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Cancer Research

एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 ए 1 गतिविधि के आधार पर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को स्ट्रैटिफाई करने के लिए AlDeSense का अनुप्रयोग

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64713
Automatic Translation
*1,3,4, *2,3,4, 1,3,4, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Biochemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Cancer Center of Illinois, University of Illinois Urbana-Champaign
* These authors contributed equally

Summary

स्टेमनेस के बायोमार्कर के रूप में इसकी स्थिति के कारण जीवित कोशिकाओं में एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि को मापने के तरीके कैंसर अनुसंधान में महत्वपूर्ण हैं। इस अध्ययन में, हमने पांच डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों के एक पैनल में एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि के सापेक्ष स्तर को निर्धारित करने के लिए एक आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच को नियोजित किया।

Abstract

कैंसर उपचार के बाद रिलैप्स को अक्सर कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) के रूप में जाना जाने वाला ट्यूमर कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या की दृढ़ता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो उनकी उल्लेखनीय ट्यूमर-पहल और आत्म-नवीकरण क्षमता की विशेषता है। ट्यूमर (जैसे, अंडाशय) की उत्पत्ति के आधार पर, सीएससी सतह बायोमार्कर प्रोफाइल नाटकीय रूप से भिन्न हो सकता है, जिससे इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के माध्यम से ऐसी कोशिकाओं की पहचान एक चुनौतीपूर्ण प्रयास बन जाती है। इसके विपरीत, एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 ए 1 (एएलडीएच 1 ए 1) सीएससी की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर के रूप में उभरा है, जो सीएससी सहित लगभग सभी पूर्वज कोशिकाओं में इसकी संरक्षित अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के कारण है। एएलडीएच 1 ए 1 आइसोफॉर्म 19 एंजाइमों के एक सुपरफैमिली से संबंधित है जो संबंधित कार्बोक्जिलिक एसिड उत्पादों के लिए विभिन्न अंतर्जात और ज़ेनोबायोटिक एल्डिहाइड के ऑक्सीकरण के लिए जिम्मेदार हैं। चान एट अल ने हाल ही में ALDeSense विकसित किया, जो ALDH1A1 गतिविधि का पता लगाने के लिए एक आइसोफॉर्म-चयनात्मक "टर्न-ऑन" जांच है, साथ ही ऑफ-टारगेट धुंधलापन के लिए एक गैर-प्रतिक्रियाशील मिलान नियंत्रण अभिकर्मक (Ctrl-AlDeSense) भी है। इस आइसोफॉर्म-चयनात्मक उपकरण को पहले से ही के 562 मायलोजेनस ल्यूकेमिया कोशिकाओं, मैमोस्फीयर और मेलेनोमा-व्युत्पन्न सीएससी जेनोग्राफ्ट्स में एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से एक बहुमुखी रासायनिक उपकरण के रूप में प्रदर्शित किया गया है। इस लेख में, जांच की उपयोगिता को अतिरिक्त फ्लोरिमेट्री, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों के माध्यम से प्रदर्शित किया गया था जहां सापेक्ष एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि पांच डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों के एक पैनल में निर्धारित की गई थी।

Introduction

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) ट्यूमर कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या है जो स्टेम सेलजैसे गुणों का प्रदर्शन करती है। अपने गैर-कैंसर समकक्षों के समान, सीएससी में आत्म-नवीनीकरण और प्रसार करने की असाधारण क्षमता होती है। अन्य अंतर्निहित तंत्रों के साथ, जैसे एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टरों के अपरेग्यूलेशन, सीएससी अक्सर प्रारंभिक सर्जिकल डिबल्किंग प्रयासों से बच जाते हैं, साथ ही बाद में सहायक चिकित्सा2। उपचार प्रतिरोध3, रिलैप्स4 और मेटास्टेसिस5 में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, सीएससी कैंसर अनुसंधान में प्राथमिकता बन गए हैं। यद्यपि विभिन्न प्रकार के सेल सतह एंटीजन (जैसे, सीडी 133) हैं जिनका उपयोग सीएससी6 की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, साइटोप्लाज्म में पाए जाने वाले एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच) की एंजाइमेटिक गतिविधि का लाभ उठाना एक आकर्षक विकल्प के रूप मेंउभरा है। एएलडीएच 19 एंजाइमों का एक सुपरफैमिली है जो प्रतिक्रियाशील अंतर्जात और ज़ेनोबायोटिक एल्डिहाइड के ऑक्सीकरण को संबंधित कार्बोक्जिलिक एसिडउत्पादों में उत्प्रेरित करने के लिए जिम्मेदार है।

