Summary
De meeste zwemmende fotoautotrofe organismen vertonen foto-geïnduceerde gedragsveranderingen (fotogedrag). Het huidige protocol observeert het genoemde fotogedrag in het modelorganisme Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Voor het overleven van de beweeglijke fototrofe micro-organismen is het cruciaal om onder de juiste lichtomstandigheden te zijn. Bijgevolg vertonen ze foto-geïnduceerd gedrag (of fotogedrag) en veranderen ze hun bewegingsrichting als reactie op licht. Typische fotobehaviors zijn photoshock (of fotofobe) respons en phototaxis. Photoshock is een reactie op een plotselinge verandering in lichtintensiteit (bijv. Flitsverlichting), waarbij organismen tijdelijk stoppen met bewegen of achteruit bewegen. Tijdens fototaxis bewegen organismen zich naar de lichtbron of in de tegenovergestelde richting (respectievelijk positieve of negatieve fototaxis genoemd). De eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii is een uitstekend organisme om fotogedrag te bestuderen omdat het zijn zwempatroon snel verandert door het slaan van trilharen (ook bekend als flagella) na fotoreceptie te moduleren. Hier worden verschillende eenvoudige methoden getoond om fotobehaviors in C. reinhardtii te observeren. Onderzoek naar de fotobehaviors van C. reinhardtii heeft geleid tot de ontdekking van gemeenschappelijke regulerende mechanismen tussen eukaryote trilharen en channelrhodopsines, die kunnen bijdragen aan een beter begrip van ciliopathieën en de ontwikkeling van nieuwe optogenetische methoden.
Introduction
Licht is een onmisbare energiebron voor fotosynthetische organismen, maar te veel licht kan foto-oxidatieve schade veroorzaken. Fototrofe organismen moeten dus overleven onder licht met matige intensiteit, waar ze kunnen fotosynthetiseren maar geen foto-oxidatieve schade oplopen1. In landplanten kunnen chloroplasten niet uit het blad komen en fotobewegingen in de cel laten zien; chloroplasten verplaatsen zich naar de periferie van de cel bij veel licht en het celoppervlak bij weinig licht2, terwijl veel beweeglijke algen fotobehaviors vertonen die hen in staat stellen de juiste lichtomstandigheden voor fotosynthese te vinden en zo hun overleving te vergemakkelijken3.
Chlamydomonas reinhardtii is een eencellige groene alg die wordt beschouwd als een modelorganisme in onderzoeksgebieden zoals trilharen (ook bekend als flagella), fotosynthese en fotogedrag. C. reinhardtii presenteert zich met één oogvlek en twee trilharen per cel, gebruikt voor respectievelijk fotoreceptie en zwemmen. De oogvlek heeft twee componenten: channelrhodopsins (ChRs), licht-gated ionkanalen in het plasmamembraan en de carotenoïde-rijke korrellagen direct achter de ChRs. De oogvlek fungeert als een directionele lichtreceptor omdat de carotenoïderijke korrellagen functioneren als een lichtreflector 4,5.
ChRs werden aanvankelijk geïdentificeerd als fotoreceptoren die fotobehaviors veroorzaakten in C. reinhardtii 6,7,8,9. Hoewel twee isovormen, ChR1 en ChR2, in de oogvlek worden gevonden, toonden knock-down experimenten aan dat ChR1 de primaire fotoreceptor is voor fotobehaviors10. Desondanks heeft ChR2 meer aandacht gekregen en een centrale rol gespeeld bij de ontwikkeling van optogenetica, een techniek om celexcitatie door licht te regelen11. Daarom zal het bestuderen van de regulerende mechanismen voor fotobehaviors in C. reinhardtii het begrip van de ChR-functie bevorderen en de optogenetica verbeteren.
Na fotoreceptie vertonen C. reinhardtii-cellen twee soorten fotobehaviors: fototaxis en fotoshockrespons12. Fototaxis is het gedrag van cellen die zwemmen in de richting van de lichtbron of de tegenovergestelde richting, respectievelijk positieve of negatieve fototaxis genoemd. Fotoshockrespons is een gedrag dat cellen vertonen na het waarnemen van een plotselinge verandering in lichtintensiteit, zoals wanneer ze worden verlicht door een flitser. Cellen stoppen met zwemmen of zwemmen achteruit (d.w.z. zwemmen met het cellichaam naar voren) voor een korte periode, meestal <1 s.
