Articolo metodologico

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 settembre 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

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Sommario

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L'ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale murino di dermatite allergica da contatto (ACD). ChS si basa sulla sensibilizzazione con hapten reattivo dipingendo la pelle rasata del torace e dell'addome, con una successiva sfida della pelle dell'orecchio con un hapten diluito, causando una reazione di gonfiore che viene valutata in vari modi.

Abstract

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L'ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale di dermatite allergica da contatto (ACD) che può essere studiato nei topi. Questo studio mira a presentare un metodo di laboratorio oggettivo che può aiutare a studiare la reazione CHS nei topi, che può essere misurata e quantificata da vari test. Per indurre CHS, il giorno "0", i topi sono stati sensibilizzati su un punto precedentemente rasato dipingendo la pelle addominale con l'apteten 2,4,6-trinitroclorobenzene (TNCB) in una miscela acetone-etanolo, mentre i topi a controllo negativo sono stati sensibilizzati fintamente con la miscela veicolo da solo-acetone-etanolo. Il giorno "4", lo spessore dell'orecchio di base è stato misurato con un micrometro prima dell'elicitazione di CHS (sfida) dipingendo entrambe le orecchie con TNCB diluito sia nel gruppo di prova che in quello di controllo. Dopo 24 ore, il gonfiore dell'orecchio è stato misurato con un micrometro. CHS è un esempio di una risposta immunitaria mediata da cellule T che provoca gonfiore nel tessuto infiammato, con un picco di 24 ore dopo la sfida cutanea con lo stesso apteno. Un aumento dell'edema dell'orecchio correlato all'aumento del peso dell'orecchio, all'attività della mieloperossidasi (MPO), alla concentrazione di citochine pro-infiammatorie negli estratti dell'orecchio, all'aumento dell'ispessimento del derma edematoso nell'esame istologico e alla permeabilità vascolare dell'orecchio. C'è stato anche un aumento della concentrazione di anticorpi IgG1 specifici del TNP nei sieri del gruppo di test rispetto ai topi di controllo. Inoltre, chs può essere trasferito con successo con le cellule effettrici CHS ottenute da donatori precedentemente sensibilizzati con TNCB. Le cellule effettrici CHS sono state somministrate per via endovenosa in topi riceventi naïve, che sono stati successivamente sfidati con lo stesso apteno diluito. Il gonfiore dell'orecchio è stato misurato con un micrometro 24 ore dopo.

Introduzione

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La dermatite allergica da contatto (ACD) è una comune malattia infiammatoria della pelle nei paesi industrializzati causata da una reazione di ipersensibilità di tipo IV derivante dall'esposizione a sostanze chimiche a basso peso molecolare chiamate apteni. Le sostanze che causano sensibilizzazione al contatto nell'uomo includono ioni di metalli pesanti (cromo, nichel, ferro, cobalto), trementina, profumi, coloranti e conservanti presenti nei cosmetici (ad esempio, p-fenilendiammina), alcuni farmaci (ad esempio, neomicina, benzocaina), antibiotici β-lattamici (cioè penicillina), sostanze chimiche prodotte dalle piante (pentadecacatecolo, una sostanza presente nell'ede....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti presentati in questo articolo sono stati condotti secondo le linee guida del 1 ° Comitato etico locale sulla sperimentazione animale a Cracovia. Tutte le procedure descritte sono state eseguite secondo le raccomandazioni locali, in particolare per quanto riguarda l'uso di ketamina / xilazina come anestetico, utilizzando entrambi i lati delle orecchie per applicare la sostanza / aptena, tagliando l'orecchio e raccogliendo sangue mediante rimozione del bulbo oculare. Per il presente studio sono stati utilizzati BALB/c (aplotipo H-2d), CBA/J (H-2k) e C57BL/6 (H-2b) di età maschile e femminile, di 6-12 settimane di et....

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Risultati

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Per l'induzione CHS, gli animali sono stati sensibilizzati tramite verniciatura della pelle (addominale) con 150 μL del 5% di TNCB o finta sensibilizzati con il solo veicolo. Il giorno "4", le risposte di gonfiore dell'orecchio di entrambe le orecchie sono state indotte dalla pittura a contatto (sfida) con 10 μL di TNCB allo 0,4% in entrambi i topi precedentemente sensibilizzati al contatto con TNCB (gruppo di test) e topi del gruppo di controllo (sham sensibilizzato). I dati presentati mostrano che i topi sensi.......