सामान्य तौर पर, एल्डिहाइड डिटॉक्सिफिकेशन अवांछनीय क्रॉसलिंकिंग घटनाओं और ऑक्सीडेटिव तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने में महत्वपूर्ण है जो स्टेम सेल अखंडताको नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, 1 ए 1 आइसोफॉर्म रेटिनोइक एसिड चयापचय को नियंत्रित करता है, जो बदले में रेटिनाल्डिहाइड सिग्नलिंग10 के माध्यम से स्टेमनेस को प्रभावित करता है। AlDeSense 11,12, एक छोटे अणु गतिविधि-आधारित संवेदन (ABS) जांच जो चुनिंदा ALDH1A1 गतिविधि का पता लगाने के लिए है, हाल ही में विकसित किया गया था। एबीएस डिजाइन एक बाध्यकारी घटना के बजाय रासायनिक परिवर्तन के माध्यम से विश्लेषण का पता लगाने को प्राप्त करते हैं, जिससे उच्च चयनात्मकता की अनुमति मिलती है और ऑफ-टारगेट प्रतिक्रियाओं में कमी आती है 13,14,15,16। आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच का डिजाइन सिद्धांत एक दाता-फोटोप्रेरित इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (डी-पीईटी) शमन तंत्र17 पर निर्भर करता है, जो एल्डिहाइड कार्यात्मक समूह से उत्पन्न होता है, जो जांच18 के फ्लोरोसेंट हस्ताक्षर को दबाने का कार्य करता है। कार्बोक्जिलिक एसिड में एएलडीएच 1 ए 1-मध्यस्थता रूपांतरण पर, विकिरण छूट को अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद उत्पन्न करने के लिए अनलॉक किया जाता है। चूंकि डी-पीईटी शमन कभी भी 100% कुशल नहीं होता है, अवशिष्ट प्रतिदीप्ति जो संभावित झूठे सकारात्मक परिणामों का कारण बन सकती है, को Ctrl-AlDeSense के विकास के माध्यम से इस परख को स्थापित करते समय माना गया था, जो मिलान फोटोफिजिकल विशेषताओं (जैसे, क्वांटम उपज) और कोशिकाओं में एक समान साइटोप्लाज्मिक धुंधला पैटर्न के साथ एक गैर-उत्तरदायी अभिकर्मक था। जब अग्रानुक्रम में उपयोग किया जाता है, तो यह अद्वितीय जोड़ी उच्च एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि वाली कोशिकाओं को उन लोगों से मज़बूती से अलग कर सकती है जो फ्लोरिमेट्री, आणविक इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से निम्न स्तर प्रदर्शित करते हैं। पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियों पर आइसोफॉर्म-चयनात्मक सक्रिय रंगों के उपयोग से कई प्रमुख फायदे जुड़े हुए हैं। उदाहरण के लिए, सीएससी को ट्यूमर के भीतर गहराई से दफन करने की परिकल्पना की जाती है, और इस प्रकार बड़े एंटीबॉडी19 के सापेक्ष एक छोटे अणु के लिए अधिक सुलभ होते हैं। इसके अतिरिक्त, मुड़ा हुआ फ्लोरोसेंट उत्पाद किसी भी सेलुलर घटक को सहसंयोजक रूप से संशोधित नहीं करता है, जिसका अर्थ है कि इसे सीएससी को असंशोधित स्थिति में छोड़ने के लिए धोने के चक्रों के माध्यम से आसानी से हटाया जा सकता है। अंत में, टर्न-ऑन प्रतिक्रिया केवल व्यवहार्य कोशिकाओं और कार्यों की पहचान करती है, एमटीटी परख की तरह, एनएडी + कोफ़ेक्टर पर इसकी निर्भरता के कारण।

Figure 1
चित्रा 1: एल्डेसेंस के फ्लोरोसेंट टर्न-ऑन का योजनाबद्ध प्रदर्शन। आइसोफॉर्म-चयनात्मक डाई एएलडीएच 1 ए 1 द्वारा सक्रिय है और इसका उपयोग फ्लोरिमेट्री, आणविक इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में ऊंचा एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पिछले काम में, आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच परख ने के 562 मानव क्रोनिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं, एमडीए-एमबी -231 मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं और बी 16 एफ 0 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाओं में एएलडीएच कम (एएलडीएच -) कोशिकाओं से एएलडीएच उच्च (एएलडीएच +) कोशिकाओं को सफलतापूर्वक स्तरीकृत किया। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि, कई कैंसर प्रकारों के लिए, उच्च एएलडीएच 1 ए 1 प्रोटीन अभिव्यक्ति एक खराब नैदानिक पूर्वानुमान20 का संकेत देती है। यह मानता है कि एएलडीएच 1 ए 1 के ऊंचे स्तर सीएससी का संकेत हैं जो उपचार से बच सकते हैं, प्रतिरोध विकसित कर सकते हैं, और पूरे शरीर में फैल सकते हैं। हालांकि, डिम्बग्रंथि के कैंसर के मामले में, विपरीत खोज की रिपोर्ट करने वाले अध्ययन हैं (उच्च एएलडीएच 1 ए 1 अभिव्यक्ति बेहतर रोगी अस्तित्व से जुड़ी हुई है) 21,22,23,24। हालांकि यह पहली नज़र में विरोधाभासी दिखाई दे सकता है, अभिव्यक्ति आवश्यक रूप से एंजाइम गतिविधि से संबंधित नहीं है, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (जैसे, पीएच फ्लक्स, ऑक्सीजन ग्रेडिएंट), एनएडी + कोफ़ेक्टर या एल्डिहाइड सब्सट्रेट्स की उपलब्धता, कार्बोक्जिलिक एसिड (उत्पाद निषेध) के स्तर और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में परिवर्तन से प्रभावित हो सकती है जो एंजाइम गतिविधि को बदल सकती हैं25 . इसके अतिरिक्त, डिम्बग्रंथि के कैंसर को पांच मुख्य हिस्टोलॉजिकल प्रकारों (उच्च श्रेणी के सीरस, निम्न-ग्रेड सीरस, एंडोमेट्रियोइड, स्पष्ट कोशिका और श्लेष्म) में विभाजित किया गया है, जिसे हम अनुमान लगाते हैं कि एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि26 के परिवर्तनीय स्तर होंगे। डिम्बग्रंथि के ट्यूमर में एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि की जांच करने के लक्ष्य के साथ, ऊपर उल्लिखित विभिन्न हिस्टोलॉजिकल प्रकारों से संबंधित पांच डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों के पैनल में एएलडीएच 1 ए 1 + आबादी की पहचान करने के लिए एक आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच परख को नियोजित किया गया था। इस अध्ययन में परीक्षण की गई सेल लाइनों में बीजी -1, काओव -3, आईजीआरओवी -1, ओवीसीएआर -3 और पीईओ 4 कोशिकाएं शामिल हैं, जो स्पष्ट सेल और सीरस हिस्टोटाइप को कवर करती हैं। इसमें, शोधकर्ताओं के लिए सीएससी की पहचान करने के लिए जांच की बहुमुखी प्रतिभा और सामान्यीकरण पर प्रकाश डाला गया था जो अन्य अमर कैंसर सेल लाइनों के साथ-साथ रोगी के नमूनों में समान अध्ययन करना चाहते हैं। AlDeSense का उपयोग जटिल ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट में सीएससी रखरखाव में शामिल जैव रासायनिक मार्गों पर प्रकाश डालेगा और संभावित रूप से रोग का निदान करने और कैंसर की आक्रामकता को मापने के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में काम करेगा।