Ciliaire bewegingen in C. reinhardtii zijn betrokken bij zijn fotobehaviors. Twee trilharen slaan meestal als een menselijke schoolslag zwemmen, en dit is gemoduleerd voor fotobehaviors. Voor fototaxis worden de krachten die door de twee trilharen worden gegenereerd uit balans gebracht door de modulatie van de slagfrequentie en de golfvormamplitude van elk cilium13. Het cilium dat zich het dichtst bij de oogvlek bevindt, wordt cis cilium genoemd en het andere wordt transcilium genoemd. Deze twee trilharen verschillen op verschillende punten. De ciliaire slagfrequentie van transcilium in vitro is bijvoorbeeld 30%-40% hoger14. Bovendien is hun Ca2+ gevoeligheid anders. Reactivering van gedemembraneerde celmodellen15 toonde aan dat het cis cilium sterker klopt dan het transcilium voor Ca2+ <1 x 10−8 M, terwijl het tegenovergestelde geldt voor Ca2+ >1 x 10−7 M. Deze asymmetrie in Ca2+ gevoeligheid is mogelijk belangrijk voor fototactische wendingen, omdat mutanten die deze asymmetrie missen geen normale fototaxis vertonen16,17. Omgekeerd is golfvormconversie noodzakelijk voor photoshock. De ciliaire golfvorm transformeert van de asymmetrische golfvorm bij voorwaarts zwemmen naar de symmetrische golfvorm bij achterwaarts zwemmen. Deze golfvormconversie wordt ook geregeld door Ca2+, bij een drempel van 1 x 10−4 M18,19. Aangezien defecten in het reguleren van ciliaire bewegingen primaire ciliaire dyskinesie bij mensen veroorzaken, kan het bestuderen van fotobehaviors bij C. reinhardtii helpen bij een beter begrip van deze ziekten en therapeutische ontwikkelingen20.
Hierin worden vier eenvoudige methoden gedemonstreerd om fotobehaviors in C. reinhardtii te observeren. Ten eerste wordt een fototaxistest met petrischalen getoond en ten tweede een fototaxistest tegen celsuspensiedruppels. Het fenomeen dat in beide gevallen wordt waargenomen, is niet strikt fototaxis, maar foto-accumulatie, waarbij de cellen de neiging hebben zich dicht bij de lichtbronzijde of de andere kant op te hopen. In C. reinhardtii wordt foto-accumulatie voornamelijk veroorzaakt door fototaxis op een manier die kan worden gebruikt als een benadering van fototaxis. Ten derde wordt een strengere test voor fototaxis onder een microscoop getoond, en als laatste is een fotoshocktest onder een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In deze studie werd een wildtype stam van Chlamydomonas reinhardtii, een nageslacht van de kruis CC-124 x CC-125 met agg1+mt-, gebruikt21. CC-124 en CC-125 werden verkregen van het Chlamydomonas Resource Center (zie Materiaaltabel) en onderhouden op een Tris-acetaat-fosfaat (TAP)22, 1,5% agarose medium bij 20-25 °C. Elke beweeglijke stam kan voor dit protocol worden gebruikt.
1. Celkweek
- Kweek een interessante stam van Chlamydomonas reinhardtii in TAP vloeibaar medium met beluchting door steriele lucht te borrelen in een licht-donkere periode van 12 h/12 uur (lichtperiode, ~50 μmol fotonen·m−2·s−1 wit licht) bij 20-25 °C gedurende 2 dagen.
OPMERKING: Cellen in een mid-logaritmische groeifase moeten worden gebruikt. Lange kweek (>3 dagen, in de late logaritmische groeifase) maakt cellen minder gevoelig voor de lichtprikkel en verhoogt het aantal dode cellen in de cultuur, waardoor de uitlezing van resultaten wordt belemmerd.
Figuur 1: Vloeibare cultuur na 2 dagen kweken. Van een TAP-1,5% agarplaat werd een stuk wild-type cellen die de platinalus vulden, ingeënt tot ~ 150 ml TAP vloeibaar medium in een kolf. De celdichtheid na 2-daagse kweek was ~5,0 x 106 cellen/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Voorbehandeling van cellen
- Meng ~ 10 μL van de cultuur met een gelijk volume deciliatieoplossing om te voorkomen dat de cellen zwemmen en meet de celdichtheid met behulp van een celteller of hemocytometer.
