Summary
Denne artikel beskriver en modificeret teknik til heterotopisk vaskulariseret hjertetransplantation med opdateret aseptisk teknik, analgesi og anæstesi.
Abstract
Udviklingen af eksperimentelle modeller for hjertetransplantation hos dyr har bidraget til mange fremskridt inden for immunologi og fast organtransplantation. Mens den heterotopiske vaskulariserede murin hjertetransplantationsmodel oprindeligt blev brugt i undersøgelser af transplantatafvisning ved hjælp af kombinationer af uoverensstemmende indavlede musestammer, kan adgang til genetisk modificerede stammer og terapeutiske modaliteter give kraftfuld ny præklinisk indsigt. Grundlæggende har den kirurgiske metode til denne teknik ikke ændret sig siden dens udvikling, især med hensyn til vigtige faktorer som aseptisk teknik, anæstesi og analgesi, som har væsentlig indflydelse på postkirurgisk sygelighed og dødelighed. Derudover forventes forbedringer i perioperativ forvaltning at give forbedringer i både dyrevelfærd og forsøgsresultater. Dette papir rapporterer om en protokol udviklet i samarbejde med en fagekspert i veterinærbedøvelse og beskriver den kirurgiske teknik med vægt på perioperativ styring. Derudover diskuterer vi konsekvenserne af disse forbedringer og giver detaljer om fejlfinding af kritiske kirurgiske trin til denne procedure.
Introduction
Vi skylder meget af vores forståelse af immunologi og transplantation forskning baseret på eksperimentelle modeller for fast organtransplantation ved hjælp af dyreforsøgspersoner. Siden den første beskrivelse af vaskulariseret hjertetransplantation hos pattedyr1 har sådanne modeller bidraget til viden inden for vidtrækkende domæner, herunder terapeutisk anvendelse af hypotermi2, fordelene ved at anvende specialiserede suturer3 og teknikker til total lunge- og hjertetransplantation4. Udviklingen af hjertetransplantationsmodeller i rotter 5,6 gav bredere muligheder for immunologiske eksperimenter på grund af tilgængeligheden af forskellige avlslinjer. Det betydeligt bredere udvalg af tilgængelige indavlede og mutante musestammer førte Corry et al.7 til at udvikle en teknik til murin heterotopisk hjertetransplantation på grund af de betydelige fordele, som dette interval bringer til transplantationsforskning. Denne model er blevet brugt bredt og har bidraget til en større forståelse af transplantatafvisning8 og terapi9. Siden den første beskrivelse er teknikken imidlertid stort set forblevet uændret bortset fra nogle mindre tekniske detaljer såsom justeringer af placeringen af anastomotiske steder10,11.
Siden integrationen af teknikken Corry et al.7 i vores eksperimenter har vi identificeret områder, der lover godt for at forbedre protokollen, nemlig aseptisk teknik, anæstesi og analgesi. Forbedringer på disse områder forventedes at have en positiv indvirkning på forsøgsresultaterne og forbedre dyrevelfærden. Dette er tidligere blevet vist, når aseptisk teknik anvendes i små dyreoperationer, da det hjælper med at reducere postoperative infektioner12, hvilket ikke kun påvirker sygelighed og dødelighed, men også kan kompromittere eksperimenter designet til at vurdere immunresponset efter transplantationskirurgi. Fra et anæstesi og smertestillende synspunkt hjælper brugen af et raffineret regime med at reducere omkostningerne for dyr og afbalancere det etiske argument i denne kirurgiske model ved at afbøde smerte og lidelse hos forsøgspersoner. Endvidere begrænser passende anæstesi og analgesi det smerteassocierede stressrespons, forbedrer kvaliteten af postoperativ genopretning og i sidste ende øger den kirurgiske succesrate13.