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Protocol

1. फ्लोरिमेट्री के माध्यम से डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल होमोजेनेट्स में कुल एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि को मापें

  1. निम्नलिखित सेल कल्चर मीडिया के 5 एमएल में टी 25 सेल कल्चर फ्लास्क में पिघलना 1 × 106 कोशिकाएं:
    1. आईजीआरओवी -1 और पीईओ 4: रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ।
    2. बीजी -1 और काव -3: 10% एफबीएस और 1% पी / एस के साथ डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम)।
    3. OVCAR-3: RPMI 1640 20% FBS, 1% P / S, और 0.01 मिलीग्राम / mL इंसुलिन के साथ।
  2. कोशिकाओं को दो से तीन मार्गों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि पासिंग से पहले कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी से अधिक न हों।
  3. ट्रिप्सिन कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन में गिनें, उन्हें स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके गिनते हैं, और 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन (180 × ग्राम) के माध्यम से 107 कोशिकाओं × गोली 1।
  4. आकांक्षा के माध्यम से सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, 1x PBS के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करके गोली को धोएं, और चरण 4 में वर्णित स्थितियों के तहत सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से कोशिकाओं को फिर से गोली मार दें।
  5. 1x PBS में 1x प्रोटीज अवरोधक के समाधान में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। 106 कोशिकाओं के प्रति 2.5 × इस समाधान के 1 एमएल का उपयोग करें।
  6. सेल होमोजेनाइज़र जांच के साथ 2 मिनट (1 एस पल्स, 40% आयाम) के लिए बर्फ पर सेल निलंबन को सोनिकेट करें।
  7. 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन (3,200 × ग्राम) के माध्यम से पैलेट अघुलनशील / झिल्ली अंश। सुपरनैटेंट को हटा दें और रखें, क्योंकि यह होमोजेनेट है जिसका उपयोग बाद के चरणों में किया जाएगा। तीन प्रतियों में प्रयोग करने के लिए होमोजेनेट्स को तीन क्यूवेट में अलग करें।
  8. घोल को अच्छी तरह से मिलाने के लिए 4 μM. पिपेट की अंतिम जांच एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जांच को होमोजेनेट में जोड़ें।
  9. फ्लोरोसेंट सिग्नल को जोड़ने के तुरंत बाद और फ्लोरिमीटर पर वांछित इनक्यूबेशन बार मापें। अधिकतम फोल्ड टर्न-ऑन (इस प्रयोग में 1 घंटे) देखने के लिए इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित किया जा सकता है। इनक्यूबेशन समय की तुलना में सभी सेल लाइनों में स्थिर होना चाहिए।
    1. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को 496 एनएम पर सेट करें।
    2. उत्सर्जन को 510-600 एनएम पर सेट करें।
    3. स्लिट चौड़ाई को 0.5 मिमी पर सेट करें।
    4. समाधान को 1 एमएल क्वार्ट्ज क्यूवेट में रखें, फ्लोरिमीटर में रखें, और स्कैन हिट करें।
  10. आइसोफॉर्म-चयनात्मक डाई के फोल्ड सक्रियण को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक रीडिंग से एक ही तरंग दैर्ध्य पर तीव्रता से अंतिम प्रतिदीप्ति तीव्रता को 516 एनएम (अधिकतम फ्लोरोसेंट तरंग दैर्ध्य) पर विभाजित करें।

2. उच्च ALDH1A1 गतिविधि के साथ कोशिकाओं की छवि बनाने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

  1. टी 25 सेल कल्चर फ्लास्क में 1 × 106 कोशिकाओं को उपयुक्त सेल कल्चर मीडिया के 5 एमएल में पिघलाया जाता है।
  2. कोशिकाओं को दो से तीन मार्गों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि पासिंग से पहले कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी से अधिक न हों।
  3. कॉन्फोकल इमेजिंग से एक दिन पहले, प्लेट 4 एक 8-वेल चैंबर स्लाइड में 105 कोशिकाओं ×।
    1. प्रत्येक कुएं के निचले हिस्से को पॉली-एल-लाइसिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल, 100 μL प्रति कुएं) के साथ 10 मिनट के लिए कोट करें, बाद में एस्पिरेशन करें।
    2. सेल कल्चर ग्रेड पानी (100 μL प्रति कुएं) को जोड़कर प्रत्येक कुएं को 3x धोएं।
    3. ट्रिप्सिन कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन में गिनें, उन्हें स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके गिनते हैं, और कोशिकाओं को 4 × 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से प्लेट करते हैं।
    4. कोशिकाओं को रात भर (12-16 घंटे) बसने और संलग्न करने दें।
  4. विकास मीडिया को उत्तेजित करें और सीरम-मुक्त मीडिया (500 μL प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें, जांच या नियंत्रण जांच के 2 μM के साथ पूरक।
  5. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जांच के साथ इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को तुरंत चित्रित करें।
  6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें और नमूने के लिए समायोजित करें।
    1. नमूने को सबसे कम आवर्धन पर सावधानीपूर्वक लोड करें; उचित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को ढूंढें।
    2. सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस 10x आवर्धन पर है और कोशिकाओं का पता लगाएं।
  7. इस प्रयोग के लिए, एफआईटीसी चैनल (उत्तेजना: 488 एनएम लेजर; उत्सर्जन: 516-521 एनएम) और टी-पीएमटी (संचारित प्रकाश) चैनल की आवश्यकता होती है। पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए प्रयोग की संपूर्णता के लिए एक ही जेड-प्लेन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए टी-पीएमटी का उपयोग करके कोशिकाओं का पता लगाएं और उन पर ध्यान केंद्रित करें।
  8. लेजर पावर और एफआईटीसी लाभ को उचित सेटिंग में समायोजित करें, जहां Ctrl-AlDeSense AM नमूनों से सिग्नल न्यूनतम रूप से पता लगाने योग्य है, जबकि अभी भी AlDeSense AM नमूनों में सिग्नल देख रहा है। प्रत्येक पैरामीटर को संबंधित पट्टी को स्लाइड करके समायोजित किया जा सकता है। सही मापदंडों की पहचान करने के लिए सेटिंग्स को कुछ बार समायोजित करना पड़ सकता है। एक बार अनुकूलित होने के बाद, समान मापदंडों का उपयोग करके उस सेल लाइन के भीतर बाकी प्रयोग पूरा करें।
  9. प्रति उपचार की स्थिति में कुल तीन कुओं (कुल नौ छवियां) के लिए प्रति कुएं तीन छवियां स्नैप करें। फ्लोरेसेंस चैनल या मर्ज की गई छवि का उपयोग करने के बजाय पूर्वाग्रह से बचने के लिए टी-पीएमटी का उपयोग करके उचित विमान पर ध्यान केंद्रित करें।
  10. ALDH1A1+ कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए छवियों को संसाधित करें।
    1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, czi फ़ाइल को विभिन्न चैनलों में विभाजित करें।
    2. कोशिकाओं की कुल संख्या और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
    3. ALDH1A1+ कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक छवि में कोशिकाओं की कुल संख्या से फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें। छवियों में हेरफेर किए बिना प्रत्येक छवि के लिए एक ही तरीके से गिनना अनिवार्य है, उदाहरण के लिए, चमक को समायोजित करने से एक भ्रमित चर जुड़ सकता है।