OPMERKING: Er zijn ongeveer 1-5 x 106 cellen / ml na een kweek van 2 dagen (figuur 1). De samenstelling van de deciliatieoplossing is als volgt23: 40 mM kaliumacetaat, 1 mM CaCl2, pH 4,5 aangepast met HCl. - Centrifugeer de vereiste hoeveelheid vloeistofcultuur bij 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Eén experiment vereist 3 ml van 2 x 107 cellen / ml voor standaardomstandigheden voor fototaxis-assay in een petrischaal. Als er twee experimenten worden uitgevoerd met 1 x 106 cellen/ml cultuur, moet 120 ml cultuur worden gecentrifugeerd. - Suspensie de celpellet met de vereiste hoeveelheid fotogedrag experimentele oplossing tot ~ 2 x 107 cellen / ml (voor schotelfototaxistest) of 1 x 106 cellen / ml (voor fototaxistest op celniveau of fotoshockresponstest) en plaats de celsuspensie in een conische buis.
OPMERKING: De celdichtheid hoeft niet erg strikt te worden gecontroleerd voor een ruwe schatting van fotobehaviors of kan veranderen afhankelijk van het doel van de test. Fotogedrag experimentele oplossing14: 5 mM HEPES (pH 7,4), 0,2 mM EGTA, 1 mM KCl, 0,3 mM CaCl2. Deze bufferuitwisselingsstap kan worden weggelaten voor een eenvoudige test op het vermogen om fotobehaviors tentoon te stellen, en het experiment kan worden uitgevoerd met het kweekmedium. Omdat de ionische samenstelling van de oplossing echter de fototactische tekenen24 beïnvloedt en de ionische samenstelling van het medium na het kweken mogelijk niet constant is, wordt het gebruik van deze oplossing voor een strengere test aanbevolen. Vervanging door vers TAP-medium kan een optie zijn. - Plaats de buis onder zwak rood licht (10-30 μmol fotonen·m−2·s−1) gedurende ~1 uur (figuur 2).
OPMERKING: Deze stap verhoogt de gevoeligheid van de cellen voor de lichtprikkel.
Figuur 2: Celophanging onder rood licht. Een gewoon fluorescerend wit licht bedekt met een vel rood cellofaan. Een buis met de celsuspensie wordt geplaatst onder ~10 μmol fotonen·m−2·s−1 rood licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Fototaxistest met behulp van de petrischaal (zogenaamde "schoteltest")
- Plaats 2-3 ml celsuspensie in een petrischaaltje (3,5 cm), plaats het op een lichtbak (als alternatief een wit vel papier of een witte plastic plaat), schud voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en verkrijg een beeld voor verlichting.
OPMERKING: De grootte van de schotel kan veranderen afhankelijk van het doel. Afhankelijk van de stam en de toestand van de cultuur, kunnen de cellen aan de onderkant van de petrischaal blijven plakken. In een dergelijk geval moeten de vastzittende cellen worden verwijderd door vóór de test te pipetteren. - Verlicht de schotel van één kant met een groene lichtgevende diode (LED, zie Materiaaltafel) in een donkere kamer op een bureaublad (figuur 3).
OPMERKING: Typische lichtomstandigheden zijn λ = 525 nm en 50-100 μmol fotonen·m−2·s−1. Zie de discussie over het selecteren van de golflengte van de lichtbron in het discussiegedeelte. Bedek zowel de vaat als de LED met een doos of zwarte doek wanneer een kleine LED wordt gebruikt. - Laat ze ≥5 minuten staan en verkrijg dan afbeeldingen.
OPMERKING: De tijd voor lichtverlichting kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte of het doel van de petrischaal (figuur 4). - Importeer het afbeeldingsbestand naar Fiji (zie Tabel met materialen) voor kwantificering.
OPMERKING: Fiji is een distributie van ImageJ2 en bundelt veel plug-ins. - Wijzig de kleurenafbeelding in grijswaarden via Afbeelding > Typ > 8-bits (afbeelding 5).
- Keer zwart-wit om via Bewerken > Omkeren.
- Omring het hele gerecht als een regio van belang (ROI) en meet de dichtheid via Analyze > Measure.
OPMERKING: De dichtheid van de totale schaal kan worden berekend als (Gebied) x (Gemiddelde). - Omring de helft van de schotel die zich het dichtst bij de lichtbron bevindt als een ROI en meet de dichtheid.
- Bereken de fototactische index als de (dichtheid van fototactische cellen) per (dichtheid van totale cellen).