Med det formål at forbedre både dyrevelfærd og forsøgsresultater blev der udviklet en protokol med justeringer for at bygge bro over disse huller. Denne protokol er blevet tilpasset fra den, der oprindeligt blev beskrevet af Corry et al.7 med konsultation fra en veterinæranæstesilæge og under behørig hensyntagen til både virkningerne og varigheden af virkningerne af de farmakologiske interventioner, der anvendes i anæstesi- og smertestillende regime. Tilgangen var baseret på principperne om afbalanceret anæstesi og multimodal analgesi for at sikre passende perioperativ pleje14. Ud over anvendelsen af aseptisk teknik blev opioidet buprenorphin og lokalbedøvelsesmidlet bupivacain administreret forebyggende. Generel anæstesi blev udført under anvendelse af inhalationsbedøvelsesmidlet isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning blev udført i overensstemmelse med Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purpose15 og godkendt i henhold til Animal Ethics Protocols RA/3/100/1568 og AE173 (henholdsvis University of Western Australia Animal Ethics Committee og Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee). Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og dyr, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af dyret til operation
BEMÆRK: Personalet er dedikeret til enten rollen som at udføre kirurgi eller overvåge anæstesi gennem hele proceduren.
- Ved præoperativ analgesi administreres en dosis buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, fortyndet til 0,03 mg/ml med natriumchlorid 0,9%) subkutant til modtagermusen mindst 1 time før initiering af recipientoperation. Indtast alle detaljer relateret til administration af lægemidler, deres dosis, administrationstidspunktet og deres virkninger i anæstesijournalen.
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde er ikke nødvendigvis nødvendig for donoren, da det er en ikke-genopretningsoperation, hvor donoren aflives under generel bedøvelse umiddelbart efter høst af organet. - Induktion af anæstesi
- Placer musen i induktionskammeret i det anæstetiske åndedrætssystem med en iltstrøm på 1-2 L·min-1 med 4% isofluran. Bekræft tilstrækkelig anæstesi ved at observere liggende, tab af den oprettende refleks og nedsat respirationsfrekvens.
- Når den er tilstrækkeligt bedøvet, skal du fjerne musen fra induktionskammeret og barbere den ventrale mave tæt ved hjælp af klippere for at fjerne hår. I tilfælde af donoren barberes området, der strækker sig fra kønsorganerne til den øvre margen af den ventrale thorax. I tilfælde af modtageren skal du barbere området, der strækker sig fra kønsorganerne til kystmargenen. I begge tilfælde skal du sikre dig, at det barberede område når den midaxillære linje sideværts.
- For at opretholde anæstesi skal du placere musen i dorsal liggende stilling for at modtage bedøvelse og ilt fra næsekeglen i åndedrætssystemet (ikke-genindånding), som leverer ilt med en hastighed på 1 L · min-1 og isofluran (1,5% - 2,5%).
BEMÆRK: Den kirurgiske arbejdsflade er et kirurgisk bord over en varmepude, og hver lem af musen er sikret ved hjælp af mikroporetape. - I betragtning af vanskeligheden ved omfattende overvågning af de fysiologiske ændringer forbundet med anæstesi hos mus, overvåge og registrere begrænsede parametre. Overvåg temperaturen, dybden af anæstesi og respirationsfrekvensen mindst hvert 5. minut i anæstesiens varighed.
- For at forhindre alvorlig hypotermi og hypertermi (fra aktiv opvarmning af varmepuden) skal du overvåge kropstemperaturen under hele proceduren. Indsæt en ren, smurt rektal sonde i dyrets endetarm og fastgør den derefter til operationspladen ved hjælp af mikroporetape.
BEMÆRK: Denne sonde føder tilbage til et dynamisk system (en funktion i bedøvelsesleveringssystemet), som ændrer varmepudens temperatur for at styre kropstemperaturen. - Få den person, der er ansvarlig for anæstesi, til at vurdere bedøvelsesdybden ved at observere reaktioner på stimulering af poten eller halen fra tryk påført af atraumatiske tang, palpebralrefleksen og muskeltonen.
- Mål respirationsfrekvensen ved at observere bevægelse af brystvæggen, mens du observerer åndedrætsindsatsen subjektivt for at vurdere tidevandsvolumen. Beregn respirationsfrekvensen ved at tælle vejrtrækninger over en periode på 10-15 s og gange med henholdsvis 6 eller 4 for at bestemme en vejrtrækning / min.
- For at forhindre alvorlig hypotermi og hypertermi (fra aktiv opvarmning af varmepuden) skal du overvåge kropstemperaturen under hele proceduren. Indsæt en ren, smurt rektal sonde i dyrets endetarm og fastgør den derefter til operationspladen ved hjælp af mikroporetape.