3. उच्च एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि वाले कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का अनुप्रयोग

  1. टी 25 सेल कल्चर फ्लास्क में 1 × 106 कोशिकाओं को उपयुक्त सेल कल्चर मीडिया के 5 एमएल में पिघलाया जाता है।
  2. कोशिकाओं को दो से तीन मार्गों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि पासिंग से पहले कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी से अधिक न हों।
  3. ट्रिप्सिनाइज, गिनती, और 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन (180 × ग्राम) के माध्यम से 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को गोली मारता है।
  4. पीबीएस में 2 μM जांच / नियंत्रण जांच समाधान के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। डाई के संपर्क में आने को सुनिश्चित करने के लिए 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को हिलाएं।
  5. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन (180 × ग्राम) के माध्यम से कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों से हटा दें। पीबीएस के 0.5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। कोशिका झुरमुट को हटाने के लिए सेल स्ट्रेनर (35 μm नायलॉन जाल) के माध्यम से कोशिकाओं को चलाएं जो प्रवाह साइटोमीटर को बंद कर सकते हैं। कोशिकाओं को तुरंत बर्फ पर रखें।
  6. उपकरण चालू करें और स्टार्ट-अप प्रोटोकॉल चलाएं।
  7. शीथ द्रव और खाली कचरे की जांच करें।
  8. लाइनों को 10% ब्लीच और पानी के साथ 5 मिनट के लिए चलाएं।
  9. उचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मोती चलाएं।
  10. सेटिंग्स टैब में, फ्लोरेसेंस फिल्टर के लिए एफएससी (फॉरवर्ड स्कैटर), एसएससी (साइड स्कैटर), और एफआईटीसी (फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट) का चयन करें।
  11. व्यवहार्यता, सिंगल्स और फ्लोरेसेंस के लिए गेट करने के लिए निम्नलिखित ग्राफ ़ खींचें। लेजर पावर (उपयोगकर्ता के उपकरण के लिए विशिष्ट) को अनुकूलित करें ताकि सेल आबादी आगे के विश्लेषण के लिए दिए गए मापदंडों के भीतर हो।
    1. एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए स्कैटर प्लॉट: मुख्य सेल आबादी ग्राफ के केंद्र के पास है।
    2. एफएससी-ए बनाम एफएससी-डब्ल्यू स्कैटर प्लॉट: एकल (सेल क्लंप के बजाय) का संकीर्ण क्षैतिज बैंड संकेतक।
    3. एफआईटीसी-ए बनाम एफएससी-ए स्कैटर प्लॉट: आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक टर्न-ऑन जांच द्वारा क्रमबद्ध कोशिकाओं के वितरण का निरीक्षण करें।
    4. एफआईटीसी-ए हिस्टोग्राम: एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एफआईटीसी के आधार पर जनसंख्या में बदलाव का निरीक्षण करें।
  12. एफआईटीसी लेजर पावर को अनुकूलित करने के लिए, जांच के साथ एक नमूना चलाएं ताकि हिस्टोग्राम वक्र की दाईं पूंछ अधिकतम एफआईटीसी-ए सिग्नल के पास हो। इसके बाद, नियंत्रण जांच के साथ एक नमूना चलाएं। अधिकतम गतिशील सीमा को प्रकट करने के लिए जनसंख्या परिवर्तन देखने योग्य होना चाहिए। लेजर पावर ऑप्टिमाइज़ेशन चरण को कई बार दोहराया जा सकता है, लेकिन एक प्रयोग के लिए सेटिंग निर्दिष्ट होने के बाद लेजर पावर को नमूनों में नहीं बदला जाना चाहिए।
  13. प्रत्येक नमूने को 10,000 गणनाओं के लिए चलाएं (तीन प्रतियों में किया गया)।
  14. प्रत्येक सेल लाइन के लिए चरण 3.12 दोहराएं, क्योंकि अपटेक और एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि में परिवर्तनशीलता होगी।
  15. नमूना संग्रह के पूरा होने के बाद, लाइनों को 10% ब्लीच और पानी के साथ 5 मिनट के लिए चलाएं, फिर उपकरण को बंद करना शुरू करें।
  16. फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को संसाधित करें और वांछित सेल आबादी को गेट करें। गेट सेट करें ताकि सभी घटनाएं या तो ALDH1A1- या ALDH1A1+ गेट में आ जाएं। आयत द्वार चयन का उपयोग करके, ALDH1A1- गेट सेट करें ताकि नियंत्रण जांच नमूनों में >99.5% घटनाएं इस गेट के भीतर हों। शेष कोशिकाओं को ALDH1A1+ माना जाएगा। इन समान गेटों को जांच नमूने पर लागू किया जा सकता है ताकि एएलडीएच 1 ए 1- और एएलडीएच 1 ए 1 + मानी जाने वाली घटनाओं की संख्या निर्धारित की जा सके।

