Articolo metodologico

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 settembre 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

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Sommario

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L'ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale murino di dermatite allergica da contatto (ACD). ChS si basa sulla sensibilizzazione con hapten reattivo dipingendo la pelle rasata del torace e dell'addome, con una successiva sfida della pelle dell'orecchio con un hapten diluito, causando una reazione di gonfiore che viene valutata in vari modi.

Abstract

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L'ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale di dermatite allergica da contatto (ACD) che può essere studiato nei topi. Questo studio mira a presentare un metodo di laboratorio oggettivo che può aiutare a studiare la reazione CHS nei topi, che può essere misurata e quantificata da vari test. Per indurre CHS, il giorno "0", i topi sono stati sensibilizzati su un punto precedentemente rasato dipingendo la pelle addominale con l'apteten 2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB) in una miscela acetone-etanolo, mentre i topi a controllo negativo sono stati sensibilizzati fintamente con la miscela veicolo da solo-acetone-etanolo. Il giorno "4", lo spessore dell'orecchio di base è stato misurato con un micrometro prima dell'elicitazione di CHS (sfida) dipingendo entrambe le orecchie con TNCB diluito sia nel gruppo di prova che in quello di controllo. Dopo 24 ore, il gonfiore dell'orecchio è stato misurato con un micrometro. CHS è un esempio di una risposta immunitaria mediata da cellule T che provoca gonfiore nel tessuto infiammato, con un picco di 24 ore dopo la sfida cutanea con lo stesso apteno. Un aumento dell'edema dell'orecchio correlato all'aumento del peso dell'orecchio, all'attività della mieloperossidasi (MPO), alla concentrazione di citochine pro-infiammatorie negli estratti dell'orecchio, all'aumento dell'ispessimento del derma edematoso nell'esame istologico e alla permeabilità vascolare dell'orecchio. C'è stato anche un aumento della concentrazione di anticorpi IgG1 specifici del TNP nei sieri del gruppo di test rispetto ai topi di controllo. Inoltre, chs può essere trasferito con successo con le cellule effettrici CHS ottenute da donatori precedentemente sensibilizzati con TNCB. Le cellule effettrici CHS sono state somministrate per via endovenosa in topi riceventi naïve, che sono stati successivamente sfidati con lo stesso apteno diluito. Il gonfiore dell'orecchio è stato misurato con un micrometro 24 ore dopo.

Introduzione

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La dermatite allergica da contatto (ACD) è una comune malattia infiammatoria della pelle nei paesi industrializzati causata da una reazione di ipersensibilità di tipo IV derivante dall'esposizione a sostanze chimiche a basso peso molecolare chiamate apteni. Le sostanze che causano sensibilizzazione al contatto nell'uomo includono ioni di metalli pesanti (cromo, nichel, ferro, cobalto), trementina, profumi, coloranti e conservanti presenti nei cosmetici (ad esempio, p-fenilendiammina), alcuni farmaci (ad esempio, neomicina, benzocaina), antibiotici β-lattamici (cioè penicillina), sostanze chimiche prodotte dalle piante (pentadecacatecolo, una sostanza presente nell'edera velenosa), nonché idrochinone-utilizzato nell'industria fotografica 1,2 . Gli agenti eziologici ACD sono molto alti in quanto oltre 100.000 sostanze chimiche sono utilizzate solo nell'industria e 2.000 nuove vengono sintetizzate ogni anno. Ad oggi, sono state identificate più di 3.700 molecole che possono essere apteni/allergeni da contatto3. La reazione di ipersensibilità al contatto (CHS) è un modello sperimentale di ACD che può essere studiato in topi, porcellini d'India e ratti e può essere indotto dall'applicazione topica cutanea di apteni chimici reattivi disciolti in solventi organici 4,5,6. Questo studio mira a descrivere un metodo di laboratorio oggettivo che può aiutare a studiare la reazione CHS nei topi, che può essere misurata e quantificata da vari test.

Il CHS è costituito da fasi di sensibilizzazione (induzione) ed effettore (sfida). Nei modelli animali, gli apteni si legano prima covalentemente alle proteine del corpo per creare neoantigeni. Durante la fase di sensibilizzazione, i cheratinociti attivati favoriscono la migrazione e la maturazione delle cellule dendritiche cutanee (sDC) producendo citochine pro-infiammatorie-fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) e interleuchina 1β (IL-1β)7. Le cellule epidermiche di Langerhans (LCs) presentano antigeni durante l'induzione chs e le fasi effettrici8. Le LC esposte all'aptene durante la sensibilizzazione promuovono l'induzione delle cellule regolatorie ed effettrici9. Prove crescenti da diversi studi suggeriscono che le risposte CHS possono essere mediate da cellule Th1 cd4 + MHC di classe II limitate, rilasciando localmente interferone-γ (IFN-γ) per impiegare un caratteristico infiltrato infiammatorio, linfociti Tc1 CD8 + MHC di classe I che possono anche rilasciare IFN-γ ma soprattutto mediare danni citotossici ai cheratinociti, e ora anche le cellule Th17 che producono interleuchina 17 (IL-17)10, 11.

