Summary
Denne artikkelen beskriver en modifisert teknikk for heterotopisk vaskularisert hjertetransplantasjon med oppdatert aseptisk teknikk, analgesi og anestesi.
Abstract
Utviklingen av eksperimentelle modeller for hjertetransplantasjon hos dyr har bidratt til mange fremskritt innen immunologi og solid organtransplantasjon. Mens den heterotopiske murine hjertetransplantasjonsmodellen opprinnelig ble brukt i studier av transplantatavstøtning ved bruk av kombinasjoner av feilmatchede innavlede musestammer, kan tilgang til genetisk modifiserte stammer og terapeutiske modaliteter gi kraftig ny preklinisk innsikt. I utgangspunktet har den kirurgiske metodikken for denne teknikken ikke endret seg siden utviklingen, spesielt med hensyn til viktige faktorer som aseptisk teknikk, anestesi og analgesi, som har materiell innvirkning på postkirurgisk sykelighet og dødelighet. I tillegg forventes forbedringer i perioperativ ledelse å gi forbedringer i både dyrevelferd og eksperimentelle resultater. Denne artikkelen rapporterer om en protokoll utviklet i samarbeid med en fagekspert i veterinær anestesi og beskriver kirurgisk teknikk med vekt på perioperativ ledelse. I tillegg diskuterer vi implikasjonene av disse forbedringene og gir detaljer om feilsøking av kritiske kirurgiske trinn for denne prosedyren.
Introduction
Vi skylder mye av vår forståelse av immunologi og transplantasjon til forskning basert på eksperimentelle modeller av solid organtransplantasjon ved hjelp av dyreforsøkspersoner. Siden den første beskrivelsen av vaskularisert hjertetransplantasjon hos pattedyr1 har slike modeller bidratt til kunnskap på vidtfavnende områder, inkludert terapeutisk anvendelse av hypotermi2, fordelene ved å bruke spesialiserte suturer3 og teknikker for total lunge- og hjertehomotransplantasjon4. Utviklingen av hjertetransplantasjonsmodeller hos rotter 5,6 ga bredere rom for immunologiske eksperimenter på grunn av tilgjengeligheten av forskjellige avlslinjer. Det betydelig bredere spekteret av tilgjengelige innavlede og mutante musestammer førte Corry et al.7 til å utvikle en teknikk for murine heterotopisk hjertetransplantasjon på grunn av de betydelige fordelene som dette området bringer til transplantasjonsforskning. Denne modellen har vært mye brukt og har bidratt til økt forståelse av transplantatavstøtning8 og terapeutikk9. Siden den første beskrivelsen har imidlertid teknikken stort sett vært uendret, bortsett fra noen mindre tekniske detaljer som justeringer av posisjonen til anastomotiske steder10,11.
Siden integreringen av teknikken til Corry et al.7 i våre eksperimenter, har vi identifisert løfteområder for å forbedre protokollen, nemlig aseptisk teknikk, anestesi og analgesi. Forbedringer på disse områdene ble forventet å gi en positiv innvirkning på eksperimentelle resultater og forbedre dyrevelferden. Dette har tidligere blitt vist når aseptisk teknikk brukes i smådyroperasjoner, da det hjelper til med reduksjon av postoperative infeksjoner12, som ikke bare påvirker sykelighet og dødelighet, men kan også kompromittere eksperimenter designet for å vurdere immunresponsen etter transplantasjonskirurgi. Fra et anestesi og smertestillende synspunkt bidrar bruken av et raffinert diett til å redusere kostnadene for dyr og balansere det etiske argumentet til denne kirurgiske modellen ved å redusere smerten og lidelsen til eksperimentelle. Videre begrenser passende anestesi og analgesi den smerteassosierte stressresponsen, forbedrer kvaliteten på postoperativ utvinning og til slutt øker den kirurgiske suksessraten13.
Med sikte på å forbedre både dyrevelferd og eksperimentelle resultater, ble det utviklet en protokoll med justeringer for å bygge bro over disse gapene. Denne protokollen er tilpasset fra det som opprinnelig ble beskrevet av Corry et al.7 med konsultasjon fra en veterinæranestesilege og med behørig hensyn til både effektene og varigheten av effektene av de farmakologiske inngrepene som brukes i anestesi- og smertestillende behandling. Tilnærmingen var basert på prinsippene om balansert anestesi og multimodal analgesi for å sikre forsvarlig perioperativ behandling14. I tillegg til aseptisk teknikk ble opioidet buprenorfin og lokalanestetikumet bupivakain gitt på forhånd. Narkose ble utført ved bruk av inhalasjonsanestesimiddelet isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen ble utført i samsvar med Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purpose15 og godkjent under Animal Ethics Protocols RA/3/100/1568 og AE173 (The University of Western Australia Animal Ethics Committee og The Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee, henholdsvis). Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og dyr som brukes i denne protokollen.
