Summary
अधिकांश तैराकी फोटोऑटोट्रॉफिक जीव फोटो-प्रेरित व्यवहार परिवर्तन (फोटोबिहेवियर) दिखाते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल मॉडल जीव क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी में उक्त फोटोबिहेवियर का अवलोकन करता है।
Abstract
मोटाइल फोटोट्रॉफिक सूक्ष्मजीवों के अस्तित्व के लिए, उचित प्रकाश स्थितियों में होना महत्वपूर्ण है। नतीजतन, वे फोटो-प्रेरित व्यवहार (या फोटोबिहेवियर) दिखाते हैं और प्रकाश के जवाब में आंदोलन की अपनी दिशा बदलते हैं। विशिष्ट फोटोबिहेवियर में फोटोशॉक (या फोटोफोबिक) प्रतिक्रिया और फोटोटैक्सिस शामिल हैं। फोटोशॉक प्रकाश तीव्रता (जैसे, फ्लैश रोशनी) में अचानक परिवर्तन की प्रतिक्रिया है, जिसमें जीव क्षणिक रूप से आगे बढ़ना बंद कर देते हैं या पीछे की ओर बढ़ते हैं। फोटोटैक्सिस के दौरान, जीव प्रकाश स्रोत की ओर या विपरीत दिशा में आगे बढ़ते हैं (क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस कहा जाता है)। एककोशिकीय हरा शैवाल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी फोटोबिहेवियर का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट जीव है क्योंकि यह फोटोरिसेप्शन के बाद सिलिया (उर्फ, फ्लैगेला) की धड़कन को संशोधित करके अपने तैराकी पैटर्न को तेजी से बदलता है। यहां, फोटोबिहेवियर का निरीक्षण करने के लिए विभिन्न सरल तरीकों को दिखाया गया है सी। रेनहार्डटी के फोटोबिहेवियर पर शोध ने यूकेरियोटिक सिलिया और चैनलरोडोप्सिन के बीच सामान्य नियामक तंत्र की खोज की है, जो सिलियोपैथी की बेहतर समझ और नए ऑप्टोजेनेटिक्स विधियों के विकास में योगदान दे सकता है।
Introduction
प्रकाश प्रकाश संश्लेषक जीवों के लिए एक अनिवार्य ऊर्जा स्रोत है, लेकिन बहुत अधिक प्रकाश फोटो-ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बन सकता है। इस प्रकार, फोटोट्रॉफिक जीवों को मध्यम तीव्रता वाले प्रकाश के तहत जीवित रहने की आवश्यकता होती है, जहां वे प्रकाश संश्लेषण कर सकते हैं लेकिन फोटो-ऑक्सीडेटिव क्षति का सामना नहीं कर सकतेहैं 1. भूमि पौधों में, क्लोरोप्लास्ट पत्ती से बाहर नहीं निकल सकते हैं और सेल में फोटो आंदोलनों को दिखा सकते हैं; क्लोरोप्लास्ट उच्च प्रकाश के तहत कोशिका की परिधि में जाते हैं और कम रोशनी2 के तहत कोशिका की सतह, जबकि कई प्रेरक शैवाल फोटोबिहेवियर दिखाते हैं जो उन्हें प्रकाश संश्लेषण के लिए उचित प्रकाश की स्थिति खोजने की अनुमति देते हैं और इस प्रकार, उनके अस्तित्व की सुविधा प्रदान करते हैं3.
क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी एक एककोशिकीय हरा शैवाल है जिसे सिलिया (उर्फ, फ्लैगेला), प्रकाश संश्लेषण और फोटोबिहेवियर जैसे अनुसंधान क्षेत्रों में एक मॉडल जीव माना जाता है। रेनहार्डटी प्रति सेल एक आईस्पॉट और दो सिलिया के साथ प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग क्रमशः फोटोरिसेप्शन और तैराकी के लिए किया जाता है। आईस्पॉट के दो घटक हैं: चैनलरोडोप्सिन (सीएचआर), प्लाज्मा झिल्ली में हल्के गेटेड आयन चैनल, और सीएचआर के ठीक पीछे स्थित कैरोटीनॉयड समृद्ध ग्रेन्युल परतें। आईस्पॉट एक दिशात्मक प्रकाश रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है क्योंकि कैरोटीनॉयड समृद्ध ग्रेन्युल परतें प्रकाश परावर्तक 4,5 के रूप में कार्य करती हैं।
सीएचआर को शुरू में फोटोरिसेप्टर्स के रूप में पहचाना गया था, जो सी रेनहार्डटी 6,7,8,9 में फोटोबिहेवियर पैदा करता था। यद्यपि दो आइसोफॉर्म, सीएचआर 1 और सीएचआर 2, आईस्पॉट में पाए जाते हैं, नॉक-डाउन प्रयोगों से पता चला है कि सीएचआर 1 फोटोबिहेवियर10 के लिए प्राथमिक फोटोरिसेप्टर है। इसके बावजूद, सीएचआर 2 ने अधिक ध्यान आकर्षित किया है और ऑप्टोजेनेटिक्स विकसित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाई है, प्रकाश11 द्वारा सेल उत्तेजना को नियंत्रित करने की तकनीक। इसलिए, सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्र का अध्ययन करने से सीएचआर फ़ंक्शन की समझ को आगे बढ़ाया जाएगा और ऑप्टोजेनेटिक्स में सुधार होगा।
रेनहार्डटी कोशिकाएं दो प्रकार के फोटोबिहेवियर दिखाती हैं: फोटोटैक्सिस और फोटोशॉक प्रतिक्रिया12. फोटोटैक्सिस प्रकाश स्रोत या विपरीत दिशा की दिशा में तैरने वाली कोशिकाओं का व्यवहार है, जिसे क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस कहा जाता है। फोटोशॉक प्रतिक्रिया एक ऐसा व्यवहार है जो कोशिकाएं प्रकाश की तीव्रता में अचानक परिवर्तन को महसूस करने के बाद दिखाती हैं, जैसे कि फ्लैश द्वारा प्रकाशित होने पर। कोशिकाएं थोड़े समय के लिए तैरना या पीछे तैरना बंद कर देती हैं (यानी, सेल बॉडी के साथ आगे तैरना), आमतौर पर <1 एस।
