Summary
表达IL-9的T和ILC2细胞在 巴西猪笼草 感染期间被诱导，但由于它们的低频率和差异动力学，它们的表征在感染的肠道中在很大程度上被忽视了。该协议描述了从不同靶器官中分离这些细胞，并通过不同感染阶段的流式细胞术 确认 其身份。
Abstract
IL-9是一种多效性细胞因子，与各种过程相关，包括抗肿瘤免疫，过敏病理诱导和对蠕虫感染的免疫反应，其中它在寄生虫的排出中起重要作用。在 巴西黑圆线虫 感染的小鼠模型中，IL-9主要由肺、小肠和引流淋巴结中发现的CD4 + T淋巴细胞和先天淋巴细胞产生。鉴于IL-9细胞内染色所涉及的技术困难，以及在感染时从小肠分离造血细胞的复杂性，迫切需要一个全面但直接的方案来分析IL-9在该模型中不同淋巴和非淋巴组织中的表达。此处描述的方案概述了CD4 + T细胞和先天淋巴样细胞在整个感染过程中在肺和小肠（ 巴西奈瑟菌靶向的主要器官）以及纵隔和肠系膜淋巴结中产生的IL-9的动力学。此外，它还详细说明了感染所需的幼虫数量，具体取决于感兴趣的细胞类型和器官。该协议旨在通过提供专注于 巴西猪笼草 感染模型中感兴趣的特定细胞、器官和疾病阶段的机会，协助测定的标准化以节省时间和资源。
Introduction
钩虫是肠道寄生虫，感染全世界约7亿人，主要在不发达国家的热带地区。 十二指肠钩瘤 和美洲钩虫（人类最常见的 钩虫寄生虫）的高强度感染会导致贫血和蛋白质缺乏，从而导致生长和智力发育延迟1。 美洲猪笼草 和啮齿动物寄生虫巴西 圆线虫 在其宿主中诱导原型2型免疫反应，并且在其生命周期中具有相似性。因此， 巴西猪笼草 小鼠感染是人类钩虫感染最常用的模型。3期（L3） 巴西猪笼草 感染性幼虫在感染后的最初几个小时内从皮肤移动到肺部。一旦进入肺部，它们就会变成L4并沿着气管向上迁移，被吞咽，通过胃，并在4-5天内到达肠道成为成虫（L5）。在肠道中，L5蠕虫产卵，这些卵在粪便中排泄以重新启动寄生虫生命周期2。
巴西猪笼草诱导的免疫应答的特征是几种 2 型细胞因子增加，包括 IL-4、IL-5、IL-9、IL-10 和 IL-13，以及嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多、杯状细胞和肥大细胞增生，以及 IgG1 和 IgE 生成增加。大多数试图识别和定义巴西奈瑟菌感染时引发的免疫反应的研究都集中在IL-4或IL-13在该模型3中的作用上。然而，表达IL-9的细胞的鉴定和表征以及这种细胞因子的功能在很大程度上被忽视了，直到Licona-Limón等人发表了第一项研究，证明IL-9在针对巴西猪笼草的免疫反应中的关键作用。本研究使用报告小鼠将T细胞（主要是辅助性T细胞9）和2型先天淋巴细胞（ILC2）描述为感染时表达IL-9的主要细胞亚群4。
从蠕虫感染的肺部分离和表征免疫细胞是可行的，并且已被广泛报道3，4。然而，由于固有的组织重塑和粘液的产生，在受感染的肠道中这样做被证明是一个技术挑战，直到最近Ferrer-Font等人5的发表。该小组概述了一种方案，用于分离和分析来自 Heligmosomoides polygyrus感染的鼠肠的免疫亚群的单细胞悬浮液。基于此，我们现在已经标准化了从 巴西猪笼草 感染肠道中分离和细胞术分析表达IL-9的淋巴细胞的方案。此外，我们已经建立了来自整个感染过程中不同细胞来源和解剖位置的IL-9动力学。
表征参与这种感染的不同细胞群对于更广泛地了解对寄生虫的免疫反应及其与宿主的相互作用至关重要。这个全面的方案提供了一条明确的途径，可以在感兴趣的疾病阶段从所需器官中分离和分析产生IL-9的细胞，从而可以显着提高有关这些细胞在 巴西猪笼草 感染和寄生虫感染中的作用的知识。
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Protocol
这里描述的所有动物实验都得到了墨西哥国立自治大学细胞生理学研究所动物处理内部委员会（CICUAL）的批准。
注意：整个协议的流程图如图 1 所示。
1. 老鼠的住房