- For at forberede huden skal du desinficere det kirurgiske sted ved hjælp af sterile applikatorer med bomuldsspids. Påfør chlorhexidin i en cirkulær, ekspanderende bevægelse, der arbejder fra midten af det kirurgiske sted til kanterne. Gentag denne proces 3x (med en ny applikator med bomuldsspids hver gang) før en endelig påføring af en kombination af chlorhexidin og ethanol med en ny steril applikator med bomuldsspids i samme mønster, der bevæger sig fra midten af det kirurgiske sted til kanten.
- Få kirurgen til at anvende en ethanolbaseret håndgel, inden du ifører dig en steril operationskjole og sterile kirurgiske handsker.
- For at forberede det kirurgiske felt skal du placere sterile kirurgiske gardiner (forskåret til 25 cm x 25 cm) på hver side af operationsbrættet, der tjener som stedet for at placere sterile instrumenter. Brug steril saks til at fenestrate en bredere 25 cm x 40 cm steril drapering til at skære en lille (lidt længere end snitstedet), ovalformet åbning. Læg denne drapering over toppen af dyret, således at fenestrationen er placeret på det foreslåede snitsted. Sørg for, at de laterale ender af denne tredje drapering overlapper de to mindre gardiner på hver side for at skabe et kontinuerligt kirurgisk felt.
2. Donorkirurgi
BEMÆRK: Se supplerende figur S1 for de vigtigste aspekter af donorkirurgi.
- Udfør donoroperationen ved hjælp af et kirurgisk kikkertmikroskop. Til at begynde med skal du bruge en forstørrelse på 8x og udføre et ventralt midterlinjehudsnit ved hjælp af et kirurgisk skalpelblad (# 23). Sørg for, at snittet spænder fra den kaudale ende af det barberede område til kystmargenen med en intakt margen af forberedt hud i begge ender.
BEMÆRK: Startforstørrelsen på 8x er valgt for at muliggøre tilstrækkelig visualisering af forsøgspersonens makrostruktur i begyndelsen af operationen. Fra dette tidspunkt er forstørrelse efter operatørens skøn og bør vælges for at give en passende balance mellem situationsbevidstheden ved lavere forstørrelse og de fine detaljer, der kan visualiseres med højere forstørrelse. - Brug to sterile bomuldsspidsede applikatorer fugtet med opvarmet normalt saltvand til at skifte tyndtarmen for at udsætte abdominal aorta og ringere vena cava (IVC). Brug applikatorerne til direkte at dissekere disse kar fra det omgivende væv.
- Brug en 3,0 ml sprøjte med en 30 G, 0,5 i kanyle til at trække 2,5 ml 100 IE · ml-1 hepariniseret natriumchlorid 0,9% opløsning (opretholdt ved 4 ° C, indtil det kræves under operationen). Brug lige spids, rund kropssuturtang med den ikke-dominerende hånd til at sikre abdominal aorta i det infra-membranmatiske område, brug den dominerende hånd til at injicere 1,5 ml opløsning i aorta i retning af hjertet. Forsegl den resulterende aortotomi med tryk fra en applikator med bomuldsspids.
- Brug mikrokirurgisk saks med lige spids til at transektere IVC for at tillade ekssanguination.
- Udfør en thoracotomi ved hjælp af kirurgisk saks for at lave to snit i de bilaterale midaxillære linjer. På dette tidspunkt skal du bekræfte dyrets død og slukke for isofluranfordamperen.
- Fastgør det resulterende mediansegment af brystvæggen ved hjælp af en mikro-bulldog-klemme. Send dette til den ikke-sterile kirurgiske assistent, der kan fastgøre dette til næsekeglen ved hjælp af mikroporekirurgisk tape.
BEMÆRK: Målet er at give trækkraft på dette segment af thorax, som hjælper med eksponering af hjertevævet. - Brug rund kropssuturtang til at identificere og mobilisere den intra-thoracale IVC.
BEMÆRK: Ideelt set bør de lige spidsede tang være i den ikke-dominerende hånd og den buede tang i den dominerende hånd. - Med IVC fastgjort i den ikke-dominerende hånds tang, brug den dominerende hånd til at injicere de resterende 1,5 ml 100 IE · ml-1 hepariniseret natriumchlorid 0,9% opløsning i hjertet.
- Brug begge sæt tang til at ligere IVC ved hjælp af 7/0 flettet silke med en længde på 2 cm. Brug et instrument binde kirurgens knude med to ekstra kast for sikkerhed. Gør denne knude så proksimal langs karret til hjertet som muligt.