Sono stati sviluppati diversi modelli CHS che impiegano varie specie1 2,13,14 e apteni (un confronto dettagliato di diversi apteni, solventi e tempo di applicazione è riassunto nella Tabella 1). Il topo, una specie di laboratorio frequentemente utilizzata, offre alcuni vantaggi nello studio della CHS. Ci sono più ceppi, knockout (KO) e animali transgenici tra i topi rispetto ad altre specie, il che li rende un animale molto attraente15. Inoltre, il modello CHS richiede molti animali e i topi sono più economici qui. I modelli animali non imitano l'ACD in tutti gli aspetti; in particolare, mostrano croste e desquamazione, che non è comune perl'uomo 16,17. Le caratteristiche della malattia cronica sono difficili da riprodurre, principalmente perché il modello descritto non presuppone l'applicazione dell'apteno per un lungo periodo di tempo. Tuttavia, è stato confermato qui che molti degli aspetti significativi dell'ACD sono riprodotti. È stato anche dimostrato che, come negli esseri umani, queste caratteristiche sono associate a reazioni allergiche locali. La scelta dell'apteno, il suo solvente e la sua applicazione delineati in questo protocollo sono stati dettati dal fatto che i risultati sono stati confermati da numerosi test in vitro e che è stato testato e modificato in laboratorio per molti anni fino a quando non è stata stabilita la versione attuale. I modelli murini consentono l'analisi dei sottoinsiemi cellulari o delle citochine che sono coinvolti nello sviluppo dell'ACD e sono essenziali per le valutazioni precliniche di nuovi trattamenti.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti presentati in questo articolo sono stati condotti secondo le linee guida del 1 ° Comitato etico locale sulla sperimentazione animale a Cracovia. Tutte le procedure descritte sono state eseguite secondo le raccomandazioni locali, in particolare per quanto riguarda l'uso di ketamina / xilazina come anestetico, utilizzando entrambi i lati delle orecchie per applicare la sostanza / aptena, tagliando l'orecchio e raccogliendo sangue mediante rimozione del bulbo oculare. Per il presente studio sono stati utilizzati BALB/c (aplotipo H-2d), CBA/J (H-2k) e C57BL/6 (H-2b) di età maschile e femminile, di 6-12 settimane di età (vedere Tabella dei materiali). Per la significatività statistica, è meglio se ogni gruppo di topi è composto da 10-12 animali.

1. Preparazione animale

  1. Pulire il tavolo operatorio con una soluzione di etanolo al 70% prima e dopo tutte le procedure. Se si utilizzano topi che richiedono condizioni sterili, eseguire tutte le operazioni in un armadio di biosicurezza.

2. Marcatura dei topi per l'identificazione

  1. Etichetta i topi radendo la pelle con una lama di rasoio: #0 - non marcata, #2 - sulla zampa anteriore destra, #3 - sul lato destro, #4 - sulla zampa posteriore destra, #5 - alla base della coda, #6 - sulla zampa posteriore sinistra, #7 - sul lato sinistro, #8 - sulla zampa anteriore sinistra.
    NOTA: A causa della reazione indotta, i topi non possono essere contrassegnati classicamente da punzonatura o etichettatura dell'orecchio. I topi non sono stati anestetizzati durante l'etichettatura.

3. Induzione di CHS

NOTA: questa procedura è illustrata nella Figura 1.

