Summary
Bloedplaatjeslysaten vormen een opkomend hulpmiddel voor de behandeling van oculaire oppervlakteziekten. Hier stellen we een methode voor voor de bereiding, dispensatie, opslag en karakterisering van bloedplaatjeslysaat verzameld van bloedplaatjesdonoren.
Abstract
Verschillende oculaire oppervlakteziekten worden behandeld met van bloed afgeleide oogdruppels. Het gebruik ervan is in de klinische praktijk geïntroduceerd vanwege hun metaboliet- en groeifactorgehalte, dat de regeneratie van het oogoppervlak bevordert. Op bloed gebaseerde oogdruppels kunnen worden bereid uit verschillende bronnen (d.w.z. volbloed- of bloedplaatjesferesedonatie), evenals met verschillende protocollen (bijv. Verschillende verdunningen en vries- / dooicycli). Deze variabiliteit belemmert de standaardisatie van klinische protocollen en bijgevolg de evaluatie van hun klinische werkzaamheid. Het detailleren en delen van de methodologische procedures kan bijdragen tot het vaststellen van gemeenschappelijke richtsnoeren. In de afgelopen jaren zijn allogene producten verspreid als een alternatief voor de autologe behandelingen, omdat ze hogere werkzaamheidsnormen garanderen; onder hen worden de bloedplaatjesrijke plasmalysaat (PRP-L) oogdruppels bereid met eenvoudige productieprocedures. In de afdeling transfusiegeneeskunde van AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italië, wordt PRP-L verkregen uit bloedplaatjes-aferesedonatie. Dit product wordt in eerste instantie verdund tot 0,3 x 109 bloedplaatjes/ml (uitgaande van een gemiddelde concentratie van 1 x 109 bloedplaatjes/ml) in 0,9% NaCl. Verdunde bloedplaatjes worden ingevroren/ontdooid en vervolgens gecentrifugeerd om vuil te verwijderen. Het uiteindelijke volume wordt gesplitst in aliquots van 1,45 ml en bewaard bij −80 °C. Voordat ze aan patiënten worden verstrekt, worden oogdruppels getest op steriliteit. Patiënten kunnen bloedplaatjeslysaten opslaan bij −15 °C gedurende maximaal 1 maand. De samenstelling van de groeifactor wordt ook beoordeeld op basis van willekeurig geselecteerde aliquots en de gemiddelde waarden worden hier gerapporteerd.
Introduction
Bloedderivaten worden veel gebruikt in wondverzorging1, maxillofaciale en orthopedische chirurgie, en voor de behandeling van verschillende oculaire oppervlakteziekten2 zoals droge ogen (DED)3. Bij DED is de homeostase van de traanfilm aangetast als gevolg van het abnormaal functioneren van verschillende factoren die betrokken zijn bij de traanproductie en de integriteit van het oculaire oppervlak 4,5.
DED wordt gekenmerkt door heterogeniteit in oorzaken en ernst 6,7,8 en kan een gevolg zijn van verschillende factoren zoals veroudering, geslacht9, contactlenzen, actuele of systemische medicijnen10, of reeds bestaande aandoeningen zoals het syndroom van Sjögren10. Ondanks het hebben van milde symptomen, treft DED miljoenen mensen over de hele wereld, wat ook van invloed is op hun kwaliteit van leven en het gezondheidssysteem6.
Veel behandelingen zijn gemeld voor deze pathologie, maar er is nog steeds geen consensus over de meest effectieve oplossing12. Tot op heden zijn kunstmatige tranen de eerste therapielijn gericht op het herstellen van de waterige samenstelling van de traanfilm, hoewel deze substituten niet de belangrijkste biologisch actieve opgeloste stoffen van natuurlijke tranen bevatten 6,11. Op bloedplaatjes gebaseerde producten worden beschouwd als een geldig alternatief12,13 voor kunstmatige tranen, hoewel hun klinische werkzaamheid, aanbevelingen voor gebruik en methoden van preparaten nog steeds een punt van discussie zijn3.
Bloedproducten delen met tranen een vergelijkbare samenstelling in termen van metabolieten14, eiwitten, lipiden, vitamines, ionen, groeifactoren (GFs), antioxidanten11 en osmolariteit (300 mOsm / L)11. Door de synergetische activiteit van hun componenten bevorderen ze de regeneratie van het cornea-epitheel, remmen ze de afgifte van inflammatoire cytokines en verhogen ze het aantal bokaalcellen en de expressie van mucines in het bindvlies 2,3.