- Fastgør de to ender af denne knude ved hjælp af arteriepincet. Placer disse tang, så de giver blid trækkraft i hjertet i kaudale retning for at lette optimal karpositionering til efterfølgende dissektion.
- Identificer thymus på det anterosuperior aspekt af hjertet. Brug tang til at dissekere dette organ fra donoren for at identificere den overlegne vena cava (SVC).
- Fjern adventitia og tilhørende væv i SVC ved hjælp af tang. Brug buede tang til stump dissekering og lav en lille kanal bagved fartøjet. Sørg for, at denne kanal er så proksimal til hjertet som muligt.
- Før et stykke 7/0 flettet silke på 2 cm længde gennem denne kanal ved hjælp af tang og bind det derefter ved hjælp af ovennævnte teknik.
- På et punkt ca. 2 mm fra denne ligering (på den modsatte side af hjertet) deles SVC ved hjælp af buet mikrokirurgisk saks.
- Brug applikatorer med bomuldsspids til at vende hjertet til den anatomiske højre.
- Identificer den azygote vene på den anatomiske venstre side af hjertet. Brug tang, dissekere det direkte fra omgivende strukturer. Som før skal du bruge buede spidstang til at skabe en lille kanal bagved dette fartøj.
- Brug et tredje stykke 7/0 flettet silke skåret til 2 cm for at ligere den azygote vene i maksimal nærhed til hjertet ved hjælp af den samme knudebindingsteknik. Skær beholderen 2 mm fra ligeringen på siden væk fra hjertet.
- Brug applikatorer med bomuldsspids til at vende hjertets spids tilbage til den anatomiske venstre. Brug tang til at identificere og mobilisere den stigende aorta. Før den buede tang under aortabuen for at skabe en kanal mellem den stigende og faldende aorta.
- Brug lige spids mikrokirurgisk saks til at transektere aortabuen proksimal til dens grene.
- Brug tang til at identificere og mobilisere lungearterien. Brug buede tang til at lave en kanal bagved til fartøjet.
- Brug lige spids mikrokirurgisk saks til at transektere arterien på et punkt, der bare er proksimalt til dets bifurcation.
- Brug en Rycroft vandingskanyle til forsigtigt at injicere 2 ml 10 IE · ml-1 hepariniseret natriumchlorid 0,9% gennem lungearterien og stigende aorta for at skylle eventuelt resterende blod fra hjertet.
BEMÆRK: En passende skylning indikeres ved clearance af synligt blod fra koronarbeholderne. - Brug et 3 cm stykke 7/0 flettet silke til at ligere de resterende bageste kar (lungevenerne) en bloc ved hjælp af en kirurgknude med to efterfølgende kast. Adskil hjertet fra den bageste thoraxvæg ved omhyggeligt at skære ved hjælp af kirurgisk saks.
- Fjern forsigtigt hjertet fra brystkassen, nedsænk det i University of Wisconsin Solution (UWS), og læg det derefter på is til opbevaring (ved 4 ° C).
3. Modtager kirurgi
- Efter tilberedning af dyret som beskrevet i punkt 1 påføres øjensmøremiddel. Injicer en vægtbaseret dosis (8 mg/kg) bupivacain (0,25% fortyndet til 0,625 mg/ml i natriumchlorid 0,9% opløsning) i det subkutane væv i ventral abdomen langs det planlagte snitsted. Brug en 29 G insulinsprøjte til denne injektion og se efter en lige linje med synlig blæsning, der dækker omfanget af det planlagte snit (supplerende figur S2A-C).
BEMÆRK: Der skal gives fem-syv minutter for at give tid til maksimal effekt af lokalbedøvelsen. - Med mikroskopet indstillet til 8x forstørrelse, lav et ventralt midterlinie hudsnit ved hjælp af et sterilt kirurgisk skalpelblad (# 23). Sørg for, at laparotomien spænder fra underlivet til kystmargenen. Indsæt en retraktor for at maksimere det kirurgiske felt (supplerende figur S2D).
- Fugt et 5 cm x 5 cm segment af sterilt gaze med opvarmet 0,9% natriumchloridopløsning og placer det på det overlegne aspekt af det kirurgiske sted. Brug fugtede sterile bomuldssnopper forsigtigt til at udtage tarmene, placere dem oven på denne gasbind og vikle gasbindet rundt om organet (supplerende figur S3A).