  1. Eseguire la sensibilizzazione (induzione) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Il giorno "0", radere i topi sul petto e sull'addome (quadrato 2 cm x 2 cm) applicando sapone grigio con acqua e radendosi con una lama di rasoio.
      NOTA: Prima di applicare hapten, attendere 6 ore in modo che la pelle non sia irritata.
    2. Preparare il 5% di hapten: 2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB, vedi Tabella dei materiali) in una miscela acetone-etanolo (rapporto 1:3) o da solo (acetone-etanolo). Preparare le soluzioni appena prima dell'uso in un flaconcino di vetro e proteggerlo dalla luce coprendo il flaconcino con un foglio di alluminio.
    3. Lo stesso giorno, sensibilizzare i topi applicando 150 μL di hapten al 5% sul punto precedentemente rasato. Nel gruppo di topi di controllo, applicare il veicolo da solo per valutare la reazione infiammatoria non specifica. Prima di rimettere l'animale nella gabbia, attendere 30 s, lasciando asciugare l'hapten.
      ATTENZIONE: Utilizzare guanti; TNCB provoca una grave reazione allergica nella maggior parte delle persone.
  2. Eseguire la misurazione dell'elicitazione (sfida) e del gonfiore dell'orecchio.
    1. Il giorno "4", preparare lo 0,4% di hapten: TNCB in una miscela acetone-etanolo (rapporto 1:1). Preparare la soluzione appena prima dell'uso in un flaconcino di vetro e proteggerla dalla luce coprendo il flaconcino con un foglio di alluminio.
    2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per l'anestesia profonda. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per almeno 5 minuti con un pizzico di punta.
    3. Misurare lo spessore dell'orecchio (misurazione di 0 ore, baseline) con un micrometro (vedi Tabella dei materiali) da un osservatore ignaro dei gruppi sperimentali.
    4. Applicare 10 μL di 0,4% di hapten su entrambi i lati delle orecchie in entrambi i gruppi (test e controllo). Prima di rimettere l'animale nella gabbia, attendere 30 s e lasciare asciugare l'hapten.
    5. Il giorno "5", 24 ore dopo l'applicazione, ripetere i passaggi 3.2.2-3.2.3 per la misurazione di 24 ore.
    6. Valutare la risposta CHS calcolando la differenza di spessore del padiglione auricolare prima e dopo la sfida con l'hapten: 24 h di spessore dell'orecchio (μm) - 0 h di spessore dell'orecchio (μm). Conta ogni orecchio come misura separata. Quindi, esprimere il gonfiore dell'orecchio in micrometri (μm) ± errore standard della media (SEM) (Tabella 2, Figura 3).

4. Biopsie dell'orecchio

  1. Subito dopo la misurazione di 24 ore dello spessore dell'orecchio (quando il topo è ancora in anestesia profonda), tagliare le orecchie il più vicino possibile al cranio con le forbici. Raccogliere le biopsie dal lato distale delle orecchie facendo un pugno di 6 mm di diametro usando un pugno bioptico (vedi Tabella dei materiali).
    1. Misurare il peso dell'orecchio (fase 4.2) ed eseguire inoltre uno dei seguenti test sulla stessa biopsia dell'orecchio: saggio della mieloperossidasi (MPO) (fase 4.3) o misurazione in vitro della concentrazione di citochine negli estratti dell'orecchio (ad esempio, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [fase 4.4]).
      NOTA: Tagliare le orecchie prima della raccolta del sangue. Dopo questa procedura, i topi devono essere eutanasizzati (ad esempio, per lussazione cervicale).
  2. Misurare il peso di ciascuna biopsia dell'orecchio sulla bilancia analitica ed esprimerlo in milligrammi (mg) (Figura 4).
  3. Eseguire un test MPO seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preparare il tampone di omogeneizzazione sciogliendo il bromuro di esadeciltrimetilammonio allo 0,5% in tampone fosforato da 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4 e regolando il pH a 6,0 (utilizzare a temperatura ambiente, RT).
    2. Omogeneizzare le biopsie in tubi microcentrifuga da 2 mL con 500 μL di tampone preparato per 10 minuti utilizzando un omogeneizzatore con perline di acciaio inossidabile di diametro 5 mm (aggiungere due perline / fiala) (vedi Tabella dei materiali). Quindi, raffreddare il campione per 15 minuti a 4 °C e omogeneizzarlo per altri 10 minuti.
      NOTA: i tubi microcentrifuga hanno un fondo rotondo in modo che le perline possano muoversi facilmente.
    3. Congelare gli omogeneizzati a -20 °C per 30 min. Scongelamento e vortice (assicurarsi che i campioni siano scongelati). Ripetere questa procedura 3x.
    4. Centrifugare gli omogeneizzati a 3.000 x g per 30 min a 4 °C. Raccogli i supernatanti con una pipetta. Esprimere l'attività MPO in unità (U) per 1 mg di proteina.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni sono stabili a -20 °C per 3 mesi.
    5. Per misurare l'attività MPO, eseguire una reazione enzimatica mescolando 20 μL di surnatante e 200 μL di substrato MPO (0,167 mg/mL di orto-dianisina dicloridrato in 50 mmol di KH2PO4/Na2HPO4 tampone con 5 x 10−4% H202) e aggiungere in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le piastre per 20 minuti a RT.
    6. Preparare la curva standard utilizzando 20 μL dello standard MPO a concentrazioni da 0,008 U fino a 0,5 U in 200 μL del substrato MPO. Preparare il campione in bianco con il solo substrato MPO.
      ATTENZIONE: Utilizzare una maschera mentre si lavora con orto-dianisina dicloridrato.
      NOTA: Le piastre devono essere fatte di polipropilene, che ha una capacità di legame inferiore in modo che le proteine o il DNA non si leghino.
    7. Misurare la densità ottica (OD) ad una lunghezza d'onda di λ = 460 nm. La reazione enzimatica è stabile per 10 min. Leggere l'attività MPO nei campioni testati dalla curva standard.
    8. Per misurare la concentrazione proteica, utilizzare 20 μL del surnatante, eseguire un test con un kit di acido bicinconinico per la determinazione delle proteine (vedere Tabella dei materiali) e misurare l'OD a λ = 562 nm (Figura 5).
  4. Eseguire la misurazione in vitro delle citochine nell'estratto dell'orecchio.
    1. Omogeneizzare le biopsie dell'orecchio a RT in tubi microcentrifuga da 2 mL con 500 μL di reagente di estrazione delle proteine tissutali (T-PER) per 10 minuti utilizzando un omogeneizzatore con perle di acciaio inossidabile di diametro 5 mm (aggiungere due perline / fiala). Quindi, raffreddare il campione per 15 minuti a 4 °C e omogeneizzarlo per altri 10 minuti.
      NOTA: i tubi microcentrifuga hanno un fondo rotondo in modo che le perline possano muoversi facilmente.
    2. Centrifugare gli omogeneizzati a 3.000 x g per 30 min a 4 °C.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni sono stabili a -80 °C per 6 mesi.
    3. Valutare i livelli di citochine utilizzando un set ELISA disponibile in commercio (ad esempio, IFN-γ) (vedere Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore (Figura 6).