- 使用8-10周龄的雌性或雄性小鼠组，在12小时光照/黑暗循环中饲养在具有恒定温度和湿度的动物设施中， 随意获取水和 食物。
注意：该协议在C57BL / 6背景中使用IL-9报告小鼠品系，如前所述4;然而，可以使用其他IL-9报告菌株6，7，8，以及细胞内IL-9染色，结果各不相同9。
2.小鼠感染
- 在感染前1天将小鼠的背部从身体中间剃到尾巴底部附近。麻醉剂的使用不是必需的。
- 如前所述2，11，在下背部的100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）10中皮下接种每只小鼠200个活的第三阶段巴西猪笼草幼虫（L3），或单独注射100μLPBS作为对照。在感染后第 4 天、第 7 天或第 10 天处死动物。
3.肺、小肠、纵隔、肠系膜淋巴结分离
- 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将鼠标放在背上，喷洒70%乙醇。用剪刀做一个中线切口，打开皮肤，露出腹部和胸部区域。
注意：异氟醚可用作替代安乐死方法12。不建议使用二氧化碳室，因为 CO2 会导致肺组织损伤和出血13。 - 分离纵隔淋巴结和肺
- 在胸骨处切开一个切口，切成“V”形，以去除肋骨和胸肌。一旦胸腔暴露，将纵隔淋巴结定位在食道旁边，心脏下方（见 补充图1）。
- 提取纵隔淋巴结并将其收集在12孔培养板中的1mL R-10培养基（表1）中。在冰上保存，避光直至加工。
注意：样品应避光，以避免减少这些实验中使用的报告小鼠的荧光信号。 - 提取肺并将其收集在每只小鼠12孔培养板中的1mL R-10培养基中。在冰上保存，避光直至加工。
- 分离肠系膜淋巴结链和小肠
- 暴露腹膜腔，并小心地将小肠向右移动，以暴露沿结肠的肠系膜淋巴结（MLN）链。
- 用镊子取出MLN，在纸巾上轻轻滚动，然后拉下脂肪。
- 将 MLN 转移到 12 孔培养板中的 1 mL R-10 培养基中。在冰上保存，避光直至加工。
- 切开幽门括约肌下方和盲肠上方的小肠。在镊子的帮助下慢慢拉出肠道，去除附着的肠系膜和脂肪组织。
- 将小肠放在纸巾上，并用PBS大量润湿。用剪刀从小肠上取下佩耶氏贴片。
注意：为了保持活力，请去除剩余的脂肪组织，并在整个过程中用PBS保持小肠湿润。 - 用剪刀纵向切开小肠，将镊子轻轻滑过开放的肠，去除粪便和粘液。
- 用镊子握住小肠，小心地将其浸入冰上的 5 mL PBS 中洗涤几次。重复两次。
- 将小肠切成短块（约5毫米），并将它们收集在50 mL锥形管中，其中含有10 mL HBSS14 和2%FBS（表1）。立即继续分离上皮内和固有层细胞。
4.制备小肠、肺和淋巴结的单细胞悬液
注意：从小肠制备单细胞悬浮液时，每人最多处理六只小鼠非常重要，因为细胞活力随着处理时间的延长而显着降低。该方法改编自 Heligmosomoides polygyrus 感染小鼠模型5。
- 在37°C下预热振荡培养箱，R-20培养基，HBSS和HBSS-2mM EDTA（表1）。
- 每个样品制备10 mL小肠消化培养基（表1）。
- 用手用力摇晃步骤3.3.8中的肠片。
- 通过玻璃漏斗上的尼龙网（约10 cm x 10 cm）过滤每个样品。通过在网眼上加入 10 mL 预热的 HBSS 来洗涤样品并丢弃流通物。再重复一次。
注意：为每个样品使用一个新的网格，并在整个过程中重复使用它。 - 从漏斗中取出网布，并将网孔中的样品收集在装有10 mL温热HBSS-2 mM EDTA的50 mL锥形管中（步骤4.1）。在37°C孵育10分钟，以200rpm振荡。
- 以最大速度 （3，200 rpm） 涡旋 10 秒，并在玻璃漏斗上用网状物过滤样品，回收 50 mL 锥形管中的流出物。
- 重复步骤 4.5 和 4.6 两次，在同一 50 mL 锥形管中回收流出物。上皮内细胞位于这个 30 mL 级分中。保存剩余的组织。
- 上皮内细胞的单细胞悬液制备
- 在室温（RT）下以450× g 离心在步骤4.7中回收的30mL细胞悬液5分钟。弃去上清液。