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Representative Results

डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका होमोजेनेट्स की कुल ALDH1A1 गतिविधि
इस परख से प्राप्त प्रत्येक सेल लाइन के लिए औसत गुना टर्न-ऑन हैं: बीजी -1 (1.12 ± 0.01); आईजीआरओवी -1 (1.30 ± 0.03); काओव -3 (1.72 ± 0.06); पीईओ 4 (2.51 ± 0.29); और OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्र 2: फ्लोरिमेट्री (औसत ± मानक विचलन) (एन = 3) द्वारा मापी गई प्रत्येक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन के होमोजेनेट्स में आइसोफॉर्म-चयनात्मक डाई का फोल्ड फ्लोरोसेंट टर्न-ऑन। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सुसंस्कृत डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में ALDH1A1+ उप-आबादी की आणविक इमेजिंग
एक जांच या नियंत्रण जांच के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने पर, प्रत्येक सेल लाइन में एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित किया गया था। Ctrl-AlDeSense AM उपचारित नमूने में सिग्नल को कम करने के लिए लेजर शक्ति और लाभ को ट्यून करके, फ्लोरेसेंस सिग्नल को AlDeSense AM उपचारित कोशिकाओं (चित्रा 3) में अनुकूलित किया गया था। ALDH1A1+ कोशिकाओं की संख्या की गणना करके, ALDH1A1+ कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित किया गया था: BG-1 (3.2% ± 1.6%); पीईओ 4 (18.0% ± 3.6%); ओवीसीएआर -3 (3.9% ± 39%); आईजीआरओवी -1 (51.7% ± 5.4%); और काओव -3 (93.7% ± 3.4%) (चित्रा 4)।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। (ए, सी, ई, जी, आई) Ctrl-AlDeSense AM दाग वाली कोशिकाएं और (B, D, F, H, J) AlDeSense AM दाग वाली कोशिकाएं। बाएं से दाएं, छवियां उज्ज्वल क्षेत्र, प्रतिदीप्ति और विलय प्रदर्शित करती हैं। स्केल पट्टियाँ 50 μm हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (मानक विचलन के औसत ±) (एन = 9) द्वारा मापा गया प्रत्येक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन में एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का औसत प्रतिशत। एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का प्रतिशत बीजी -1 (3.2% ± 1.6%) हैं; पीईओ 4 (18.0% ± 3.6%); ओवीसीएआर -3 (3.9% ± 39%); आईजीआरओवी -1 (51.7% ± 5.4%); और काओव -3 (93.7% ± 3.4%)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ALDH1A1+ कोशिकाओं की आबादी की पहचान करना
आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच के आवेदन के साथ, एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं की आबादी को विभिन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों में सफलतापूर्वक पहचाना गया था। पोस्ट-प्रयोगात्मक डेटा विश्लेषण के दौरान, प्रत्येक सेल लाइन के भीतर एएलडीएच 1 ए 1 + सेल आबादी को Ctrl-AlDeSense AM उपचारित आबादी के भीतर सबसे उज्ज्वल कोशिकाओं के शीर्ष 0.5% के लिए गेटिंग करके निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 5)। डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के पैनल के विश्लेषण से पता चला है कि एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का प्रतिशत है: बीजी -1 (4.9% ± 0.4%); पीईओ 4 (5.66% ± 0.9%); ओवीसीएआर -3 (0.1% ± 7.6%); आईजीआरओवी -1 (35.4% ± 2.8%); और काओव -3 (70.1% ± 2.4%) (चित्रा 6)।

