Summary
تعد طرق قياس نشاط ALDH1A1 في الخلايا الحية أمرا بالغ الأهمية في أبحاث السرطان نظرا لوضعها كعلامة حيوية للجذع. في هذه الدراسة ، استخدمنا مسبارا فلوروجينيا انتقائيا للشكل لتحديد المستويات النسبية لنشاط ALDH1A1 في لوحة من خمسة خطوط خلايا سرطان المبيض.
Abstract
غالبا ما يعزى الانتكاس بعد علاج السرطان إلى استمرار مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية المعروفة باسم الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) ، والتي تتميز بقدرتها الرائعة على بدء الورم وتجديده ذاتيا. اعتمادا على أصل الورم (على سبيل المثال ، المبايض) ، يمكن أن يختلف ملف تعريف العلامات الحيوية لسطح CSC بشكل كبير ، مما يجعل تحديد هذه الخلايا عن طريق تلطيخ المواد الكيميائية المناعية مسعى صعبا. على العكس من ذلك ، برز ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 (ALDH1A1) كعلامة ممتازة لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية ، نظرا لملف تعريف التعبير المحفوظ في جميع الخلايا السلفية تقريبا بما في ذلك الخلايا الجذعية السرطانية. ينتمي الشكل المتماثل ALDH1A1 إلى عائلة فائقة من 19 إنزيما مسؤولة عن أكسدة مختلف الألدهيدات الداخلية و xenobiotic إلى منتجات حمض الكربوكسيل المقابلة. قام Chan et al. مؤخرا بتطوير AlDeSense ، وهو مسبار "تشغيل" انتقائي للشكل للكشف عن نشاط ALDH1A1 ، بالإضافة إلى كاشف تحكم مطابق غير تفاعلي (Ctrl-AlDeSense) لحساب التلوين خارج الهدف. وقد ثبت بالفعل أن هذه الأداة الانتقائية للشكل الأيزوفورم هي أداة كيميائية متعددة الاستخدامات من خلال الكشف عن نشاط ALDH1A1 في خلايا ابيضاض الدم النقوي K562 ، والغلاف الثديي ، والطعوم الخارجية CSC المشتقة من سرطان الجلد. في هذه المقالة ، تم عرض فائدة المسبار من خلال القياس الفلوري الإضافي ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتجارب قياس التدفق الخلوي حيث تم تحديد نشاط ALDH1A1 النسبي في لوحة من خمسة خطوط خلايا سرطان المبيض.
Introduction
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تظهر خصائص تشبه الخلايا الجذعية1. على غرار نظيراتها غير السرطانية ، تمتلك CSCs قدرة غير عادية على التجديد الذاتي والتكاثر. جنبا إلى جنب مع الآليات المدمجة الأخرى ، مثل تنظيم ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP ، غالبا ما يتم تجنيب الخلايا الجذعية السرطانية من جهود إزالة الانتفاخ الجراحية الأولية ، بالإضافة إلى العلاج المساعداللاحق 2. نظرا لدورها الحاسم في مقاومة العلاج3 ، والانتكاس4 ، وورم خبيث5 ، أصبحت الخلايا الجذعية السرطانية أولوية في أبحاث السرطان. على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من مستضدات سطح الخلية (على سبيل المثال ، CD133) التي يمكن استخدامها لتحديد CSCs6 ، إلا أن الاستفادة من النشاط الأنزيمي لنازعة هيدروجين الألدهيد (ALDHs) الموجودة في السيتوبلازم قد ظهرت كبديل جذاب7. ALDHs هي عائلة فائقة من 19 إنزيما مسؤولا عن تحفيز أكسدة الألدهيدات الداخلية والغريبة المنشأ التفاعلية مع منتجات حمض الكربوكسيل المقابلة8.
