Summary
Trombocytlysater repræsenterer et nyt værktøj til behandling af okulære overfladesygdomme. Her foreslår vi en metode til fremstilling, dispensation, opbevaring og karakterisering af blodpladelysat indsamlet fra blodpladedonorer.
Abstract
Forskellige okulære overfladesygdomme behandles med blodafledte øjendråber. Deres anvendelse er blevet introduceret i klinisk praksis på grund af deres metabolit og vækstfaktorindhold, som fremmer øjenoverfladeregenerering. Blodbaserede øjendråber kan fremstilles fra forskellige kilder (dvs. fuldblods- eller blodpladeaferesedonation) samt med forskellige protokoller (f.eks. Forskellige fortyndinger og fryse-/optøningscyklusser). Denne variation hæmmer standardiseringen af kliniske protokoller og dermed evalueringen af deres kliniske virkning. Detaljering og deling af de metodologiske procedurer kan bidrage til at fastlægge fælles retningslinjer. I løbet af de sidste år har allogene produkter været diffuse som et alternativ til de autologe behandlinger, da de garanterer højere effektivitetsstandarder; blandt dem fremstilles det blodpladerige plasmalysat(PRP-L) øjendråber med enkle fremstillingsprocedurer. I transfusionsmedicinsk enhed på AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, opnås PRP-L ved blodplade-aferese donation. Dette produkt fortyndes oprindeligt til 0,3 x 10 9 blodplader/ml (startende fra en gennemsnitlig koncentration på 1 x 10 9 blodplader/ml) i0,9% NaCl. Fortyndede blodplader fryses / optøes og centrifugeres derefter for at fjerne snavs. Det endelige volumen opdeles i 1,45 ml alikvoter og opbevares ved -80 °C. Før de udleveres til patienter, testes øjendråber for sterilitet. Patienter kan opbevare blodpladelysater ved -15 °C i op til 1 måned. Vækstfaktorsammensætningen vurderes også ud fra tilfældigt udvalgte alikvoter, og middelværdierne er rapporteret her.
Introduction
Blodafledte produkter anvendes i vid udstrækning i sårpleje1, maxillofacial og ortopædkirurgi og til behandling af forskellige okulære overfladesygdomme2 såsom tør øjensygdom (DED)3. I DED er tårefilmhomeostase nedsat som følge af den unormale funktion af forskellige faktorer, der er involveret i tåreproduktion og okulær overfladeintegritet 4,5.
DED er karakteriseret ved heterogenitet i årsager og sværhedsgrad 6,7,8 og kan være en konsekvens af forskellige faktorer som aldring, køn9, kontaktlinser, topiske eller systemiske lægemidler 10 eller allerede eksisterende tilstande som Sjögrens syndrom 10. På trods af milde symptomer påvirker DED millioner af mennesker over hele verden og påvirker også deres livskvalitet og sundhedssystemet6.
Mange behandlinger er blevet rapporteret for denne patologi, men der er stadig ingen konsensus om den mest effektive løsning12. Til dato er kunstige tårer den første terapilinje, der sigter mod at genoprette tårefilmens vandige sammensætning, omend disse substitutter ikke indeholder de vigtigste biologisk aktive opløste stoffer af naturlige tårer 6,11. Trombocytbaserede produkter betragtes som et gyldigt alternativ12,13 til kunstige tårer, selvom deres kliniske effektivitet, anbefalinger til brug og fremstillingsmetoder stadig er et spørgsmål om debat3.
Blodbaserede produkter deler med tårer en lignende sammensætning med hensyn til metabolitter14, proteiner, lipider, vitaminer, ioner, vækstfaktorer (GF'er), antioxidantforbindelser 11 og osmolaritet (300 mOsm / L)11. Gennem den synergistiske aktivitet af deres komponenter fremmer de regenerering af hornhindeepitelet, hæmmer frigivelsen af inflammatoriske cytokiner og øger antallet af bægerceller og ekspressionen af muciner i bindehinden 2,3.