Figure 5
चित्र 5: प्रतिनिधि स्कैटर प्लॉट और हिस्टोग्राम ओवरले. (ए, डी, जी, जे, एम) कोशिकाओं के साथ 1 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद Ctrl-AlDeSense AM के प्रतिनिधि स्कैटर प्लॉट। (B, E, H, K, N) कोशिकाओं के साथ 1 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद एल्डेसेंस एएम के प्रतिनिधि स्कैटर प्लॉट। (C, F, L, J, O) Ctrl-AlDeSense AM और AlDeSense AM के हिस्टोग्राम ओवरले इन स्थितियों को धुंधला करते हैं। दाग वाली सेल लाइनें (ए-सी) बीजी -1, (डी-एफ) पीईओ 4, (जी-आई) ओवीसीएआर -3, (जे-एल) आईजीआरओवी -1, और (एम-ओ) काओव -3 हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रवाह साइटोमेट्री (मानक विचलन के ± माध्य) (एन = 3) द्वारा मापा गया प्रत्येक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन में एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का औसत प्रतिशत। एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं का प्रतिशत बीजी -1 (4.9% ± 0.4%) था; पीईओ 4 (5.66% ± 0.9%); ओवीसीएआर -3 (0.1% ± 7.6%); आईजीआरओवी -1 (35.4% ± 2.8%); और काओव -3 (70.1% ± 2.4%)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जबकि कई एएलडीएच आइसोफॉर्म (यानी, एएलडीएच 1 ए 1, एएलडीएच 1 ए 2, एएलडीएच 1 ए 3, और एएलडीएच 3 ए 1) को सीएससी से जोड़ा गया है, एएलडीएच 1 ए 1 को इस अध्ययन के लिए लक्ष्य के रूप में चुना गया था क्योंकि, डिम्बग्रंथि के कैंसर के संदर्भ में, अभिव्यक्ति का स्तर21,27 ऊंचा है, और इस आइसोफॉर्म को दवा प्रतिरोध28,29 को बढ़ाने और ट्यूमरजेनिसिस 30,31 को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। . कॉन्फोकल इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री के परिणाम एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं की बढ़ती आबादी के क्रम में सहमति में हैं। इसके अतिरिक्त, सेल होमोजेनेट प्रयोग एक सेल लाइन के भीतर औसत गतिविधि को प्रकट करते हैं। संयोजन में, प्रत्येक सेल लाइन के ALDH1A1+ उप-आबादी के भीतर गतिविधि की मात्रा के बारे में निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि बीजी -1 में सबसे कम एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि और सबसे कम एएलडीएच 1 ए 1 + आबादी है। ध्यान दें, हमने एएलडीएच 1 ए 1 की नगण्य अभिव्यक्ति के कारण, इस अध्ययन में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए बीजी 1 सेल लाइन का चयन किया। इसके अतिरिक्त, कॉन्फोकल इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री ने काओव -3 कोशिकाओं में एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं के सबसे बड़े प्रतिशत का खुलासा किया, लेकिन सेल लाइन की समग्र गतिविधि केवल तीसरी सबसे अधिक थी। वैकल्पिक रूप से, OVCAR-3 कोशिकाओं में तीसरी सबसे अधिक ALDH1A1+ आबादी थी, लेकिन उच्चतम समग्र गतिविधि का प्रदर्शन किया। इन परिणामों से पता चलता है कि ALDH1A1+ OVCAR-3 कोशिकाओं की उप-जनसंख्या ALD1A1+ Caov-3 कोशिकाओं की उप-जनसंख्या की तुलना में अधिक गतिविधि है। सेल लाइनों या ऊतक नमूनों के भीतर एएलडीएच 1 ए 1 आबादी के आगे के विश्लेषण के माध्यम से, एएलडीएच 1 ए 1 की भूमिका को और स्पष्ट किया जा सकता है और ऊंचा एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक परिवर्तनों की जांच की जा सकती है।

सेल लाइन हिस्टोलॉजिकल प्रकार फ्लोरिमेट्री (फोल्ड चालू) Confocal (% सकारात्मक) प्रवाह (% सकारात्मक)
बीजी -1 खराब विभेदित एडेनोकार्सिनोमा 1.12 3.2 4.9
PEO4 उच्च ग्रेड सीरस सिस्टाडेनोकार्सिनोमा 2.51 18.0 5.7
OVCAR-3 उच्च श्रेणी के सीरस एडेनोकार्सिनोमा 10.25 39.8 7.6
IGROV-1 एंडोमेट्रोइड एडेनोकार्सिनोमा 1.30 51.7 35.4
काव -3 उच्च श्रेणी के सीरस एडेनोकार्सिनोमा 1.72 93.7 70.1

तालिका 1: सेल होमोजेनेट्स, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री के परिणामों का सारांश।

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Discussion

पैन-चयनात्मकता कई एएलडीएच जांच की एक प्रमुख सीमा है; हालांकि, कई आइसोफॉर्म-चयनात्मक उदाहरण हाल ही में32,33,34,35,36,37,38,39,40,41 बताए गए हैं। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच पहली तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन की गई जांच का प्रतिनिधित्व करती है जो केवल एएलडीएच 1 ए 1 आइसोफॉर्म के साथ प्रतिक्रिया करती है, यहां तक कि प्रतिस्पर्धी एंजाइमों की उपस्थिति में भी जो बड़ी अतिरिक्त मात्रा मेंमौजूद हैं। इस जांच की एक और विशिष्ट विशेषता इसकी अनूठी फ्लोरोजेनिक प्रकृति है, जिसे जांच सक्रियण से पहले कम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की विशेषता है। यह वाणिज्यिक किट जैसे कि ALDEFLUOR परख के विपरीत है, जिसमें एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट (BODIPY एमिनोएसिटालडिहाइड [BAAA]) होता है जो हमेशा 'ऑन-स्टेट' 32 में होता है। बीएएए इस आधार पर एएलडीएच + कोशिकाओं की पहचान करता है कि सक्रिय कार्बोक्सिलेट उत्पाद (जो समान रूप से फ्लोरोसेंट है) उच्च स्तर पर एएलडीएच व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में अधिक हद तक बरकरार है। एएलडीएच-कोशिकाओं में जांच के गैर-विशिष्ट संचय के लिए, एक नियंत्रण नमूने में मौजूद एएलडीएच को अवरुद्ध करने के लिए एक अवरोधक लागू किया जाना चाहिए। हालांकि, यह कई उल्लेखनीय कमियों के साथ है। सबसे पहले, यदि इरादा एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि के माध्यम से सीएससी की पहचान करना है, तो अवरोधक रणनीति का अनुप्रयोग विफल हो जाता है क्योंकि यह अलग-अलग सीमा तक अन्य आइसोफॉर्म को भी अवरुद्ध करता है। दूसरा, अवरोधक का गैर-विशिष्ट व्यवहार वैश्विक स्तर पर प्रतिक्रियाशील एल्डिहाइड को डिटॉक्सिफाई करने के लिए एक सेल की क्षमता को खराब कर सकता है। इन चिंताओं में से पहले को AlDeSense के डिजाइन में संबोधित किया गया है, क्योंकि यह केवल ऊपर उल्लिखित एकल आइसोफॉर्म के साथ प्रतिक्रिया करता है (पूरक चित्र 1)। दूसरी चिंता को दूर करने के लिए, Ctrl-AlDeSense अवरोधक की भूमिका को प्रतिस्थापित करता है। विशेष रूप से, नियंत्रण अभिकर्मक लगभग एक समान फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रदर्शित करता है जैसे कि निष्क्रिय AlDeSense, कोशिकाओं द्वारा समान सीमा तक लिया जाता है, और मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म के लिए स्थानीयकृत होता है। नियंत्रण द्वारा स्थापित बेसलाइन से परे किसी भी संकेत को इसलिए एएलडीएच 1 ए 1-मध्यस्थता जांच सक्रियण का प्रतिनिधित्व करना चाहिए।

