Summary
Los métodos para medir la actividad de ALDH1A1 en células vivas son críticos en la investigación del cáncer debido a su estado como biomarcador de tallo. En este estudio, empleamos una sonda fluorogénica selectiva de isoformas para determinar los niveles relativos de actividad de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Abstract
La recaída después del tratamiento del cáncer a menudo se atribuye a la persistencia de una subpoblación de células tumorales conocidas como células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por su notable capacidad de iniciación y autorenovación tumoral. Dependiendo del origen del tumor (por ejemplo, ovarios), el perfil de biomarcadores de superficie de CSC puede variar drásticamente, lo que hace que la identificación de tales células a través de la tinción inmunohistoquímica sea un esfuerzo difícil. Por el contrario, la aldehído deshidrogenasa 1A1 (ALDH1A1) se ha convertido en un excelente marcador para identificar las CSC, debido a su perfil de expresión conservado en casi todas las células progenitoras, incluidas las CSC. La isoforma ALDH1A1 pertenece a una superfamilia de 19 enzimas que son responsables de la oxidación de varios aldehídos endógenos y xenobióticos a los productos de ácido carboxílico correspondientes. Chan et al. desarrollaron recientemente AlDeSense, una sonda de "encendido" selectiva de isoformas para la detección de la actividad de ALDH1A1, así como un reactivo de control de coincidencia no reactivo (Ctrl-AlDeSense) para tener en cuenta la tinción fuera del objetivo. Esta herramienta selectiva de isoformas ya ha demostrado ser una herramienta química versátil a través de la detección de la actividad de ALDH1A1 en células de leucemia mielógena K562, mamosferas y xenoinjertos CSC derivados del melanoma. En este artículo, la utilidad de la sonda se mostró a través de fluorimetría adicional, microscopía confocal y experimentos de citometría de flujo donde se determinó la actividad relativa de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Introduction
Las células madre cancerosas (CSC) son una subpoblación de células tumorales que exhiben propiedades similares a las células madre1. Al igual que sus contrapartes no cancerosas, las CSC poseen la extraordinaria capacidad de autorrenovarse y proliferar. Junto con otros mecanismos incorporados, como la regulación positiva de los transportadores de casetes de unión a ATP, las CSC a menudo se salvan de los esfuerzos quirúrgicos iniciales de citorreducción, así como de la terapia adyuvante posterior2. Debido a su papel crítico en la resistencia al tratamiento3, la recaída4 y la metástasis5, las CSC se han convertido en una prioridad en la investigación del cáncer. A pesar de que hay una variedad de antígenos de superficie celular (por ejemplo, CD133) que pueden ser utilizados para identificar CSCs6, el aprovechamiento de la actividad enzimática de las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) encontradas en el citoplasma ha surgido como una alternativa atractiva7. Los ALDH son una superfamilia de 19 enzimas responsables de catalizar la oxidación de aldehídos endógenos y xenobióticos reactivos a los productos de ácido carboxílico correspondientes8.
En general, la desintoxicación de aldehído es crucial para proteger las células de eventos de reticulación indeseables y estrés oxidativo que pueden dañar la integridad de las células madre9. Además, la isoforma 1A1 controla el metabolismo del ácido retinoico, que a su vez influye en el tallo a través de la señalización del retinaldehído10. Recientemente se desarrolló AlDeSense 11,12, una sonda de detección basada en la actividad de moléculas pequeñas (ABS) para detectar selectivamente la actividad de ALDH1A1. Los diseños de ABS logran la detección de analitos a través de un cambio químico en lugar de un evento vinculante, lo que permite una alta selectividad y una disminución de las respuestas fuera del objetivo13,14,15,16. El principio de diseño de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma se basa en un mecanismo de enfriamiento de transferencia de electrones fotoinducida por donante (d-PeT)17, originado en el grupo funcional aldehído, que sirve para suprimir la firma fluorescente de la sonda18. Tras la conversión mediada por ALDH1A1 al ácido carboxílico, la relajación radiativa se desbloquea para producir un producto altamente fluorescente. Debido a que el enfriamiento de d-PeT nunca es 100% eficiente, la fluorescencia residual que puede conducir a posibles resultados falsos positivos se consideró al establecer este ensayo a través del desarrollo de Ctrl-AlDeSense, un reactivo que no responde con características fotofísicas coincidentes (por ejemplo, rendimiento cuántico) y un patrón de tinción citoplasmática idéntico en las células. Cuando se usa en conjunto, este emparejamiento único puede distinguir de manera confiable las células con alta actividad ALDH1A1 de aquellas que exhiben niveles bajos a través de fluorimetría, imágenes moleculares y citometría de flujo. Varias ventajas clave están asociadas con el uso de colorantes activables selectivos de isoformas sobre los métodos inmunohistoquímicos tradicionales. Por ejemplo, se presume que las CSC están enterradas profundamente dentro de un tumor y, por lo tanto, son más accesibles a una molécula pequeña en relación con los anticuerpos grandes19. Además, el producto fluorescente volteado no modifica covalentemente ningún componente celular, lo que significa que se puede eliminar fácilmente a través de ciclos de lavado para dejar un CSC en un estado sin modificar. Por último, la respuesta de encendido solo identifica células y funciones viables, al igual que el ensayo MTT, debido a su dependencia del cofactor NAD +.