5. Istologia del tessuto auricolare

  1. Subito dopo la misurazione di 24 ore dello spessore dell'orecchio, quando il mouse è ancora profondamente anestetizzato, tagliare le orecchie il più vicino possibile al cranio con le forbici (passo 4.1).
    NOTA: Dopo questa procedura, i topi devono essere sottoposti a eutanasia (ad esempio, per lussazione cervicale).
  2. Eseguire l'incorporamento di paraffina dei blocchi di tessuto seguendo i passaggi seguenti.
    1. Subito dopo la rimozione, posizionare l'orecchio in ~ 10 ml di formalina al 10% per 24 ore.
    2. Posizionare le orecchie in una cassetta di lavorazione dei tessuti. Mettere le cassette in un processore automatizzato (vedi Tabella dei materiali) per i cicli di disidratazione (alcol 70%, 90%, 100%, 30 min ciascuno a RT), cicli di pulizia (xilene 3x, 30 min ciascuno a RT) e cicli di infiltrazione di cera (paraffina 3x, 30 min ciascuno a 56 °C).
    3. Rimuovere le cassette dal processore automatico e tenere premuta la piastra di riscaldamento fino a quando non è necessario. Riempire lo stampo di cera con cera calda (dal distributore).
    4. Rimuovere le sezioni dalla cassetta con pinza riscaldata e metterle nello stampo; quindi, posizionare la base della cassetta sulla parte superiore dello stampo e quindi riempire con altra cera. Metterlo in acqua refrigerata su una piastra fredda per 30 minuti in modo che la paraffina si solidifichi per formare un blocco contenente il campione.
    5. Utilizzare un microtomo rotante (vedere Tabella dei materiali) per tagliare sezioni di circa 5 μm di spessore. Far galleggiare le sezioni in un bagno caldo per appiattirle. Raccogli le sezioni su un vetrino per microscopio. Lasciarli asciugare a RT per assicurarsi che le sezioni aderiscano alla diapositiva.
      NOTA: utilizzare vetrini che eliminano la necessità di applicare materiali adesivi o rivestimenti proteici per prevenire la perdita di sezioni di tessuto durante la colorazione.
  3. Eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E).
    1. Preparare 17 piatti di colorazione con quanto segue: xilene (quattro piatti), etanolo al 100% (alcol assoluto) (quattro piatti), etanolo al 90%, etanolo all'80%, etanolo al 70%, etanolo al 50%, PBS (tre piatti), soluzione di ematossilina, soluzione di eosina. Trasferisci le diapositive da un piatto all'altro secondo i passaggi seguenti ed esegui tutto a RT.
      NOTA: La procedura in ogni piatto può essere ripetuta circa 10 volte (ad esempio, se si utilizza un piatto da 20 diapositive, è possibile effettuare 200 macchie senza cambiare i liquidi).
    2. Deparaffinizzare le sezioni per incubazione a 65 °C per 30 minuti nell'incubatrice. Immergere gli scivoli in xilene per 30 min. Ripetere 1x in xilene nuovo per 30 min.
    3. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Ripetere 1x in nuovo etanolo al 100% per 5 min. Immergere le diapositive nella fila di etanolo, 90%, 80%, 70% e 50%, per 2 minuti in ogni diluizione.
    4. Immergere i vetrini in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 min. Pulire il liquido in eccesso da tutto il tessuto e dal lato posteriore dei vetrini.
    5. Macchiare le sezioni in soluzione di ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per 7-8 min. Lavare in acqua corrente per 30 s dal retro in modo da non danneggiare le sezioni. Ripetere il passaggio 5.3.4.
    6. Macchiare le sezioni con soluzione di eosina (vedere Tabella dei materiali) per 30 s. Lavare come indicato al passaggio 5.3.5 e quindi ripetere il passaggio 5.3.4.
    7. Immergere i vetrini in etanolo al 100% (alcool assoluto) per 2 min. Ripetere 1x in nuovo etanolo al 100% per 2 min.
    8. Immergere gli scivoli in xilene per 5 min. Ripetere 1x nel nuovo xilene per 5 min.
    9. Lasciare asciugare all'aria le sezioni per 15 minuti a RT. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su una copertina e quindi posizionarla nella parte superiore della sezione.
  4. Esaminare la sezione al microscopio ottico con un ingrandimento di 20x o 40x e acquisire immagini (Figura 7).