- 加入 5 mL PBS 并在室温下以 450 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于3 mL RPMI 10%FBS-20 μg/mL DNase中（表1）。保持在冰上，避光直到细胞染色。
- 由固有细胞层制备单细胞悬液
- 通过将超过 10 mL 的温热 HBSS 倒入漏斗上的网状物来洗涤步骤 4.7 中剩余的小肠组织。重复洗涤。将网状物中的组织收集在装有 10 mL 小肠消化培养基的 50 mL 锥形管中。
- 在37°C孵育30分钟，以200rpm振荡。每5分钟以最大速度涡旋10秒。
- 加入 10 mL FACS-EDTA 缓冲液（表 1）以停止消化反应，并将其置于冰上。
- 使用血清移液管通过 100 μm 细胞过滤器过滤每个样品，在放置在冰上的 50 mL 锥形管中回收悬浮液。
- 在4°C下以600× g 离心6分钟。
- 弃去上清液。用5mL PBS洗涤细胞沉淀，并在4°C下以600× g 离心6分钟。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL RPMI 10% FBS-20 μg/mL 脱氧核糖核酸酶中。保持在冰上，避光直到细胞染色。
- 肺单细胞悬液制备
注意：每个肺和小肠应由两个人并行处理，以避免延长处理时间，从而导致细胞活力低下。- 每个处理的样品准备 4 mL 肺消化培养基（表 1）。
- 从步骤3.2.3中从含有肺的孔中取出RPMI培养基。用细剪刀将肺切成小块。
- 用刮刀将肺碎片转移到 15 mL 锥形管中。加入4 mL肺消化培养基（表1）。
- 在37°C下孵育30分钟，以250rpm振荡。完成后，继续在冰上，直到每个样品都得到处理。
- 通过放置在6孔培养板的单孔中的100μm细胞过滤器过滤每个样品。用注射器柱塞解离组织。
- 在 15 mL 锥形管中回收每个样品，并加入 4 mL R-2 培养基（表 1）。在处理其他样品时保持冰上。
- 在4°C下以600× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL R-5培养基中（表1）。
- 离心时，每个样品制备4 mL的27.5%密度梯度溶液（表1），以富集造血细胞级分15，16。与其他类似的密度梯度培养基相比，这种单细胞分离策略更有效、更具成本效益且毒性更小17.
- 将4mL的27.5%密度梯度溶液加入步骤4.10.7的1mL细胞悬液中，并剧烈摇晃。
- 在混合悬浮液上缓慢加入 1 mL R-5 培养基（表 1）以形成两相。
- 在室温下以 1，500 x g 离心 20 分钟，低加速度和制动器关闭。观察两相之间形成的环。
- 用 1 mL 微量移液器回收两相之间形成的环，并重悬于 4 mL R-2 培养基中。
- 在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1mL ACK缓冲液中（表1），并在室温下孵育1分钟。
- 加入4mL的R-5培养基，并在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL R-10培养基中。保存在冰上，避光直至染色以进行流式细胞术。
- 淋巴结单细胞悬液制备
- 将步骤3.2.2或3.3.3中的淋巴结放在6孔培养板中的两片网片之间，并用注射器柱塞解离。
- 在1.5mL锥形管中回收细胞悬液，并在4°C下以450× g 离心5分钟。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL R-10培养基中。保存在冰上，避光直至染色以进行流式细胞术。
注意：如果可见团块，请通过100μm细胞过滤器过滤样品。
5.流式细胞术的细胞染色（图2和图3）
注意：将步骤4.11.3中的淋巴结细胞悬液在450× g 下在4°C下离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于500μLFACS缓冲液中（表1）。
- 用于鉴定ILC2的细胞染色（图3 和 补充图2）