بشكل عام ، تعد إزالة سموم الألدهيد أمرا بالغ الأهمية في حماية الخلايا من أحداث التشابك غير المرغوب فيها والإجهاد التأكسدي الذي قد يضر بسلامة الخلايا الجذعية9. علاوة على ذلك ، يتحكم الشكل الإيزوفورم 1A1 في استقلاب حمض الريتينويك ، والذي بدوره يؤثر على الجذع عبر إشارات ريتينالديهيد10. تم مؤخرا تطوير AlDeSense 11,12 ، وهو مسبار استشعار قائم على نشاط جزيء صغير (ABS) للكشف بشكل انتقائي عن نشاط ALDH1A1. تحقق تصميمات ABS الكشف عن التحليل من خلال تغيير كيميائي بدلا من حدث ملزم ، مما يسمح بانتقائية عالية وتقليل الاستجابات خارج الهدف13،14،15،16. يعتمد مبدأ تصميم المسبار الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل على آلية تبريد نقل الإلكترون المستحث ضوئيا (d-PeT)17 ، والتي تنشأ من المجموعة الوظيفية للألدهيد ، والتي تعمل على قمع التوقيع الفلوري للمسبار18. عند التحويل بوساطة ALDH1A1 إلى الحمض الكربوكسيلي ، يتم فتح الانحلال الإشعاعي لإنتاج منتج شديد الفلورسنت. نظرا لأن التبريد d-PeT ليس فعالا بنسبة 100٪ أبدا ، فقد تم النظر في التألق المتبقي الذي قد يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة محتملة عند إنشاء هذا الفحص من خلال تطوير Ctrl-AlDeSense ، وهو كاشف غير مستجيب له خصائص فيزيائية ضوئية مطابقة (على سبيل المثال ، العائد الكمومي) ونمط تلطيخ سيتوبلازمي متطابق في الخلايا. عند استخدامه جنبا إلى جنب ، يمكن لهذا الاقتران الفريد أن يميز بشكل موثوق الخلايا ذات النشاط العالي ALDH1A1 عن تلك التي تظهر مستويات منخفضة عن طريق القياس الفلوري والتصوير الجزيئي وقياس التدفق الخلوي. ترتبط العديد من المزايا الرئيسية باستخدام الأصباغ القابلة للتنشيط الانتقائية للأشكال على الطرق الكيميائية المناعية التقليدية. على سبيل المثال ، يفترض أن تكون الخلايا الجذعية السرطانية مدفونة بعمق داخل الورم ، وبالتالي يمكن الوصول إليها بشكل أكبر لجزيء صغير بالنسبة للأجسام المضادة الكبيرة19. بالإضافة إلى ذلك ، لا يقوم منتج الفلورسنت المقلوب بتعديل أي مكون خلوي تساهميا ، مما يعني أنه يمكن إزالته بسهولة عبر دورات الغسيل لترك CSC في حالة غير معدلة. أخيرا ، تحدد استجابة التشغيل فقط الخلايا والوظائف القابلة للحياة ، مثل الكثير من مقايسة MTT ، نظرا لاعتمادها على العامل المساعد NAD +.
الشكل 1: تخطيطي يوضح تشغيل الفلورسنت ل AlDeSense. يتم تنشيط الصبغة الانتقائية للشكل الثابت بواسطة ALDH1A1 ويمكن استخدامها لتحديد نشاط ALDH1A1 المرتفع في خلايا سرطان المبيض عن طريق القياس الفلوري والتصوير الجزيئي وقياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في العمل السابق ، نجح فحص المسبار الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل في تقسيم خلايا ALDH العالية (ALDH +) إلى طبقات من خلايا ALDH المنخفضة (ALDH-) في خلايا سرطان الدم المزمن البشرية K562 ، وخلايا سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 ، وخلايا سرطان الجلد B16F0 الفئران. هذا مهم لأنه بالنسبة للعديد من أنواع السرطان ، يشير التعبير البروتيني المرتفع ALDH1A1 إلى أسوأ المراجعالسريرية 20. هذا يفترض أن المستويات المرتفعة من ALDH1A1 تدل على الخلايا الجذعية السرطانية التي يمكن أن تتهرب من العلاج ، وتطور المقاومة ، وتنتشر في جميع أنحاء الجسم. ومع ذلك ، في حالة سرطان المبيض ، هناك دراسات تشير إلى نتيجة معاكسة (يرتبط تعبير ALDH1A1 المرتفع بتحسين بقاء المريض)21،22،23،24. في حين أن هذا قد يبدو متناقضا للوهلة الأولى ، إلا أن التعبير لا يرتبط بالضرورة بنشاط الإنزيم ، والذي قد يتأثر بالتغيرات في البيئة الدقيقة للورم (على سبيل المثال ، تدفق الأس الهيدروجيني ، وتدرجات الأكسجين) ، وتوافر العامل المساعد NAD + أو ركائز الألدهيد ، ومستويات الأحماض الكربوكسيلية (تثبيط المنتج) ، والتعديلات اللاحقة للترجمة التي يمكن أن تغير نشاط الإنزيم25 . بالإضافة إلى ذلك ، ينقسم سرطان المبيض إلى خمسة أنواع نسيجية رئيسية (مصلية عالية الدرجة ، مصلية منخفضة الدرجة ، بطانة الرحم ، خلية صافية ، ومخاطية) ، والتي نفترض أنها ستتميز بمستويات متغيرة من نشاط ALDH1A126. بهدف التحقيق في نشاط ALDH1A1 في أورام المبيض ، تم استخدام مقايسة مسبار فلوروجيني انتقائي للشكل لتحديد مجموعات ALDH1A1 + في لوحة من خمسة خطوط خلايا سرطان المبيض تنتمي إلى الأنواع النسيجية المختلفة المذكورة أعلاه. تشمل خطوط الخلايا التي تم اختبارها في هذه الدراسة خلايا BG-1 و Caov-3 و IGROV-1 و OVCAR-3 و PEO4 ، والتي تغطي الخلايا الصافية والأنماط النسيجية المصلية. هنا ، تم تسليط الضوء على تنوع وقابلية تعميم المسبار لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية للباحثين الذين يسعون إلى إجراء دراسات مماثلة في خطوط الخلايا السرطانية الخالدة الأخرى وكذلك عينات المرضى. سيلقي استخدام AlDeSense الضوء على المسارات الكيميائية الحيوية المشاركة في صيانة CSC في البيئات الدقيقة المعقدة للأنسجة ويحتمل أن يكون بمثابة أداة سريرية لتحديد التشخيص وقياس عدوانية السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. قياس إجمالي نشاط ALDH1A1 في تجانس خلايا سرطان المبيض عن طريق القياس الفلوري
- ذوبان 1 × 106 خلايا في دورق زراعة الخلايا T25 في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا التالية:
- IGROV-1 و PEO4: معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S).