6. Test di permeabilità vascolare

NOTA: In alternativa alla misurazione dello spessore dell'orecchio, è possibile eseguire un test di permeabilità vascolare.

  1. Sensibilizzare i topi il giorno "0" (passi 3.1.1-3.1.3), quindi, il giorno "4", anestetizzare i topi (passo 3.2.2) e applicare direttamente hapten sulle orecchie (passo 3.2.4), omettendo la misurazione dell'orecchio 0 h.
  2. A 23 ore dopo la sfida, anestetizzare i topi (passo 3.2.2).
  3. Iniettare per via endovenosa (i.v.) 8,3 μL/g di peso corporeo dell'1% di colorante blu di Evans (vedere Tabella dei materiali) in Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
  4. Anestetizzare nuovamente i topi in anestesia profonda (passo 3.2.2)-1 ora dopo l'iniezione blu di Evans.
  5. Raccogliere biopsie dell'orecchio (passo 4.1).
    NOTA: Dopo questa procedura, i topi devono essere sottoposti a eutanasia (ad esempio, per lussazione cervicale).
  6. Estrarre il colorante dal tessuto, posizionare i punzoni auricolari nei tubi contenenti 1 mL di formammide e incubare a 37 °C nell'atmosfera del 5% di CO2 per 18 ore.
  7. Centrifugare le biopsie a 3.000 x g per 3 minuti a RT. Raccogliere i supernatanti con una pipetta.
  8. Misurare l'OD a una lunghezza d'onda di λ = 565 nm in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti contro un bianco contenente formammide. Il colore è stabile per 24 ore. Leggere la concentrazione dei campioni di prova dalla curva standard (utilizzare le concentrazioni di blu di Evans comprese tra 0,2-30 μg di colorante/mL di formammide) (Figura 8).
    NOTA: Le piastre devono essere fatte di polipropilene, che ha una capacità di legame inferiore in modo che le proteine o il DNA non si leghino.