रेनहार्डटी में सिलिअरी आंदोलन इसके फोटोबिहेवियर में शामिल हैं। दो सिलिया आमतौर पर मानव के ब्रेस्टस्ट्रोक तैराकी की तरह हराते हैं, और यह फोटोबिहेवियर के लिए संशोधित होता है। फोटोटैक्सिस के लिए, दो सिलिया द्वारा उत्पन्न बलों को धड़कन आवृत्ति के मॉडुलन और प्रत्येक सिलियम13 के तरंग आयाम द्वारा असंतुलित किया जाता है। आईस्पॉट के सबसे करीब सिलियम को सीआईएस सिलियम कहा जाता है, और दूसरे को ट्रांस सिलियम कहा जाता है। ये दोनों सिलिया विभिन्न बिंदुओं पर भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, इन विट्रो में ट्रांस सिलियम की सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति 30% -40% अधिक14 है। इसके अलावा, उनकी सीए2 + संवेदनशीलता अलग है। डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल15 के पुनर्सक्रियन से पता चला है कि सीआईएस सिलियम सीए2 + <1 एक्स 10−8 एम के लिए ट्रांस सिलियम की तुलना में अधिक दृढ़ता से धड़कता है, जबकि सीए2 + >1 एक्स 10−7 एम के लिए विपरीत सच है। सीए2+ संवेदनशीलता में यह विषमता संभवतः फोटोटैक्टिक मोड़ के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि इस विषमता की कमी वाले म्यूटेंट सामान्य फोटोटैक्सिस16,17 प्रदर्शित नहीं करते हैं। इसके विपरीत, फोटोशॉक के लिए तरंग रूपांतरण आवश्यक है। सिलिअरी तरंग आगे तैराकी में विषम तरंग से पिछड़ी तैराकी में सममित तरंग में बदल जाती है। इस तरंग रूपांतरण को सीए2+ द्वारा भी विनियमित किया जाता है, 1 एक्स 10−4 एम18,19 की सीमा पर। चूंकि सिलिअरी आंदोलनों को विनियमित करने में दोष मनुष्यों में प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया का कारण बनते हैं, इसलिए सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर का अध्ययन करने से इन बीमारियों और चिकित्सीय विकास की बेहतर समझ में मदद मिल सकती है20.
इसमें, सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर का निरीक्षण करने के लिए चार सरल तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। सबसे पहले, पेट्री व्यंजनों का उपयोग करके एक फोटोटैक्सिस परख दिखाया गया है, और दूसरा, सेल निलंबन बूंदों के खिलाफ एक फोटोटैक्सिस परख। दोनों मामलों में देखी गई घटना सख्ती से फोटोटैक्सिस नहीं है, लेकिन फोटो संचय है, जहां कोशिकाएं प्रकाश स्रोत पक्ष या विपरीत पक्ष के करीब जमा होती हैं। रेनहार्डटी में, फोटो संचय मुख्य रूप से फोटोटैक्सिस के कारण होता है जिसे फोटोटैक्सिस के सन्निकटन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तीसरा, एक माइक्रोस्कोप के तहत फोटोटैक्सिस के लिए एक और कठोर परख दिखाया गया है, और अंतिम एक माइक्रोस्कोप के तहत एक फोटोशॉक परख है।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन में, क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी का एक जंगली प्रकार का तनाव, एजीजी 1 + एमटी-के साथ क्रॉस सीसी -124 एक्स सीसी -125 की संतान,21 का उपयोग किया गया था। सीसी -124 और सीसी -125 क्लैमाइडोमोनास संसाधन केंद्र ( सामग्री की तालिका देखें) से प्राप्त किए गए थे और ट्रिस-एसीटेट-फॉस्फेट (टीएपी) 22, 1.5% एगारोज़ माध्यम पर 20-25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी मोटाइल तनाव का उपयोग किया जा सकता है।
1. सेल संस्कृति
- 12 घंटे प्रकाश-अंधेरे अवधि (प्रकाश अवधि, ~ 50 μmol फोटॉनों ·एम−2·एस−1 सफेद प्रकाश) में बाँझ हवा को बुदबुदाते हुए वातन के साथ टीएपी तरल माध्यम में क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी की रुचि का एक तनाव 2 दिनों के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: एक मध्य लघुगणक विकास चरण में कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता है। लंबी संस्कृति (>3 दिन, देर से लघुगणकीय विकास चरण में) कोशिकाओं को प्रकाश उत्तेजना के प्रति कम संवेदनशील बनाती है और संस्कृति में मृत कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाती है, परिणामों के पढ़ने में बाधा डालती है।
चित्रा 1: 2-दिवसीय संवर्धन के बाद तरल संस्कृति। एक टीएपी -1.5% अगर प्लेट से, प्लैटिनम लूप को भरने वाली जंगली प्रकार की कोशिकाओं का एक हिस्सा एक फ्लास्क में टीएपी तरल माध्यम के ~ 150 मिलीलीटर में टीका लगाया गया था। 2-दिवसीय संस्कृति के बाद सेल घनत्व ~ 5.0 x 106 कोशिकाओं / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
2. कोशिकाओं का पूर्वउपचार
- कोशिकाओं को तैरने से रोकने और सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल घनत्व को मापने के लिए डेसीलिएशन समाधान की एक समान मात्रा के साथ संस्कृति के ~ 10 μL को मिलाएं।