- BG-1 و Caov-3: وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 مع 20٪ FBS و 1٪ P / S و 0.01 مجم / مل من الأنسولين.
- الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ممرين إلى ثلاثة ممرات. تأكد من أن الخلايا لا تتجاوز التقاء 80٪ -90٪ قبل المرور.
- التربسين الخلايا في 0.25٪ التربسين لمدة 10 دقائق ، عدها باستخدام عداد الخلايا الآلي ، وبيليه 1 × 107 خلايا عن طريق الطرد المركزي (180 × جم) عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط ، واغسل الحبيبات عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من 1x PBS ، وأعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي في ظل نفس الظروف الموضحة في الخطوة 4.
- إعادة تعليق الخلايا في محلول مثبط الأنزيم البروتيني 1x في 1x PBS. استخدم 1 مل من هذا المحلول لكل 2.5 × 106 خلايا.
- قم بتعليق الخلية على الجليد لمدة 2 دقيقة (نبضة 1 ثانية ، سعة 40٪) باستخدام مسبار خالط الخلية.
- حبيبات غير قابلة للذوبان / أجزاء الغشاء عن طريق الطرد المركزي (3200 × جم) عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية والحفاظ عليها ، لأن هذا هو التجانس الذي سيتم استخدامه في الخطوات اللاحقة. افصل التجانسات إلى ثلاث مكعبات لإجراء التجربة في ثلاث نسخ.
- أضف المسبار إلى التجانس للحصول على تركيز مسبار نهائي يبلغ 4 ميكرومتر. ماصة لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لخلط المحلول جيدا.
- قم بقياس إشارة الفلورسنت مباشرة بعد الإضافة وبعد أوقات الحضانة المرغوبة على مقياس الفلور. يمكن تحسين وقت الحضانة لرؤية الحد الأقصى لتشغيل الطي (1 ساعة في هذه التجربة). يجب أن يكون وقت الحضانة ثابتا عبر جميع خطوط الخلايا المقارنة.
- اضبط الطول الموجي للإثارة على 496 نانومتر.
- اضبط الانبعاث على 510-600 نانومتر.
- اضبط عرض الشق على 0.5 مم.
- ماصة المحلول في كفيت كوارتز سعة 1 مل ، ضعه في مقياس الفلور ، واضغط على المسح الضوئي.
- اقسم شدة التألق النهائية عند 516 نانومتر (أقصى طول موجي للفلورسنت) على الشدة عند نفس الطول الموجي من القراءة الأولية لتحديد تنشيط الطي للصبغة الانتقائية للشكل المتساوي.
2. استخدام المجهر الفلوري لتصوير الخلايا ذات النشاط العالي ALDH1A1
- قم بإذابة 1 × 106 خلايا في دورق زراعة الخلايا T25 في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا المناسبة.
- الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ممرين إلى ثلاثة ممرات. تأكد من أن الخلايا لا تتجاوز التقاء 80٪ -90٪ قبل المرور.
- في اليوم السابق للتصوير متحد البؤر ، × اللوحة 4 105 خلايا في شريحة غرفة ذات 8 آبار.
- قم بتغطية قاع كل بئر ببولي-L-lysine (0.1 مجم / مل ، 100 ميكرولتر لكل بئر) لمدة 10 دقائق ، ثم شفطها لاحقا.
- اغسل كل بئر 3 مرات عن طريق إضافة ماء من الدرجة المزروعة بالخلايا (100 ميكرولتر لكل بئر) وشفطه.
- التربسين الخلايا في 0.25٪ التربسين لمدة 10 دقائق ، عدها باستخدام عداد الخلايا الآلي ، ولوحة الخلايا في 4 × 105 خلايا لكل بئر.
- دع الخلايا تستقر وتعلق بين عشية وضحاها (12-16 ساعة).
- قم بنضح وسائط النمو وإضافة وسائط خالية من المصل (500 ميكرولتر لكل بئر) ، مع استكمالها ب 2 ميكرومتر من المسبار أو مسبار التحكم.
- احتضان المسبار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وصور الخلايا على الفور.
- قم بتشغيل المجهر متحد البؤر واضبط العينة.
- قم بتحميل العينة بعناية بأقل تكبير ؛ العثور على الخلايا لضمان الوضع الصحيح.
- تأكد من تكبير العدسة الشيئية بمعدل 10 أضعاف وحدد موقع الخلايا.