Tot nu toe is heterogeniteit in oogheelkundige bloedproducten gedocumenteerd in de literatuur; deze producten kunnen worden ingedeeld op basis van de oorsprong van de bloeddonoren, d.w.z. autoloog of allogeen, evenals de bloedbron, d.w.z. perifeer bloed, navelstrengbloed, serum of bloedplaatjes.
Hoewel autologe producten de meest voorkomendewaren 3, worden allogene producten nu de voorkeur, omdat ze zorgen voor hogere werkzaamheids- en veiligheidsnormen15, samen met een aanzienlijke kostenbesparing16,17. Eerdere studies hebben inderdaad aangetoond dat bloedproducten verkregen van patiënten met auto-immuun- en/of systemische ziekten een veranderde kwaliteit en functionaliteit kunnen vertonen 6,16,17. Ondanks het feit dat oogdruppels op basis van serum het meest wijdverspreid zijn, worden producten op basis van bloedplaatjes onlangs bevestigd als een geldig alternatief, omdat ze gemakkelijk kunnen worden bereid met behoud van aanzienlijke niveaus van werkzaamheid 3,11. Momenteel beschikbare producten op basis van bloedplaatjes kunnen worden onderverdeeld in bloedplaatjesrijk plasma (PRP), bloedplaatjesrijk plasmalysaat (PRP-L) en plasma rijk aan groeifactoren (PRGF)3.
Onder hen heeft PRP-L het voordeel dat het een bevroren product met een lange levensduur is. PRP-L kan worden bereid uit aferese, buffy-coats of zelfs uit aflopende bloedplaatjes (PLTs)18,19, waardoor hun verspilling kostbaar wordt verminderd. De aliquots kunnen maandenlang worden bewaard in de bloedtransfusiecentra bij −80 °C of zelfs bij patiënten thuis bij −15 °C voor kortere periodes.
PRP-L zijn sterk verrijkt in GF's, waarvan is bewezen dat ze de regeneratie van het oogoppervlak stimuleren 12,20,21. Niettemin zijn er slechts weinig gerapporteerde klinische studies op dit gebied, en ze gebruikten allemaal autologe bronnen 3,22. PRP-L heeft nog verdere validatie en karakterisering nodig voordat het routinematig kan worden gebruikt voor de behandeling van oogoppervlakziekten, omdat er geen gestandaardiseerde richtlijnen zijn voor de bereiding, dispensatie en opslag3.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gedeeld voor de productie van PRP-L gebruikt op de Transfusion Medicine Unit in AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italië, en dispensatie aan patiënten met DED. We willen de wetenschappelijke gemeenschap helpen om standaard bereidingsmethoden te ontwikkelen, die de homogeniteit en consistentie in wereldwijde studies en klinische benaderingen kunnen vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRP-L gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van groeifactoren werd verzameld in een bredere studie over de karakterisering van PRP-producten voor regeneratieve doeleinden, uitgevoerd bij de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia en goedgekeurd door de Area Vasta Emilia Nord Ethische Commissie op 10 januari 2019 (protocolnummer 2019/0003319). Donoren gaven hun geïnformeerde toestemming volgens de Verklaring van Helsinki. Er was geen ethische goedkeuring nodig voor het verzamelen van de geaggregeerde, anonieme gegevens van de Ocular Surface Disease Index (OSDI) vragenlijst, die routinematig wordt gebruikt door clinici om de symptomen van het droge ogen syndroom te controleren. Figuur 1A toont een overzicht van het gevolgde protocol, terwijl de afbeeldingen in figuur 1B de belangrijkste stappen van de procedure weergeven.
1. Bloedplaatjesrijke plasma (PRP) collectie
- PRP-aferese
- Selecteer voor dit protocol bloedplaatjesdonoren volgens de Italiaanse wetgeving: bloedplaatjesdonoren moeten 18-65 jaar oud zijn, met normale druk- en bloedbeeldparameters en een bloedplaatjesaantal van niet minder dan 180 x 109 bloedplaatjes / L23. In aanmerking komende donoren kunnen geen bloedplaatjes- of antistollingsmedicijnen innemen binnen 1 week voor donatie.