注意：此染色程序特定于鉴定表达IL-9的ILC2细胞。- 在96孔锥形底部培养板中，从步骤4.10.14中板每个肺样品（约1.8 x 10 6个细胞）板150μL，从步骤4.11.3中板每个淋巴结样品50μL（纵隔和肠系膜淋巴结样品分别约为0.7 x 10 6和2.2 x 106细胞）。加入 100 μL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 450 x g 离心 5 分钟。
- 在96孔锥形底部培养板中，来自步骤4.8.3和4.9.7的每个小肠样品板100μL（上皮内和固有层样品分别约为2.7 x 106和 0.6 x 106 细胞）。加入 150 μL FACS 缓冲液，并在 4 °C 下以 450 x g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并将每个细胞沉淀重悬于在FACS缓冲液中稀释的50μL生物素化抗体混合物（表2）中。在4°C避光孵育30分钟。
注意：使用含有20μg/ mL DNase的FACS缓冲液用于上皮内和固有层样品。 - 加入 150 μL FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。再次离心并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于50μL抗体/染色混合物中（表2），并在4°C避光下孵育30分钟。
- 加入 150 μL FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。再次离心并弃去上清液。重复洗涤（步骤5.1.7），弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
- 对于小肠和肺样本，使用门控策略：淋巴细胞，单细胞，活细胞，造血细胞，CD90 +谱系细胞，ST2 +细胞和IL-9 +细胞（图3A，B 和 补充图2A）。对于淋巴结样本，使用门控策略：活细胞，单细胞，CD90 +谱系细胞，ST2 +细胞和IL-9 +细胞（补充图2B，C）。
- 用于鉴定产生IL-9的淋巴细胞的细胞染色（图2 和 补充图3）
- 将步骤 4.10.14 的每个肺样品转移 800 μL 到 1.5 mL 管（约 14.6 x 106 个细胞）中。在4°C下以450× g 离心5分钟。 弃去上清液。
- 对于淋巴结样品，将步骤 4.11.3 中的 400 μL 细胞悬液（纵隔和肠系膜淋巴结样品分别为约 5.6 x 10 6 和 17.5 x 106 细胞）接种在 96 孔锥形底板中，分两步进行。
- 首先转移200μL，在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
- 将另外 200 μL 转移到相应的孔中。在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于50-400μL抗体/染色混合物中（表3），并在4°C避光下孵育30分钟。
注意：肺样本应重悬于400μL中，纵隔淋巴结样本重悬于50μL中，肠系膜淋巴结样本重悬于100μL染色混合物中。 - 向纵隔淋巴结样品中加入 150 μL FACS 缓冲液，向肠系膜淋巴结样品中加入 100 μL 的 FACS 缓冲液。在4°C下以450× g 离心5分钟，弃去上清液。
- 通过将沉淀分别重悬于 1 mL 和 200 μL FACS 缓冲液中来洗涤肺和淋巴结样品。在4°C下以450×g 离心5分钟。 弃去上清液并重复洗涤。
- 将肺样品重悬于 600 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。使用门控策略：淋巴细胞，单细胞，活细胞，造血细胞，CD4 + TCRβ +细胞和IL-9 +细胞（图2A）。