- لهذه التجربة ، يلزم وجود قناة FITC (الإثارة: ليزر 488 نانومتر ؛ الانبعاث: 516-521 نانومتر) وقناة T-PMT (الضوء المرسل). حدد موقع الخلايا التي تستخدم T-PMT وركز عليها للتركيز على نفس المستوى z لكامل التجربة لإزالة التحيز.
- اضبط طاقة الليزر وكسب FITC على الإعداد المناسب ، حيث يمكن اكتشاف الإشارة من عينات Ctrl-AlDeSense AM إلى الحد الأدنى ، مع الاستمرار في رؤية الإشارة في عينات AlDeSense AM. يمكن ضبط كل معلمة عن طريق تحريك الشريط المقابل. قد يلزم ضبط الإعدادات عدة مرات لتحديد المعلمات الصحيحة. بمجرد التحسين ، أكمل بقية التجربة داخل خط الخلية هذا باستخدام معلمات متطابقة.
- التقط ثلاث صور لكل بئر ليصبح المجموع ثلاثة آبار لكل حالة معالجة (تسع صور في المجموع). ركز على المستوى المناسب باستخدام T-PMT لتجنب التحيز بدلا من استخدام قناة التألق أو الصورة المدمجة.
- قم بمعالجة الصور لتحديد النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1+.
- باستخدام برنامج معالجة الصور ، قم بتقسيم ملف czi إلى قنوات مختلفة.
- احسب العدد الإجمالي للخلايا وإجمالي عدد خلايا الفلورسنت.
- لتحديد النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1+ ، قسم عدد خلايا الفلورسنت على إجمالي عدد الخلايا في كل صورة. من الضروري العد بنفس الطريقة لكل صورة دون التلاعب بالصور ، على سبيل المثال ، قد يؤدي ضبط السطوع إلى إضافة متغير مربك.
3. تطبيق قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا ذات النشاط العالي ALDH1A1
- قم بإذابة 1 × 106 خلايا في دورق زراعة الخلايا T25 في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا المناسبة.
- الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ممرين إلى ثلاثة ممرات. تأكد من أن الخلايا لا تتجاوز التقاء 80٪ -90٪ قبل المرور.
- التربسين, عد, وبيليه الخلايا في أنبوب طرد مركزي 15 مل عن طريق الطرد المركزي (180 × غرام) في 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول مسبار / مسبار تحكم 2 ميكرومتر في PBS. قم بهز الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة لضمان التعرض للصبغة.
- بعد فترة الحضانة ، قم بإذابة الخلايا عن طريق الطرد المركزي (180 × جم) عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من PBS. قم بتشغيل الخلايا من خلال مصفاة خلية (شبكة نايلون 35 ميكرومتر) لإزالة كتل الخلايا التي قد تسد مقياس التدفق الخلوي. ضع الخلايا على الجليد على الفور.
- قم بتشغيل الأداة وتشغيل بروتوكول بدء التشغيل.
- تحقق من وجود سائل غمد ونفايات فارغة.
- قم بتشغيل الخطوط باستخدام 10٪ مبيض وماء لمدة 5 دقائق لكل منها.
- تشغيل حبات مراقبة الجودة لضمان الوظيفة المناسبة.
- في علامة تبويب الإعدادات ، حدد FSC (التشتت الأمامي) و SSC (التشتت الجانبي) و FITC (إيزوثيوسيانات الفلوريسئين) لمرشح التألق.
- ارسم الرسوم البيانية التالية لبوابة الجدوى والمفردات والتألق. قم بتحسين طاقة الليزر (الخاصة بأداة المستخدم) بحيث تكون مجموعات الخلايا ضمن المعلمات المحددة لمزيد من التحليل.
- مخطط تشتت FSC-A مقابل SSC-A: يوجد عدد الخلايا الرئيسية بالقرب من مركز الرسم البياني.
- مخطط مبعثر FSC-A مقابل FSC-W: شريط أفقي ضيق يدل على المفردات (بدلا من كتل الخلايا).
- مخطط تشتت FITC-A مقابل FSC-A: راقب توزيع الخلايا التي تم فرزها بواسطة مسبار التشغيل الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل.
- الرسم البياني FITC-A: لاحظ التحول في السكان بناء على FITC لتحديد النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 +.
- لتحسين طاقة ليزر FITC ، قم بتشغيل عينة باستخدام المسبار بحيث يكون الذيل الأيمن لمنحنى الرسم البياني بالقرب من الحد الأقصى لإشارة FITC-A. بعد ذلك ، قم بتشغيل عينة باستخدام مسبار التحكم. يجب أن يكون التحول السكاني قابلا للملاحظة للكشف عن النطاق الديناميكي الأقصى. قد يلزم تكرار خطوة تحسين طاقة الليزر عدة مرات ، ولكن لا ينبغي تغيير طاقة الليزر عبر العينات بمجرد تعيين إعداد للتجربة.
- قم بتشغيل كل عينة ل 10000 عدد (يتم ذلك في ثلاث نسخ).
- كرر الخطوة 3.12 لكل خط خلية ، حيث سيكون هناك تباين في الامتصاص ونشاط ALDH1A1.