- Voer plasma-bloedplaatjes-aferese uit met behulp van een geautomatiseerd bloedafnamesysteem, volgens de instructies van de fabrikant en nationale wetten23, om 1 eenheid bloedplaatjesrijk plasma (PRP) met één donor te verkrijgen. Verzamel PRP in Adenine Citraat Dextrose Solution A (ACD-A) antistollingsoplossing.
OPMERKING: Bloedplaatjes-aferese wordt uitgevoerd met een continue procedure; de tijd van verzamelen ligt in een bereik tussen 40 min en 90 min. De hoeveelheid ACD die aan de donoren wordt geleverd en het tijdstip van de procedures zijn afhankelijk van de donorkenmerken, bijvoorbeeld hematocriet en naaldmeter.
- Kenmerken van PRP-eenheden
OPMERKING: De volgende stap wordt meestal automatisch uitgevoerd door het geautomatiseerde bloedafnamesysteem tijdens de plasma-bloedplaatjes-afereseprocedure. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant.- Resuspensie van de PRP-eenheden die door aferese zijn verzameld in een adequate hoeveelheid conserveermiddeloplossing met de minimale hoeveelheid restplasma, die nodig is om de pH gedurende de gehele opslagtijd > 6,4 te houden, tot een gemiddeld eindvolume van 180 ml netto van de antistollingsoplossing (ongeveer 40 ml).
OPMERKING: Volgens de Italiaanse wetgeving moeten kwaliteitscontroles beoordelen of het aantal bloedplaatjes (PLT's) ten minste 2,0 x 1011 PLTs / eenheid is, terwijl resterende leukocyten minder dan 1 x 106 cellen / eenheid moeten zijn. - Bewaar leucodepleted en doorstraalde PRP gedurende maximaal 5 dagen bij 22 °C ± 2 °C op een bloedplaatjesschudder voor verdere manipulatie23.
- Resuspensie van de PRP-eenheden die door aferese zijn verzameld in een adequate hoeveelheid conserveermiddeloplossing met de minimale hoeveelheid restplasma, die nodig is om de pH gedurende de gehele opslagtijd > 6,4 te houden, tot een gemiddeld eindvolume van 180 ml netto van de antistollingsoplossing (ongeveer 40 ml).
- PRP-verdunning
- Voer onmiddellijk voordat u met prp-verdunning begint een PLT-telling uit met een hemocytometer met behulp van het monster dat uit de hoofdzak is verzameld via een piercing spike.
OPMERKING: Voer de volgende stappen in steriliteit uit onder een klasse II biohazard kap. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en bril) tijdens de procedure. - Verdun PRP met een voldoende hoeveelheid steriele 0,9% NaCl tot een eindconcentratie van 0,32 x 109 ± 0,03 x 109 PLTs/ml, die de gemiddelde PLT-concentratie in perifeer bloed simuleert.
- Gebruik makend van een piercing spike voor bloedzakken, splits de verdunde PRP in 300 ml lege verzamelzakken om een nettovolume van 190 ml / zak te bereiken.
- Gebruik een aliquot van resterende verdunde PRP (meestal 1 ml) om kwaliteitscontroles uit te voeren om mogelijke microbiële besmettingen te beoordelen. Voer een steriliteitstest uit volgens de instructies van de fabrikant in een microbiologisch laboratorium (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Gebruik kweekflacons die specifiek zijn voor aerobe bloedculturen, die in staat zijn om de kwalitatieve kweek en het herstel van aërobe micro-organismen (voornamelijk bacteriën en gist) uit bloedmonsters met een klein volume uit te voeren. - Bewaar verdunde PRP-zakken bij −80 °C gedurende maximaal 2 maanden voordat u ontdooit.
- Voer onmiddellijk voordat u met prp-verdunning begint een PLT-telling uit met een hemocytometer met behulp van het monster dat uit de hoofdzak is verzameld via een piercing spike.
2. Bloedplaatjesrijk plasmalysaat (PRP-L) preparaat
- Ontdooien
- Voordat u met de ontdooiprocedure begint, moet u ervoor zorgen dat een warm bad is ingesteld op 37 °C. Doe de PRP-zakken in het warme bad en wacht tot ze volledig ontdooid zijn.