नोट: 2 दिन की संस्कृति (चित्रा 1) के बाद लगभग 1-5 x 10 6 कोशिकाएं / डेसीलिएशन समाधान की संरचना निम्नानुसार है23: 40 एमएम पोटेशियम एसीटेट, 1 एमएम सीएसीएल2, पीएच 4.5 एचसीएल के साथ समायोजित। - कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1000 x g पर तरल संस्कृति की आवश्यक मात्रा अपकेंद्रित्र।
नोट: एक प्रयोग एक पेट्री डिश में फोटोटैक्सिस परख के लिए मानक शर्तों के लिए 2 x 107 कोशिकाओं / यदि 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल संस्कृति के साथ दो प्रयोग किए जा रहे हैं, तो 120 एमएल संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करने की आवश्यकता है। - एमएल (डिश फोटोटैक्सिस परख के लिए) या 1 एक्स10 6 कोशिकाओं /एमएल (सेल-स्तर फोटोटैक्सिस परख या फोटोशॉक प्रतिक्रिया परख के लिए) के लिए फोटोबिहेवियर प्रयोगात्मक समाधान की आवश्यक मात्रा के साथ सेल गोली को निलंबित करें और सेल निलंबन को शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
नोट: सेल घनत्व फोटोबिहेवियर के किसी न किसी अनुमान के लिए बहुत सख्ती से नियंत्रित करने की आवश्यकता नहीं है या परख के उद्देश्य के आधार पर बदल सकते हैं। फोटोबिहेवियर प्रायोगिक समाधान14: 5 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.4), 0.2 एमएम ईजीटीए, 1 एमएम केसीएल, 0.3 एमएम सीएसीएल2। इस बफर विनिमय कदम फोटोबिहेवियर प्रदर्शित करने की क्षमता पर एक साधारण परख के लिए छोड़ा जा सकता है, और प्रयोग संस्कृति माध्यम के साथ किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि समाधान की आयनिक संरचना फोटोटैक्टिक संकेतों को प्रभावित करती है24, और संवर्धन के बाद माध्यम की आयनिक संरचना स्थिर नहीं हो सकती है, अधिक कठोर परख के लिए इस समाधान का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। ताजा टीएपी माध्यम के साथ प्रतिस्थापन एक विकल्प हो सकता है। - ~ 1 एच (चित्रा 2) के लिए मंद लाल बत्ती (10-30 μmol फोटॉनों ·m−2·s−1) के तहत ट्यूब रखें।
नोट: यह कदम प्रकाश उत्तेजना के लिए कोशिकाओं की संवेदनशीलता को बढ़ाता है।
चित्रा 2: लाल बत्ती के तहत सेल निलंबन। लाल सिलोफेन की शीट के साथ कवर किया गया एक नियमित फ्लोरोसेंट सफेद प्रकाश। सेल निलंबन वाली एक ट्यूब ~ 10 μmol फोटॉनों के तहत रखा जाता है−2·s−1 लाल बत्ती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. पेट्री डिश का उपयोग कर फोटोटैक्सिस परख (तथाकथित "डिश परख")
- पेट्री डिश (3.5 सेमी) में 2-3 एमएल सेल निलंबन रखो, इसे लाइटबॉक्स (वैकल्पिक रूप से, कागज की एक सफेद शीट या एक सफेद प्लास्टिक प्लेट) पर रखें, कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए धीरे-धीरे हिलाएं, और रोशनी से पहले एक तस्वीर प्राप्त करें।
नोट: पकवान का आकार उद्देश्य के आधार पर बदल सकता है। तनाव और संस्कृति की स्थिति के आधार पर, कोशिकाएं पेट्री डिश के नीचे चिपक सकती हैं। ऐसे मामले में, अटक कोशिकाओं परख से पहले पाइपिंग द्वारा हटाया जा करने की जरूरत है। - एक डेस्कटॉप डार्करूम (चित्रा 3) में एक हरे रंग की रोशनी उत्सर्जक डायोड (एलईडी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक तरफ से पकवान रोशन।
नोट: विशिष्ट प्रकाश की स्थिति λ = 525 एनएम और 50-100 μmol फोटॉन ·m−2·s−1 हैं। चर्चा अनुभाग में प्रकाश-स्रोत तरंग दैर्ध्य का चयन करने पर चर्चा देखें। जब एक छोटे एलईडी का उपयोग किया जाता है तो एक बॉक्स या काले कपड़े के साथ व्यंजन और एलईडी दोनों को कवर करें। - उन्हें ≥5 मिनट के लिए छोड़ दें और फिर छवियों को प्राप्त करें।
नोट: पेट्री डिश आकार या उद्देश्य (चित्रा 4) के आधार पर प्रकाश रोशनी के लिए समय बदला जा सकता है। - मात्रा का ठहराव के लिए चित्र फ़ाइल को फिजी में आयात करें (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: फिजी इमेजजे 2 का वितरण है, जो कई प्लगइन्स को बंडल करता है। - छवि के माध्यम से रंग चित्र को ग्रेस्केल में परिवर्तित करें > 8-बिट (चित्रा 5) > प्रकार करें।
- संपादित करें > पलटा के माध्यम से श्वेत और श्याम रिवर्स करें।
- ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) के रूप में पूरे पकवान को घेरें और विश्लेषण > माप के माध्यम से घनत्व को मापें।
नोट: कुल पकवान के घनत्व की गणना (क्षेत्र) एक्स (माध्य) के रूप में की जा सकती है। - आरओआई के रूप में प्रकाश स्रोत के निकटतम पकवान के आधे हिस्से को घेरें और घनत्व को मापें।
- फोटोटैक्टिक इंडेक्स की गणना (फोटोटैक्टिक कोशिकाओं का घनत्व) प्रति (कुल कोशिकाओं का घनत्व) के रूप में करें।