Indtil videre er heterogenitet i oftalmiske blodbaserede produkter blevet dokumenteret i litteraturen; Disse produkter kan klassificeres efter bloddonorernes oprindelse, dvs. autolog eller allogen, samt blodkilden, dvs. perifert blod, navlestrengsblod, serum eller blodplader.
Selvom autologe produkter var de mest udbredte3, bliver allogene nu det foretrukne valg, da de sikrer højere effektivitet og sikkerhedsstandarder 15 sammen med en betydelig reduktion i omkostninger16,17. Tidligere undersøgelser har faktisk vist, at blodbaserede produkter fra patienter med autoimmune og/eller systemiske sygdomme kan vise ændret kvalitet og funktionalitet 6,16,17. På trods af at serumbaserede øjendråber er de mest udbredte, er blodpladebaserede produkter for nylig blevet bekræftet som et gyldigt alternativ, da de let kan tilberedes, samtidig med at der opretholdes betydelige effektivitetsniveauer 3,11. Aktuelt tilgængelige blodpladebaserede produkter kan opdeles i blodpladerig plasma (PRP), blodpladerig plasmalysats (PRP-L) og plasma rig på vækstfaktorer (PRGF)3.
Blandt dem har PRP-L den fordel, at det er et frossent produkt med lang levetid. PRP-L kan fremstilles af aferese, buffy-coats eller endda fra udløbende blodplader (PLT'er)18,19, hvilket dyrebart reducerer deres spild. Aliquoterne kan opbevares i månedsvis i blodtransfusionscentrene ved -80 °C eller endda i patienternes hjem ved -15 °C i kortere perioder.
PRP-L er meget beriget i GF'er, som har vist sig at stimulere øjenoverfladeregenerering 12,20,21. Ikke desto mindre er der kun få rapporterede kliniske undersøgelser på dette område, og alle brugte autologe kilder 3,22. PRP-L har stadig brug for yderligere validering og karakterisering, før den rutinemæssigt kan bruges til behandling af øjenoverfladesygdomme, da der ikke er nogen standardiserede retningslinjer for forberedelse, dispensation og opbevaring3.
Heri deles en detaljeret protokol for produktion af PRP-L, der anvendes på Transfusion Medicine Unit i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, og dispensation til patienter med DED. Vi sigter mod at hjælpe det videnskabelige samfund med at udvikle standardmetoder til forberedelse, som kan øge homogeniteten og konsistensen i verdensomspændende undersøgelser og kliniske tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRP-L, der blev anvendt til kvantitativ vurdering af vækstfaktorer, blev indsamlet i en bredere undersøgelse af karakterisering af PRP-produkter til regenerative formål, udført på AUSL-IRCCS di Reggio Emilia og godkendt af Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee den 10. januar 2019 (protokolnummer 2019/0003319). Donorerne gav deres informerede samtykke i henhold til Helsingforserklæringen. Ingen etisk godkendelse var nødvendig for at indsamle de aggregerede, anonyme data fra Ocular Surface Disease Index (OSDI) spørgeskemaet, som rutinemæssigt bruges af klinikere til at overvåge symptomer på tørt øjensyndrom. Figur 1A viser en oversigt over den fulgte protokol, mens billederne i figur 1B viser de vigtigste trin i proceduren.
1. Blodpladerig plasma (PRP) samling
- PRP-aferese
- For denne protokol skal du vælge blodpladedonorer i henhold til italiensk lovgivning: blodpladedonorer skal være 18-65 år gamle med normale tryk- og blodtællingsparametre og et blodpladetal på mindst 180 x 109 blodplader / L23. Støtteberettigede donorer kan ikke tage antiplatelet eller antikoagulerende lægemidler inden for 1 uge før donation.