- PRP-L collectie
- Centrifugeer de PRP-zakken bij 3000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in steriliteit onder een klasse II biohazard kap. - Maak gebruik van de doordringende spike van de transferzak en verbind de gecentrifugeerde zak met een lege steriele transferzak van 300 ml. Breng het PRP-L supernatant voorzichtig over, terwijl u vuil vermijdt, in de nieuwe zak. Gebruik indien mogelijk een zakpers.
- Sluit de aansluitbuis van de PRP-L unit af met een zakkensealer.
- Centrifugeer de PRP-zakken bij 3000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- PRP-L aliquotering
OPMERKING: Een starteenheid met PRP van 190 ml (zie stap 1.3.3.) is voldoende om twee oogdruppelskits te vullen (voor meer informatie over de specifieke medische hulpmiddelen die worden gebruikt voor het aanbrengen en bewaren van oogdruppels uit bloedbestanddelen, zie de tabel met materialen). Oogdruppels moeten worden geopend onder een klasse II-kap met de hele snaarflacons boven de vooraf aangesloten spuit en de centrale pijl van de stopkraan naar links gericht om het antibacteriële filter uit te sluiten.- Verzamel 30-60 ml PRP-L met een steriele spuit en koppel de spuit aan de Luer/lock-aansluiting op de vullijn.
- Volgens de instructies van de fabrikant draait u de stopkraan met een halve draai om de lijn tussen de PRP-L-bevattende spuit en de vooraf aangesloten spuit te openen. Vul de voorgeconnecteerde spuit met PRP-L.
- Koppel de PRP-L spuit los, sluit de buisdop van de luer/vergrendelingsaansluiting en draai de stopkraan naar de oorspronkelijke positie. Gebruik de oogdruppels kitspuit om de injectieflacons te vullen met PRP-L.
- Herhaal de procedure uit stap 2.3.1.-2.3.3. totdat alle injectieflacons van de applicator zijn gevuld. Zorg ervoor dat elke applicator goed gevuld is en sluit ze vervolgens individueel af met een zakkensluiter.
- Herhaal de procedure met een nieuwe oogdruppelskit.
- Gebruik een kleine hoeveelheid resterende verdunde PRP-L om mogelijke microbiële besmetting te beoordelen (zie stap 1.3.4.).
OPMERKING: Als de vloeistof per ongeluk het antibacteriële filter aan het einde van de snaar bereikt, kan de zuigspuit weerstand bieden, waardoor de vulling wordt belemmerd. Om de vulcyclus voort te zetten, verhoogt u het eindgedeelte van de string voor ongeveer 5/6 aliquots van het antibacteriële hydrofobe filter aan het einde van de string. Gebruik in deze positie een nieuwe steriele spuit (van 30 ml volume) die al met lucht is gevuld. Sluit de vrouwelijke luer/slot van het antibacteriële filter aan en druk hard en herhaaldelijk op de zuiger van de spuit om alle resten van de bloedbestanddelen te verwijderen en het membraan van het antibacteriële filter vrij van de vloeistof te maken. Verwijder de spuit en vul de resterende injectieflacons.
- PRP-L opslag
- Label elke applicator op de juiste manier en stop ze in een plastic zak. Label de plastic zak ook en zorg ervoor dat de bloedgroep van de donor wordt gemarkeerd.
- Bewaren bij −80 °C gedurende maximaal 24 maanden voor de toewijzing van de patiënt, volgens de Italiaanse wet23 en richtlijnen24.
3. PRP-L dispensatie
- Voer de toewijzing van de patiënt bij voorkeur uit door de PRP-L-bloedgroep te matchen. Lever PRP-L applicatorflacons af met behulp van een koelbox en zorg ervoor dat elke applicatorflacon 1,45 ml PRP-L bevat, wat overeenkomt met ongeveer 45 druppels. Instrueer de patiënt dat applicatorflacons maximaal 1 maand bij de patiënten thuis kunnen worden bewaard bij −15 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De reden voor het gebruik van serum-afgeleide oogdruppels (het op bloed gebaseerde product dat het vaakst wordt gebruikt voor de behandeling van oogoppervlakziekten) ligt in hun gehalte aan GFs, die bijna volledig zijn afgeleid van circulerende bloedplaatjes. PRP bevat een significant hoger aantal bloedplaatjes (en bijgevolg van van bloedplaatjes afgeleide GFs) in vergelijking met perifeer bloedserum, variërend tussen 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs / ml. Volgens de Italiaanse wetgeving moet het aantal bloedplaatjes in PRP-eenheden ten minste 0,9 x 109-1 x 109 PLTs / ml zijn. Daarom, om een product te verkrijgen dat de werkzaamheid van serumoogdruppels simuleert, moet PRP vóór lysaatpreparaat worden verdund tot het fysiologische bloedplaatjesgehalte.