- 将淋巴结样品重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。使用门控策略：淋巴细胞，单细胞，活细胞，CD4 + TCRβ +细胞和IL-9 +细胞（图2B 和 补充图3A）。
6. 单细胞悬浮液中细胞绝对数量的测定
- 用 PBS 以 1：20 的比例（10 μL 样品 + 190 μL PBS）稀释分离步骤 4.8.3、4.9.7、4.10.14 和 4.11.3 中的样品。
- 将步骤 6.1 中的每个稀释样品 10 μL 与 10 μL 台盼蓝混合。将 10 μL 加载到血细胞计数器中并计数活细胞，考虑每次稀释。
- 通过将流式细胞术确定的活细胞（活力染料阴性细胞）中感兴趣的群体百分比乘以分离后单细胞悬液中的活细胞总数，然后将该数字除以100（补充图4，补充图5和补充图6），获得细胞的绝对数。
绝对数=（通过流式细胞术测定的活细胞目标群体的百分比x单细胞悬液中的活细胞总数）/100
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Representative Results
小鼠皮下注射200 L3期 巴西猪笼草 幼虫，或用PBS进行假对照。调整了该协议中使用的幼虫数量，以便从肺，淋巴组织和小肠中分离出活细胞，这与以前的报告不同，以前的报告使用更高的蠕虫负荷来检测淋巴组织和肺部中的细胞仅4。在感染后第 0、4、7 和 10 天采集肺、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结和小肠，用于淋巴细胞分离和 IL-9 生成人群的特征。在两个或多个独立实验中总共使用了27只小鼠，包括9只对照和每分析4至6只巴西 猪笼草感染小鼠。每个实验中都包括假感染的对照以获得基础数。使用该协议，可以从肺，肠系膜和纵隔淋巴结中分离出产生IL-9的CD4 + T细胞（在该模型中主要是Th9细胞）以进行定量和进一步分析。
在感染的自然病程之后，我们首先评估了肺和纵隔淋巴结中存在的产生IL-9的CD4 + T淋巴细胞（Th9）的频率（门控策略如图2A和补充图3A所示）。在这两个器官中，Th9频率从第4天开始增加，并在感染后第7天达到峰值（图2C），在Th9绝对数字中也观察到了增量（补充图4A，B）。在肠系膜淋巴结（门控策略如图2B所示）中，根据以前的报告4，感染后第7天和第10天Th9细胞的频率和绝对数量均显着增加（图2C和补充图4C）。在上皮内和固有层样品中确认了T细胞和ILC2的存在;然而，在整个感染过程中，在这些肠道隔室中没有观察到Th9细胞（补充图3B，C）。
然后，我们评估了感染小鼠淋巴和非淋巴组织中表达IL-9的ILC2细胞（门控策略如图 3A，B 和 补充图2所示）。我们观察到感染后第7天肺部表达ILC2的ST2 + IL-9-和ST2+ IL-9+的频率显着增加（图3C）。同时，对绝对数字的分析显示，仅在感染后第7天ST2 + IL-9 +人群中具有统计学意义的增加（补充图5A）。在纵隔淋巴结中（门控策略如 补充图2B所示），表达IL-9的ILC2细胞（ST2 + IL-9+）的数量在感染后第10天显着增加，而ST2 +细胞的绝对数量显示出增加的趋势，从第7天开始，一直持续到感染后第10天（补充图6A，C）。
IL-9 + ILC2细胞也存在于小肠固有层和上皮内区室中（门控策略如图3B和补充图2A所示）。巴西猪笼草感染导致ST2 + IL-9+细胞在第4天的频率在统计学上显着增加，在第7天和第10天ST2-IL-9+群体在固有层中显着增加。在上皮内隔室中，在感染后第7天和第10天分别观察到ST2 + IL9 +和ST2-IL-9 +细胞的频率显着变化（图3C）。重要的是，即使幼虫负荷相对较低，寄生虫感染也会对小肠造成广泛的损害;因此，分析表达IL-9的ILC2s绝对数在技术上是不可行的，由于活细胞产量低，阻碍了该群体的准确定量（补充图5B，C）。另一方面，肠系膜淋巴结的分析（补图2C所示的门控策略）显示，感染后第10天ST2 + IL-9-，ST2+ IL-9+和ST2-IL-9+ ILC2细胞的绝对数量显着增加（补充图6D），如先前报道的4。同时，在整个感染过程中，这些人群的频率没有观察到差异（补充图6B）。表达ST2和IL-9的细胞的这些不同亚群是有趣的群体，在体内具有潜在的差异作用，并且可能对应于最近描述的天然与炎症性ILC2s18，19，20，21。然而，这需要在未来的研究中解决。