चित्रा 3: फोटोटैक्सिस डिश परख के लिए साइड रोशनी( ए) एक पेट्री डिश जिसमें एक डेस्कटॉप डार्करूम में लाइटबॉक्स पर रखा गया सेल निलंबन होता है। हरी बत्ती (525 एनएम एलईडी प्लेट, ~ 100 μmol फोटॉनों ·m−2·s−1) पक्ष से रोशन। (बी) वैकल्पिक रोशनी विधि। एक 5 मिमी तोप का गोला प्रकार एलईडी। (सी) बाहर से प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए, डेस्कटॉप डार्करूम के बजाय अंदर एक काले कपड़े के साथ एक बॉक्स का उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: 5 मिनट साइड रोशनी के बाद नकारात्मक फोटोटैक्सिस का उदाहरण( ए) 5 मिनट के लिए रोशन पेट्री डिश में जंगली प्रकार सेल निलंबन। अधिकांश कोशिकाएं प्रकाश स्रोत के विपरीत दिशा में जमा होती हैं। इन आंकड़ों को नकारात्मक फोटोटैक्सिस के रूप में व्याख्या की जा सकती है। (बी) ऊपर से पकवान की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: डिश फोटोटैक्सिस परख का ठहराव। नकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाने वाली कोशिकाओं का एक उदाहरण (प्रकाश स्रोत दाईं ओर है)। रंगीन चित्र ग्रेस्केल (चरण 3.5.) में कनवर्ट किया जाता है और फिर उल्टा (चरण 3.6.) होता है. ब्याज के क्षेत्र (आरओआई), पूरे पकवान (चरण 3.7.), और पकवान के प्रकाश-स्रोत-पक्ष आधे (चरण 3.8.) को सीमांकित किया गया था। प्रत्येक आरओआई का घनत्व मापा गया था (चरण 3.9।)। इस मामले में, फोटोटैक्टिक इंडेक्स (पीआई) लगभग 0.18 है ([1,512 x 11.671] / [2,970 x 26.077])। पीआई 1 या 0 है जब सभी कोशिकाएं क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. सेल संस्कृति बूंदों का उपयोग कर फोटोटैक्सिस परख
- सेल निलंबन बूंदों के 25 μL प्लेस (चरण 2.4.) सीधे एक माइक्रोपिपेट का उपयोग कर एक सफेद प्लास्टिक प्लेट पर।
- एक डेस्कटॉप डार्करूम (चित्रा 6) में एक हरे रंग के एलईडी के साथ एक तरफ से बूंदों को रोशन करें।
नोट: विशिष्ट प्रकाश की स्थिति λ = 525 एनएम और 50-100 μmol फोटॉन एम−2 एस−1 हैं। जब एक छोटे एलईडी का उपयोग किया जाता है तो प्लेटों और एलईडी दोनों को एक बॉक्स या काले कपड़े से कवर करें। - उन्हें 3 मिनट के लिए छोड़ दें और फिर छवियों को प्राप्त करें।
नोट: इस परख उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग या टेट्राड विश्लेषण के रूप में एक बार में कई नमूनों की फोटोटैक्सिस की एक त्वरित जांच के लिए उपयुक्त है। 96-अच्छी तरह से प्लेट में उगाए गए मध्य-लॉग चरण में एक सेल संस्कृति को आसान प्रदर्शन के लिए सीधे रोशन किया जा सकता है। दोनों मामलों में, चरण 2 (सेल प्रीट्रीटमेंट) को छोड़ा जा सकता है।
चित्रा 6: छोटी बूंद फोटोटैक्सिस परख( ए) एक सफेद प्लास्टिक शीट पर रखा गया 25 μL सेल निलंबन की नौ बूंदें और एक हरे रंग के एलईडी द्वारा पक्ष से रोशन। (बी) 3 मिनट रोशनी के बाद। प्रत्येक छोटी बूंद में, कोशिकाएं या तो प्रकाश-स्रोत पक्ष (सकारात्मक फोटोटैक्सिस) पर जमा होती हैं, विपरीत तरफ (नकारात्मक फोटोटैक्सिस) जमा होती हैं, या छोटी बूंद (कोई फोटोटैक्सिस) में फैल जाती हैं। स्केल बार = 1 सेमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. एक माइक्रोस्कोप के तहत फोटोटैक्सिस परख
- एक ग्लास स्लाइड पर सेल निलंबन (फोटोबिहेवियर प्रयोगात्मक समाधान में 1 एक्स 106 कोशिकाओं / एमएल) के ~ 30 μL ले लो और शीर्ष पर स्पेसर के साथ एक कवरस्लिप (18 मिमी x 18 मिमी) जगह (चित्रा 7)।
नोट: स्पेसर को कवरस्लिप के दो विपरीत किनारों पर सफेद पेट्रोलियम या डबल-पक्षीय चिपकने वाला टेप के साथ बनाया जा सकता है। प्रकाश को एक ऐसी दिशा से आने की आवश्यकता है जहां कोई स्पेसर नहीं हैं। - हरे रंग के एलईडी के साथ एक स्पेसर के बिना कवरस्लिप के एक तरफ से नमूने को रोशन करें और मंद लाल बत्ती के तहत 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप > के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें (λ 630 एनएम, ~ 5 μmol फोटॉनों ·m−2·s−1, चित्रा 8)।
नोट: मंच पर कोशिकाओं को एलईडी या अवलोकन प्रकाश के अलावा प्रकाश में उजागर करने से बचें, जैसे कि पीसी मॉनिटर से कमरे की रोशनी या प्रकाश। एक उद्देश्य लेंस का उपयुक्त आवर्धन कैमरे के दृश्य के कोण पर निर्भर करता है। एक आवर्धन के साथ एक लेंस का चयन करें जो सेल को देखने के क्षेत्र को छोड़ने के बिना ~ 2 एस के लिए तैरने की अनुमति देता है। कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए, एक उच्च-विपरीत छवि वांछनीय है; इस प्रकार, सूक्ष्म अवलोकन के लिए एक अंधेरे क्षेत्र कंडेनसर के उपयोग की सिफारिश की जाती है। हालांकि, अन्य कंडेनसर, जैसे कि उज्ज्वल क्षेत्र, का उपयोग फोटोटैक्सिस का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि एलईडी से प्रकाश कोशिकाओं पर चमक रहा है। - कैमरा से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रकाश रोशनी के बाद ~ 20 एस के लिए रिकॉर्ड सेल आंदोलन।