Niettemin, aangezien weefselherstel voornamelijk wordt aangedreven door van bloedplaatjes afgeleide GFs, kan de PLT-telling alleen misleidend zijn voor een effectieve therapie van oogoppervlakziekten. Bij DED, de oogziekte die het meest wordt behandeld met van bloed afgeleide oogdruppels, zijn de productie van traanfilm en homeostase verminderd. Op bloedplaatjes gebaseerde producten voor de behandeling van DED moeten daarom ook de fysiologische inhoud van tranen nabootsen.
Het identificeren van de meest geschikte PRP-L voor de behandeling van oogoppervlakziekten, beschreven in stap 1.3.2. van het huidige protocol hebben we voorlopig verschillende PRP-verdunningen beoordeeld, op basis van hun PLTs-gehalte (tussen 0,7 x 109 / ml en 0,3 x 109 / ml), en enkele representatieve GF's van degenen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij oogweefselherstel 12,20,21.
Het aantal bloedplaatjes werd uitgevoerd met een hemocytometer, terwijl GFs werden beoordeeld door middel van een multiplex eiwitkwantificeringstest. De test werd uitgevoerd zoals eerder beschreven25 volgens de instructies van de fabrikant. GFs die in dit manuscript worden getoond, werden geselecteerd voor kwantificering na een voorlopige screening van 36 GFs en GGFRs uitgevoerd op PRP-lysaat met een semi-kwantitatieve eiwitarray. Luminex-kwantificering werd uitgevoerd op 3 van de 36 gescreende GFs: EGF en PDGF (die de meest voorkomende bleken te zijn in onze PRP-lysaten) en TGFβ-1,2,3 isovormen (waarvoor de inhoud belangrijk is voor de oogoppervlakbehandeling21). Het EGF- en PDGF-gehalte werd gemeten omdat ze de werkzaamheid van PRP-L22 kunnen beïnvloeden, terwijl TGFβ-isovormen werden geselecteerd op hun bekende rol in immuunsignaleringsregualtion21.
Aangezien eiwitarrays deel uitmaken van een andere in vitro studie naar de karakterisering van verschillende PRP26, worden die gegevens niet gepresenteerd in dit manuscript.
We hebben EGF, PDGF en TGFβ kwantitatief beoordeeld in PRP-lysaten van twee verschillende donoren (D1 en D2), eerder verdund tussen 0,7 x 10 9-0,3 x 109 PLTs / ml in 0,9% NaCl. Figuur 2 toont de resultaten van de 0,3 x 109 PLTs/ml verdunning, die het meest bleek te lijken op de scheursamenstelling.
De verdunning van 0,3 x 109 PLTs/ml werd geselecteerd op basis van literatuurgegevens over de scheursamenstelling. De EFG-waarden bleken vrij laag te zijn in vergelijking met de gemiddelde scheurwaarde, maar nog steeds in het bereik van normaliteit27. Zelfs PDGF, ondanks het feit dat het zeer variabel was tussen de twee overwogen donoren, was altijd vergelijkbaar met de concentratie gevonden in normale tranen20. Ten slotte bleek TGFβ-1 de meest voorkomende isovorm in PRP-L te zijn, vergelijkbaar met tranen21.
Nadat de meest geschikte PLT-verdunning voor het bereiden van aferese PRP-L was geïdentificeerd, begon de Transfusion Medicine Unit in 2015 met de distributie van deze producten aan patiënten met oogoppervlakaandoeningen. De oogartsen verzamelden routinematig de OSDI-vragenlijsten om DED-symptomen te monitoren; de OSDI-test beoordeelt kwaliteit van leven metingen, zoals de perceptie van oogirritatie en hoe dit de werking met betrekking tot het gezichtsvermogen beïnvloedt. De vragenlijst, gemaakt door de Outcomes Research Group bij Allergan Inc. in 1995 en nu geaccepteerd als een geldig instrument om DED te monitoren, wordt ingediend bij patiënten en geanalyseerd zoals eerder beschreven 28,29.