1. Forberedelse av dyret til kirurgi
MERK: Personell er dedikert til enten rollen med å utføre kirurgi eller overvåke anestesi gjennom hele prosedyren.
- Ved preoperativ analgesi, administrer en dose buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg, fortynnet til 0,03 mg/ml med natriumklorid 0,9 %) subkutant til mottakermusen minst 1 time før oppstart av mottakeroperasjon. Skriv inn alle detaljer relatert til administrasjon av legemidler, deres dose, tidspunktet for administrering og deres effekter i bedøvelsesposten.
MERK: Denne tilnærmingen er ikke nødvendigvis nødvendig for donoren, da det er en ikke-utvinningskirurgi, hvor donoren blir avlivet under generell bedøvelse umiddelbart etter høsting av orgelet. - Induksjon av anestesi
- Plasser musen i induksjonskammeret i bedøvelsespustesystemet med en oksygenstrøm på 1-2 L·min−1 med 4 % isofluran. Bekreft tilstrekkelig anestesi ved å observere hvile, tap av høyre refleks og redusert respirasjonsfrekvens.
- Når du er tilstrekkelig bedøvet, fjern musen fra induksjonskammeret og barber den ventrale magen tett ved hjelp av klippere for å fjerne hår. Når det gjelder donoren, barber området som strekker seg fra kjønnsorganene til den øvre marginen av ventral thorax. Når det gjelder mottakeren, barber du området som strekker seg fra kjønnsorganene til kystmarginen. I begge tilfeller må du sørge for at det barberte området når midtaksillorlinjen sideveis.
- For å opprettholde anestesi, plasser musen i dorsalleie for å motta bedøvelse og oksygen fra nesekjeglen i pustesystemet (ikke-rebreathing), som leverer oksygen med en hastighet på 1 L·min−1 og isofluran (1,5%-2,5%).
MERK: Den kirurgiske arbeidsflaten er et kirurgisk bord over en varmepute, og hver lem av musen er sikret ved hjelp av mikroporetape. - Gitt vanskeligheten med omfattende overvåking av de fysiologiske endringene forbundet med anestesi hos mus, overvåker og registrerer begrensede parametere. Overvåk temperaturen, dybden av anestesi og respirasjonsfrekvens minst hvert 5. minutt i løpet av anestesien.
- For å forhindre alvorlig hypotermi og hypertermi (fra aktiv oppvarming av varmeputen), må du overvåke kroppstemperaturen gjennom hele prosedyren. Sett inn en ren, smurt rektal sonde i endetarmen til dyret og fest den deretter til operasjonsbordet ved hjelp av mikroporebånd.
MERK: Denne sonden strømmer tilbake til et dynamisk system (en funksjon i bedøvelsessystemet), som endrer temperaturen på varmeputen for å håndtere kroppstemperaturen. - Få personen som er ansvarlig for anestesi til å vurdere bedøvelsesdybden ved å observere responser på stimulering av poten eller halen fra trykk påført av atraumatiske tang, palpebralrefleksen og muskeltonen.
- Mål respirasjonsfrekvensen ved å observere bevegelse av brystveggen mens du observerer respirasjonsarbeidet subjektivt for å vurdere tidalvolum. Beregn respirasjonsfrekvensen ved å telle pust over en periode på 10-15 s og multiplisere med henholdsvis 6 eller 4 for å bestemme pustefrekvens/min.
- For å forhindre alvorlig hypotermi og hypertermi (fra aktiv oppvarming av varmeputen), må du overvåke kroppstemperaturen gjennom hele prosedyren. Sett inn en ren, smurt rektal sonde i endetarmen til dyret og fest den deretter til operasjonsbordet ved hjelp av mikroporebånd.