- Udfør plasma-blodplade-aferese ved hjælp af et automatiseret blodindsamlingssystem i henhold til producentens instruktioner og nationale love23 for at opnå 1 enhed enkeltdonor blodpladerig plasma (PRP). Der indsamles PRP i antikoagulerende opløsning af Adenin Citrate Dextrose Solution A (ACD-A).
BEMÆRK: Blodpladeaferese udføres med en kontinuerlig procedure; Indsamlingstiden ligger i et interval mellem 40 min og 90 min. Mængden af ACD, der leveres til donorerne, og tidspunktet for procedurerne afhænger af donoregenskaberne, f.eks. hæmatokrit og nålemåler.
- PRP-enhedernes egenskaber
BEMÆRK: Følgende trin udføres normalt automatisk af det automatiserede blodindsamlingssystem under plasma-blodplade-afereseproceduren. Se producentens instruktionsmanual.- PRP-enheder opsamlet ved aferese gensuspenderes i en tilstrækkelig mængde konserveringsopløsning med den mindste mængde restplasma, der er nødvendig for at opretholde pH-værdien > 6,4 under hele opbevaringstiden, til et gennemsnitligt endeligt volumen på 180 ml netto af den antikoagulerende opløsning (ca. 40 ml).
BEMÆRK: I henhold til italiensk lov skal kvalitetskontrol vurdere, at blodpladetallet (PLT'er) er mindst 2,0 x 1011 PLT'er / enhed, mens resterende leukocytter skal være mindre end 1 x 106 celler / enhed. - Der opbevares leucodeplet og bestrålet PRP i højst 5 dage ved 22 °C ± 2 °C på en blodpladeryster inden yderligere manipulation23.
- PRP-enheder opsamlet ved aferese gensuspenderes i en tilstrækkelig mængde konserveringsopløsning med den mindste mængde restplasma, der er nødvendig for at opretholde pH-værdien > 6,4 under hele opbevaringstiden, til et gennemsnitligt endeligt volumen på 180 ml netto af den antikoagulerende opløsning (ca. 40 ml).
- PRP fortynding
- Umiddelbart før PRP-fortynding påbegyndes, udføres en PLT-tælling med et hæmocytometer ved hjælp af prøven indsamlet fra hovedposen gennem en piercingspids.
BEMÆRK: Udfør de næste trin i sterilitet under en klasse II biohazard hætte. Brug personligt beskyttelsesudstyr (kittel, handsker og beskyttelsesbriller) under proceduren. - Fortynd PRP med en tilstrækkelig mængde steril 0,9% NaCl til en slutkoncentration på 0,32 x 109 ± 0,03 x 109 PLT/ml, som simulerer den gennemsnitlige PLT-koncentration i perifert blod.
- Ved at udnytte en piercingspids til blodposer opdeles den fortyndede PRP i 300 ml tomme opsamlingsposer for at nå et nettovolumen på 190 ml / pose.
- Brug en aliquot af restfortyndet PRP (normalt 1 ml) til at udføre kvalitetskontrol, der vurderer mulige mikrobielle kontamineringer. Udfør et sterilitetsassay efter producentens anvisninger i et mikrobiologisk laboratorium (se Materialetabel).
BEMÆRK: Brug kulturhætteglas, der er specifikke for aerobe blodkulturer, som er i stand til at udføre den kvalitative kultur og genopretning af aerobe mikroorganismer (hovedsageligt bakterier og gær) fra små volumenblodprøver. - Opbevar fortyndede PRP-poser ved -80 °C i højst 2 måneder inden optøning.
- Umiddelbart før PRP-fortynding påbegyndes, udføres en PLT-tælling med et hæmocytometer ved hjælp af prøven indsamlet fra hovedposen gennem en piercingspids.
2. Fremstilling af blodpladerigt plasmalysat (PRP-L)
- Optøning
- Før optøningsproceduren påbegyndes, skal du sikre dig, at et varmt bad er indstillet til 37 °C. Sæt PRP-poserne i det varme bad og vent, indtil de er helt optøet.