BEMÆRK: Denne procedure hjælper med at reducere ufølsomt væsketab under operationen og hjælper med tilbagetrækning. - Befri og mobiliser abdominal aorta og IVC fra omgivende væv ved hjælp af en stump dissektionsteknik. Brug en kombination af applikatorer med bomuldsspids og suturpincet med rund krop til dette trin. Sørg for, at frirumsområdet er mellem karrenes infrarenale aspekt og lige over forgreningen af aorta (supplerende figur S3B).
BEMÆRK: Passende visualisering på dette tidspunkt vil lette vaskulære anastomoser af høj kvalitet. - Identificer de bageste abdominale kar. Brug tang til forsigtigt at trække aorta i en retning væk fra rygsøjlen (dvs. langsgående til abdominalkarens akse).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at kun aorta og ikke IVC håndteres på en sådan måde på grund af sidstnævntes sprødhed. - Ligate hvert abdominalfartøj identificeret i den planlagte anastomotiske zone. Lav en kanal på hver side af disse kar cephalocaudally ved at føre de buede tang bagtil abdominale kar på begge sider. Ligate hvert fartøj identificeret og mobiliseret på denne måde ved hjælp af længder på 10/0 nylon bundet med instrumenter i kirurgens knuder med et ekstra kast (supplerende figur S3C).
- Isoler det anastomotiske sted fra omløb. For at gøre det skal du installere en kirurgisk klemme både ved hovedet og derefter de kaudale ender af abdominalkarrene (vigtigere i den præcise rækkefølge). Sørg for, at klemmerne krydser begge kar i tilstrækkelig grad til at sikre fuldstændig okklusion.
- Brug tang i den ikke-dominerende hånd til at stabilisere aorta, udfør en aortotomi ved hjælp af en 30 G nål på det forreste aspekt af aorta. Forlæng den ved hjælp af mikrokirurgisk saks med lige spids (supplerende figur S3D).
- Udfør en venotomi. Brug lige tang til at anvende blid forreste trækkraft på IVC på det punkt, der er på linje med midten af aortotomien. Brug buet mikrokirurgisk saks med den konkave side vendt anteriort for at fjerne et segment af IVC af samme længde som aortotomi (supplerende figur S4A).
- Brug 10 IE · ml-1 hepariniseret natriumchloridopløsning til at vaske det indre af de åbne kar med resterende blod.
- Placer donorhjertet i maven. Sørg for, at positioneringen er sådan, at den stigende aorta er direkte ved siden af abdominal aortotomi, og hjertet roteres, så lungearterien kan trækkes på tværs for den anden anastomose.
- Brug 10/0 nylon til at placere en opholdssutur mellem aortotomiens position klokken 12 og den tilsvarende ekstremitet af lumen i den stigende aorta. Udfør dette ved hjælp af lige spidser og en mikrokirurgisk nåleholder og bind den ved hjælp af en kirurgknude med tre efterfølgende kast. Skær enderne for at efterlade ca. 2 mm sutur.
- Placer en anden opholdssutur mellem aortotomiens 6-position og det tilsvarende aspekt af den stigende aorta. Da denne sutur også vil tjene som base for efterfølgende løbende suturer, skal du efterlade mindst 10 mm af halen til den ultimative fastgørelse.
- Anbring en kontinuerlig løbende sutur af 10/0 nylon på en stigende måde for at modsætte sig den anatomiske højre kant af aortotomien og den tilsvarende frie kant af den stigende aorta. Brug cirka fire kast til denne linje.
- Før den frie ende af suturen rundt om den distale opholdssutur, inden du placerer en anden kontinuerlig løbende sutur ned ad den anatomiske venstre side for at påvirke appositionen med den resterende frie kant af aortotomien. Bind suturen til halen ved hjælp af en kirurgknude med to ekstra kast.
- Placer en opholdssutur mellem IVC-venotomiens position kl. 12 og den tilsvarende ekstremitet af lungearteriens lumen.
- Fra dette ankerpunkt placeres en kontinuerlig løbende sutur på en faldende måde mellem den anatomiske venstre kant af lungearterien og den tilsvarende kant af venotomien. Brug i gennemsnit fire kast til denne linje efterfulgt af et mellem venotomiens 6-position og den tilsvarende ekstremitet af lungearteriens lumen. Lav yderligere fire kast for at trække de sidste frie kanter af lungearterien og venotomien sammen.