- For å forberede huden, desinfiser operasjonsstedet ved hjelp av sterile bomullstippede applikatorer. Påfør klorhexidin i en sirkulær, ekspanderende bevegelse som arbeider fra sentrum av operasjonsstedet til kantene. Gjenta denne prosessen 3x (med en ny bomullstippet applikator hver gang) før en endelig påføring av en kombinasjon av klorhexidin og etanol med en ny steril bomullstippet applikator i samme mønster, som beveger seg fra midten av operasjonsstedet til kanten.
- Få kirurgen til å bruke en etanolbasert håndgel før du tar på deg en steril kirurgisk kjole og sterile kirurgiske hansker.
- For å forberede det kirurgiske feltet, plasser sterile kirurgiske gardiner (precut til 25 cm x 25 cm) på hver side av operasjonsbordet, som tjener som stedet for å plassere sterile instrumenter. Bruk steril saks til å fenestrere en bredere 25 cm x 40 cm steril drapering for å kutte en liten (litt lengre enn snittstedet), ovalformet åpning. Legg denne gardinen over toppen av dyret slik at fenestrasjonen er plassert på det foreslåtte snittstedet. Sørg for at sideendene av dette tredje drapet overlapper de to mindre gardinene på hver side for å skape et kontinuerlig kirurgisk felt.
2. Donorkirurgi
MERK: Se tilleggsfigur S1 for de viktigste aspektene ved donorkirurgi.
- Utfør donoroperasjonen ved hjelp av et kirurgisk kikkertmikroskop. For å begynne, bruk en forstørrelse på 8x, og utfør et ventralt midtlinjehudsnitt ved hjelp av et kirurgisk skalpellblad (# 23). Sørg for at snittet spenner fra den kaudale enden av det barberte området til kystmarginen med en intakt margin av forberedt hud i hver ende.
MERK: Startforstørrelsen på 8x er valgt for å muliggjøre tilstrekkelig visualisering av makrostrukturen til motivet i begynnelsen av operasjonen. Fra dette punktet er forstørrelsen etter operatørens skjønn og bør velges for å gi en passende balanse mellom situasjonsbevisstheten som tilbys av lavere forstørrelse og de fine detaljene som kan visualiseres med høyere forstørrelse. - Bruk to sterile bomullstippede applikatorer fuktet med oppvarmet normalt saltvann, skift tynntarmen for å eksponere abdominal aorta og dårligere vena cava (IVC). Bruk applikatorene til å dissekere disse karene fra det omkringliggende vevet.
- Bruk en 3,0 ml sprøyte med en 30 G og 0,5 i kanyle til å trekke opp 2,5 ml 100 IE·ml−1 heparinisert natriumklorid 0,9 % oppløsning (opprettholdes ved 4 °C inntil nødvendig under kirurgi). Ved hjelp av straight-tipped, rund-kropp sutur tang med ikke-dominerende hånd for å sikre abdominal aorta i infrafragmatisk området, bruk den dominerende hånden til å injisere 1,5 ml oppløsning i aorta i retning av hjertet. Forsegl den resulterende aortotomien med trykk fra en bomullstippet applikator.
- Bruk rett-tipped mikrokirurgisk saks for å transektere IVC for å tillate exsanguination.
- Utfør en torakotomi ved hjelp av kirurgisk saks for å lage to snitt i de bilaterale midaxillary linjene. På dette tidspunktet bekrefter dyrets død og slår av isofluranfordamperen.
- Sikre det resulterende mediansegmentet av thoraxveggen ved hjelp av en mikrobulldogklemme. Send dette til den ikke-sterile kirurgiske assistenten som kan feste dette til nesekjeglen ved hjelp av mikropore kirurgisk tape.
MERK: Målet er å gi trekkraft på dette segmentet av thorax, som hjelper med eksponering av hjertevevet. - Bruk runde kroppssuturtang, identifiser og mobiliser intra-thorax IVC.
MERK: Ideelt sett bør tangen med rette tupper være i den ikke-dominerende hånden og den buede tangen i den dominerende hånden. - Med IVC festet i den ikke-dominante håndens tang, bruk den dominante hånden til å injisere de resterende 1,5 ml av 100 IE · ml - 1 heparinisert natriumklorid 0,9 % oppløsning inn i hjertet.
- Bruk begge settene med tang, liger IVC med 7/0 flettet silke på 2 cm lengde. Bruk et instrument knytte kirurgens knute med to ekstra kast for sikkerhet. Gjør denne knuten så proksimal langs fartøyet til hjertet som mulig.