Hier tonen we de geaggregeerde resultaten van OSDI-tests van DED-patiënten die tussen januari 2020 en januari 2021 zijn behandeld (n = 27). Na een behandeling van 6 maanden met PRP-L daalden de OSDI-scores van 56 ± 21 naar 45 ± 21, wat wijst op een verbetering van de kwaliteit van leven van patiënten (figuur 3).
Ondanks dat deze gegevens zich nog steeds in het ernstige bereik bevinden en geen verband houden met klinische uitkomsten van werkzaamheid, suggereren ze dat DED-patiënten PRP-L beschouwen als een nuttig product dat oculair ongemak verbetert; dit aspect moet verder worden onderzocht in prospectieve klinische onderzoeken die gericht zijn op het beoordelen van de werkzaamheid ervan bij de behandeling van oculaire oppervlakteziekten.
In tabel 1 rapporteren we een vergelijking van de huidige productiemethode met een andere methode voor het bereiden van allogene PRP-L voor oogdruppels30 en voor andere doeleinden22. Voor zover wij weten, zijn Zhang's30 protocol en het huidige protocol de enige gepubliceerde methoden om PRP-L voor het oogoppervlak te produceren. In beide wordt PRP-L verkregen uit aferese; verschillen tussen de twee protocollen, voornamelijk met betrekking tot het aantal vries- en dooicycli en centrifugatiestappen, moeten worden vergeleken om de PRP-L-productie te verbeteren. Niettemin is niet aangetoond dat deze methodologische verschillen schadelijk zijn voor het regeneratieve vermogen van PRP-L getest op andere weefsels22.
Figuur 1: Belangrijkste stappen van het protocol voor de voorbereiding van PRP-L. (A) Schema van het protocol, van PRP-verzameling tot PRP-L-voorbereiding en dispensatie. (B) Representatieve beelden van de belangrijkste stappen van de protocollen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Luminex-kwantificering van van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren voor de 0,3 x 109/ml verdunning van PRP-L. (A) Epidermale groeifactor (EFG); B) van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF); C) transformatie van groeifactor-bèta-isovorm 1 (TGFβ1); D) transformatie van groeifactor-bèta-isovorm 2 (TGFβ2); (E) transformatie van groeifactor-bèta-isovorm 3 (TGFβ3). Waarden worden uitgedrukt als pg/ml, gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke metingen. D1 en D2 zijn twee verschillende bloedplaatjesdonoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geaggregeerde OSDI-scores van DED-patiënten behandeld met PRP-L tussen januari 2020 en januari 2021 op de afdeling Oogheelkunde van de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 patiënten. Osdi-score geaggregeerde resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout, p-waarde werd berekend met een gepaarde t-test met data-analysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dit artikel | PRP-L voor het oog (in vitro onderzoek)29 | PRP-L voor andere doeleinden21 | |
| Bron | PLTs aferese | PLTs aferese | Aferese en volbloed |
| Vries- en dooicycli | 1 (bij -80 °C) | 2 (bij -80 °C) | 1-3 (bij -20 °C en -80 °C) |
| Temperatuur van de opslag | bij -80 °C | bij -80 °C | bij -20 °C en -80 °C |
| Centrifugatiesnelheid voor opslag | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtratie vóór opslag | Nee | Ja | Nee/Ja |
Tabel 1: Vergelijking van protocollen voor de bereiding van allogene PRP-L uit producten op basis van bloedplaatjes die door aferese worden verzameld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren is het klinische gebruik van op bloedplaatjes gebaseerde producten voor oculaire oppervlaktepathologieën toegenomen, maar hun diffusie wordt belemmerd door het gebrek aan wetenschappelijke robuustheid. Dit wordt voornamelijk veroorzaakt door een grote heterogeniteit in donorbronnen en voorbereidingsprotocollen, die vaak niet volledig worden bekendgemaakt of niet specifiek zijn ontworpen voor het doel waarvoor ze worden verstrekt. Met name informatie over op bloedplaatjes gebaseerde producten die door aferese worden verzameld, ontbreekt nog steeds. Daarom was het doel van dit werk om de stapsgewijze verwerking van bloedplaatjesrijke plasmalysaten (PRP-L) te beschrijven, verkregen door aferese voor de behandeling van DED.