- Bind den frie ende af suturen til ankerenden ved hjælp af et instrument, bind kirurgens knude med to ekstra kast.
- Flyt hjertet til at sidde centralt i maven ved hjælp af vatpinde. Kontroller karrene for vridning, hvilket ville forstyrre blodgennemstrømningen.
- Placer gelskum over alle suturlinjerne (supplerende figur S4B). Der anbringes og formes to stykker på ca. 2 mm hver omkring dem, således at alle synlige suturlinjer er dækket.
- Slip de vaskulære klemmer: først den kaudale klemme og derefter cephalo-klemmen. Da en lille blødning kan forventes, skal du forebyggende placere bomuldsspidsapplikatorer over de anastomotiske steder for at give tryk.
- Når det er fri for observerbare lækager, skal du vurdere hjertet for pulsering (supplerende figur S4C). Hvis dette ikke sker, skal du kontrollere, at der ikke er sket vridning af hjertekarrene (især for IVC).
- Flyt tarmene nu over og omkring hjertet. Hvis det forekommer tørt, fugt peritonealhulen ved hjælp af opvarmet natriumchloridopløsning.
- Luk bukhulen ved hjælp af ikke-absorberbart 6/0 prolenmonofilament med lag:
først muskellaget og derefter huden (supplerende figur S4D). Brug den kontinuerlige, ikke-afbrudte teknik. - Fjern forsigtigt modtageren fra operationspladen og tag den af bedøvelsesmidlet.
- Administrer 1 ml varmt saltvand subkutant og anbring modtageren i et forberedt bur med opvarmning til observation i henhold til postoperative restitutionsprotokoller (supplerende figur S4E).
4. Postoperativ pleje
- Umiddelbart efter operationen placeres modtageren i et rent bur på en varmepude under nøje observation i mindst 3 timer. I løbet af denne periode skal du overvåge forskellige parametre (aktivitet, kropsholdning, pelstilstand, ansigtsudtryk, gang, ventilation, udseende af det kirurgiske sted, tilstedeværelse af et håndgribeligt abdominalt hjerteslag) mindst hvert 30. minut. Tildel en score til hver parameter (0 = normal, 1 = lidt eller intermitterende unormal, 2 = moderat eller konsekvent unormal).
BEMÆRK: Interventioner udløses af summen af de overvågede parametre, der overstiger velfærdsscorer, der er specificeret i den etiske protokol relateret til denne model. - Flyt modtagerne til et opvarmet skab, der opbevares ved 25 °C, hvor de forbliver indtil dag 7 efter operationen. I løbet af de første 3 dage skal du overvåge dem mindst 2x dagligt. I løbet af de resterende 4 dage skal du overvåge dem mindst 1x dagligt. Ved postoperativ analgesi administreres en dosis buprenorphin (0,5-0,1 mg/kg, fortyndet til 0,03 mg/ml med natriumchlorid 0,9%) subkutant til modtagermusen om aftenen efter operationen og to gange dagligt i de næste 3 postoperative dage.
- Når modtagerne er taget ud af det opvarmede kabinet, skal de overvåges mindst 2x ugentligt indtil det relevante eksperimentelle endepunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme effektiviteten af den kirurgiske teknik til at fremme gode resultater af sårheling og musegenopretning bestemte tidlige eksperimenter i laboratoriet overlevelseskarakteristika for en række hjertetransplantater med variabel immunogenicitet til modtageren. Disse omfattede kongene (n = 5) og syngeneiske (n = 5) transplantater, som deler de samme større histokompatibilitetskompleksmarkører (MHC) som modtageren, og større uoverensstemmelsestransplantater (n = 9), hvor transplantatet og modtageren har forskellige MHC-markører. Vi brugte direkte palpation af det heterotopiske abdominale hjerteslag til at vurdere igangværende transplantatfunktion og levedygtighed, hvilket tjener som en proxymarkør for afvisning versus tolerance.