- Fest de to endene av denne knuten ved hjelp av arterietang. Plasser disse tangene slik at de gir forsiktig trekkraft av hjertet i kaudal retning for å lette optimal fartøyposisjonering for påfølgende disseksjon.
- Identifiser thymus på det anterosuperior aspektet av hjertet. Bruk tang for å dissekere dette organet fra donoren for å identifisere den overlegne vena cava (SVC).
- Fjern adventitia og tilhørende vev av SVC ved hjelp av tang. Bruk buede tang til å dissekere og lage en liten kanal bakenfor fartøyet. Sørg for at denne kanalen er så nær hjertet som mulig.
- Før et stykke 7/0 flettet silke på 2 cm lengde gjennom denne kanalen ved hjelp av tang og bind den deretter ved hjelp av den nevnte teknikken.
- På et punkt ca. 2 mm fra denne ligeringen (på siden motsatt hjertet), del SVC ved hjelp av buet mikrokirurgisk saks.
- Bruk applikatorer med bomullstipp til å vippe hjertet til den anatomiske høyresiden.
- Identifiser den azygote venen på den anatomiske venstre delen av hjertet. Bruk tang, dissekere det direkte fra omkringliggende strukturer. Som før, bruk buede tippede tang for å lage en liten kanal bakenfor dette fartøyet.
- Bruk et tredje stykke 7/0 flettet silke kuttet til 2 cm for å ligere den azygote venen i maksimal nærhet til hjertet ved hjelp av samme knutebindingsteknikk. Klipp fartøyet 2 mm fra ligeringen på siden vekk fra hjertet.
- Bruk applikatorer med bomullstipp til å vippe toppen av hjertet tilbake til den anatomiske venstre. Bruk tang for å identifisere og mobilisere den stigende aorta. Pass den buede tangen under aortabuen for å skape en kanal mellom den stigende og synkende aorta.
- Ved hjelp av rett-tipped mikrokirurgisk saks, transektere aortabuen proksimalt til sine grener.
- Bruk tang, identifiser og mobiliser lungearterien. Bruk buede tang til å lage en kanal bakre for fartøyet.
- Ved hjelp av straight-tipped mikrokirurgisk saks, transektere arterien på et punkt like proksimalt til bifurkasjonen sin.
- Bruk en Rycroft irrigasjonskanyle til forsiktig å injisere 2 ml av 10 IE · ml - 1 heparinisert natriumklorid 0,9% gjennom lungearterien og stigende aorta for å skylle gjenværende blod fra hjertet.
MERK: En tilstrekkelig spyling indikeres ved clearance av synlig blod fra koronarbeinene. - Bruk et 3 cm stykke 7/0 flettet silke, liger de resterende bakre karene (lungevenene) en blokk ved hjelp av en kirurgknute med to påfølgende kast. Separer hjertet fra den bakre thoraxveggen ved å kutte forsiktig med kirurgisk saks.
- Fjern hjertet forsiktig fra brystkassen, senk det ned i University of Wisconsin Solution (UWS), og legg det deretter på is for oppbevaring (ved 4 °C).
3. Mottaker kirurgi
- Etter tilberedning av dyret som beskrevet i pkt. 1.Påfør øyesmøremiddel. Injiser en vektbasert dose (8 mg/kg) bupivakain (0,25 % fortynnet til 0,625 mg/ml i natriumklorid 0,9 % oppløsning) inn i det subkutane vevet i ventralabdomen langs det planlagte snittstedet. Bruk en 29 G insulinsprøyte til denne injeksjonen og se etter en rett linje med synlig blebbing som dekker omfanget av det planlagte snittet (tilleggsfigur S2A-C).
MERK: Fem-syv minutter bør gis for å gi tid til topp effekt av lokalbedøvelsen. - Med mikroskopet satt til 8x forstørrelse, gjør en ventral midtlinjen huden snitt ved hjelp av en steril kirurgisk skalpell blad (# 23). Sørg for at laparotomien spenner fra underlivet til kystmarginen. Sett inn en retractor for å maksimere det kirurgiske feltet (tilleggsfigur S2D).
- Fukt et 5 cm x 5 cm segment av sterilt gasbind med oppvarmet 0,9% natriumkloridoppløsning og plasser den på det overordnede aspektet av operasjonsstedet. Bruk fuktede sterile bomullspinner, fjern forsiktig tarmene, plasser dem på toppen av dette gasbindet og vikle gasbindet rundt orgelet (tilleggsfigur S3A).