7. Raccolta del siero e misurazione degli anticorpi anti-TNP immunoglobuline (IgG1)

  1. Dopo aver raccolto le biopsie dell'orecchio (passaggio 4.1), quando il topo è ancora in anestesia profonda, rimuovere il bulbo oculare con una pinzetta, esercitare una leggera pressione sul topo e raccogliere il sangue dal seno retroorbitale nel tubo (fiala con gel per ottenere siero, vedere Tabella dei materiali). Un metodo alternativo per raccogliere il sangue potrebbe essere quello di perforare il cuore con una siringa e raccogliere il sangue.
    NOTA: Il sangue deve essere raccolto dopo aver rimosso le orecchie. Lo stesso metodo di sanguinamento deve essere utilizzato in un intero studio a causa di potenziali differenze nei parametri ematici18. Dopo questa procedura, i topi devono essere eutanasizzati (ad esempio, per lussazione cervicale).
  2. Invertire un minimo di 6x, attendere 30 minuti affinché il sangue si coaguli, quindi centrifugare a 1.300-2.000 x g per 10 minuti a RT.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione è stabile a -20 °C per 6 mesi.
  3. Rivestire una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti con 50 μL di albumina sierica bovina coniugata con 2,4,6-trinitrofenile (TNP-BSA) disciolto in DPBS alla concertazione di 10 μg/mL. Successivamente, rivestire la seconda piastra con albumina sierica bovina (BSA) da sola disciolta in DPBS (sfondo) ad una concentrazione di 10 μg/ml. Incubare durante la notte a 4 °C.
    NOTA: il siero di topo contiene anticorpi (Abs) contro BSA, quindi i campioni devono essere testati su entrambe le piastre e, successivamente, è necessario eseguire un calcolo (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Lavare le piastre con 300 μL di DPBS contenenti lo 0,05% di Tween 20. Ripeti 3x.
  5. Preparare il diluente di saggio (AD): DPBS contenente l'1% di BSA. Bloccare i pozzetti con AD per 1 ora a RT. Lavare di nuovo (passaggio 7.4).
  6. Preparare uno standard interno (iSTD): sensibilizzare i topi con TNCB (passaggi 3.1.1-3.1.3) e, 10 giorni dopo la sensibilizzazione, raccogliere ed esaminare il siero da tutti i donatori (passo 7.1 e passo 7.2).
  7. Aggiungere alla piastra 50 μL di concentrazioni graduate di iSTD diluite con AD per realizzare la curva standard (descritta nella Tabella 3). Aggiungere alla piastra 50 μL di campioni di siero. Testare ogni campione e curva standard su entrambe le piastre (rivestite TNP-BSA e BSA). Incubare per 2 ore a RT. Lavare le piastre (passaggio 7.4).
  8. Aggiungere 50 μL di anticorpo monoclonale biotinilato anti-topo IgG1 (mAb, vedere Tabella dei materiali) diluito 1:250 con AD e incubare per 1 ora a RT. Lavare di nuovo (passaggio 7.4).
  9. Aggiungere 50 μL di streptavidina perossidasi di rafano (HRD streptavidina, vedere Tabella dei materiali) diluita 1:2000 con AD e incubare per 30 minuti a RT al buio. Lavare la piastra (passaggio 7.4).
  10. Aggiungere 50 μL di substrato TMB (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 30 minuti a RT al buio.
  11. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 25 μL di 1 M H2SO4; la reazione è stabile per 30 min.
  12. Misurare l'OD a una lunghezza d'onda di λ = 450 nm e uno sfondo di 570 nm (lo sfondo deve essere sottratto da ogni misurazione di 450 nm). Quando si presentano i risultati, sottrarre le misurazioni BSA dal TNP-BSA per i campioni e la curva standard. Quindi, calcolare l'unità (U) di anticorpi secondo la curva standard (Figura 9).

8. Trasferimento adottivo delle cellule effettrici CHS

NOTA: questa procedura è illustrata nella Figura 2.

  1. Donatori (al rapporto di un donatore:1 ricevente): sensibilizzare i topi con TNCB il giorno "0" (passi 3.1.1-3.1.3).
  2. Il giorno "4", anestetizzare l'anestesia profonda dei topi (passo 3.2.2).
  3. Isolare con pinza i linfonodi ascellari e inguinali (ALN) e la milza (SPL). Raggruppare gli ALN in un flaconcino e gli SPL in un altro.
    NOTA: C'è un linfonodo ascellare dietro il muscolo pettorale in ogni ascella. Un linfonodo inguinale nella regione dell'anca si trova accanto a tre vasi sanguigni. La milza si trova sul lato sinistro del corpo dietro l'intestino e lo stomaco19. Lavora con strumenti sterili in un armadio di biosicurezza per mantenere condizioni sterili. Dopo questa procedura, i topi devono essere eutanasizzati (ad esempio, per lussazione cervicale).
  4. Schiacciare il tessuto tra le estremità smerigliate di due vetrini per microscopio. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 μm (vedere Tabella dei materiali).
  5. Lavare le cellule con DPBS integrato con siero bovino fetale all'1% (FBS). Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospescere il pellet cellulare rimanente in 1-5,0 ml di DPBS.
  6. Contare le cellule vive usando un emocitometro20 con blu di trypan e mescolare 10 μL della sospensione cellulare con 90-990 μL (a seconda del numero di cellule) di blu di tripano. Prendere in considerazione la diluizione quando si calcola il numero di cella (10x-100x).
  7. Preparare una miscela di ALN e SPL (rapporto 1:1): 8,0 x 106 fino a 7,0 x 107/mouse in 200 μL di DPBS.
  8. Riceventi (topi singenici naïve): anestetizzare topi riceventi naïve (fase 3.2.2) e iniettare e.v. con una miscela preparata di cellule effettrici CHS (fase 8.7). Nel gruppo di controllo dei topi, non iniettare alcuna cellula.
  9. Misurare lo spessore dell'orecchio prima di (0 h) e dopo (24 h) la sfida (passaggi 3.2.1-3.2.6) (Figura 10).
  10. Inoltre, eseguire test su cellule effettrici CHS isolate (ad esempio, fenotipizzazione cellulare o misurazione di citochine prodotte dalle cellule effettrici CHS mediante citometria a flusso). Possono anche essere stabilite colture cellulari e la capacità delle cellule effettrici CHS di proliferare in presenza dell'antigene o la quantità di citochine secrete nei supernatanti di coltura può essere valutata21,22 (dati non presentati).
    NOTA: l'esecuzione di test aggiuntivi richiede di conseguenza un numero maggiore di donatori di cellule.