- بعد الانتهاء من جمع العينات ، قم بتشغيل الخطوط بنسبة 10٪ مبيض وماء لمدة 5 دقائق لكل منها ، ثم ابدأ في إيقاف تشغيل الجهاز.
- قم بمعالجة البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي وبوابة عدد الخلايا المطلوب. قم بتعيين البوابات بحيث تقع جميع الأحداث في بوابة ALDH1A1- أو ALDH1A1+ . باستخدام اختيار البوابة المستطيلة ، اضبط بوابة ALDH1A1 بحيث تحدث >99.5٪ من الأحداث في عينات مسبار التحكم داخل هذه البوابة. سيتم اعتبار الخلايا المتبقية ALDH1A1 +. يمكن بعد ذلك تطبيق هذه البوابات نفسها على عينة المسبار لتحديد عدد الأحداث التي تم اعتبارها ALDH1A1- و ALDH1A1+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجمالي نشاط ALDH1A1 لمتجانسات خلايا سرطان المبيض
متوسط عمليات التشغيل للطي لكل خط خلية تم الحصول عليه من هذا الفحص هو: BG-1 (1.12 ± 0.01) ؛ IGROV-1 (1.30 ± 0.03) ؛ Caov-3 (1.72 ± 0.06) ؛ PEO4 (2.51 ± 0.29) ؛ و OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (الشكل 2).
الشكل 2: تشغيل الفلورسنت الطي للصبغة الانتقائية للشكل المتماثل في متجانسات كل خط خلية سرطان المبيض يقاس بالقياس الفلوري (متوسط الانحراف المعياري ±) (ن = 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التصوير الجزيئي لمجموعات ALDH1A1+ الفرعية في خلايا سرطان المبيض المستزرعة
عند احتضان الخلايا بمسبار أو مسبار تحكم ، تم تحديد النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + في كل خط خلية. من خلال ضبط طاقة الليزر وكسبه لتقليل الإشارة في عينة Ctrl-AlDeSense AM المعالجة ، تم تحسين إشارة التألق في الخلايا المعالجة AlDeSense AM (الشكل 3). من خلال حساب عدد خلايا ALDH1A1 + ، تم تحديد النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + لتكون: BG-1 (3.2٪ ± 1.6٪) ؛ PEO4 (18.0٪ ± 3.6٪) ؛ OVCAR-3 (39.8 ٪ ± 3.9 ٪) ؛ IGROV-1 (51.7٪ ± 5.4٪) ؛ و Caov-3 (93.7٪ ± 3.4٪) (الشكل 4).
الشكل 3: صور تمثيلية متحدة البؤر . (أ ، ج ، ه ، ز ، ط) خلايا ملطخة Ctrl-AlDeSense AM و (B ، D ، F ، H ، J) خلايا AlDeSense AM الملطخة. من اليسار إلى اليمين ، تعرض الصور برايتفيلد ، مضان ، ودمج. قضبان المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: متوسط النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + في كل خط خلية سرطان المبيض يقاس بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (متوسط الانحراف المعياري ±) (ن = 9). النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + هي BG-1 (3.2٪ ± 1.6٪) ؛ PEO4 (18.0٪ ± 3.6٪) ؛ OVCAR-3 (39.8 ٪ ± 3.9 ٪) ؛ IGROV-1 (51.7٪ ± 5.4٪) ؛ و Caov-3 (93.7٪ ± 3.4٪). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحديد تعداد خلايا ALDH1A1+ باستخدام قياس التدفق الخلوي
مع تطبيق المسبار الفلوري الانتقائي للشكل ، تم تحديد عدد خلايا ALDH1A1 + بنجاح عبر خطوط خلايا سرطان المبيض المختلفة. أثناء تحليل البيانات بعد التجربة ، يمكن قياس عدد خلايا ALDH1A1 + داخل كل خط خلية عن طريق بوابات أعلى 0.5٪ من الخلايا الأكثر سطوعا داخل السكان المعالجين ب Ctrl-AlDeSense AM (الشكل 5). كشف تحليل لوحة خلايا سرطان المبيض أن النسب المئوية لخلايا ALDH1A1 + هي: BG-1 (4.9٪ ± 0.4٪) ؛ BG-1 (4.9٪ 0.4٪) ؛ BG-1 (4.9٪ 0.4٪) ؛ BG-1 (4.9٪ 0.4٪) ؛ BG-1 (4.9٪ 0.4� PEO4 (5.66٪ ± 0.9٪) ؛ OVCAR-3 (7.6 ٪ ± 0.1 ٪) ؛ IGROV-1 (35.4٪ ± 2.8٪) ؛ و Caov-3 (70.1٪ ± 2.4٪) (الشكل 6).