I begge kontrolgrupper var alle transplantater levedygtige ved forsøgstidens endepunkt på 100 dage (gennemsnit udefineret). Den uoverensstemmende gruppe havde en gennemsnitlig overlevelsestid på 9 dage. Figur 1 viser Kaplan-Meier-overlevelseskurver, der viser den skarpe kontrast i transplantatoverlevelse mellem uoverensstemmende og kontrolhjertetransplantater16. Disse data tyder på, at teknikken er tilstrækkelig til at fremme et passende helbredende respons efter proceduren. I nærvær af patologisk inflammation, i dette tilfælde repræsenteret ved transplantatafvisning i mismatchtilstanden, fører vævsødelæggelse til hurtigt tab af funktion.
Figur 1: Indflydelsen af mismatch på overlevelsen af ortopiske hjertetransplantationer. Overlevelseskurver, der illustrerer fuld helbredelse og accept af syngeneiske (n = 5) og kongene (n = 5) heterotopiske murinhjertetransplantationer i mindst 100 dage efter operationen i modsætning til den hurtige afvisning af større uoverensstemmende (n = 7) heterotopiske murinhjertetransplantationer fra så tidligt som dag 7 efter operationen. Disse data blev offentliggjort i Prosser et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Kirurgi fase | Kold iskæmi tid | Varm iskæmi tid |
| Donor | 13 – 15 min | |
| Opbevaring 4 °C | 20- 25 min | |
| Modtager | 22 – 25 min |
Tabel 1: Interval af varme og kolde iskæmitider for donor- og modtageroperationer forbundet med den ortopiske hjertetransplantation.
Supplerende figur S1: Nøgleaspekter af donorkirurgi. a) isofluranbedøvelse B) injektion af heparin C) eksponeret donorhjerte (D) skylning af hjertet med hepariniseret saltvand; E) binding af fartøjet F) donorhjerte til opbevaring af kold iskæmi. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Nøgleaspekter af modtagerkirurgi-forberedelse og cauterization af skårne blodkar. A) Recipientkirurgisk forberedelse B) injektion af bupivacain C) steril kirurgisk drapering af det kirurgiske sted (D) cauterization af de afskårne hudkar. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Nøgleaspekter af modtagerkirurgi - fra omplacering af tarmene til aortotomi. (A) Midlertidig omplacering af tarmene; B) ringere vena cava eksponeret og fastspændt C) anbringelse af opholdssuturen D) første fase: aortotomi. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: Nøgleaspekter af modtagerkirurgi - fra venotomi til genopretning. A) Anden fase: venotomi B) anbringelse af gelskummet C) reperfusion D) kirurgisk lukning E) nyttiggørelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murinortotopiske hjertetransplantationsmodel er en robust præklinisk model, der primært anvendes til at undersøge virkningerne af MHC-mismatch på niveauet og arten af immunologisk afstødning og for nylig effekten af transplantation på tilbageholdelsen af transplantatvævsresident immunitet16. Mens vi oprindeligt nøje fulgte Corry et al.7-protokollen , har vi raffineret protokollen til at inkorporere bedste praksisstandarder for aseptisk teknik, analgesi og anæstesi. Opdateringen af denne nye praksis blev opnået via yderligere træning, levering af sterile kirurgiske handsker, kitler og kirurgiske gardiner, anvendelse af yderligere anæstesi og opdatering af doseringen af analgesi. Sådanne ændringer førte til en lille stigning i kirurgisk opsætningstid og ekstra omkostninger pr. Operation.
Brug af dyr til at løse vigtige forskningsproblemer er tilladt i henhold til en kontrakt mellem forskere og en dyreetisk komité (AEC) om at opretholde en social licens til at udføre sådant arbejde. Beslutninger truffet af et AEC er baseret på klare etiske retningslinjer15 med et overordnet princip om at afveje omkostningerne for dyret mod fordelene for samfundet. Konceptet med de tre R'er (reduktion, udskiftning og forfining) er afgørende for at adressere, hvordan omkostningerne ved et projekt afbødes.
Minimering af skaden på de involverede dyr ved vedtagelse af artspassende, perioperativ analgesi og anæstesi har en uerstattelig rolle i dyremodeller for kirurgi og er et eksempel på forfining. Derudover har pleje og teknikker, der reducerer risikoen for miljømæssige og adfærdsmæssige infektionsvektorer for den kirurgiske modtager, positive konsekvenser for både at reducere skaden på dyret med hensyn til sygelighed og dødelighed og hjælpe med at minimere de økonomiske omkostninger forbundet med gentagne mislykkede operationer. Selvom renheden af forsøgsdyrets "operationsstue" ikke nærmer sig en hospitalsækvivalent, bør det ikke være en eftertanke i sådant arbejde.