MERK: Denne prosedyren bidrar til å redusere ufølsomt væsketap under operasjonen og hjelpemidler i tilbaketrekning. - Frigjør og mobiliser abdominal aorta og IVC fra omgivende vev ved hjelp av en stump disseksjonsteknikk. Bruk en kombinasjon av applikatorer med bomullstipp og suturtang med rund kropp til dette trinnet. Sørg for at klaringsområdet er mellom det infrarenale aspektet av karene og like over bifurkasjonen av aorta (tilleggsfigur S3B).
MERK: Passende visualisering på dette punktet vil lette vaskulære anastomoser av høy kvalitet. - Identifiser de bakre bukkarene. Bruk tang, trekk forsiktig aorta i en retning bort fra vertebral kolonnen (dvs. langsgående til bukkarets akse).
MERK: Det er viktig at bare aorta og ikke IVC håndteres på en slik måte på grunn av friheten til sistnevnte. - Ligat hvert abdominalfartøy identifisert i den planlagte anastomotiske sonen. Lag en kanal på hver side av disse karene cephalocaudalt ved å føre de buede tangene bakover til bukkarene på hver side. Ligate hvert fartøy identifisert og mobilisert på denne måten ved hjelp av lengder på 10/0 nylon bundet med instrumenter i kirurgens knuter med ett ekstra kast (tilleggsfigur S3C).
- Isoler det anastomotiske stedet fra sirkulasjon. For å gjøre det, installer en kirurgisk klemme både på hodet og deretter de kaudale endene av bukkarene (viktigere, i den nøyaktige rekkefølgen). Sørg for at klemmene krysser begge fartøyene i tilstrekkelig grad for å sikre fullstendig okklusjon.
- Ved hjelp av tang i den ikke-dominerende hånden for å holde aorta, utfør en aortotomi ved hjelp av en 30 G nål på det fremre aspektet av aorta. Forleng den med mikrokirurgisk saks med rette tipper (tilleggsfigur S3D).
- Utfør en venotomi. Bruk rett tang, påfør forsiktig fremre trekkraft til IVC på punktet i tråd med midten av aortotomien. Bruk buet mikrokirurgisk saks med den konkave siden vendt anteriort for å fjerne et segment av IVC av samme lengde som aortotomi (tilleggsfigur S4A).
- Bruk 10 IE · ml - 1 heparinisert natriumkloridoppløsning til å vaske det indre av de åpnede karene med gjenværende blod.
- Plasser donorhjertet i magen. Sørg for at posisjoneringen er slik at den stigende aorta er direkte langs abdominal aortotomi og hjertet roteres slik at lungearterien kan trekkes over for den andre anastomosen.
- Bruk 10/0 nylon, plasser en oppholdsutur mellom klokken 12 i aortotomi og den tilsvarende ekstremiteten av lumen i den stigende aorta. Utfør dette ved hjelp av straight-tipped tang og en mikrokirurgisk nålholder og bind den med en kirurgs knute med tre påfølgende kast. Klipp endene slik at det blir ca. 2 mm sutur.
- Plasser en andre oppholdsutur mellom klokka 6 posisjonen til aortotomi og det tilsvarende aspektet av den stigende aorta. Siden denne suturen også vil fungere som base for påfølgende suturer, må du la det være minst 10 mm av halen for den ultimate tilknytningen.
- Plasser en kontinuerlig løpende sutur av 10/0 nylon på en stigende måte for å motsette seg den anatomiske høyre kanten av aortotomi og den tilsvarende frie kanten av den stigende aorta. Bruk omtrent fire kast for denne linjen.
- Før den frie enden av suturen rundt den distale oppholdsuturen før du plasserer en ny kontinuerlig løpende sutur ned den anatomiske venstre siden for å påvirke apposisjonen med den gjenværende frie kanten av aortotomien. Bind suturen til halen ved hjelp av en kirurgknute med to ekstra kast.
- Plasser en oppholdsutur mellom klokken 12 posisjon av IVC venotomy og tilsvarende ekstremitet av lumen av lungearterien.
- Fra dette ankerpunktet plasserer du en kontinuerlig løpende sutur på synkende måte mellom den anatomiske venstre kanten av lungearterien og den tilsvarende kanten av venotomien. Bruk et gjennomsnitt på fire kast for denne linjen etterfulgt av en mellom klokka 6 posisjon av venotomi og tilsvarende ekstremitet av lungearterien lumen. Gjør fire kast til for å trekke de siste frie kantene av lungearterien og venotomi sammen.