الشكل 5: مخططات التشتت التمثيلية وتراكب الرسم البياني. (أ ، د ، ز ، ي ، م) مخططات مبعثرة تمثيلية من تلطيخ Ctrl-AlDeSense AM بعد حضانة 1 ساعة مع الخلايا. (ب، ه، ح، ك، ن) مؤامرات مبعثرة تمثيلية من AlDeSense AM تلطيخ بعد حضانة 1 ساعة مع الخلايا. (ج، و، ل، ي، س) تراكب الرسم البياني لتلطيخ Ctrl-AlDeSense AM و AlDeSense AM لهذه الشروط. خطوط الخلايا الملطخة هي (A-C) BG-1 و (D-F) PEO4 و (G-I) OVCAR-3 و (J-L) IGROV-1 و (M-O) Caov-3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: متوسط النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + في كل خط خلية سرطان المبيض يقاس بقياس التدفق الخلوي (متوسط الانحراف المعياري ±) (ن = 3). كانت النسبة المئوية لخلايا ALDH1A1 + BG-1 (4.9٪ ± 0.4٪) ؛ PEO4 (5.66٪ ± 0.9٪) ؛ OVCAR-3 (7.6 ٪ ± 0.1 ٪) ؛ IGROV-1 (35.4٪ ± 2.8٪) ؛ و Caov-3 (70.1٪ ± 2.4٪). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في حين تم ربط العديد من أشكال ALDH (أي ALDH1A1 و ALDH1A2 و ALDH1A3 و ALDH3A1) ب CSCs ، تم اختيار ALDH1A1 كهدف لهذه الدراسة لأنه ، في سياق سرطان المبيض ، ترتفع مستويات التعبير 21,27 ، وقد ثبت أن هذا الشكل المتماثل يؤدي إلى تفاقم مقاومة الأدوية28,29 ويعزز تكوين الورم 30,31 . تتفق نتائج التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي على ترتيب زيادة عدد خلايا ALDH1A1 +. بالإضافة إلى ذلك ، تكشف تجارب تجانس الخلايا عن متوسط النشاط داخل خط الخلية. بالتزامن مع ذلك ، يمكن استقراء الاستنتاجات حول مقدار النشاط داخل المجموعات السكانية الفرعية ALDH1A1 + لكل خط خلوي. يمكن الاستنتاج أن BG-1 لديه أدنى نشاط ALDH1A1 وأقل عدد من ALDH1A1 +. وتجدر الإشارة إلى أننا اخترنا خط خلية BG1 لاستخدامه كعنصر تحكم سلبي في هذه الدراسة ، بسبب التعبير الضئيل ل ALDH1A1. بالإضافة إلى ذلك ، كشف التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي عن أكبر نسبة من خلايا ALDH1A1 + في خلايا Caov-3 ، لكن النشاط العام لخط الخلية كان ثالث أعلى نسبة فقط. بدلا من ذلك ، احتوت خلايا OVCAR-3 على ثالث أعلى عدد من ALDH1A1 + ولكنها أظهرت أعلى نشاط عام. بالاستقراء من هذه النتائج ، فإن السكان الفرعيين لخلايا ALDH1A1 + OVCAR-3 لديهم نشاط أعلى من السكان الفرعيين لخلايا ALD1A1 + Caov-3. من خلال مزيد من التحليل لمجتمع ALDH1A1 داخل خطوط الخلايا أو عينات الأنسجة ، يمكن توضيح دور ALDH1A1 بشكل أكبر ويمكن التحقيق في التغيرات الظاهرية نتيجة لنشاط ALDH1A1 المرتفع.
| خط الخلية | النوع النسيجي | القياس الفلوري (تشغيل الطي) | متحد البؤر (٪ إيجابي) | التدفق (٪ إيجابي) | ||
| بي جي-1 | سرطان غدي ضعيف التمايز | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| بيو4 | سرطان المثانة المصلي عالي الدرجة | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| أوفكار-3 | سرطان غدي مصلي عالي الدرجة | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| إيغروف -1 | سرطان بطانة الرحم الغدي | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| كاوف-3 | سرطان غدي مصلي عالي الدرجة | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
الجدول 1: ملخص النتائج من تجانس الخلايا ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وقياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الانتقائية الشاملة هي قيد رئيسي للعديد من تحقيقات ALDH. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ مؤخرا عن العديد من الأمثلة الانتقائية للأشكالالمتماثلة 32،33،34،35،36،37،38،39،40،41. يمثل المسبار الفلوري الانتقائي isoform المستخدم في هذه الدراسة أول مسبار مصمم بشكل عقلاني يتفاعل فقط مع الشكل المتماثل ALDH1A1 ، حتى في وجود إنزيمات منافسة موجودة بكميات زائدة كبيرة11,12. السمة المميزة الأخرى لهذا المسبار هي طبيعته الفلورية الفريدة ، والتي تتميز بانبعاث مضان منخفض قبل تنشيط المسبار. هذا يتعارض مع المجموعات التجارية مثل مقايسة ALDEFLUOR ، والتي تتميز بركيزة فلورية (BODIPY aminoacetaldehyde [BAAA]) تكون دائما في "الحالة"32. يحدد BAAA خلايا ALDH + بناء على فرضية أن منتج الكربوكسيلات المنشط (وهو فلورسنت متساو) يتم الاحتفاظ به إلى حد كبير في الخلايا التي تعبر عن ALDH بمستويات عالية. لحساب التراكم غير النوعي للمسبار في خلايا ALDH ، يجب تطبيق مثبط لمنع ALDHs الموجودة في عينة التحكم. ومع ذلك ، يرافق ذلك العديد من العيوب البارزة. أولا ، إذا كان القصد هو تحديد الخلايا الجذعية السرطانية عبر نشاط ALDH1A1 ، فإن تطبيق استراتيجية المثبط يفشل لأنه يمنع أيضا الأشكال المتساوية الأخرى بدرجات متفاوتة. ثانيا ، يمكن للسلوك غير المحدد للمثبط أن يضعف قدرة الخلية على إزالة السموم من الألدهيدات التفاعلية على المستوى العالمي. يتم تناول أول هذه المخاوف في تصميم AlDeSense ، لأنه يتفاعل فقط مع شكل متساوي واحد كما هو مذكور أعلاه (الشكل التكميلي 1). لتحسين القلق الثاني ، يحل Ctrl-AlDeSense محل دور المانع. على وجه التحديد ، يظهر كاشف التحكم إشارة فلورية متطابقة تقريبا مثل AlDeSense غير المنشط ، ويتم تناوله إلى حد متساو بواسطة الخلايا ، ويتمركز في الغالب إلى السيتوبلازم. لذلك يجب أن تمثل أي إشارة تتجاوز خط الأساس الذي حدده التحكم تنشيط المسبار بوساطة ALDH1A1.