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Discussione

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La CHS è indotta tramite apteni, che si legano agli antigeni autoproteici nella pelle, creando neoantigeni. La CHS è mediata dal reclutamento extravascolare locale di cellule T effettrici CHS antigene-effettrici circolanti, che provoca gonfiore nel tessuto sfidato, con un picco di 24 ore dopo l'esposizione della pelle secondaria allo stesso aptenato6. Il gonfiore del tessuto è causato principalmente dall'infiltrazione di leucociti e dalla deposizione di fibrina leucocitaria-dipendente

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione SUBZ. A020.22.060 dell'Università di Medicina di Wroclaw, Polonia, e da sovvenzioni del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo al 70%Merck KGaA, Darmstadt, Germania65350-Mper la disinfezione delle superfici
Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti, polipropileneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria655101per la misurazione del blu MPO ed Evans - le piastre devono essere realizzate in polipropilene, che ha una capacità di legame inferiore in modo che le proteine o il DNA non si leghino all'acetone
(reagente ACS, ≥ 99,5%)MerckKGaA, Darmstadt, Germania179124
Foglio di alluminioMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ185140
Bilancia analiticaSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermaniaPRACTUM224-1s, 29105177
Processatore automatizzato di tessutiMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212preparare automaticamente i campioni di tessuto fissandoli, disidratandoli, eliminandoli e infiltrandoli con paraffina
BD Vacutainer SST II Advance (tubo con gel per ottenere siero)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD
Kit di acido bicinconnico per la determinazione delle proteineMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaBCA1-1KT
Biotina Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (albumina sierica bovina)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaA9418, 2 mg/mL
Filtro cellulare, dimensione dei pori 70 μ mBIOLOGIX, Cina15-1070adatto per provette da 50 mL
Vetrino coprioggettiVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti631-158324 mm, ma è possibile utilizzare pipette monouso di diverse
dimensioni Capacità: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ soluzione salina tamponata con fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144senza calcio, senza magnesio, coltura cellulare di mammifero
DPX Mountant per istologiaMerck KGaA, Darmstadt, Germania6522mezzi di montaggio per H-E, potrebbe essere utilizzato altri, ad esempio, balsamo del Canada
Dumont 5 pinzette - drittoAnimalab, Poznan, Polonia11251-10FSTstrumenti chirurgici per procedure su topi (dovrebbe essere sterilizzato)
Dumont 7 pinzette - piegatoAnimalab, Poznan, Polonia11272-50FSTstrumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterilizzati)
Eosina Y solution, alcolicaMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf, Germania3,01,20.086
polipropilene Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLEppenforf, Germania3,01,20,094polipropilene, fondo rotondo (le perle di omogeneizzazione possono muoversi facilmente)
Etanolo 100% (alcol assoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.07017
Etanolo 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaE2129
FBS (siero fetale bovino)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
Soluzione di formalina, tampone neutro, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaHT501128
Formamide 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaF7503
Congelatore -20 gradi CBosch, GermaniaGSN54AW30
Frigorifero +4 C / congelatore -20 ° CBosch, GermaniaKGV36V10Colture cellulari di mammiferi, qualificato, Brasile, 10 vetrini
microskope in vetroVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Vetrini che eliminano la necessità di applicare materiali adesivi o rivestimenti proteici, per prevenire la perdita di sezioni di tessuto durante la colorazione.
Graph Pad PrismaGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Sapone grigioPollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PoloniaBialy jelen saponebar grigio Sapone Bar Naturale Ipoallergenico. Prodotto generalmente disponibile
H2SO4 (acido solforico) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germania1.60313
Soluzione di ematossilina HarrisMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaEmocitometro HHS16
VWR, Avantor, U.S.A612-5719, che è più accurata
Bromuro di esadeciltrimetilammonioMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaOmogeneizzatore H5882
QIAGEN Hilden, GermaniaLyser tissutale LT, omogeneizzatore SN 23.1001/05234con perle in acciaio inossidabile (diametro 5 mm) per provette da centrifuga da 2 mL
Streptavidina perossidasi di rafano (streptavidina HRP)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Soluzione di perossido di idrogeno (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaH1009
Incubatore Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germania4107106837 oC nell'atmosfera del 5 % di CO2 e 65 0C per la deparaffinazione le sezioni per istologia
Ketamina 100 mg/mL, soluzione iniettabileBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poloniacat.# non disponibile