总之，我们调整了该协议以从 巴西奈瑟菌感染的肠道中恢复表达IL-9的细胞，同时仍然能够在肺和淋巴组织中检测到它们。从寄生虫感染的肠道中取出免疫细胞已被证明在技术上是困难的。在这里，调整用于感染的幼虫数量导致肠道组织完整性的改善，从而允许IL-9 +种群的恢复。据我们所知，这是第一个专门为分析 巴西猪笼草 感染期间肠道中表达IL-9的细胞而开发的方案。然而，也可以按照这些步骤分离其他免疫细胞。这里提供的数据显示，小肠中大多数表达IL-9的组织细胞是ILC2。
图 1：所述协议的流程图。示意图，其中显示了用于处理不同器官的主要步骤以及获得的预期表达IL-9的细胞亚群。请点击此处查看此图的大图。
图 2：Th9 细胞存在于整个巴西猪笼草感染的肺、纵隔和肠系膜淋巴结中。 代表性流式细胞术分析和门控策略用于从 （A） 肺和 （B） 肠系膜淋巴结鉴定 Th9 细胞。将来自每个器官的单细胞悬浮液染色为可固定的活力染料，荧光标记的抗CD45用于鉴定造血细胞，抗T细胞受体（TCR）β和抗CD4用于鉴定CD4 + T淋巴细胞。GFP+信号表示存在的Th9细胞的百分比。第一个门显示出侧向散射（SSC）-A/前向散射（FSC）-A的性质，具有淋巴细胞的经典形态。选择单细胞事件，然后选择活细胞，然后选择CD45 +细胞。在这个群体中，我们专注于TCR-β和CD4双阳性细胞，其中GFP +细胞被鉴定为Th9细胞。淋巴结染色不包括抗CD45抗体，因为预计整个人群都是阳性的。（C）感染后指定时间在肺，纵隔和肠系膜淋巴结中发现的Th9细胞的频率。数据表示每个时间点从三个独立实验中分析的每组±两只小鼠的平均SEM;非配对 T 检验;*p≤ 0.05， **p≤ 0.001， ****p≤ 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
图3：产生IL-9的ILC2细胞存在于非淋巴器官中。 代表性流式细胞术分析和门控策略用于鉴定来自 （A） 肺和 （B） 小肠固有层的 IL-9+ ILC2 细胞。用生物素化抗体标记来自每个器官的单细胞悬浮液以鉴定谱系细胞（抗B220，抗CD11b，抗FcεRI，抗TCR-β，抗TCR-γδ，抗Siglec F，抗CD4，抗CD11c，抗Gr-1，抗CD8，抗CD19，抗NK1.1和抗Ter119）和Fc-Block。然后用可固定的活力染料、荧光染料标记的链霉亲和素、用于鉴定造血细胞的抗CD45和用于鉴定ILC2细胞的抗CD90对细胞悬液进行染色。第一个门显示出具有淋巴细胞经典形态的散射（SSC）-A/侧散射（FSC）-A特性。选择单细胞事件，然后选择活细胞，然后选择CD45 +细胞。在这个人群中，我们专注于CD90 +亚麻细胞;从该组中，我们评估了ST2和GFP表达以鉴定IL-9 + ILC2细胞。（C）在感染后指定时间点在肺，固有层和上皮内细胞区室中发现的ILC2细胞的频率。数据表示每个时间点从三个独立实验中分析的每组±两只小鼠的平均SEM;未配对的 T 检验; *p ≤ 0.05。 请点击此处查看此图的大图。
表1：化学溶液及其组成列表。请按此下载此表格。
表2：用于鉴定产生IL-9的ILC2细胞的抗体混合物。请按此下载此表格。
表 3：用于鉴定产生 IL-9 的 T 淋巴细胞的抗体混合物。请按此下载此表格。
补充图1：纵隔淋巴结位置示意图。 创建于 BioRender.com 请点击此处下载此文件。