- PRP-L kollektion
- Centrifuge PRP-poserne ved 3000 x g i 30 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: De næste trin skal udføres i sterilitet under en klasse II biohazard hætte. - Ved at udnytte overføringsposens gennemtrængende spids skal du forbinde den centrifugerede pose med en tom steril 300 ml overførselspose. Overfør forsigtigt PRP-L-supernatanten, mens du undgår snavs, i den nye taske. Når det er muligt, skal du bruge en posepresse.
- Forsegl forbindelsesrøret til PRP-L-enheden med en poseforsegler.
- Centrifuge PRP-poserne ved 3000 x g i 30 min ved stuetemperatur.
- PRP-L aliquotation
BEMÆRK: En startenhed indeholdende 190 ml PRP (se trin 1.3.3.) er tilstrækkelig til at fylde to øjendråbersæt (for detaljer om det specifikke medicinske udstyr, der anvendes til påføring og konservering af øjendråber fra blodkomponenter, se materialetabellen). Øjendråbersæt skal åbnes under en klasse II-hætte med hele strenghætteglassene placeret over den forudtilsluttede sprøjte og stophanens midterpil pegende mod venstre for at udelukke det antibakterielle filter.- Saml 30-60 ml PRP-L med en steril sprøjte, og tilslut sprøjten til Luer/lock-forbindelsen på påfyldningsledningen.
- I henhold til producentens anvisninger skal du dreje stophanen med halvdelen af en drejning for at åbne linjen mellem den PRP-L-holdige sprøjte og den tilsluttede sprøjte. Fyld den forudtilsluttede sprøjte med PRP-L.
- Frakobl PRP-L-sprøjten, luk rørhætten på luer/lock-forbindelsen, og drej stophanen til den oprindelige position. Brug kit sprøjten med øjendråber til at fylde hætteglassene med PRP-L.
- Gentag proceduren fra trin 2.3.1.-2.3.3. indtil alle hætteglassene med applikatoren er fyldt. Sørg for, at hver applikator er korrekt fyldt, og forsegl dem derefter individuelt med en poseforsegler.
- Gentag proceduren med et nyt øjendråber kit.
- Brug en lille alikvote af restfortyndet PRP-L til at vurdere mulig mikrobiel kontaminering (se trin 1.3.4.).
BEMÆRK: Hvis væsken ved et uheld når det antibakterielle filter i slutningen af strengen, kan sugesprøjten modsætte sig modstand og hindre påfyldningen. For at fortsætte påfyldningscyklussen hæves strengens endesektion i ca. 5/6 aliquoter fra det antibakterielle hydrofobe filter i slutningen af strengen. I denne position skal du bruge en ny steril sprøjte (med et volumen på 30 ml), der allerede er fyldt med luft. Tilslut den kvindelige luer/lås på det antibakterielle filter, og tryk hårdt og gentagne gange på sprøjtens stempel for at fjerne alle rester af blodkomponent og gøre membranen i det antibakterielle filter fri for væsken. Fjern sprøjten, og fyld de resterende hætteglas.
- PRP-L opbevaring
- Mærk hver applikator korrekt og læg dem i en plastikpose. Mærk også plastikposen, og sørg for at fremhæve donorens blodgruppe.
- Opbevares ved -80 °C i højst 24 måneder før patienttildeling i henhold til den italienske lov23 og vejledning24.
3. PRP-L dispensation
- Udfør patientopgave helst ved at matche PRP-L blodgruppen. Aflever PRP-L applikatorhætteglas ved hjælp af en køleboks, og sørg for, at hvert hætteglas med applikator indeholder 1,45 ml PRP-L, hvilket svarer til ca. 45 dråber. Instruer patienten om, at applikatorflasker kan opbevares hjemme hos patienterne i op til 1 måned ved -15 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begrundelsen for brugen af serumafledte øjendråber (som er det blodbaserede produkt, der oftest anvendes til behandling af øjenoverfladesygdomme) ligger i deres indhold af GF'er, som næsten fuldstændigt stammer fra cirkulerende blodplader. PRP indeholder et signifikant højere antal blodplader (og følgelig af blodpladeafledte GF'er) sammenlignet med perifert blodserum, der spænder mellem 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT'er / ml. I henhold til italiensk lovgivning skal blodpladetallet i PRP-enheder være mindst 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT'er / ml. For at opnå et produkt, der simulerer effekten af serumøjedråber, bør PRP derfor fortyndes til det fysiologiske blodpladeindhold før lysatpræparatet.