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Risultati

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Per l'induzione CHS, gli animali sono stati sensibilizzati tramite verniciatura della pelle (addominale) con 150 μL del 5% di TNCB o finta sensibilizzati con il solo veicolo. Il giorno "4", le risposte di gonfiore dell'orecchio di entrambe le orecchie sono state indotte dalla pittura a contatto (sfida) con 10 μL di TNCB allo 0,4% in entrambi i topi precedentemente sensibilizzati al contatto con TNCB (gruppo di test) e topi del gruppo di controllo (sham sensibilizzato). I dati presentati mostrano che i topi sensi...

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Discussione

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La CHS è indotta tramite apteni, che si legano agli antigeni autoproteici nella pelle, creando neoantigeni. La CHS è mediata dal reclutamento extravascolare locale di cellule T effettrici CHS antigene-effettrici circolanti, che provoca gonfiore nel tessuto sfidato, con un picco di 24 ore dopo l'esposizione della pelle secondaria allo stesso aptenato6. Il gonfiore del tessuto è causato principalmente dall'infiltrazione di leucociti e dalla deposizione di fibrina leucocitaria-dipendente

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione SUBZ. A020.22.060 dell'Università di Medicina di Wroclaw, Polonia, e da sovvenzioni del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo al 70%Merck KGaA, Darmstadt, Germania65350-Mper la disinfezione delle superfici
Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti, polipropileneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria655101per la misurazione del blu MPO ed Evans - le piastre devono essere realizzate in polipropilene, che ha una capacità di legame inferiore in modo che le proteine o il DNA non si leghino all'acetone
(reagente ACS, ≥ 99,5%)MerckKGaA, Darmstadt, Germania179124
Foglio di alluminioMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ185140
Bilancia analiticaSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermaniaPRACTUM224-1s, 29105177
Processatore automatizzato di tessutiMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212preparare automaticamente i campioni di tessuto fissandoli, disidratandoli, eliminandoli e infiltrandoli con paraffina
BD Vacutainer SST II Advance (tubo con gel per ottenere siero)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD
Kit di acido bicinconnico per la determinazione delle proteineMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaBCA1-1KT
Biotina Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (albumina sierica bovina)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaA9418, 2 mg/mL
Filtro cellulare, dimensione dei pori 70 μ mBIOLOGIX, Cina15-1070adatto per provette da 50 mL
Vetrino coprioggettiVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti631-158324 mm, ma è possibile utilizzare pipette monouso di diverse
dimensioni Capacità: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ soluzione salina tamponata con fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144senza calcio, senza magnesio, coltura cellulare di mammifero
DPX Mountant per istologiaMerck KGaA, Darmstadt, Germania6522mezzi di montaggio per H-E, potrebbe essere utilizzato altri, ad esempio, balsamo del Canada
Dumont 5 pinzette - drittoAnimalab, Poznan, Polonia11251-10FSTstrumenti chirurgici per procedure su topi (dovrebbe essere sterilizzato)
Dumont 7 pinzette - piegatoAnimalab, Poznan, Polonia11272-50FSTstrumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterilizzati)
Eosina Y solution, alcolicaMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germania3,01,20.086
polipropilene Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germania3,01,20,094polipropilene, fondo rotondo (le perle di omogeneizzazione possono muoversi facilmente)
Etanolo 100% (alcol assoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.07017
Etanolo 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaE2129
FBS (siero fetale bovino)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
Soluzione di formalina, tampone neutro, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaHT501128
Formamide 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaF7503
Congelatore -20 gradi CBosch, GermaniaGSN54AW30
Frigorifero +4 C / congelatore -20 ° CBosch, GermaniaKGV36V10Colture cellulari di mammiferi, qualificato, Brasile, 10 vetrini
microskope in vetroVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Vetrini che eliminano la necessità di applicare materiali adesivi o rivestimenti proteici, per prevenire la perdita di sezioni di tessuto durante la colorazione.
Graph Pad PrismaGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Sapone grigioPollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PoloniaBialy jelen saponebar grigio Sapone Bar Naturale Ipoallergenico. Prodotto generalmente disponibile
H2SO4 (acido solforico) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.60313
Soluzione di ematossilina HarrisMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaEmocitometro HHS16
VWR, Avantor, U.S.A612-5719, che è più accurata
Bromuro di esadeciltrimetilammonioMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaOmogeneizzatore H5882
QIAGEN Hilden, GermaniaLyser tissutale LT, omogeneizzatore SN 23.1001/05234con perle in acciaio inossidabile (diametro 5 mm) per provette da centrifuga da 2 mL