PRP-L is een optimale bron voor de productie van oogdruppels, omdat het meer GF's bevat dan de andere op bloed gebaseerde producten22, en in vergelijking met serum of PRP is de productie of opslag ervan goedkoop en eenvoudig. Om PRP-L te verkrijgen, worden bloedplaatjes onderworpen aan lysis (meestal door een of meer vries- en dooicycli) om hun inhoud vrij te geven. Dit proces garandeert een oplossing verrijkt met actieve moleculen die weefselregeneratie stimuleren22,26. Een toenemend aantal ziekten is behandeld met PRP-L22, maar de indicatie voor gebruik in de oogheelkunde is nog steeds zwak vanwege de lage standaardisatiecriteria in bloedplaatjesverzameling en PRP-L-productie 3,22.
Allogene producten op basis van bloedplaatjes verdienen de voorkeur, omdat ze meer standaardiserend zijn dan autologe producten, zowel wat betreft donorkenmerken als qua bereidingswijze. De gezondheidsstatus van de patiënt kan van invloed zijn op de kwaliteit van het product 6,16,17, terwijl de interne kits voor het verzamelen van autologe bloedplaatjes uit volbloed wanneer transfusiediensten niet direct beschikbaar zijn, niet voldoen aan de standaardkwaliteit die vereist is in transfusiegeneeskunde 31.
Voor zover wij weten, zijn er geen klinische studies die het gebruik van allogene PRP-L in de oogheelkunde3 karakteriseren, terwijl er weinig meldingen zijn over autologe PRP-L oogdruppels3 en slechts één studie met allogene PRP-L verkregen uit navelstrengbloed om patiënten met oogoppervlakziekten te behandelen32. Hoewel allogene PRP-L wordt vermeld in de klinische richtlijnen24 en het gebruik ervan is voorgesteld 3,30, is er nog steeds een gebrek aan bewijs over de werkzaamheid ervan in vergelijking met andere behandelingen en andere op bloed gebaseerde producten (bijv. Serum). Hier heeft het gepresenteerde protocol tot doel de wetenschappelijke gemeenschap te helpen gemeenschappelijke productiemethoden te ontwikkelen en licht te werpen op de methodologische verschillen.
Hier beschreven we PRP-L-productie vanaf allogene PRP verzameld door aferese. Op bloedplaatjes gebaseerde allogene producten om bloedplaatjeslysaten te verkrijgen, kunnen ook worden verzameld uit buffy-coats (BC's), en beide bronnen zijn gelijk gerapporteerd31. BC's worden verkregen van gepoolde donoren (meestal vier of vijf), waardoor de interindividuele verschillen worden geminimaliseerd. Omgekeerd verhoogt pooling het risico op overdracht van infectieuze agentia of prionen of het stimuleren van een allogene respons31,33. Aferese is een complexe en invasieve procedure en slechts een minderheid van de donoren komt ervoor in aanmerking of voldoet eraan34. Niettemin zijn op bloedplaatjes gebaseerde producten verkregen door aferese vrij van andere resterende circulerende bloedcellen en bevatten ze een hogere hoeveelheid PLTs35. Om deze redenen is het huidige werk gericht op het ontwikkelen van klinische studies om PRP-L uit deze twee verschillende bronnen te vergelijken.
In dit protocol was de startconcentratie van PLT's in PRP-eenheden verzameld door aferese gemiddeld 1 x 109/ml, wat consistent is met de gerapporteerde concentraties voor andere op bloedplaatjes gebaseerde producten22. Bij deze methode worden PLT's daarna verdund met 0,9% NaCl-oplossing tot 0,3 x 109/ml. Andere protocollen melden het gebruik van plasma voor de verdunning22.