Figuur 3: Zijverlichting voor fototaxis schoteltest. (A) Een petrischaal met een celophanging geplaatst op een lichtbak in een desktop donkere kamer. Groen licht (525 nm LED-plaat, ~100 μmol fotonen·m−2·s−1) verlicht vanaf de zijkant. (B) Alternatieve verlichtingsmethode. Een 5 mm kanonskogel-type LED. (C) Om licht van buitenaf te blokkeren, kan een doos met een zwarte doek aan de binnenkant worden gebruikt in plaats van een desktop donkere kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van negatieve fototaxis na 5 minuten zijverlichting. (A) Wild-type celsuspensie in een petrischaal die gedurende 5 minuten wordt verlicht. De meeste cellen hoopten zich op aan de andere kant van de lichtbron. Deze gegevens kunnen worden geïnterpreteerd als negatieve fototaxis. (B) Afbeelding van het gerecht van bovenaf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van de schotelfototaxistest. Een voorbeeld van cellen met negatieve fototaxis (de lichtbron bevindt zich aan de rechterkant). De kleurenafbeelding wordt geconverteerd naar grijswaarden (stap 3.5.) en vervolgens omgekeerd (stap 3.6.). Interessante regio's (ROI), het hele gerecht (stap 3.7.) en de lichtbronzijde van het gerecht (stap 3.8.) werden afgebakend. De dichtheid van elke ROI werd gemeten (stap 3.9.). In dit geval is de fototactische index (PI) ongeveer 0,18 ([1.512 x 11.671] / [2.970 x 26.077]). PI is 1 of 0 wanneer alle cellen respectievelijk positieve of negatieve fototaxis vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Fototaxis-test met behulp van celkweekdruppels
- Plaats 25 μL celsuspensiedruppels (stap 2.4.) rechtstreeks op een witte plastic plaat met behulp van een micropipette.
- Verlicht de druppels van één kant met een groene LED in een donkere kamer op het bureaublad (figuur 6).
OPMERKING: Typische lichtomstandigheden zijn λ = 525 nm en 50-100 μmol fotonen m−2 s−1. Bedek zowel platen als LED met een doos of een zwarte doek wanneer een kleine LED wordt gebruikt. - Laat ze 3 minuten staan en verkrijg dan afbeeldingen.
OPMERKING: Deze test is geschikt voor een snelle controle van fototaxis van veel monsters tegelijk, zoals bij mutantscreening of tetrad-analyse. Een celcultuur in de mid-log fase gekweekt in een 96-well plaat kan direct worden verlicht voor eenvoudigere prestaties. In beide gevallen kan stap 2 (celvoorbehandeling) worden weggelaten.
Figuur 6: Druppelfototaxistest. (A) Negen druppels van een celsuspensie van 25 μL geplaatst op een witte plastic plaat en vanaf de zijkant verlicht door een groene LED. (B) Na 3 minuten verlichting. In elke druppel hoopten cellen zich op aan de kant van de lichtbron (positieve fototaxis), verzameld aan de andere kant (negatieve fototaxis) of diffuus in de druppel (geen fototaxis). Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Fototaxistest onder een microscoop
- Neem ~30 μL celsuspensie (1 x 106 cellen/ml in fotogedrag experimentele oplossing) op een glazen schuif en plaats een coverslip (18 mm x 18 mm) met afstandhouders erop (figuur 7).
OPMERKING: De afstandhouders kunnen worden gemaakt met witte petroleum of dubbelzijdige kleefbanden aan twee tegenovergestelde zijden van een coverslip. Het licht moet uit een richting komen waar geen afstandhouders zijn. - Verlicht het monster vanaf één kant van de coverslip zonder afstandhouder met een groene LED en observeer de cellen onder een donkerveldmicroscoop met een 10x objectieflens onder zwak rood licht (λ > 630 nm, ~5 μmol fotonen·m−2·s−1, figuur 8).
OPMERKING: Stel de cellen op het podium niet bloot aan ander licht dan LED- of observatielicht, zoals kamerverlichting of licht van een pc-monitor. De juiste vergroting van een objectieflens is afhankelijk van de beeldhoek van de camera. Selecteer een lens met een vergroting waarmee de cel ~ 2 s kan zwemmen zonder het gezichtsveld te verlaten. Om cellen te volgen, is een afbeelding met hoog contrast wenselijk; daarom wordt het gebruik van een dark-field condensor aanbevolen voor microscopische observatie. Andere condensors, zoals bright-field, kunnen echter worden gebruikt om fototaxis te observeren. Zorg ervoor dat het licht van de LED op de cellen schijnt. - Registreer celbewegingen gedurende ~ 20 s na lichtverlichting met behulp van een met camera uitgeruste microscoop.