Fra et videnskabeligt perspektiv påvirker postoperative infektioner nødvendigvis profilen af inflammatoriske cytokiner og immunceller, som er de typiske aflæsninger for eksperimenter, der vurderer transplantationsgenopretning eller afstødning. Der bør derfor gøres en maksimal indsats for at kontrollere postoperativ infektion i betragtning af den negative indvirkning, dette kan have på forskningens validitet. Fokus på analgesi er vigtigt ud fra et dyrevelfærdssynspunkt. Dyretransplantationsoperationer er vigtige procedurer, og der bør gøres en stor indsats for at reducere unødig smerte og lidelse hos forsøgspersonerne. For at vende tilbage til de praktiske resultater af dette fokus er en yderligere praktisk fordel ved effektiv smertekontrol den reducerede sandsynlighed for, at dyr fjernes fra forsøgsprotokollen på grund af smerterelaterede tegn på nød.
Siden denne procedure først blev beskrevet, har flere forfattere rapporteret fejlfinding af almindelige problemer, der opstår under proceduren10,11. Kontrollen af blødning efter frigivelse af klemmerne er velbeskrevet og afspejler teknikker, der anvendes i menneskelige operationer, nemlig brugen af tryk på blødningsstedet, yderligere suturering og hæmostatiske midler. Vi har bemærket, at blødning ofte opstår fra et af to hovedsteder: anastomosestederne eller beskadigelse af myokardiet. Tilgange til at standse blødning fra hjertet er blevet rapporteret af Niimi10, der kontrollerede blødning fra hjertet gennem ligering af atrium. Efter vores erfaring er stammen af blodgennemstrømning fra selve myokardiet usædvanligt udfordrende på grund af dets rige vaskularisering.
Der skal derfor udvises behørig omhu for at undgå en sådan skade, som oftest skyldes en ukontrolleret pincetspids, der kommer i kontakt med hjertemusklen under operationen. Vi søger derfor kun at komme i direkte kontakt med hjertemusklen ved hjælp af fugtede applikatorer med bomuldsspids. For at reducere direkte kontakt i manipulationen af hjertet kan de frie ender af den endelige silkeligering bruges til at bevæge hjertet, såsom når det flyttes fra UWS til brysthulen.
En anden stor udfordring er forebyggelsen af postoperativ lammelse af bagbenene, en komplikation, der kræver eutanasi. Anekdotisk har vi fundet ud af, at en varm iskæmisk tid på >30 min er forbundet med en højere risiko for, at denne lammelse opstår. Vores iskæmiske tider overvåges nøje og registreres som en uformel standard for ydeevne. Det skal dog bemærkes, at iskæmisk tid ikke synes at forudsige denne komplikation pålideligt. Niimi10, for eksempel, en kirurg med betydelig operativ erfaring (over 3.000 operationer), rapporterede, at iskæmiske tider på op til 2 timer er acceptable.
Måske endnu mere opsigtsvækkende end dette, Abbott et al.5, der udviklede en lignende teknik hos rotter, men brugte en ende-til-ende anastomotisk opsætning i maven (dvs. IVC og abdominal aorta blev ligeret permanent), rapporterede om to rotter, der blev holdt som langsigtede overlevende, der varede over 100 dage uden nogen tilsyneladende skadelige virkninger. Disse forskelle mellem grupper i resultater forklares måske af subtilt forskellige teknikker eller alternativt af de genetiske forskelle mellem forskellige stammer af mus. For eksempel bemærker vi, at Ly5.1-mus er meget mere modtagelige for denne komplikation end BALB / c-mus. For at forbedre klarheden om virkningerne af iskæmisk tid på forekomsten af lammelse af bagbenene kunne effekten af abdominalkarokklusionslængden undersøges.
Sammenfattende giver denne beskrevne protokol enkle forbedringer af etablerede teknikker ved hjælp af let tilgængelige lægemidler og materialer. Disse forbedringer tilpasser standarden, som denne kirurgiske model udføres til, til den kliniske veterinære standarder og gavner dyrene og i sidste ende forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den fremragende indsats fra dyreplejepersonalet ved University of Western Australia og Harry Perkins Institute of Medical Research, hvis engagement og ekspertise bidrog til gennemførligheden og succesen af disse operationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
