenvolvido as características adaptando condições ambientais monótonas (ou seja, plantações de chá) e contra vários microrganismos endossímbicos (por exemplo, Wolbachia11,12 ). Os ovos das duas espécies são facilmente obtidos, mas seus comportamentos de oviposição são diferentemente atribuídos à sua ecologia. De fato, a umidade e a direção do vinco parecem afetar diretamente o número de ovos ovipostos, o que pode refletir as histórias naturais dos insetos nos campos. É importante ajustar os métodos de criação às espécies em relação às suas características biológicas na natureza.
Os protocolos estabelecidos neste estudo permitiram a observação de embriogênese e estudos moleculares utilizando embriões e larvas amadurecidos por sexo. Os ovos de insetos são geralmente revestidos com várias camadas de concha10,19. Além disso, os ovos de H. magnanima e A. honmai estão cobertos de secreções maternas. Para manchar os ovos com uma estrutura tão complexa, separação, fixação e permeabilização parece ser tudo necessário. Em Ostrinia furnacalis (Crambidae), que oviposito massa de ovos em escala como H. magnanima e A. honmai, foram propostos protocolos de determinação sexual baseados em PCR usando embriões únicos, mas a baixa qualidade e quantidade de ácidos nucleicos têm sido um problema para análise subsequente 6,20. Em contraste, o presente estudo sugeriu a extração de ácidos nucleicos de embriões agrupados determinados por sexo após observar cromatina sexual específica da mulher. As RNAs são facilmente degradadas, e o procedimento de extração aqui mostrado não afetou a qualidade do RNA, o que também foi confirmado pela análise do transcriptome (RNA-seq). As técnicas aqui apresentadas são aplicáveis para estudos de embriogênese de várias espécies de insetos. Além disso, os protocolos têm os potenciais a serem utilizados para avaliar os efeitos de pesticidas químicos ou micróbios intracelulares como wolbachia, que causa defeitos específicos do sexo durante a embrigênese 6,11,12.
O presente estudo tem várias limitações. Primeiro, o sexo de embriões imaturos (0-3 dpo) foi difícil de determinar usando manchas de orceína lática-acética em H. magnanima e A. honmai. Isso ocorre porque o número e o tamanho dos núcleos são geralmente pequenos durante a embriogênese precoce, dificultando a observação do cromossomo W. Para esclarecer o sexo dos tortricídeos durante a embriogênese precoce, a detecção e quantificação de marcadores nos cromossomos sexuais 6,20 pode ser uma abordagem alternativa. Em segundo lugar, foi difícil extrair ácidos nucleicos com alta pureza de um único indivíduo após a determinação sexual, possivelmente devido ao pequeno número de células. No entanto, o RNA ou DNA extraído de um único embrião pode ser aplicado a análises subsequentes, como ensaios pcr e sequenciamentos unicelulares.
Em resumo, o presente protocolo descreve a criação em massa, observações morfológicas e análises genéticas dos ovos de dois insetos de pragas lepidopteranos não modelo, H. magnanima e A. honmai. Espera-se que essas técnicas simples sejam aplicáveis para novas pesquisas sobre tortricídeos, outros insetos lepidopteranos e outros impostos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o apoio da Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Bolsas de Pesquisa para Jovens Cientistas [Grant Number 19J13123 e 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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