Ikke desto mindre, da vævsreparation hovedsageligt er drevet af blodpladeafledte GF'er, kan PLT-antallet alene være vildledende for en effektiv behandling af øjenoverfladesygdomme. I DED, som er den øjensygdom, der oftest behandles med blodafledte øjendråber, er tårefilmproduktion og homeostase nedsat. Trombocytbaserede produkter til behandling af DED bør derfor også efterligne det fysiologiske indhold af tårer.
At identificere den bedst egnede PRP-L til behandling af øjenoverfladesygdomme, beskrevet i trin 1.3.2. af den nuværende protokol vurderede vi foreløbigt forskellige PRP-fortyndinger i henhold til deres PLT-indhold (mellem 0,7 x 10 9 / ml og 0,3 x 109 / ml) og nogle repræsentative GF'er fra dem, der vides at være involveret i øjenvævsreparation12,20,21.
Trombocyttal blev udført med et hæmocytometer, mens GF'er blev vurderet ved hjælp af et multiplexproteinkvantificeringsassay. Analysen blev udført som tidligere beskrevet25 i henhold til producentens anvisninger. GF'er vist i dette manuskript blev udvalgt til kvantificering efter en foreløbig screening af 36 GF'er og GFR'er udført på PRP-lysat med et semikvantitativt proteinarray. Luminexkvantificering blev udført på 3 ud af de 36 screenede GF'er: EGF og PDGF (som viste sig at være de mest rigelige i vores PRP-lysater) og TGFβ-1,2,3 isoformer (for hvilke indholdet er vigtigt for øjenoverfladebehandling21). EGF- og PDGF-indholdet blev målt, da de kan påvirke effekten af PRP-L22, mens TGFβ-isoformer blev valgt på grund af deres kendte rolle i immunsignaleringsregualtion21.
Da proteinarrays er en del af en anden in vitro-undersøgelse af karakteriseringen af forskellige PRP26, er disse data ikke præsenteret i dette manuskript.
Vi vurderede kvantitativt EGF, PDGF og TGFβ i PRP-lysater fra to forskellige donorer (D1 og D2), tidligere fortyndet mellem 0,7 x 10 9-0,3 x 109 PLT/ml i0,9% NaCl. Figur 2 viser resultaterne af fortyndingen på 0,3 x 109 PLT/ml, som viste sig at minde mest om tåresammensætningen.
Fortyndingen på 0,3 x 109 PLT/ml blev udvalgt på baggrund af litteraturdata om tåresammensætning. EGF-værdierne viste sig at være ret lave sammenlignet med middelværdien, men stadig i normalitetsintervallet27. Selv PDGF var, på trods af at den var meget variabel mellem de to donorer, altid sammenlignelig med den koncentration, der blev fundet i normale tårer20. Endelig viste TGFβ-1 sig at være den mest rigelige isoform i PRP-L, svarende til tårer21.
Da den bedst egnede PLT-fortynding til fremstilling af aferese PRP-L var blevet identificeret, begyndte Transfusionsmedicinsk Enhed at distribuere disse produkter til patienter, der var ramt af øjenoverfladeforstyrrelser i 2015. Øjenlægerne indsamlede rutinemæssigt OSDI-spørgeskemaerne for at overvåge DED-symptomer; OSDI-testen vurderer livskvalitetsmålinger, såsom opfattelsen af okulær irritation, og hvordan det påvirker funktionen relateret til synet. Spørgeskemaet, der blev oprettet af Outcomes Research Group hos Allergan Inc. i 1995 og nu accepteret som et gyldigt instrument til overvågning af DED, sendes til patienter og analyseres som tidligere beskrevet28,29.