नोट: हरी एलईडी रोशनी की शुरुआत के कुछ सेकंड बाद, एक फोटोशॉक प्रतिक्रिया हो सकती है, और / या फोटोटैक्टिक अभिविन्यास (या संकेत) स्थिर नहीं है; इस प्रकार, प्रतिक्रिया स्थिरीकरण (मूवी 1) के लिए 20 एस रिकॉर्डिंग की सिफारिश की जाती है।
चित्र 7: कवरस्लिप किनारों पर स्पेसर बनाना। (ए) वैसलीन की एक पतली परत एक हाथ की हथेली पर लागू की गई थी। सफेद पेट्रोलियम की एक छोटी मात्रा को कवरस्लिप के किनारे से स्क्रैप किया गया था। (बी) एक कवरस्लिप के किनारे पर एक स्पेसर। (सी) विपरीत किनारे पर एक और स्पेसर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 8: एक माइक्रोस्कोप के तहत साइड रोशनी( ए) एक हरे रंग के एलईडी का सेटअप। एक तोप का गोला-प्रकार का हरा एलईडी मफ के लिए तय किया गया है और माइक्रोस्कोप के बगल में स्टैंड पर तय किया गया है। कोशिकाओं को एक तेज कट फिल्टर (_ 630 एनएम >) के साथ एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। (बी) हरे रंग के एलईडी द्वारा साइड रोशनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1: एक माइक्रोस्कोप के तहत फोटोटैक्सिस परख। हरे रंग की रोशनी दाईं ओर से ~ 0 एस पर रोशन होती है। उस बिंदु पर, कोशिकाएं एक यादृच्छिक दिशा में तैरने लगती थीं। टाइम काउंटर में 0 एस के बाद, कोशिकाएं या तो दाईं या बाईं ओर तैरती हैं, सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाती हैं। प्रकाश ~ 15 एस पर बंद कर दिया गया था जब कोशिकाओं ने फिर से यादृच्छिक दिशा में तैरना शुरू कर दिया था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
6. फोटोटैक्टिक कोशिकाओं और ध्रुवीय हिस्टोग्राम ड्राइंग की ट्रैकिंग
- रोशनी के बाद 15 एस शुरू, रिकॉर्ड किए गए वीडियो से 1.5 एस निकालें।
नोट: प्रक्षेपवक्र अवधि सेल के तैराकी वेग के आधार पर बदल सकती है। एक 1.5 एस वीडियो में 30 एफपीएस रिकॉर्डिंग पर 46 फ्रेम होते हैं। - फ़ाइल > आयात > छवि अनुक्रम के माध्यम से टैग छवि फ़ाइल स्वरूप छवि अनुक्रम के रूप में फ़िजी में फ़ाइल आयात करें।
- प्लगइन्स > ट्रैकिंग > मैनुअल ट्रैकिंग का उपयोग करके सेल ट्रैकिंग के लिए प्लगइन "मैनुअल ट्रैकिंग" चलाएं।
- ट्रैक जोड़ें पर क्लिक करें, और पहला फ्रेम प्रकट होता है।
- ब्याज की एक सेल पर क्लिक करें, और दूसरा फ्रेम प्रकट होता है।
- स्लाइडर को अंतिम फ़्रेम पर ले जाएँ और चरण 6.5 के समान कक्ष क्लिक करें.
नोट: प्रत्येक फ्रेम में कोशिकाओं को ट्रैक करना आवश्यक नहीं है। केवल प्रकाश अक्ष और प्रारंभ और समापन बिंदुओं द्वारा गठित रेखा खंड के बीच का कोण आवश्यक है। - चरण 6.4.-6.6 दोहराएँ। ~ 30 कोशिकाओं के लिए।
नोट: पूरे 1.5 एस के लिए दृश्य के कोण के भीतर रहने वाले कक्षों का चयन करें। यदि सेल घनत्व पर्याप्त रूप से कम है और कोई सेल तैराकी प्रक्षेपवक्र 1.5 एस के लिए प्रतिच्छेद नहीं करता है, तो स्वचालित ट्रैकिंग की जा सकती है। उस स्थिति में, प्लगइन "एमट्रैक 2" चुनें (विशिष्ट सेटिंग्स: न्यूनतम ऑब्जेक्ट आकार = 1; अधिकतम ऑब्जेक्ट आकार = 10,000; अधिकतम वेग = 100; न्यूनतम टैक लंबाई [फ्रेम्स] = 46)। वीडियो पर कोशिकाओं और ट्रैकिंग परिणामों के बीच पत्राचार को सत्यापित करने की सिफारिश की जाती है, पाठ दिखाएं? > ओवरले डॉट्स एंड लाइन्स की जांच करके डेटा प्राप्त करके। - स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर (जैसे, एक्सेल) में परिणामों को कॉपी और पेस्ट करें।
नोट: यहां, एक्सेल के साथ ध्रुवीय हिस्टोग्राम कैसे आकर्षित किया जाए दिखाया गया है। - प्रकाश अक्ष और सेल की तैराकी दिशा के बीच के कोण को "= डिग्री (atan2(x2-x1), -(y2-y1)", जहां सेल की प्रारंभ स्थिति (स्लाइस # 1) (x1, y1) है, और अंतिम स्थिति (स्लाइस # 46) (x2, y1) है।
नोट: एक फिजी छवि में, ऊपरी बाएं कोने मूल (0, 0) है। - चरण 6.9 दोहराएँ। मापा सभी कोशिकाओं के लिए (आमतौर पर ~ 30 कोशिकाओं)।
- -180 ° से +180 ° तक डिब्बे के साथ प्राप्त सभी डेटा के लिए एक आवृत्ति वितरण तालिका तैयार करें, दोनों सिरों पर 15 ° और "आवृत्ति" फ़ंक्शन का उपयोग करके शेष सीमा के लिए 30 ° में विभाजित किया गया है।
नोट: बिन कॉलम में तुरंत कॉलम का चयन करने के बाद, शीर्ष कॉलम = आवृत्ति (data_array, bins_array) में निम्नलिखित दर्ज करें और शिफ्ट + सीटीआरएल + एंटर (पूरक चित्रा 1) दबाएं। - चरण 6.8 में परिकलित मानों के साथ आवृत्ति वितरण तालिका पुन: बनाएँ। दाईं ओर 0 ° पर सेट करने के लिए -90 ° घुमाया जाता है (यानी, -15 ° से 15 ° तक की सीमा में संख्या को परिवर्तित करें, -105 ° से -75 ° तक की सीमा तक), क्योंकि, उपरोक्त विधि के साथ, ऊपर की ओर तैरने वाली कोशिकाओं को प्रकाश में 0 ° के कोण पर तैरना माना जाता है (यानी, सकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखारहा है), हालांकि प्रकाश दाईं ओर से आ रहा है (पूरक चित्रा 2)।