KH2PO4 (diidrogeno fosfato di potassio) 99,995% base anidraMerck KGaA, Darmstadt, Germania1.05108
Centrifuga da laboratorioHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, GermaniaB00013899velocità a 300 x g, con raffreddamento a 4 0C
Centrifuga da laboratorioHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germania75002425velocità a 3.000 x g, con raffreddamento a 4 0C
Maschera (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti111-0917per lavorare con l'orto-dianisina dicloridrato
Unitàdi allevamento di topi della Cattedra di Scienze Biomediche, Facoltà di Scienze della Salute, Jagellonian University Medical College, Cracovia, PoloniaCBA/J, C57BL/6
MicrometroMitutoyo, Tokyo, Giappone193-111cifre Micrometro esterno, arresto a cricchetto, intervallo 0-25 mm, graduazione 0,001 mm, precisione +/-0,002 mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
micropiastra, 96 pozzetti, microlon, alto legame (per test ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria655061con superfici leganti maxi-sorp per risultati affidabili e riproducibili nei saggi colorimetrici
Microscopio con obiettiviLeica Microsystems CMS GmbH, GermaniaDM1000, 294011-082007L'istologia presentata nell'articolo è stata eseguita con il sistema di imaging EVOS M5000 di ThermoFisher Scientific, con obiettivi: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD e FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD
Mieloperossidasi da leucociti umani (MPO standard)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodio fosfato bibasico eptaidrato)Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaS9390
Olio d'olivaMerck KGaA, Darmstadt, Germania75343puro, naturale
OptEIA Mouse IFN-γ Set ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisina dicloridratoMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaD3252
Cera di paraffinaMerck KGaA, Darmstadt, Germania76242perline, solido ceroso
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA20012027pH 7.2, phmetro per colture cellulari di mammifero
Elmetron, PoloniaCP-401
Pipette, volume variabile con punteMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaEP3123000900-1EAconfezione da 3, opzione 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, include epT.I.P.S.
Lama di rasoioVWR, Radnor, Pennsylvania, Stati UnitiPERS94-0462Lame per raschietto e taglierina, bordo singolo, dorso in alluminio, 100 lame per scatola, confezionato singolarmente
Microtomo rotanteMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Forbici - dritte, affilate / affilateAnimalab, Poznan, Polonia14060-10FSTStrumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterili)
Tappo a vite (parte superiore aperta)Merck KGaA, Darmstadt, Germania27056tappo foro in polipropilene nero, per l'uso con 22  Fiala da ml con filettatura 20-400
SpettrofotometroBioTek Instruments, U.S.A201446spettrofotometro universale per micropiastre: λ intervallo: 200 - 999 nm, intervallo di misurazione dell'assorbanza: 0,000 - 4,000 Piatto di colorazione in Abs
20 vetrini con rackMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaS6141ad es. 20 piastre per la colorazione dei vetrini complete di coperchi, rack per vetrini e maniglia
Punzone per biopsia sterile monouso da 6 mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, USA33-36
Forbici chirurgicheAnimalab, Poznan, Polonia52138-46strumenti chirurgici per procedure su topi (devono essere sterilizzati)
Cassette per il trattamento dei tessutiMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaZ672122Cassette per il trattamento/inclusione dei tessuti con coperchio
Set di reagenti per substrati TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555214
TNCB (2,4,6-trinitroclorobenzene)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, GiapponeC0307
TNP-BSA (albumina sierica bovina coniugata con 2,4,6-trinitrofenil)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (reagente per l'estrazione di proteine tissutali)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Provette 15 mL steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430055 (Corning)polipropilene, fondo conico
Provette 50 mL, steriliMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaCLS430290 (Corning)polipropilene, fondo conico
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermaniaP1379
Fiale, tappo a vite, vetro trasparente (solo flaconcino) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germania27173per la preparazione di aptene, avvitato in modo che non evapori
Bagno d'acquaAJL Electronic, PoloniaLW102
Dispenser di cera (paraffina)VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti114-8737
Xilazina (xilapan 20 mg/mL) soluzione iniettabileVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poloniacat.# non disponibile
Xilene (grado istologico)Merck KGaA, Darmstadt, Germania534056
366882 Saggi e analisi delle proteine A3160802 in da 50 mL, SuperFrost Plus Si consiglia la camera di conteggio manuale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....

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Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Tag

Risposta delle cellule Tgonfiore dell orecchiosensibilizzazione all aptenesaggio della mieloperossidasipermeabilit vascolaretrasferimento di cellule effettriciisolamento dei linfonodi

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