- Bind av den frie enden av suturen til ankerenden ved hjelp av et instrumentbånd kirurgens knute med to ekstra kast.
- Flytt hjertet til å sitte sentralt i magen ved hjelp av bomullspinner. Sjekk fartøyene for vridning, noe som vil forstyrre blodstrømmen.
- Plasser gelskum over alle suturlinjene (tilleggsfigur S4B). Plasser og form to stykker på ca. 2 mm hver rundt dem slik at alle de synlige suturlinjene er dekket.
- Frigjør vaskulære klemmer: først kaudalklemmen, og deretter cephalo-klemmen. Siden en liten blødning kan forventes, plasser bomullstippede applikatorer på forhånd over de anastomotiske stedene for å gi trykk.
- Når du er fri for observerbare lekkasjer, vurder hjertet for pulsering (tilleggsfigur S4C). Hvis dette ikke skjer, må du kontrollere at det ikke har skjedd noen vridning av hjertekarene (spesielt for IVC).
- Flytt tarmene nå over og rundt hjertet. Hvis det virker tørt, fukt bukhulen ved hjelp av oppvarmet natriumkloridoppløsning.
- Lukk bukhulen med ikke-absorberbar 6/0 prolene monofilament med lag:
først muskellaget, og deretter huden (tilleggsfigur S4D). Bruk kontinuerlig, uavbrutt teknikk. - Fjern forsiktig mottakeren fra operasjonsstyret og ta den av bedøvelsen.
- Administrer 1 ml varmt saltvann subkutant og plasser mottakeren i et ferdig forberedt bur med oppvarming for observasjon i henhold til postoperative gjenopprettingsprotokoller (tilleggsfigur S4E).
4. Postoperativ behandling
- Umiddelbart etter operasjonen, plasser mottakeren i et rent bur på en varmepute under nøye observasjon i minst 3 timer. I løpet av denne perioden må du overvåke ulike parametere (aktivitet, kroppsstilling, frakktilstand, ansiktsuttrykk, gang, ventilasjon, utseende på operasjonsstedet, tilstedeværelse av håndgripelig abdominal hjerterytme) minst hvert 30. minutt. Tilordne en poengsum til hver parameter (0 = normal, 1 = litt eller periodisk unormal, 2 = moderat eller konsekvent unormal).
MERK: Intervensjoner utløses av summen av de overvåkede parametrene som overstiger velferdsskårer spesifisert av etikkprotokollen knyttet til denne modellen. - Flytt mottakerne til et oppvarmet skap som holdes på 25 °C, hvor de blir liggende til dag 7 etter operasjonen. I løpet av de første 3 dagene, overvåke dem minst 2x daglig. I løpet av de resterende 4 dagene, overvåke dem minst 1x daglig. Ved postoperativ analgesi, administrer en dose buprenorfin (0,5-0,1 mg/kg, fortynnet til 0,03 mg/ml med natriumklorid 0,9 %) subkutant til mottakermusen kvelden etter operasjonen og to ganger daglig de neste 3 postoperative dagene.
- Når mottakerne er fjernet fra det oppvarmede kabinettet, må du overvåke mottakerne minst 2x ukentlig til riktig eksperimentelt endepunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å bestemme effektiviteten av den kirurgiske teknikken for å fremme gode resultater av sårheling og musegjenoppretting, bestemte tidlige eksperimenter i laboratoriet overlevelsesegenskapene til en rekke hjertetransplantater av variabel immunogenitet til mottakeren. Disse inkluderte kongene (n = 5) og syngene (n = 5) transplantater, som deler de samme store histokompatibilitetskompleksmarkørene (MHC) som mottakeren, og store mismatch-transplantater (n = 9), der transplantatet og mottakeren har forskjellige MHC-markører. Vi brukte direkte palpasjon av heterotopisk abdominalt hjerteslag for å vurdere pågående transplantatfunksjon og levedyktighet, som fungerer som en proxymarkør for avstøtning versus toleranse.
I begge kontrollgruppene var alle transplantatene levedyktige ved det eksperimentelle tidsendepunktet på 100 dager (gjennomsnitt udefinert). Den uoverensstemmende gruppen hadde en gjennomsnittlig overlevelsestid på 9 dager. Figur 1 viser Kaplan-Meier-overlevelseskurver som viser den sterke kontrasten i transplantatoverlevelse mellom feilmatchede og kontrollhjertetransplantater16. Disse dataene tyder på at teknikken er tilstrekkelig til å fremme en passende helbredende respons etter prosedyren. I nærvær av patologisk betennelse, imidlertid, i dette tilfellet representert ved graftavvisning i mismatch-tilstanden, fører vevsødeleggelse til raskt tap av funksjon.