- एक 30 ° बिन (उदाहरण के लिए, 15 ° -45 ° के लिए 30 °) की सीमा के बीच में कोण मान दर्ज करें, एक स्तंभ छोड़दें, और इसके दाईं ओर इसी नमूना गिनती दर्ज करें (पूरक चित्रा 3)।
- प्रत्येक नमूना गणना मान को प्रतिशत में कनवर्ट करें, और डिब्बे के बीच रिक्त स्तंभ के अनुरूप स्तंभ में 0 दर्ज करें।
- क्षैतिज अक्ष लेबल के रूप में कोण मानों और किंवदंती (पूरक चित्रा 4) के रूप में प्रतिशत (%) मानों का उपयोग करके एक रडार चार्ट ड्रा करें।
- कोसθ (θ = प्रकाश अक्ष और तैराकी दिशा के बीच का कोण)16 को औसत करके आगे परिमाणीकरण के लिए फोटोटैक्टिक इंडेक्स (पीआई) की गणना कीजिए।
नोट: पीआई 0 है जब कोशिकाएं यादृच्छिक दिशा में तैर रही हैं और 1 या -1 जब 100% कोशिकाएं क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाती हैं।
7. एक माइक्रोस्कोप के तहत फोटोशॉक प्रतिक्रिया परख
- एक ग्लास स्लाइड पर ~ 30 μL सेल निलंबन (फोटोबिहेवियर प्रयोगात्मक समाधान में 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल) रखें, और शीर्ष पर स्पेसर्स के साथ एक कवरस्लिप (18 मिमी x 18 मिमी) रखें, जैसा कि चरण 4.1 में है।
- मंद लाल बत्ती के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें (_ > 630 एनएम, ~ 5 μmol फोटॉनों ·m−2·s−1)।
- कैमरा फ्लैश (मूवी 2,3) का उपयोग करके फ्लैश रोशनी लागू करें।
नोट: फोटोशॉक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने का एक और तरीका अवलोकन प्रकाश पथ से हाथ से लाल फिल्टर को जल्दी से हटाना है। हालाँकि, यह विधि अधिक परिवर्तनशील है क्योंकि फ़िल्टर हटाने की गति व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति में भिन्न होती है (मूवी 4,5)। - कैमरा से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल आंदोलन रिकॉर्ड करें।
- मात्रा का ठहराव के लिए, निम्नलिखित में से कोई एक या दोनों प्रदर्शन करें: (1) कुल कोशिकाओं16 प्रति फोटोशॉक प्रतिक्रिया दिखाने वाली कोशिकाओं के अनुपात की गणना करें; (2) फोटोशॉक प्रतिक्रिया दिखाने वाली कोशिकाओं के लिए, फोटोशॉक उत्तेजना से आगे तैराकी की वसूली के लिए समय को मापें25.
मूवी 2: कैमरा फ्लैश द्वारा फोटोशॉक रोशनी। कैमरा फ्लैश को माइक्रोस्कोप स्टेज तक रखा गया और चालू किया गया। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 3: एक माइक्रोस्कोप के नीचे एक फ्लैश के कारण फोटोशॉक प्रतिक्रिया। कोशिकाओं को मंद लाल बत्ती के नीचे देखा गया था। एक फ्लैश ~ 0 एस पर उत्सर्जित किया गया था। लगभग सभी कोशिकाओं ने आगे तैरना बंद कर दिया, थोड़े समय के लिए पीछे की ओर तैर गए, और आगे तैराकी बरामद की। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 4: माइक्रोस्कोप के नीचे एक लाल फिल्टर को हटाने के कारण फोटोशॉक प्रतिक्रिया। कोशिकाओं को मंद लाल बत्ती के नीचे देखा गया था। लाल फिल्टर ~ 5 एस पर हटा दिया गया था। लगभग सभी कोशिकाओं ने आगे तैरना बंद कर दिया, थोड़े समय के लिए पीछे की ओर तैर गए, और आगे तैराकी बरामद की। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 5: एक लाल फिल्टर निकालना। फोटोशॉक देने के लिए प्रकाश पथ में सेट लाल फिल्टर को तेजी से हटाना। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
रेनहार्डटी फोटोटैक्सिस और फोटोशॉक प्रतिक्रिया परख यहां दिखाए गए हैं। सेल घनत्व अनुमान के बाद, जंगली प्रकार सेल संस्कृति (एजीजी 1 + एमटी -) 23 के साथ क्रॉस सीसी -124 × सीसी -125 की संतान फोटोटैक्सिस डिश परख के लिए फोटोबिहेवियर प्रयोगात्मक समाधान के साथ धोया गया था। सेल निलंबन ~ 1 घंटे के लिए मंद लाल बत्ती के तहत रखा गया था। एक 2 एमएल सेल निलंबन को 3.5 सेमी पेट्री डिश में रखा गया था। पेट्री डिश को धीरे से हिलाया गया, एक लाइटबॉक्स पर रखा गया, और एक स्टैंड पर तय किए गए कैमरे के साथ फोटो खिंचवाया गया। कोशिकाओं ने इस मामले में स्पष्ट नकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाया (यानी, प्रकाश स्रोत के विपरीत पक्ष में संचित कोशिकाएं) (चित्रा 4 बी)।
प्रकाश हस्तक्षेप से बचने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत फोटोटैक्सिस और फोटोशॉक प्रतिक्रिया परख एक अंधेरे कमरे में की गई थी। एक और जंगली प्रकार का तनाव, सीसी -125, जो सकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाता है, का उपयोग इनपरखों के लिए किया गया था 26. फोटोटैक्सिस परख के लिए, रिकॉर्डिंग आमतौर पर ~ 25 एस के लिए की जाती है। फिजी द्वारा 15 एस पर प्रत्येक सेल की स्थिति से कोशिकाओं के प्रक्षेपवक्र को 16.5 एस पर ट्रैक किया गया था।