Her viser vi de samlede resultater af OSDI-test af DED-patienter behandlet mellem januar 2020 og januar 2021 (n = 27). Efter 6 måneders behandling med PRP-L faldt OSDI-scoren fra 56 ± 21 til 45 ± 21, hvilket indikerer en forbedring af patienternes livskvalitet (figur 3).
På trods af at disse data stadig er i det alvorlige område og ikke vedrører kliniske resultater af effekt, tyder de på, at DED-patienter betragter PRP-L som et nyttigt produkt, der forbedrer okulært ubehag; Dette aspekt bør undersøges yderligere i prospektive kliniske forsøg med henblik på at vurdere dets effektivitet til behandling af okulære overfladesygdomme.
I tabel 1 rapporterer vi en sammenligning af den nuværende produktionsmetode med en anden metode til fremstilling af allogen PRP-L til øjendråber30 og til andre formål22. Så vidt vi ved, er Zhangs30-protokol og den nuværende protokol de eneste offentliggjorte metoder til at producere PRP-L til øjenoverfladen. I begge opnås PRP-L fra aferese; Forskellene mellem de to protokoller, hovedsagelig vedrørende antallet af fryse- og optøningscyklusser og centrifugeringstrin, bør sammenlignes for at forbedre PRP-L-produktionen. Ikke desto mindre har disse metodologiske forskelle ikke vist sig at være skadelige for den regenerative kapacitet af PRP-L testet på andre væv22.
Figur 1: Protokollens vigtigste trin til udarbejdelse af PRP-L. (A) Protokollens skema, fra PRP-indsamling til PRP-L-forberedelse og dispensation. (B) Repræsentative billeder af protokollernes hovedtrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Luminexkvantificering af blodpladeafledte vækstfaktorer for 0,3 x 109/ml fortynding af PRP-L. (A) Epidermal vækstfaktor (EGF); B) blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) C) transformerende vækstfaktor-beta-isoform 1 (TGFβ1) D) transformerende vækstfaktor-beta-isoform 2 (TGFβ2) (E) transformering af vækstfaktor-beta isoform 3 (TGFβ3). Værdier udtrykkes som pg/ml, gennemsnit ± standardafvigelse for tre uafhængige målinger. D1 og D2 er to forskellige blodpladedonorer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Samlet OSDI-score for DED-patienter behandlet med PRP-L mellem januar 2020 og januar 2021 på oftalmologienheden i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 patienter. OSDI-score aggregerede resultater er repræsenteret som middel ± standardfejl, p-værdi blev beregnet med en parret t-test med dataanalysesoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Denne artikel | PRP-L for øjet (in vitro-undersøgelse )29 | PRP-L til andre formål21 | |
| Kilde | PLTs aferese | PLTs aferese | Aferese og fuldblod |
| Frys og tø cyklusser | 1 (ved -80 °C) | 2 (ved -80 °C) | 1-3 (ved -20 °C og -80 °C) |
| Opbevaringstemperatur | ved -80 °C | ved -80 °C | ved -20 °C og -80 °C |
| Centrifugeringshastighed før opbevaring | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtrering før opbevaring | Nej | Ja | Nej/ja |
Tabel 1: Sammenligning af protokoller til fremstilling af allogen PRP-L fra blodpladebaserede produkter indsamlet ved aferese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år er den kliniske anvendelse af blodpladebaserede produkter til okulære overfladepatologier steget, men deres diffusion hæmmes af manglen på videnskabelig robusthed. Dette skyldes hovedsagelig stor heterogenitet i donorkilder og forberedelsesprotokoller, som ofte ikke er fuldt ud offentliggjort eller ikke specifikt designet til det formål, som de udleveres til. Især mangler der stadig oplysninger om blodpladebaserede produkter indsamlet ved aferese. Formålet med dette arbejde var derfor at beskrive den trinvise behandling af blodpladerige plasmalysater (PRP-L) opnået ved aferese til behandling af DED.