OPMERKING: Enkele seconden na het begin van groene LED-verlichting kan een fotoshockreactie optreden en/of is de fototactische oriëntatie (of teken) niet stabiel; daarom wordt een opname van 20 s aanbevolen voor responsstabilisatie (film 1).
Figuur 7: Afstandhouders maken op de randen van de deklip. (A) Op de palm van een hand werd een dunne laag vaseline aangebracht. Een kleine hoeveelheid witte petroleum werd afgeschraapt met de rand van een deklip. (B) Een afstandhouder aan de rand van een afdekplaat. (C) Nog een afstandhouder aan de tegenovergestelde rand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Zijverlichting onder een microscoop. (A) Opstelling van een groene LED. Een kanonskogelachtige groene LED wordt aan de muff bevestigd en bevestigd aan de standaard naast de microscoop. Cellen werden waargenomen onder een donkerveldmicroscoop met een scherp gesneden filter (λ > 630 nm). (B) Zijverlichting door de groene LED. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Fototaxistest onder een microscoop. Groen licht verlicht op ~ 0 s van rechts. Op dat moment hadden cellen de neiging om in een willekeurige richting te zwemmen. Na 0 s in de tijdteller zwommen cellen naar rechts of links, met positieve of negatieve fototaxis. Het licht werd uitgeschakeld bij ~ 15 s toen cellen weer in een willekeurige richting begonnen te zwemmen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
6. Tracking van fototactische cellen en polaire histogramtekening
- Extraheer 1,5 s uit de opgenomen video en begin 15 s na verlichting.
OPMERKING: De duur van het traject kan veranderen afhankelijk van de zwemsnelheid van de cel. Een video van 1,5 s bevat 46 frames bij 30 fps opname. - Importeer het bestand naar Fiji als een afbeeldingsreeks in tagafbeeldingsbestandsindeling via > Importeer > afbeeldingsreeks.
- Voer de plug-in "Manual Tracking" uit voor celtracking met behulp van Plug-ins > Tracking > Manual Tracking.
- Klik op Track toevoegen en het eerste frame verschijnt.
- Klik op een interessante cel en het tweede frame verschijnt.
- Verplaats de schuifregelaar naar het laatste frame en klik op dezelfde cel als in stap 6.5.
OPMERKING: Het is niet nodig om cellen in elk frame te volgen. Alleen de hoek tussen de lichtas en het lijnsegment gevormd door de start en eindpunten is essentieel. - Herhaal stap 6.4.-6.6. voor ~30 cellen.
OPMERKING: Selecteer cellen die gedurende de gehele 1,5 s binnen de beeldhoek blijven. Als de celdichtheid voldoende laag is en er gedurende 1,5 s geen celzwemtrajecten elkaar kruisen, kan automatische tracking worden uitgevoerd. Kies in dat geval de plug-in "MTrack2" (typische instellingen: Minimale objectgrootte = 1; Maximale objectgrootte = 10.000; Maximale snelheid = 100; Minimale kleeflengte [Frames] = 46). Het wordt aanbevolen om de correspondentie tussen cellen op de video en de trackingresultaten te controleren door de gegevens te verkrijgen door Tekst weergeven? > Overlay-punten en -regels aan te vinken. - Kopieer en plak de resultaten in spreadsheetsoftware (bijvoorbeeld Excel).
OPMERKING: Hierin wordt weergegeven hoe u een polair histogram tekent met Excel. - Meet de hoek tussen de lichtas en de zwemrichting van een cel met "=graden(atan2(x2-x1),-(y2-y1))", waarbij de beginpositie van de cel (segment #1) is (x1, y1) en de laatste positie (segment #46) (x2, y1).
OPMERKING: In een Fiji-afbeelding is de linkerbovenhoek de oorsprong (0, 0). - Herhaal stap 6.9. voor alle gemeten cellen (meestal ~30 cellen).
- Maak een frequentieverdelingstabel voor alle gegevens die zijn verkregen met de bakken van −180° tot +180°, verdeeld in 15° aan beide uiteinden en 30° voor de rest van het bereik met behulp van de functie "FREQUENTIE".