फोटोशॉक प्रतिक्रिया परख एक कैमरा फ्लैश का उपयोग करके किया गया था। लगभग सभी कोशिकाओं ने फोटोशॉक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया, थोड़े समय (~ 0.3 एस) के लिए पीछे की ओर तैरा, और आगे तैराकी (मूवी 3) बरामद की। इस फिल्म से डेटा को मापने के लिए, दो तरीकों का पालन किया गया था (पहले प्रकाशित रिपोर्ट16,25 देखें): सभी कोशिकाओं16 के बीच फोटोशॉक प्रतिक्रिया दिखाने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करना, और प्रत्येक सेल की पिछड़ी तैराकी की शुरुआत से लेकर आगे तैराकी25 की वसूली तक के समय को मापना। प्रकाश तीव्रता पर इन मूल्यों की निर्भरता प्रकाश स्रोत और नमूना16 के बीच तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्टर रखकर सत्यापित किया जा सकता है।
अनुपूरक चित्रा 1: आवृत्ति वितरण तालिका। कॉलम ए नमूना संख्या दिखाता है, और कॉलम बी चरण 6.6 पर कोण दिखाता है। कॉलम डी डिब्बे (30 ° के 12 डिब्बे) दिखाता है। कॉलम ई संदर्भ के लिए प्रति बिन कोणीय सीमा दिखाता है। एफ 2-एफ 14 का चयन करने के बाद, एफ 2 में आवृत्ति फ़ंक्शन एफएक्स विंडो में दिखाए गए अनुसार दर्ज किया जाता है, और आवृत्ति वितरण तालिका तैयार करने के लिए शिफ्ट + सीटीआरएल + एंटर दबाया जाता है। योग (F15) स्तंभ A में कुल नमूना गणना के बराबर होना चाहिए कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
अनुपूरक चित्रा 2: डेटा रोटेशन। प्रकाश रोशनी की वास्तविक दिशा (दाईं ओर से) के साथ ध्रुवीय हिस्टोग्राम की दिशा से मेल खाने के लिए, डिब्बे के कोणों को आवृत्ति वितरण तालिका में -90 ° तक घुमाया जाता है। उदाहरण के लिए, रेंज 165 ° -135 ° (एफ 3) में नमूना गिनती 75 ° -45 ° (आई 6) में बदल जाती है। 180 ° -165 ° (एफ 2) और -165 ° -−180 ° (एफ 14) रेंज में गिनती को नई सीमा 105 ° -75 ° (आई 5) में जोड़ा जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक चित्रा 3: ध्रुवीय हिस्टोग्राम ड्राइंग के लिए नए डिब्बे सेट करना। प्रत्येक 30 ° बिन के मध्य मान का उपयोग करके डिब्बे का नाम बदलें (कॉलम के: उदाहरण के लिए, 165 ° -−165 ° के बिन का नाम -180 ° के रूप में बदलें)। एक्सेल में रडार चार्ट 90 ° पर पहले बिन के साथ स्थापित किया गया है। नमूनों की संख्या की परवाह किए बिना विभिन्न डेटा की तुलना करने के लिए नमूना गणना (स्तंभ L) को प्रतिशत (स्तंभ M) में परिवर्तित करें। रडार चार्ट में एक रेखा के रूप में प्रत्येक बिन के मूल्यों का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रत्येक डेटम (जैसे, एम 3, एम 5, एम 7 ...) के बीच 0 दर्ज करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक चित्रा 4: एक फोटोटैक्सिस परख के लिए ध्रुवीय हिस्टोग्राम का प्रतिनिधित्व करने वाला रडार चार्ट। क्षैतिज अक्ष लेबल के रूप में डिब्बे (स्तंभ K) और लेजेंड के रूप में प्रतिशत मान (स्तंभ M) का उपयोग करके रडार चार्ट आरेखित करें. एक विशिष्ट ध्रुवीय हिस्टोग्राम सीसी -125 कोशिकाओं के प्रतिशत को दाईं ओर (0 °) (30 ° के 12 डिब्बे; एन = 30 कोशिकाओं) से रोशन प्रकाश के सापेक्ष एक विशेष दिशा में आगे बढ़ने का चित्रण करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल आसान है और समय लेने वाला नहीं है। यदि एक सी रेनहार्डटी उत्परिवर्ती को फोटोरिसेप्शन या सिलिअरी गति में दोषों के साथ पेश करने का संदेह है, तो यह विधि प्राथमिक फेनोटाइपिक विश्लेषण के रूप में काम कर सकती है।
हालाँकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम मौजूद हैं। एक शुरुआती से मध्य-लॉग विकास चरण में प्रयोग में कोशिकाओं का उपयोग करना है। लंबे समय तक संवर्धन के बाद, कोशिकाएं कम गतिशील, कम प्रकाश-संवेदनशील हो जाती हैं, और यहां तक कि पामलॉइड (सेल क्लंप) 27 भी बनाती हैं। एक और महत्वपूर्ण कदम प्रयोग से पहले लाल बत्ती के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए है (चरण 2.4.)। प्रकाश संश्लेषक गतिविधि को बनाए रखते हुए कोशिकाएं सीएचआर उत्तेजना से बचकर उच्च प्रकाश जवाबदेही और गतिशीलता प्रदर्शित करती हैं। माइक्रोस्कोप के तहत सेल अवलोकन को यह पुष्टि करनी चाहिए कि प्रकाश कोशिकाओं पर चमक रहा है। विशेष रूप से जब एक छोटे, अत्यधिक दिशात्मक एलईडी का उपयोग करते हैं, तो ऑप्टिकल अक्ष का थोड़ा विचलन प्रकाश को कोशिकाओं को रोशन करने से रोक सकता है।
पकवान और छोटी बूंद फोटोटैक्सिस परख का एक स्पष्ट दोष यह है कि वे बल्कि गुणात्मक हैं। यद्यपि परिणामों की मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जैसा कि चरण 3.4.-3.9 में दिखाया गया है, फोटोटैक्सिस के अलावा अन्य घटनाएं परिणामों को प्रभावित कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोशिकाएं संस्कृति की स्थिति या डिश / प्लेट सामग्री के आधार पर व्यंजन या प्लास्टिक प्लेटों से चिपक सकती हैं। इस प्रकार, सावधानी बरतनी चाहिए यदि डेटा कोई या खराब फोटोटैक्सिस का सुझाव नहीं देता है। उद्देश्य के अनुसार उपयुक्त विधि का चयन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये विधियां सादगी के महान लाभ को प्रदर्शित करती हैं।