الشكل التكميلي 1: تفاعل AlDeSense و ALDEFLUOR. (أ) تشغيل مضان طبيعي ل AlDeSense بعد الحضانة مع كل شكل متماثل ALDH و (ب) تفاعل ALDEFLUOR مع كل شكل من أشكال ALDH. تم إجراء جميع القياسات في ثلاث نسخ. أشرطة الخطأ ± SD. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
أول تطبيق للمسبار الفلوروجيني الانتقائي للشكل المتماثل الذي تم اختياره لتسليط الضوء عليه هو قياس نشاط ALDH1A1 في متجانسات الخلايا. في ظل الظروف التي لا تتوفر فيها أجهزة متخصصة مثل المجاهر متحدة البؤر أو مقاييس التدفق الخلوي ، يمكن أن يؤدي استخدام مقاييس الفلور الشائعة إلى الإبلاغ بسرعة عن إجمالي نشاط ALDH1A1 داخل العينة. على هذا المنوال ، فإن سهولة تحضير العينات (يمكن الوصول إلى التجانسات من عينات تتراوح من مزارع الخلايا إلى الأنسجة المستأصلة) توسع نطاق تطبيق هذا الفحص. هناك بعض المعلمات الرئيسية التي يجب مراعاتها عند تحسين المسبار الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل للاستخدام مع التجانس. الأول يتضمن تعديل عدد الخلايا لكل عينة محللة. على سبيل المثال ، إذا كان النطاق الديناميكي ، الذي يعرف بأنه مدى تغير إشارة الفلورسنت ، منخفضا بما فيه الكفاية ، فيمكن زيادة عدد الخلايا لكل عينة. وبالمثل ، يمكن أيضا تعديل وقت الحضانة بحيث يمكن تنشيط المزيد من مسبار الفلوروجينيك للحصول على قراءات فلورية أقوى. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو عدم القدرة على التمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا التي تظهر مستويات متفاوتة من نشاط ALDH1A1. نظرا لأن الخلايا يتم دمجها وتحللها بغض النظر عن حالة ALDH1A1 ، يتم حساب متوسط مقدار نشاط الإنزيم على جميع الخلايا الموجودة في العينة. ينتج عن هذا نتيجة مختلفة مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر وتحليلات قياس التدفق الخلوي ، حيث يتم الإبلاغ عن النسبة المئوية لخلايا ALDH +. بينما تعرض خلايا BG-1 أقل استجابة تشغيل للطي ، بالإضافة إلى أصغر مجموعة من خلايا ALDH1A1 + ، يصبح ترتيب خطوط الخلايا الأربعة المتبقية غير متسق. على سبيل المثال ، يحدد الفحص المتجانس خلايا OVCAR-3 التي تتمتع بأعلى نشاط ALDH1A1 بشكل عام ، في حين أنها تحتل المرتبة الثالثة فقط بناء على الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي. تفسيرنا لهذه البيانات هو أن خلية ALDH1A1+ يجب أن يكون لها مستويات مختلفة من النشاط. أخيرا ، من المهم ملاحظة أن هذا النوع من تجارب "التشغيل" لن يكون ممكنا باستخدام المجسات القائمة على التراكم.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن المسبار الفلوري الانتقائي للشكل هو عامل تصوير جزيئي لتصور مجموعات خلايا ALDH1A1 +. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من استخدام الفحص المجهري متحد البؤر في هذا العرض التوضيحي ، فإن هذا المسبار الفلوري متوافق مع مجموعة كبيرة من إعدادات التصوير ، بما في ذلك عدادات الخلايا الآلية ، والمجاهر الفلورية epi-fluorescence ، وأدوات الإضاءة واسعة المجال. واحدة من أهم الخطوات في هذه التجربة هي استخدام Ctrl-AlDeSense لإنشاء معلمات العتبة المناسبة (على سبيل المثال ، حجم الثقب ، وطاقة الليزر ، وكسب FITC). في هذا الصدد ، يجب ضبط الإعدادات بحيث تكون إشارة Ctrl-AlDeSense أعلى الخلفية مباشرة. في حالة ما إذا وجد المستخدم أنه من الضروري زيادة طاقة الليزر لرؤية هذه الإشارة ، يوصى بتمديد فترة تلطيخ الصبغة أو تركيز التحميل على زيادة طاقة الليزر (أعلى من 50٪) بسبب زيادة السمية الضوئية أو تبييض المسبار. أحد قيود التصوير متحد البؤر هو التباين عند البوابات باستخدام Ctrl-AlDeSense. على الرغم من هذا التحذير ، كان ترتيب خط الخلية المرصود بناء على النسب المئوية المتزايدة لخلايا ALDH1A1 + مطابقا للنتائج التي تم الحصول عليها عبر قياس التدفق الخلوي. على عكس التصوير الجزيئي ، حيث يكون الحد الأقصى لعدد الخلايا المرئية محدودا بمجال الرؤية ، تحلل تجربة قياس التدفق الخلوي النموذجية ما يصل إلى عشرات الآلاف من الخلايا. تتشابه اعتبارات وقت التلوين وتركيز التحميل مع تلك التي تمت مناقشتها للتصوير الجزيئي. عنصر إضافي يجب مراعاته هو تلطيخ الصبغة في تعليق الخلية لضمان عدم التعرف بشكل خاطئ على مجموعات ALDH1A1 + الإيجابية الخاطئة.
في الختام ، تسلط هذه المقالة الضوء على عملية تحسين AlDeSense لمجموعة متنوعة من الطرائق ، باستخدام خلايا سرطان المبيض كمثال. يمثل هذا خطوة أولى مهمة نحو الإجابة عن سبب وجود تقارير متناقضة بشأن تعبير ALDH1A1 في هذا النوع من السرطان21،22،23،24. بالإضافة إلى ما أظهرناه ، نتصور أنه يمكن استخدام هذا المسبار الفلوري الانتقائي للأشكال في حملة فحص عالية الإنتاجية لتحديد مثبطات ALDH1A1 الانتقائية التي قد تظهر كأدوية مرشحة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يستمر هذا المسبار في العثور على استخدام لتحديد CSCs في الحيوانات الحية ، كما أوضحنا في منشورنا الأولي11. إن خاصية انبعاث الضوء الأخضر للمسبار الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل تهيئه لتجارب تعدد الإرسال حيث يمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية الباعثة للأحمر ، أو الأصباغ ذات الجزيئات الصغيرة ، أو المجسات المستجيبة للتحليل. علاوة على ذلك ، توجد نسخة حمراء من المسبار الفلوري الانتقائي للشكل المتماثل ، والذي يمكن أن يزيد من توسيع قدرة تعدد الإرسال هذه12. أخيرا ، على الجبهة الطبية ، يمكن استخدام هذا المسبار كأداة تنبؤية في الإعداد السريري لاتخاذ قرارات العلاج في نقطة الرعاية. يمكن أن يكون القياس الكمي لنشاط ALDH1A1 ومجموعات خلايا ALDH1A1 + بمثابة طريقة لتحديد عدوانية السرطان ، مما يسمح باستراتيجيات علاج شخصية لتحسين نوعية الحياة. علاوة على ذلك ، باستخدام AlDeSense ، يمكن تسليم القراءة وتفسيرها في غضون ساعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نكشف عن براءة اختراع معلقة (US20200199092A1) لتقنية AlDeSense.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM133581 إلى JC) ومركز السرطان في منحة الدراسات العليا في إلينوي (الممنوحة ل SG). تشكر JC مؤسسة Camille and Henry Dreyfus على الدعم. يشكر المؤلفون الدكتور توماس إي بيرود على مساهمته الأولية في إعداد مخزون AlDeSense و AlDeSense AM. بيشاردو بيغيرو والسيد جوزيف أ. فورزانو على مساعدتهما في إعداد مختلف السلائف الاصطناعية. نشكر البروفيسور إريك نيلسون (قسم علم وظائف الأعضاء الجزيئي والتكاملي ، UIUC) لخلايا Caov-3 و IGROV-1 و PEO4. نشكر البروفيسور بول هيرجنروثر (قسم الكيمياء ، UIUC) على خلايا BG-1. نشكر المرافق الأساسية في معهد Carl R. Woese لعلم الأحياء الجينومي للوصول إلى مجهر Zeiss LSM 700 Confocal والبرامج المقابلة. نشكر مرفق قياس التدفق الخلوي للوصول إلى BD LSR II CMtO Analyzer. نشكر الدكتورة ساندرا ماكماسترز ومرفق وسائط الخلية على المساعدة في إعداد وسائط زراعة الخلايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