OPMERKING: Nadat u de kolommen onmiddellijk in de kolommen van de prullenbak hebt geselecteerd, voert u het volgende in de bovenste kolom in = FREQUENTIE (data_array, bins_array) en drukt u op shift + ctrl + enter (aanvullende figuur 1). - Maak een frequentieverdelingstabel opnieuw met de waarden die zijn berekend in stap 6.8. gedraaid -90° om de rechterkant in te stellen op 0° (d.w.z. het getal in het bereik omrekenen van −15° naar 15°, naar het bereik van −105° tot −75°), aangezien met de bovenstaande methode cellen die omhoog zwemmen worden beschouwd als zwemmend onder een hoek van 0° ten opzichte van het licht (d.w.z. positieve fototaxis laten zien), hoewel het licht van rechts komt (aanvullende figuur 2).
- Voer de hoekwaarde in het midden van het bereik van een bak van 30° in (bijvoorbeeld 30° voor 15°-45°), sla één kolom over en voer het overeenkomstige aantal monsters rechts in (aanvullende figuur 3).
- Converteer elke waarde voor het aantal voorbeelden naar een percentage en voer 0 in de kolom in die overeenkomt met de lege kolom tussen bakken.
- Teken een radardiagram met de hoekwaarden als de horizontale aslabels en de procentuele (%) waarden als de legenda (aanvullende figuur 4).
- Bereken de fototactische index (PI) voor verdere kwantificering door het gemiddelde te nemen van de cosθ (θ = de hoek tussen de lichtas en de zwemrichting)16.
OPMERKING: PI is 0 wanneer cellen in een willekeurige richting zwemmen en 1 of -1 wanneer 100% van de cellen respectievelijk positieve of negatieve fototaxis vertonen.
7. Photoshock response assay onder een microscoop
- Plaats ~30 μL celsuspensie (1 x 106 cellen/ml in de fotogedragsexperimentele oplossing) op een glazen schuif en plaats een coverslip (18 mm x 18 mm) met afstandhouders erop, zoals in stap 4.1.
- Observeer de cellen onder een microscoop met zwak rood licht (λ > 630 nm, ~5 μmol fotonen·m−2·s−1).
- Pas flitsverlichting toe met behulp van een cameraflitser (film 2,3).
OPMERKING: Een andere manier om een photoshock-reactie te induceren, is door snel een rood filter met de hand van het observatielichtpad te verwijderen. Deze methode is echter variabeler omdat de snelheid waarmee het filter wordt verwijderd van persoon tot persoon varieert (film 4,5). - Registreer celbewegingen met behulp van een microscoop met camera.Betrek de celbewegingen.
- Voer voor kwantificering een of beide van de volgende handelingen uit: (1) bereken de verhouding van cellen met de fotoshockrespons per totaal aantal cellen16; (2) meet voor cellen die de fotoshockrespons laten zien de tijd vanaf de fotoshockprikkel tot het herstel van voorwaarts zwemmen25.
Film 2: Photoshock-verlichting door een cameraflitser. De cameraflitser werd tegen het microscooppodium gehouden en ingeschakeld. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 3: Photoshock reactie veroorzaakt door een flits onder een microscoop. Cellen werden waargenomen onder zwak rood licht. Een flits werd uitgezonden bij ~ 0 s. Bijna alle cellen stopten met vooruit zwemmen, zwommen een korte periode achteruit en herstelden het voorwaarts zwemmen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 4: Photoshock-reactie veroorzaakt door het verwijderen van een rood filter onder een microscoop. Cellen werden waargenomen onder zwak rood licht. Het rode filter werd verwijderd bij ~5 s. Bijna alle cellen stopten met vooruit zwemmen, zwommen een korte periode achteruit en herstelden het voorwaarts zwemmen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 5: Een rood filter verwijderen. Snelle verwijdering van een rode filterset in het lichtpad om fotoshock te leveren. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische C. reinhardtii fototaxis en photoshock response assays worden hier getoond. Na schatting van de celdichtheid werd wild-type celkweek (een nageslacht van de kruis CC-124 × CC-125 met agg1 + mt -)23 gewassen met fotogedrag experimentele oplossing voor de fototaxis schoteltest. De celsuspensie werd gedurende ~ 1 uur onder zwak rood licht geplaatst. Een 2 ml celsuspensie werd in een petrischaaltje van 3,5 cm geplaatst. De petrischaal werd zachtjes geschud, op een lichtbak gezet en gefotografeerd met een camera op een standaard. De cellen vertoonden in dit geval duidelijke negatieve fototaxis (d.w.z. cellen die zich ophoopten aan de andere kant van de lichtbron) (figuur 4B).