ये विधियां उल्लेखनीय हैं कि वे आसान और सरल हैं। क्लैमाइडोमोनास28 या यूग्लेना29 में फोटोबिहेवियर का आकलन करने के लिए कई परिष्कृत तरीके उपलब्ध हैं। हालांकि, उन्हें कई प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन करना मुश्किल हो सकता है। यहां वर्णित विधियों को एक विशेष माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है, लेकिन एक सस्ते एलईडी या कैमरा फ्लैश की आवश्यकता है। इस सरल सेटिंग के कारण, विधियां भी बहुत बहुमुखी हैं। उदाहरण के लिए, फोटोबिहेवियर पर प्रकाश की तीव्रता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एनडी फिल्टर को प्रकाश स्रोत और नमूना16 के बीच रखा जा सकता है। व्यवहार के एक्शन स्पेक्ट्रम की जांच करने के लिए, एलईडी प्रकाश स्रोत के रंग का आदान-प्रदान किया जा सकताहै 30.
फोटोटैक्सिस परख के लिए हरी बत्ती (α = 525 एनएम) का उपयोग करने का तर्क यह है कि सीएचआर 1 की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य, फोटोटैक्सिस के लिए फोटोरिसेप्टर, ~ 485 एनएम है, जो ~ 470 एनएम10,31 पर क्लोरोफिल बी के अवशोषण शिखर के करीब है। चूंकि प्रकाश संश्लेषक गतिविधि में परिवर्तन फोटोटैक्टिक संकेतों को प्रभावित कर सकता है, इसलिए हरे रंग का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि इसे सीएचआर 1 द्वारा अवशोषित किया जा सकता है लेकिन क्लोरोफिल32 द्वारा इतनी अच्छी तरह से नहीं। हालांकि, यदि केवल फोटोटैक्टिक क्षमता का परीक्षण किया जाता है, तो नीली रोशनी का उपयोग प्रकाश स्रोत के रूप में किया जा सकता है। फोटोटैक्टिक संकेतों पर प्रकाश संश्लेषक गतिविधि में अस्थायी परिवर्तनों की जांच करने के लिए, 425-550 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य सीमा वाले एक सफेद प्रकाश स्रोत का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जो सीएचआर 1 द्वारा अच्छी तरह से अवशोषित होता है।
फोटोटैक्टिक संकेत सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा विनियमित होते हैं। जब आरओएस जमा होता है, तो कोशिकाएं सकारात्मक फोटोटैक्सिस दिखाती हैं, और जब समाप्त हो जाती हैं, तो कोशिकाएं नकारात्मक फोटोटैक्सिस26 दिखाती हैं। झिल्ली-पारगम्य आरओएस अभिकर्मक या आरओएस-मैला ढोने वाले अभिकर्मक क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस को प्रेरित करते हैं। आमतौर पर, एच2ओ2 या टी-बूह का उपयोग आरओएस अभिकर्मकों के रूप में किया जाता है, जबकि डाइमेथिलथियोरिया (डीएमटीयू) का उपयोग आरओएस-मेहतर के रूप में किया जाता है। इस प्रकार, इन अभिकर्मकों में एक फोटोटैक्टिक परख का उपयोग फोटोटैक्सिस साइन-स्विचिंग में दोषों के साथ म्यूटेंट के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, जो फोटोरिसेप्शन या आरओएस से संबंधित चयापचय 4,21,33 में दोषों से संबंधित हो सकता है।
फोटोशॉक प्रतिक्रियाएं सीए2+ प्रवाह के कारण होती हैं जो वोल्टेज-निर्भर सीए2+ चैनलों के माध्यम से सिलिया की नोक से सिलिअरी तरंग रूपांतरण18,34 के बाद होती हैं। यद्यपि सिलिया का सीए2 +-निर्भर तरंग रूपांतरण कई यूकेरियोटिक जीवों के लिए आम है, लेकिन इसका आणविक तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। यदि एक सी रेनहार्डटी उत्परिवर्ती फोटोशॉक प्रतिक्रिया लेकिन सामान्य फोटोटैक्सिस में दोष दिखाता है, तो यह सामान्य फोटोरिसेप्शन क्षमता का सुझाव देगा। संक्षेप में, यहां दिखाए गए फोटोशॉक प्रतिक्रिया के लिए त्वरित और सरल परख यूकेरियोटिक सिलिया में सीए2 + निर्भर तरंग रूपांतरण के लिए सामान्य आणविक तंत्र को समझने में मदद कर सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेन्ही (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) से एनयू (19के 23758, 21के06295), टीएच (16एच06556), और किलोवाट (19एच03242, 20के21420, 21एच00420) से, ओहसुमी फ्रंटियर साइंस फाउंडेशन (https://www.ofsf.or.jp/en/) से किलोवाट तक और डायनामिक एलायंस फॉर ओपन इनोवेशन ब्रिजिंग ह्यूमन, एनवायरनमेंट एंड मटीरियल्स (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M.
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F.
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , Springer. 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M.
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, Academic Press. Ch. 2 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