Figur 1: Påvirkning av mismatch på overlevelse av ortotopiske hjertetransplantasjoner. Overlevelseskurver som illustrerer full restitusjon og aksept av syngene (n = 5) og kongene (n = 5) heterotopiske murine hjertetransplantasjoner i minst 100 dager etter operasjonen, i motsetning til rask avstøtning av store mismatchede (n = 7) heterotopiske murine hjertetransplantasjoner fra så tidlig som dag 7 etter operasjonen. Disse dataene ble publisert i Prosser et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kirurgi Stage | Kald iskemi tid | Varm iskemi tid |
| Giver | 13 – 15 min | |
| Oppbevaring 4 °C | 20- 25 min | |
| Mottaker | 22 – 25 min |
Tabell 1: Intervall av varme og kalde iskemitider for donor- og mottakeroperasjoner forbundet med ortotopisk hjertetransplantasjon.
Tilleggsfigur S1: Viktige aspekter ved donorkirurgi. (A) Isofluran anestesi; (B) heparin injeksjon; (C) donorhjerte eksponert; (D) skylling av hjertet med heparinisert saltvann; (E) binding av fartøyet; (F) donorhjerte for lagring av kald iskemi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Sentrale aspekter ved resipientkirurgi-forberedelse og cauterization av kuttede hudkar. (A) Mottakerens forberedelse av operasjonsstedet; (B) bupivakain injeksjon; c) steril kirurgisk drapering av operasjonsstedet, (D) cauterization av kuttede hudkar. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Sentrale aspekter ved mottakerkirurgi – fra reposisjonering av tarm til aortotomi. (A) Midlertidig reposisjonering av tarmene; (B) dårligere vena cava eksponert og klemmet; (C) plassere oppholdet sutur; (D) første fase: aortotomi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S4: Viktige aspekter ved mottakerkirurgi - fra venotomi til bedring. (A) Andre fase: venotomi; (B) plassering av gelskummet; (C) reperfusjon; (D) kirurgisk nedleggelse; (E) gjenoppretting. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine ortotopisk hjertetransplantasjonsmodell er en robust preklinisk modell som primært brukes til å undersøke effekten av MHC-mismatch på nivået og arten av immunologisk avstøtning og, mer nylig, effekten av transplantasjon på retensjon av transplantatvevsresident immunitet16. Mens vi i utgangspunktet fulgte Corry et al.7-protokollen , har vi raffinert protokollen for å innlemme beste praksisstandarder for aseptisk teknikk, analgesi og anestesi. Oppdateringen av disse nye praksisene ble oppnådd via tilleggsopplæring, levering av sterile kirurgiske hansker, kjoler og kirurgiske gardiner, påføring av ytterligere anestesi og oppdatering av analgesidoseringen. Slike endringer førte til en liten økning i kirurgisk oppsettstid og merkostnader per operasjon.
Bruk av dyr for å løse viktige forskningsproblemer er tillatt i henhold til en kontrakt mellom forskere og en dyreetisk komité (AEC) for å opprettholde en sosial lisens til å utføre slikt arbeid. Beslutninger i en AEC er basert på klare etiske retningslinjer15, med et overordnet prinsipp om å balansere kostnadene for dyret mot nytten for samfunnet. Konseptet med de tre R-ene (reduksjon, utskifting og raffinement) er avgjørende for å adressere hvordan kostnadene ved et prosjekt reduseres.
Minimering av skade på dyrene som er involvert ved adopsjon av artspassende, perioperativ analgesi og anestesi har en uerstattelig rolle i dyremodeller for kirurgi og er et eksempel på forfining. I tillegg har omsorg og teknikker som reduserer risikoen for miljø- og atferdsvektorer av infeksjon til den kirurgiske mottakeren, positive implikasjoner for både å redusere skadene på dyret når det gjelder sykelighet og dødelighet og bidra til å minimere de økonomiske kostnadene forbundet med gjentatte mislykkede operasjoner. Selv om rensligheten til forsøksdyrets "operasjonsstue" ikke nærmer seg en sykehusekvivalent, bør det ikke være en ettertanke i slikt arbeid.