Weinig studies hebben het gebruik van PRP-L in de oogheelkunde gemeld; in deze gevallen werden autologe oogdruppels bereid in concentraties van PLT's variërend van 0,5 x 109/ml-1 x 109/ml 36,37,38. Zoals eerder besproken, zijn standaardisatiemarkers wenselijk en zouden ze ook helpen bij het bepalen van de juiste verdunning. Hier rapporteren we bijvoorbeeld de concentratie van enkele cruciale GF's in de PRP-L. EGF- en PDGF-gehalte beïnvloeden de werkzaamheid van PRP-L22, terwijl TGFβ-isovormen betrokken zijn bij het reguleren van immuunsignalering 21,39 en hun concentratie nauwkeurig wordt gereguleerd. Daarom kan de TGFβ-concentratie in oogdruppels op basis van bloedplaatjes niet alleen de werkzaamheid beïnvloeden, maar ook potentiële schadelijke effecten veroorzaken39; daarom moet het zorgvuldig worden onderzocht voordat de juiste verdunning wordt gedefinieerd. Niettemin was de geselecteerde verdunning - 0,3 x 109 PLTs / ml - gebaseerd op het GFs-gehalte in tranen21,25. Zhang et al. vergeleken eerder op serum gebaseerde oogdruppels, zowel autoloog als allogeen, en op bloedplaatjes gebaseerde lysaten voor hun inhoud in GFs en voor hun vermogen om de regeneratie van hoornvliescellen in vitro te bevorderen30. De studie toonde aan hoe deze producten vergelijkbare kenmerken hebben, waarbij PRP-L een hogere EGF-concentratie heeft, maar een lagere fibronectine. In hun protocol werd het vries-/dooiproces tweemaal herhaald, de centrifuge uitgevoerd bij 3500 x g gedurende 30 minuten en het bloedplaatjeslysaat opgeslagen bij −80 °C30.
Invriezen en ontdooien is inderdaad een cruciale stap; de meeste protocollen (waaronder deze) zijn ontwikkeld met −80 °C bevriezing en 37 °C ontdooien, maar bevriezing is ook gemeld bij −24 °C, −196 °C en −150 °C22,33 Zelfs het aantal uitgevoerde vries-/dooicycli is variabel, variërend van 1 tot 522,33. Een beperkt aantal studies meldde ook ultrasoonapparaat of behandeling met oplosmiddelen/detergenten om bloedplaatjeslysaten22,33 te verkrijgen. Andere methodologische variabelen die eerder bij de bereiding van PRP-L zijn gemeld, hebben betrekking op de centrifugatiestap tussen 300 x g en 10000 x g, van 2 min tot 60 min, en de langdurige opslag, die in de meeste gevallen bij −80 °C ligt, zij het dat soortgelijke producten ook rechtstreeks bij −20 °C22 zijn opgeslagen. Met name de opslagcondities moeten zorgvuldig worden gecontroleerd, aangezien zij van invloed kunnen zijn op de beschikbaarheid en activiteit van GF's in lysaten. In deze zeer heterogene context moeten kwaliteitscontroles en klinische studies, rekening houdend met de afgifte van biogene factoren en de verschillen in het therapeutische effect, dringend worden geëvalueerd.
Ten slotte laten we hier zien hoe deze methode significant is geëvalueerd met een positief resultaat van een geaggregeerde analyse van patiënten met droge ogen die PRP-L gedurende 6 maanden kregen (OSDI-vragenlijst3). Hoewel veelbelovend, is OSDI alleen niet voldoende om de werkzaamheid van PRP-L bij de behandeling van DED en andere oculaire oppervlakteziekten te bepalen, en klinische studies naar het gebruik van allogene PRP-L zijn gerechtvaardigd. Bovendien moeten mogelijke verschillen in productsamenstelling als gevolg van alternatieve methodologische stappen (d.w.z. bevriezen en ontdooien, centrifugatie, opslag) worden vergeleken om de methodologische procedure te optimaliseren.
Concluderend kan worden gesteld dat de hoge heterogeniteit van bloedbronnen en protocollen nog steeds de definitieve vertaling van op bloed gebaseerde producten naar de klinische behandeling van oculaire oppervlakteziekten belemmert. Hoewel PRP-L een opkomend product is met een aantal voordelige functies, zijn verdere studies nodig om het gebruik ervan te valideren en gemeenschappelijke richtlijnen te ontwikkelen. Het delen en detailleren van het voorbereidingsprotocol kan de bruikbaarheid vergroten en licht werpen op de kritieke stappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen "Casa del Dono di Reggio Emilia" bedanken voor het leveren van van donoren afgeleide bloedplaatjesconcentraten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