PRP-L er en optimal kilde til produktion af øjendråber, da den indeholder flere GF'er end de andre blodbaserede produkter22, og sammenlignet med serum eller PRP er produktionen eller opbevaringen billig og enkel. For at opnå PRP-L udsættes blodplader for lysis (normalt gennem en eller flere fryse- og optøningscyklusser) for at frigive deres indhold. Denne proces garanterer en opløsning beriget med aktive molekyler, der stimulerer vævsregenerering22,26. Et stigende antal sygdomme er blevet behandlet med PRP-L 22, men indikationen til brug i oftalmologi er stadig svag på grund af de lave standardiseringskriterier i blodpladeopsamling og PRP-L-produktion 3,22.
Allogene blodpladebaserede produkter bør foretrækkes, da de er mere standardiserbare end autologe, både hvad angår donoregenskaber og fremstillingsmetode. Patientens sundhedsstatus kan påvirke produktets kvalitet 6,16,17, mens de interne sæt til indsamling af autologe blodplader fra fuldblod, når transfusionstjenester ikke er direkte tilgængelige, ikke opfylder den standardkvalitet, der kræves i transfusionsmedicin31.
Så vidt vi ved, er der ingen kliniske undersøgelser, der karakteriserer brugen af allogen PRP-L i oftalmologi 3, mens der er få rapporter om autologe PRP-L øjendråber3 og kun en undersøgelse med allogen PRP-L opnået fra navlestrengsblod til behandling af patienter med øjenoverfladesygdomme32. Selvom allogen PRP-L er opført i de kliniske retningslinjer24, og dets anvendelse er blevet foreslået 3,30, mangler der stadig bevis for dets effektivitet sammenlignet med andre behandlinger og andre blodbaserede produkter (f.eks. Serum). Her har den fremlagte protokol til formål at hjælpe det videnskabelige samfund med at udvikle fælles produktionsmetoder og kaste lys over de metodologiske forskelle.
Her beskrev vi PRP-L-produktion startende fra allogen PRP indsamlet ved aferese. Trombocytbaserede allogene produkter til opnåelse af blodpladelysater kan også indsamles fra buffy-coats (BC'er), og begge kilder er blevet rapporteret lige31. BC'er opnås fra samlede donorer (normalt fire eller fem), hvilket minimerer de interindividuelle forskelle. Omvendt øger pooling risikoen for overførsel af smitsomme agenser eller prioner eller stimulering af et allogent respons31,33. Aferese er en kompleks og invasiv procedure, og kun et mindretal af donorer er berettiget til eller overholder den34. Ikke desto mindre er blodpladebaserede produkter opnået ved aferese fri for andre resterende cirkulerende blodlegemer og indeholder en højere mængde PLT'er35. Af disse grunde er det nuværende arbejde fokuseret på at udvikle kliniske undersøgelser til sammenligning af PRP-L fra disse to forskellige kilder.
I denne protokol var startkoncentrationen af PLT'er i PRP-enheder indsamlet ved aferese i gennemsnit 1 x 109/ml, hvilket er i overensstemmelse med de rapporterede koncentrationer for andre blodpladebaserede produkter22. I denne metode fortyndes PLT'er bagefter med 0,9% NaCl-opløsning til 0,3 x 109/ml. Andre protokoller rapporterer om brugen af plasma til fortynding22.