补充图2：代表性流式细胞术和门控策略，用于鉴定小肠和淋巴结上皮内细胞内的IL-9+ ILC2。 （A）来自小肠上皮内细胞的单细胞悬液首先与生物素标记的抗体一起孵育以选择谱系细胞（抗B220，抗CD11b，抗FcεRI，抗TCR-β，抗TCR-γδ，抗Siglec F，抗CD4，抗CD11c，抗Gr-1，抗CD8，抗CD19，抗NK1.1和抗Ter119）和Fc-Block。随后用可固定的活性染料、荧光染料标记的链霉亲和素、用于鉴定造血细胞的抗CD45和用于鉴定ILC2细胞的抗CD90进行染色。第一个门显示出侧向散射（SSC）-A/前向散射（FSC）-A的性质，具有淋巴细胞的经典形态。选择单细胞事件，然后选择活细胞，然后选择CD45 +细胞。在这个人群中，我们专注于CD90 +亚麻细胞;从该组中，GFP +细胞被鉴定为IL-9 + ILC2细胞。（乙，丙）（B） 纵隔淋巴结和 （C） 肠系膜淋巴结的代表性流式细胞术和门控策略，以鉴定 IL-9+ ILC2 细胞。淋巴结染色不包括抗CD45抗体，因为预计整个人群都是阳性的。 请点击此处下载此文件。
补充图3：用于鉴定纵隔淋巴结和小肠中Th9细胞的代表性流式细胞术分析和门控策略。 用可固定的活性染料和荧光标记的抗TCR-β和抗CD4抗体染色来自（A）纵隔淋巴结的单细胞悬浮液。第一个门显示出侧向散射（SSC）-A/前向散射（FSC）-A的性质，具有淋巴细胞的经典形态。选择单细胞事件，然后选择活细胞，然后是TCR-β和CD4双阳性细胞;从该组中，GFP+细胞被鉴定为Th9细胞。类似的流式细胞术策略用于来自小肠的（B）固有层和（C）上皮内细胞，除了在活细胞之后选择CD45 +细胞，其次是TCR-β和CD4双阳性细胞，其中GFP+细胞被鉴定为Th9细胞。 请点击此处下载此文件。
补充图4：Th9细胞的绝对数量在整个感染过程中显着变化。 在感染后第0、4、7和10天测定（A）肺、（B）纵隔淋巴结和（C）肠系膜淋巴结中来自TCR-β和CD4双阳性细胞的IL-9+细胞的绝对数量。数据表示每个时间点从三个独立实验中分析的每组±两只小鼠的平均SEM;未配对 T 检验 *p ≤ 0.05，**p ≤ 0.001，***P ≤ 0.0001。 请点击此处下载此文件。
补充图5：IL-9 + ILC2细胞的绝对数量在整个感染过程中不同。 在感染后第 0、4、7 和 10 天测定来自 lin-CD90+ 群体的 IL-9+ ILC2 细胞的绝对数量在 （A） 肺、（B） 固有层和 （C） 来自小肠的上皮内细胞中。数据表示每个时间点从三个独立实验中分析的每组±两只小鼠的平均SEM;未配对 T 检验 *p ≤ 0.05。 请点击此处下载此文件。
补充图6：感染期间淋巴结中IL-9 + ILC2细胞的频率和绝对数量显着增加。 （A）来自纵隔淋巴结的IL-9 + ILC2细胞的频率和（C）绝对数量。（B）来自肠系膜淋巴结的IL-9 + ILC2细胞的频率和（D）绝对数量。在感染后第0、4、7和10天，将值确定为lin-CD90+群体中的IL-9 + ILC2细胞。数据代表每组分析的一只或两只小鼠的平均±SEM，来自三个独立实验，每个时间点;未配对的T检验*p ≤0.05，***p≤0.0001。 请点击此处下载此文件。
补充图7：来自 巴西奈瑟菌 感染肠道表达ILC2细胞的IL-9的流式细胞术分析。 感染后第7天从IL-9报告小鼠肠道中分离的ILC2细胞的代表性图。在从感染报告小鼠（IL-9 REP）的上皮内或固有层区室新鲜分离的ILC2细胞中评估IL-9表达，并遵循先前描述的IL-9细胞内染色方案9 （IL-9 AB，使用IL-9抗体克隆RM9A4，BioLegend）。为了鉴定表达IL-9的ILC2，首先将单细胞悬液与生物素标记的抗体一起孵育以选择谱系细胞（抗B220，抗CD11b，抗FcεRI，抗TCR-β，抗TCR-γδ，抗Siglec F，抗CD4，抗CD11c，抗Gr-1，抗CD8，抗CD19，抗NK1.1和抗Ter119）和Fc-Block，然后用柔性活性染料，荧光染料标记的链霉亲和素，抗CD45和抗CD90染色。该图显示了表达IL-9的ILC2细胞在上皮内（A，B）和固有层（C，D）区室中存在的lin-CD45 + CD90 +群体上设门，通过来自新鲜分离细胞（A，C）的报告信号或在IL-9（B，D）的细胞内染色后检测到。对照小鼠注射PBS。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