पूरक चित्र 1: AlDeSense और ALDEFLUOR की प्रतिक्रियाशीलता। (ए) प्रत्येक एएलडीएच आइसोफॉर्म के साथ इनक्यूबेशन के बाद एल्डेसेंस का सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति टर्न-ऑन और (बी) प्रत्येक एएलडीएच आइसोफॉर्म के साथ एएलडीईफ्लोर की प्रतिक्रिया। सभी माप तीन प्रतियों में किए गए थे; त्रुटि पट्टियाँ SD ± हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रकाश डालने के लिए चुने गए आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच का पहला अनुप्रयोग सेल होमोजेनेट्स में एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि का माप है। ऐसी परिस्थितियों में जहां विशेष उपकरण जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर उपलब्ध नहीं हैं, सामान्य फ्लोरीमीटर का उपयोग तेजी से एक नमूने के भीतर कुल एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि पर रिपोर्ट कर सकता है। इन लाइनों के साथ, नमूना तैयार करने में आसानी (होमोजिनेट्स को सेल संस्कृतियों से लेकर उत्पादित ऊतक तक के नमूनों से एक्सेस किया जा सकता है) इस परख की प्रयोज्यता को व्यापक बनाता है। होमोजेनेट्स के साथ उपयोग के लिए आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच को अनुकूलित करते समय कुछ प्रमुख मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए। पहले में प्रति लाइसेट नमूने में कोशिकाओं की संख्या को संशोधित करना शामिल है। उदाहरण के लिए, यदि फ्लोरोसेंट सिग्नल परिवर्तन की सीमा के रूप में परिभाषित गतिशील सीमा अपर्याप्त रूप से कम है, तो प्रति नमूना कोशिकाओं की संख्या बढ़ाई जा सकती है। इसी तरह, इनक्यूबेशन समय को भी समायोजित किया जा सकता है ताकि एक मजबूत फ्लोरोसेंट रीडआउट प्राप्त करने के लिए अधिक फ्लोरोजेनिक जांच को सक्रिय किया जा सके। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि इस पद्धति की एक बड़ी सीमा एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि के विभिन्न स्तरों का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं की उप-आबादी के बीच अंतर करने में असमर्थता है। चूंकि कोशिकाओं को उनकी एएलडीएच 1 ए 1 स्थिति की परवाह किए बिना संयुक्त और लाइस किया जाता है, इसलिए नमूने में मौजूद सभी कोशिकाओं पर एंजाइम गतिविधि की मात्रा औसत होती है। यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की तुलना में एक अलग परिणाम देता है, जहां यह एएलडीएच + कोशिकाओं का प्रतिशत है जो रिपोर्ट किया जा रहा है। जबकि बीजी -1 कोशिकाएं सबसे कम गुना टर्न-ऑन प्रतिक्रिया प्रदर्शित करती हैं, साथ ही साथ एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं की सबसे छोटी आबादी, शेष चार सेल लाइनों का क्रम असंगत हो जाता है। उदाहरण के लिए, होमोजेनेट परख ओवीसीएआर -3 कोशिकाओं की पहचान उच्चतम समग्र एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि के लिए करती है, जबकि यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री के आधार पर केवल तीसरे स्थान पर है। इस डेटा की हमारी व्याख्या यह है कि एक ALDH1A1+ सेल में गतिविधि के अलग-अलग स्तर होने चाहिए। अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संचय-आधारित जांच का उपयोग करके इस प्रकार का 'टर्न-ऑन' प्रयोग संभव नहीं होगा।

इसके अतिरिक्त, आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच एएलडीएच 1 ए 1 + सेल आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक आणविक इमेजिंग एजेंट है। ध्यान दें, हालांकि इस प्रदर्शन में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी नियोजित किया गया था, यह फ्लोरोजेनिक जांच स्वचालित सेल काउंटर, एपि-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और वाइड-फील्ड रोशनी उपकरणों सहित इमेजिंग सेटअप के एक बड़े वर्गीकरण के साथ संगत है। इस प्रयोग में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक उपयुक्त थ्रेशोल्डिंग पैरामीटर (जैसे, पिनहोल आकार, लेजर पावर, एफआईटीसी लाभ) स्थापित करने के लिए Ctrl-AlDeSense का उपयोग है। इस संबंध में, सेटिंग्स को इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए कि Ctrl-AlDeSense सिग्नल पृष्ठभूमि के ठीक ऊपर है। उस घटना में जहां एक उपयोगकर्ता पाता है कि इस संकेत को देखने के लिए लेजर शक्ति को बढ़ाना आवश्यक है, बढ़ी हुई फोटोटॉक्सिसिटी या जांच विरंजन के कारण लेजर शक्ति (50% से ऊपर) बढ़ाने पर डाई धुंधला अवधि या लोडिंग एकाग्रता बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। Ctrl-AlDeSense के साथ गेटिंग करते समय कॉन्फोकल इमेजिंग की एक सीमा परिवर्तनशीलता है। इस चेतावनी के बावजूद, एएलडीएच 1 ए 1 + कोशिकाओं के बढ़ते प्रतिशत के आधार पर देखा गया सेल लाइन क्रम फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से प्राप्त परिणामों के समान था। आणविक इमेजिंग के विपरीत, जहां दृश्य कोशिकाओं की अधिकतम संख्या दृश्य के क्षेत्र द्वारा सीमित है, एक विशिष्ट प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग हजारों कोशिकाओं का विश्लेषण करता है। धुंधला समय और लोडिंग एकाग्रता के विचार आणविक इमेजिंग के लिए चर्चा किए गए समान हैं। एक अतिरिक्त तत्व जिस पर विचार किया जाना चाहिए, वह सेल निलंबन में डाई धुंधलापन भी है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि झूठी सकारात्मक एएलडीएच 1 ए 1 + आबादी को गलत तरीके से पहचाना न जाए।