Få undersøgelser har rapporteret brugen af PRP-L i oftalmologi; i disse tilfælde blev autologe øjendråber fremstillet i koncentrationer af PLT'er fra 0,5 x 10 9/ml-1 x 109/ml36,37,38. Som diskuteret tidligere er standardiseringsmarkører ønskelige og vil også hjælpe med at bestemme den korrekte fortynding. Her rapporterer vi for eksempel koncentrationen af nogle centrale GF'er i PRP-L. EGF- og PDGF-indhold påvirker effektiviteten af PRP-L22, mens TGFβ-isoformer er involveret i regulering af immunsignalering21,39, og deres koncentration er fint reguleret. Derfor kan TGFβ-koncentrationen i blodpladebaserede øjendråber påvirke ikke kun effektiviteten, men også fremkalde potentielle skadelige virkninger39; Det bør derfor undersøges nøje, inden den korrekte fortynding defineres. Ikke desto mindre var den valgte fortynding - 0,3 x 109 PLT'er / ml - baseret på GF'ernes indhold i tårer21,25. Zhang et al. sammenlignede tidligere serumbaserede øjendråber, både autologe og allogene, og blodpladebaserede lysater for deres indhold i GF'er og for deres evne til at fremme regenerering af hornhindeceller in vitro30. Undersøgelsen viste, hvordan disse produkter har sammenlignelige egenskaber, hvor PRP-L har højere EGF-koncentration, men lavere fibronectin. I deres protokol blev fryse-/optøningsprocessen gentaget to gange, centrifugen blev udført ved 3500 x g i 30 minutter, og blodpladelysatet opbevaret ved -80 °C30.
Frysning og optøning er faktisk et kritisk skridt; de fleste af protokollerne (inklusive denne) blev udviklet med -80 ° C frysning og 37 ° C optøning, men frysning er også rapporteret ved -24 ° C, -196 ° C og -150 ° C 22,33 Selv antallet af udførte fryse- / optøningscyklusser er variable og spænder fra 1 til 522,33. Et begrænset antal undersøgelser rapporterede også sonikering eller behandling med opløsningsmiddel/vaskemiddel for at opnå blodpladelysater22,33. Andre metodologiske variabler, der tidligere er rapporteret ved fremstillingen af PRP-L, vedrører centrifugeringstrinnet mellem 300 x g og 10000 x g, fra 2 minutter til 60 minutter - og langtidsopbevaringen, som i de fleste tilfælde er ved -80 °C, selv om lignende produkter også er blevet opbevaret direkte ved -20 °C22. Navnlig bør opbevaringsforholdene overvåges nøje, da de kan påvirke tilgængeligheden og aktiviteten af GF'er indeholdt i lysater. I denne meget heterogene sammenhæng bør kvalitetskontrol og kliniske undersøgelser under hensyntagen til frigivelsen af biogene faktorer og forskellene i den terapeutiske virkning evalueres hurtigst muligt.
Endelig viser vi her, hvordan denne metode er blevet signifikant evalueret med et positivt resultat fra en samlet analyse af patienter med tør øjensygdom, der får PRP-L i 6 måneder (OSDI spørgeskema3). Selvom det er lovende, er OSDI alene ikke tilstrækkeligt til at bestemme effekten af PRP-L til behandling af DED og andre okulære overfladesygdomme, og kliniske undersøgelser af brugen af allogen PRP-L er berettigede. Desuden bør mulige produktsammensætningsforskelle som følge af alternative metodologiske trin (dvs. frysning og optøning, centrifugering, opbevaring) sammenlignes for at optimere den metodologiske procedure.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den høje heterogenitet af blodkilder og -protokoller stadig hæmmer den endelige oversættelse af blodbaserede produkter til klinisk behandling af okulære overfladesygdomme. Selv om PRP-L er et nyt produkt med nogle fordelagtige egenskaber, er der behov for yderligere undersøgelser for at validere dets anvendelse og udvikle fælles retningslinjer. Deling og detaljering af forberedelsesprotokollen kan udvide anvendeligheden og kaste lys over de kritiske trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke "Casa del Dono di Reggio Emilia" for at levere donorafledte blodpladekoncentrater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