要全面了解肠道寄生虫-宿主相互作用和对蠕虫感染的免疫反应，需要鉴定和分析不同的细胞群和效应分子，这些细胞群和效应分子是诱导组织重塑和蠕虫排出的关键。土壤传播的蠕虫感染是全世界发展中国家的一个大问题。然而，直到最近，还没有允许分析受这种感染影响的主要器官小肠中存在的稀有细胞群的方案5。该协议涵盖了先前描述的方法，这些方法允许在 巴西奈瑟菌 感染期间对肺，纵隔和肠系膜淋巴结中表达IL-9的淋巴细胞进行流式细胞术分析，并具有首次在小肠中鉴定该群体的额外优势。
该方案的成功在很大程度上取决于组织处理时间。每人必须一次最多处理六个小肠样本。如果要处理不同的器官，我们建议由另一个人同时完成。通过使用相对较低的寄生虫负荷（200 L3幼虫），该协议允许从 巴西奈瑟菌感染的肠道中分离淋巴细胞，同时保持将这些细胞与其他器官分离的能力。使用较高的寄生虫负荷会危及从小肠分离的细胞的质量和数量（数据未显示）;然而，它可能导致其他器官中表达IL-9的淋巴细胞显着增加4。在处理肠道和肠系膜淋巴结时，去除粘附的脂肪组织至关重要，因为否则会导致细胞死亡增加。数据支持这样的观察，即感染的自然过程会对从小肠回收的淋巴细胞的绝对数量产生负面影响。在这里描述的研究中，IL-9 + ILC2细胞的频率保持一致，而绝对数字在每个独立实验中显示出高度的变异性。因此，从绝对数字得出的结论可能不准确，应避免。此外，鉴于组织中表达IL-9的T细胞的频率较低，建议采集和染色尽可能多的细胞。
这种ILC2分析的一个局限性是使用标记的离散组合来定义该人群。根据感兴趣的组织和感染的阶段，额外的标志物，如CD25，Klrg1和ST2等，可用于ILC2细胞的更详细的表型表征22。我们承认，这里提出的方案是基于FER报告小鼠品系4的，并且可能代表鉴定表达IL-9的细胞的优势。然而，我们期望这里发现的结果可以使用替代策略获得，包括使用其他小鼠报告株和细胞内IL-9染色6，7，8，9。值得一提的是，使用常规小鼠并在上皮内和固有层细胞中对IL-9进行细胞内染色可能导致丢失任何可检测信号并损害获得的数据（补充图7）。这可能是由于对已经难以体外分离和维持的子集进行染色所需的长期操作。因此，我们建议使用报告小鼠品系以减少处理时间并确保对体内IL-9表达进行可靠分析。我们也承认Th9细胞并不是唯一表达IL-923的T细胞;但是，在这个寄生模型中，我们不希望其他子集来表达它。然而，为了在所描述的上下文中丢弃其他表达IL-9的亚群的存在，对2型细胞因子进行完整表征以及使用转录标记物是可行的。
先前已有报道在感染后第 5 天之前对表达 IL-9 的淋巴样细胞进行定量;然而，它导致非常低的单元频率4。本研究中的方案涵盖了 巴西猪笼草 感染动力学的很大一部分，直到寄生虫清除开始2。然而，我们注意到本研究中的一些细胞群在分析的时间范围内没有恢复到基础水平，这表明该研究可以从延长的时间点中受益，以全面了解这些细胞在 体内感染更晚期的行为。无论如何，我们相信这里介绍的工作可以作为有兴趣研究寄生虫感染模型中表达IL-9的淋巴细胞的研究人员的参考指南，使他们能够选择理想的感染阶段来检测感兴趣的组织中的特定细胞类型。总之，这里描述的方法将有助于评估在生理相关的寄生虫感染模型中表达IL-9的T淋巴细胞和ILC2细胞的表型和功能，拓宽我们对这些细胞的了解，并可能提高我们对它们在其他病理条件下的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢何塞·路易斯·拉莫斯-巴尔德拉斯的技术支持。这项工作得到了CONACYT（FORDECYT-PRONACE-303027）对PLL的以下资助的支持。OM-P和EO-M获得了CONACYT的研究金（分别为736162和481437）。MCM-M 获得了 CONACYT 的奖学金（墨西哥 2022 年 （3））。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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