Fra et vitenskapelig perspektiv påvirker postoperative infeksjoner nødvendigvis profilen til inflammatoriske cytokiner og immunceller, som er de typiske avlesningene for eksperimenter som vurderer transplantasjonsgjenoppretting eller avvisning. Maksimal innsats bør derfor gjøres for å kontrollere for postoperativ infeksjon, gitt den negative effekten dette kan ha på forskningens validitet. Fokuset på smertestillende er viktig fra et dyrevelferdssynspunkt. Dyretransplantasjonsoperasjoner er viktige prosedyrer, og det bør gjøres en stor innsats for å redusere unødvendig smerte og lidelse hos forsøkspersonene. For å gå tilbake til de praktiske resultatene av dette fokuset, er en ekstra praktisk fordel med effektiv smertekontroll den reduserte sannsynligheten for at dyr blir fjernet fra den eksperimentelle protokollen på grunn av smerteassosierte tegn på nød.
Siden denne prosedyren først ble beskrevet, har flere forfattere rapportert feilsøking av vanlige problemer som oppstår under prosedyren10,11. Kontrollen av blødning etter frigjøring av klemmene er godt beskrevet og speiler teknikker som brukes i menneskelige operasjoner, nemlig bruk av trykk til blødningsstedet, ytterligere suturering og hemostatiske midler. Vi har lagt merke til at blødning ofte oppstår fra ett av to hovedsteder: anastomosestedene eller skade på myokardiet. Tilnærminger for å stoppe blødning fra hjertet har blitt rapportert av Niimi10, som kontrollerte blødning fra hjertet gjennom ligering av atriumet. Vår erfaring er at blodstrømmen fra selve myokardiet er usedvanlig utfordrende på grunn av den rike vaskulariseringen.
Tilbørlig forsiktighet må derfor utvises for å unngå slike skader, som oftest skyldes en feilkontrollert tangspiss som kommer i kontakt med hjertemuskelen under operasjonen. Vi søker derfor å bare komme i direkte kontakt med hjertemuskelen ved hjelp av fuktede bomullstippede applikatorer. For å redusere direkte kontakt i manipulasjonen av hjertet, kan de frie endene av den endelige silkeligeringen brukes til å bevege hjertet, for eksempel når du flytter det fra UWS til thoraxhulen.
En annen stor utfordring er forebygging av postoperativ lammelse i bakbenene, en komplikasjon som krever eutanasi. Anekdotisk har vi funnet ut at en varm iskemisk tid på >30 min er forbundet med en høyere risiko for at denne lammelsen oppstår. Våre iskemiske tider overvåkes strengt og registreres som en uformell standard for ytelse. Det skal imidlertid bemerkes at iskemisk tid ikke ser ut til å forutsi denne komplikasjonen på en pålitelig måte. Niimi10, for eksempel, en kirurg med betydelig operativ erfaring (over 3000 operasjoner), rapporterte at iskemiske tider på opptil 2 timer er akseptable.
Kanskje enda mer oppsiktsvekkende enn dette, rapporterte Abbott et al.5, som utviklet en lignende teknikk hos rotter, men brukte et ende-til-ende anastomotisk oppsett i magen (dvs. IVC og abdominal aorta ble ligert permanent), rapportert om to rotter holdt som langsiktige overlevende som varer over 100 dager uten noen åpenbare dårlige effekter. Disse forskjellene mellom grupper i utfall forklares kanskje av subtilt forskjellige teknikker eller alternativt av de genetiske forskjellene mellom forskjellige musestammer. For eksempel bemerker vi at Ly5.1-mus er mye mer utsatt for denne komplikasjonen enn BALB / c-mus. For å forbedre klarheten om effekten av iskemisk tid på forekomst av lammelse av bakre lemmer, kan effekten av okklusjonstid for bukkar undersøkes.
Oppsummert gir denne beskrevne protokollen enkle forbedringer av etablerte teknikker ved bruk av lett tilgjengelige stoffer og materialer. Disse forbedringene justerer standarden som denne kirurgiske modellen utføres til den for kliniske veterinærstandarder og fordeler dyrene og til slutt forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne den ypperlige innsatsen til dyrepleiepersonalet ved University of Western Australia og Harry Perkins Institute of Medical Research, hvis engasjement og kompetanse bidro til muligheten og suksessen til disse operasjonene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