De fototaxis- en fotoshockresponstests onder een microscoop werden uitgevoerd in een donkere kamer om lichtinterferentie te voorkomen. Een andere wild-type stam, CC-125, die positieve fototaxis laat zien, werd gebruikt voor deze testen26. Voor de fototaxistest wordt de opname meestal uitgevoerd gedurende ~ 25 s. De trajecten van cellen werden gevolgd van de positie van elke cel op 15 s tot die op 16,5 s door Fiji.
De photoshock response assay werd uitgevoerd met behulp van een cameraflitser. Bijna alle cellen vertoonden de fotoshockrespons, zwommen een korte periode achteruit (~ 0,3 s) en herstelden het voorwaarts zwemmen (film 3). Om de gegevens uit deze film te kwantificeren, werden twee methoden gevolgd (zie eerder gepubliceerde rapporten16,25): het berekenen van het percentage cellen met fotoshockrespons tussen alle cellen16, en het meten van de tijd vanaf het begin van het achterwaarts zwemmen van elke cel tot het herstel van voorwaarts zwemmen25. De afhankelijkheid van deze waarden van de lichtintensiteit kan worden geverifieerd door filters met neutrale dichtheid (ND) tussen de lichtbron en het monster16 te plaatsen.
Aanvullende figuur 1: Frequentieverdelingstabel. Kolom A toont het voorbeeldnummer en kolom B toont de hoek bij stap 6.6. Kolom D toont de bakken (12 bakken van 30°). Kolom E toont het hoekbereik per bak ter referentie. Na het selecteren van F2-F14 wordt de functie FREQUENCY in F2 ingevoerd zoals weergegeven in het fx-venster en wordt Shift + Ctrl + Enter ingedrukt om de frequentieverdelingstabel voor te bereiden. De som (F15) moet gelijk zijn aan het totale aantal monsters in kolom A. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Gegevensrotatie. Om de richting van de polaire histogrammen af te stemmen op de werkelijke richting van de lichtverlichting (van rechts), worden de hoeken van de bakken in de frequentieverdelingstabel met −90° gedraaid. Het aantal monsters in het bereik van 165°-135° (F3) verschuift bijvoorbeeld naar 75°-45° (I6). De tellingen in de bereiken 180°-165° (F2) en −165°-−180° (F14) worden gecombineerd in het nieuwe bereik 105°-75° (I5). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Nieuwe bakken instellen voor het tekenen van het polaire histogram. Hernoem de bakken met de middelste waarde van elke 30° bak (kolom K: hernoem bijvoorbeeld de bak van 165°-−165° naar −180°). De radarkaart in Excel is ingesteld met de eerste bak op 90°. Wijzig het aantal monsters (kolom L) in een percentage (kolom M) om verschillende gegevens te vergelijken, ongeacht het aantal monsters. Voer 0 in tussen elk datum (bijv. M3, M5, M7...) om de waarden van elke bak weer te geven als een lijn in de radargrafiek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Radargrafiek die een polair histogram weergeeft voor een fototaxistest. Teken een radardiagram met de bakken (kolom K) als horizontale aslabels en de percentagewaarden (kolom M) als legenda. Een typisch polair histogram dat het percentage CC-125-cellen weergeeft dat in een bepaalde richting beweegt ten opzichte van licht dat van rechts (0°) wordt verlicht (12 bakken van 30°; n = 30 cellen). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol is eenvoudig en niet tijdrovend. Als een C. reinhardtii-mutant wordt verdacht van defecten in fotoreceptie of ciliaire beweging, kan deze methode dienen als primaire fenotypische analyse.
Er zijn echter enkele kritieke stappen. Een daarvan is om cellen in het experiment te gebruiken in de vroege tot mid-log groeifase. Na lange perioden kweken worden cellen minder beweeglijk, minder lichtgevoelig en vormen ze zelfs palmelloiden (celklonten)27. Een andere belangrijke stap is om de cellen vóór het experiment bloot te stellen aan het rode licht (stap 2.4.). Cellen vertonen een hoge lichtresponsiviteit en beweeglijkheid door ChR-stimulatie te vermijden met behoud van fotosynthetische activiteit. Celobservatie onder een microscoop moet bevestigen dat het licht op de cellen schijnt. Vooral bij gebruik van een kleine, zeer gerichte LED kan een kleine afwijking van de optische as voorkomen dat het licht de cellen verlicht.