समापन में, यह लेख एक उदाहरण के रूप में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करके विभिन्न तरीकों के लिए AlDeSense को अनुकूलित करने की प्रक्रिया पर प्रकाश डालता है। यह इस कैंसर प्रकार21,22,23,24 में एएलडीएच 1 ए 1 अभिव्यक्ति के बारे में विरोधाभासी रिपोर्टें क्यों मौजूद हैं, इसका जवाब देने की दिशा में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। हमने जो दिखाया है, उससे परे, हम कल्पना करते हैं कि इस आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग एएलडीएच 1 ए 1-चयनात्मक अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग अभियान में किया जा सकता है जो दवा उम्मीदवारों के रूप में उभर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, यह जांच जीवित जानवरों में सीएससी की पहचान करने के लिए उपयोग करना जारी रख सकती है, जैसा कि हमने अपने प्रारंभिक प्रकाशन11 में प्रदर्शित किया है। आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच की हरी-हल्की उत्सर्जक विशेषता इसे मल्टीप्लेक्सिंग प्रयोगों के लिए प्रमुख बनाती है जहां इसका उपयोग लाल उत्सर्जक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, छोटे अणु रंजक या विश्लेषण-उत्तरदायी जांच के साथ मिलकर किया जा सकता है। इसके अलावा, आइसोफॉर्म-चयनात्मक फ्लोरोजेनिक जांच का एक लाल संस्करण मौजूद है, जो इस मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता12 का विस्तार कर सकता है। अंत में, चिकित्सा के मोर्चे पर, इस जांच का उपयोग पॉइंट-ऑफ-केयर उपचार निर्णय लेने के लिए नैदानिक सेटिंग में एक रोगसूचक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। एएलडीएच 1 ए 1 गतिविधि और एएलडीएच 1 ए 1 + सेल आबादी को निर्धारित करना कैंसर की आक्रामकता को निर्धारित करने के लिए एक विधि के रूप में काम कर सकता है, जिससे जीवन की बेहतर गुणवत्ता के लिए व्यक्तिगत उपचार रणनीतियों की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, AlDeSense का उपयोग करके, एक रीडआउट को कुछ ही घंटों में वितरित और व्याख्या किया जा सकता है।

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Disclosures

हम AlDeSense तकनीक के लिए एक लंबित पेटेंट (US20200199092A1) का खुलासा करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर 35 जीएम 133581 से जेसी) और इलिनोइस ग्रेजुएट स्कॉलरशिप (एसजी को सम्मानित) में कैंसर सेंटर द्वारा समर्थित किया गया था। जेसी समर्थन के लिए केमिली और हेनरी ड्रेफस फाउंडेशन को धन्यवाद देता है। लेखकों ने AlDeSense और AlDeSense AM के स्टॉक तैयार करने में अपने प्रारंभिक योगदान के लिए डॉ थॉमस ई बेयररूड को धन्यवाद दिया। हम विभिन्न सिंथेटिक अग्रदूतों को तैयार करने में उनकी सहायता के लिए श्री ओलिवर डी पिचार्डो पेगुएरो और श्री जोसेफ ए फोरज़ानो को धन्यवाद देते हैं। एरिक नेल्सन (आणविक और एकीकृत फिजियोलॉजी विभाग, यूआईयूसी) को काव -3, आईजीआरओवी -1 और पीईओ 4 कोशिकाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। हम बीजी -1 कोशिकाओं के लिए प्रोफेसर पॉल हर्गेनरोथर (रसायन विज्ञान विभाग, यूआईयूसी) को धन्यवाद देते हैं। हम ज़ीस एलएसएम 700 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और संबंधित सॉफ्टवेयर तक पहुंच के लिए कार्ल आर विसे इंस्टीट्यूट फॉर जीनोमिक बायोलॉजी में कोर सुविधाओं को धन्यवाद देते हैं। हम बीडी एलएसआर द्वितीय सीएमटीओ विश्लेषक तक पहुंच के लिए फ्लो साइटोमेट्री सुविधा को धन्यवाद देते हैं। सैंड्रा मैकमास्टर्स और सेल मीडिया सुविधा को सेल संस्कृति मीडिया तैयार करने में सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning   25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline Corning 21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
AlDeSense Synthesized in-house
BG-1 A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask Thermo Fisher Scientific  130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2 Thermo Fisher Scientific 
Caov-3 A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer Fisher Scientific
Centrifuge 5180R Eppendorf 22627040
Contrl-AlDeSense Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL Corning 352003
FCS Express 6 Provided by UIUC CMtO
FL microscope EVOS
Fluorometer Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator Fisher Scientific 3110
IGROV-1 A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700 Zeiss
LSR II BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System Thermo Fisher Scientific  155383
OVCAR-3 ATCC HTB-161
PEO4 A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Scientific A32963
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Rocker VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin Prepared by UIUC cell media facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 ए 1 गतिविधि के आधार पर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को स्ट्रैटिफाई करने के लिए AlDeSense का अनुप्रयोग
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Lee, M. C., Gardner, S. H., Tapia… More

Lee, M. C., Gardner, S. H., Tapia Hernandez, R., Chan, J. Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity. J. Vis. Exp. (193), e64713, doi:10.3791/64713 (2023).

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