Streptavidina perossidasi di rafano (streptavidina HRP)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Soluzione di perossido di idrogeno (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaH1009
Incubatore Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germania4107106837 oC nell'atmosfera del 5 % di CO2 e 65 0C per la deparaffinazione le sezioni per istologia
Ketamina 100 mg/mL, soluzione iniettabileBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poloniacat.# non disponibile
KH2PO4 (diidrogeno fosfato di potassio) 99,995% base anidraMerck KGaA, Darmstadt, Germania1.05108
Centrifuga da laboratorioHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermaniaB00013899velocità a 300 x g, con raffreddamento a 4 0C
Centrifuga da laboratorioHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germania75002425velocità a 3.000 x g, con raffreddamento a 4 0C
Maschera (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti111-0917per lavorare con l'orto-dianisina dicloridrato
Unitàdi allevamento di topi della Cattedra di Scienze Biomediche, Facoltà di Scienze della Salute, Jagellonian University Medical College, Cracovia, PoloniaCBA/J, C57BL/6
MicrometroMitutoyo, Tokyo, Giappone193-111cifre Micrometro esterno, arresto a cricchetto, intervallo 0-25 mm, graduazione 0,001 mm, precisione +/-0,002 mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
micropiastra, 96 pozzetti, microlon, alto legame (per test ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria655061con superfici leganti maxi-sorp per risultati affidabili e riproducibili nei saggi colorimetrici
Microscopio con obiettiviLeica Microsystems CMS GmbH, GermaniaDM1000, 294011-082007L'istologia presentata nell'articolo è stata eseguita con il sistema di imaging EVOS M5000 di ThermoFisher Scientific, con obiettivi: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD e FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD
Mieloperossidasi da leucociti umani (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodio fosfato bibasico eptaidrato)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaS9390
Olio d'olivaMerck KGaA, Darmstadt, Germania75343puro, naturale
OptEIA Mouse IFN-γ Set ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisina dicloridratoMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaD3252
Cera di paraffinaMerck KGaA, Darmstadt, Germania76242perline, solido ceroso
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, phmetro per colture cellulari di mammifero
Elmetron, PoloniaCP-401
Pipette, volume variabile con punteMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaEP3123000900-1EAconfezione da 3, opzione 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, include epT.I.P.S.
Lama di rasoioVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati UnitiPERS94-0462Lame per raschietto e taglierina, bordo singolo, dorso in alluminio, 100 lame per scatola, confezionato singolarmente
Microtomo rotanteMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Forbici - dritte, affilate / affilateAnimalab, Poznan, Polonia14060-10FSTStrumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterili)
Tappo a vite (parte superiore aperta)Merck KGaA, Darmstadt, Germania27056tappo foro in polipropilene nero, per l'uso con 22  Fiala da ml con filettatura 20-400
SpettrofotometroBioTek Instruments, U.S.A201446spettrofotometro universale per micropiastre: λ intervallo: 200 - 999 nm, intervallo di misurazione dell'assorbanza: 0,000 - 4,000 Piatto di colorazione in Abs
20 vetrini con rackMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaS6141ad es. 20 piastre per la colorazione dei vetrini complete di coperchi, rack per vetrini e maniglia
Punzone per biopsia sterile monouso da 6 mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Forbici chirurgicheAnimalab, Poznan, Polonia52138-46strumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterilizzati)
Cassette per il trattamento dei tessutiMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ672122Cassette per il trattamento/inclusione dei tessuti con coperchio
Set di reagenti per substrati TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitroclorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, GiapponeC0307
TNP-BSA (albumina sierica bovina coniugata con 2,4,6-trinitrofenil)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (reagente per l'estrazione di proteine tissutali)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Provette 15 mL steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430055 (Corning)polipropilene, fondo conico
Provette 50 mL, steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430290 (Corning)polipropilene, fondo conico
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaP1379
Fiale, tappo a vite, vetro trasparente (solo flaconcino) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germania27173per la preparazione di aptene, avvitato in modo che non evapori
Bagno d'acquaAJL Electronic, PoloniaLW102
Dispenser di cera (paraffina)VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti114-8737
Xilazina (xilapan 20 mg/mL) soluzione iniettabileVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poloniacat.# non disponibile
Xilene (grado istologico)Merck KGaA, Darmstadt, Germania534056
366882 Saggi e analisi delle proteine A3160802 in da 50 mL, SuperFrost Plus Si consiglia la camera di conteggio manuale

Riferimenti

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Errata corrige

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Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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