Een duidelijk nadeel van de schotel- en druppelfototaxistests is dat ze nogal kwalitatief zijn. Hoewel de resultaten kunnen worden gekwantificeerd, zoals weergegeven in stap 3.4.-3.9., kunnen andere verschijnselen dan fototaxis de resultaten beïnvloeden. Cellen kunnen bijvoorbeeld aan gerechten of plastic borden blijven plakken, afhankelijk van de kweekomstandigheden of het schaal- / bordmateriaal. Voorzichtigheid is dus geboden als gegevens geen of slechte fototaxis suggereren. Het selecteren van de juiste methode op basis van het doel is belangrijk omdat deze methoden het grote voordeel van eenvoud aantonen.
Deze methoden zijn opmerkelijk omdat ze gemakkelijk en eenvoudig zijn. Er zijn verschillende geavanceerde methoden beschikbaar om fotogedrag te beoordelen in Chlamydomonas28 of Euglena29. Ze kunnen echter in veel laboratoria moeilijk uit te voeren zijn. De hier beschreven methoden vereisen geen speciale microscoop, maar een goedkope LED of een cameraflitser. Door deze eenvoudige instelling zijn de methoden ook zeer veelzijdig. Om bijvoorbeeld het effect van lichtintensiteit op fotogedrag te bestuderen, kan een ND-filter tussen de lichtbron en het monster16 worden geplaatst. Om het actiespectrum van het gedrag te onderzoeken, kan de kleur van de LED-lichtbron worden uitgewisseld30.
De reden voor het gebruik van groen licht (λ = 525 nm) voor fototaxistests is dat de maximale absorptiegolflengte van ChR1, de fotoreceptor voor fototaxis, ~ 485 nm is, dicht bij de absorptiepiek van chlorofyl b bij ~ 470 nm10,31. Aangezien een verandering in fotosynthetische activiteit de fototactische symptomen kan beïnvloeden, wordt het gebruik van groen aanbevolen omdat het kan worden geabsorbeerd door ChR1, maar niet zo goed door chlorofyl32. Als echter alleen het fototactische vermogen wordt getest, kan blauw licht in plaats daarvan als lichtbron worden gebruikt. Om temporele veranderingen in fotosynthetische activiteit over fototactische tekens te onderzoeken, wordt aanbevolen om een witte lichtbron te gebruiken met het golflengtebereik tussen 425-550 nm, dat goed wordt geabsorbeerd door ChR1.
Fototactische symptomen worden gereguleerd door cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS). Wanneer ROS zich ophoopt, vertonen cellen positieve fototaxis en wanneer ze uitgeput zijn, vertonen cellen negatieve fototaxis26. Membraandoorlatende ROS-reagentia of ROS-opruimreagentia induceren respectievelijk positieve of negatieve fototaxis. Typisch, H2O2 of t-BOOH worden gebruikt als ROS-reagentia, terwijl dimethylthiourea (DMTU) wordt gebruikt als een ROS-scavenger. Zo kan een fototactische test in deze reagentia worden gebruikt om te screenen op mutanten met defecten in fototaxis sign-switching, die verband kunnen houden met defecten in fotoreceptie of ROS-gerelateerd metabolisme 4,21,33.
Fotoshockreacties worden veroorzaakt door Ca2+ instroom vanaf de punt van de trilharen via spanningsafhankelijke Ca2+ kanalen na ciliaire golfvormconversie18,34. Hoewel de Ca2+-afhankelijke golfvormconversie van trilharen veel eukaryote organismen gemeen heeft, is het moleculaire mechanisme nog niet volledig begrepen35. Als een C. reinhardtii-mutant defecten vertoont in de fotoshockrespons, maar normale fototaxis, zou dit een normaal fotoreceptievermogen suggereren. Kortom, de snelle en eenvoudige test voor de hier getoonde fotoshockrespons kan helpen om het gemeenschappelijke moleculaire mechanisme voor de Ca2 +-afhankelijke golfvormconversie in eukaryote trilharen te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) aan NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) en KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), van de Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) tot KW, en van de Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) aan NU, TH en KW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M.
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F.
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , Springer. 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M.
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, Academic Press. Ch. 2 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