Figura 1: Esquema que demuestra el encendido fluorescente de AlDeSense. El colorante selectivo de isoforma es activado por ALDH1A1 y se puede utilizar para identificar la actividad elevada de ALDH1A1 en células de cáncer de ovario a través de fluorimetría, imágenes moleculares y citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En trabajos anteriores, el ensayo de sonda fluorogénica selectiva de isoformas estratificó con éxito células ALDH altas (ALDH +) de células ALDH bajas (ALDH-) en células de leucemia crónica humana K562, células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y células de melanoma murino B16F0. Esto es importante porque, para muchos tipos de cáncer, la expresión alta de la proteína ALDH1A1 significa un peor pronóstico clínico20. Esto supone que los niveles elevados de ALDH1A1 son indicativos de CSC que pueden evadir el tratamiento, desarrollar resistencia y diseminarse por todo el cuerpo. Sin embargo, en el caso del cáncer de ovario, hay estudios que reportan el hallazgo contrario (la alta expresión de ALDH1A1 está relacionada con una mejor supervivencia de la paciente)21,22,23,24. Si bien esto puede parecer contradictorio a primera vista, la expresión no necesariamente se correlaciona con la actividad enzimática, que puede estar influenciada por cambios en el microambiente tumoral (por ejemplo, flujo de pH, gradientes de oxígeno), disponibilidad del cofactor NAD + o sustratos aldehídos, niveles de ácidos carboxílicos (inhibición del producto) y modificaciones postraduccionales que pueden alterar la actividad enzimática25 . Además, el cáncer de ovario se divide en cinco tipos histológicos principales (seroso de alto grado, seroso de bajo grado, endometrioide, de células claras y mucinoso), que hipotetizamos que presentarán niveles variables de actividad ALDH1A126. Con el objetivo de investigar la actividad de ALDH1A1 en tumores de ovario, se empleó un ensayo de sonda fluorogénica selectiva de isoforma para identificar poblaciones de ALDH1A1+ en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario pertenecientes a los diferentes tipos histológicos mencionados anteriormente. Las líneas celulares probadas en este estudio incluyen células BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 y PEO4, que cubren histotipos de células claras y serosas. Aquí, se destacó la versatilidad y generalización de la sonda para identificar CSC para los investigadores que buscan realizar estudios similares en otras líneas celulares de cáncer inmortalizadas, así como muestras de pacientes. El uso de AlDeSense arrojará luz sobre las vías bioquímicas involucradas en el mantenimiento de CSC en microambientes tisulares complejos y potencialmente servirá como una herramienta clínica para determinar el pronóstico y medir la agresividad del cáncer.
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Protocol
1. Medir la actividad total de ALDH1A1 en homogeneizados de células de cáncer de ovario a través de fluorimetría
- Descongelar 1 × 106 células en un matraz de cultivo celular T25 en 5 ml de los siguientes medios de cultivo celular:
- IGROV-1 y PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
- BG-1 y Caov-3: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 10% FBS y 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 con 20% FBS, 1% P/S y 0,01 mg/ml de insulina.
- Mantener las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante dos o tres pasos. Asegúrese de que las células no excedan el 80% -90% de confluencia antes del paso.
- Tripsinizar las células en tripsina al 0,25% durante 10 min, contarlas con un contador de células automatizado y granular 1 × 107 células mediante centrifugación (180 × g) a 25 °C durante 5 min.
- Retire el sobrenadante cuidadosamente por aspiración, lave el pellet resuspendiendo las células en 1 ml de 1x PBS y vuelva a granular las células mediante centrifugación en las mismas condiciones que se describen en el paso 4.
- Resuspender las células en una solución de inhibidor de proteasa 1x en 1x PBS. Use 1 ml de esta solución por cada 2,5 × 106 células.
- Sonicar la suspensión celular en hielo durante 2 min (pulso de 1 s, 40% de amplitud) con una sonda homogeneizadora celular.
- Fracciones insolubles/membrana del pellet por centrifugación (3.200 × g) a 25 °C durante 15 min. Retire y mantenga el sobrenadante, ya que este es el homogeneizado que se utilizará en los pasos posteriores. Separar los homogeneizados en tres cubetas para realizar el experimento por triplicado.
- Añadir la sonda al homogeneizado para obtener una concentración final de la sonda de 4 μM. Pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar bien la solución.
- Mida la señal fluorescente inmediatamente después de la adición y después de los tiempos de incubación deseados en un fluorímetro. El tiempo de incubación se puede optimizar para ver el encendido máximo del pliegue (1 h en este experimento). El tiempo de incubación debe ser constante en todas las líneas celulares comparadas.
- Establezca la longitud de onda de excitación en 496 nm.
- Ajuste la emisión a 510-600 nm.
- Ajuste el ancho de la hendidura a 0,5 mm.
- Pipeta la solución en una cubeta de cuarzo de 1 ml, colóquela en el fluorímetro y presione escanear.
- Divida la intensidad de fluorescencia final a 516 nm (longitud de onda fluorescente máxima) por la intensidad en la misma longitud de onda de la lectura inicial para determinar la activación del pliegue del colorante selectivo de isoforma.
2. Uso de microscopía de fluorescencia para obtener imágenes de células con alta actividad ALDH1A1
- Descongelar 1 × 106 células en un matraz de cultivo celular T25 en 5 ml del medio de cultivo celular apropiado.
- Mantener las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante dos o tres pasos. Asegúrese de que las células no excedan el 80% -90% de confluencia antes del paso.
- El día anterior a la toma de imágenes confocales, la placa 4 × 105 células en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos.
- Cubra el fondo de cada pocillo con poli-L-lisina (0,1 mg/ml, 100 μL por pocillo) durante 10 min, aspirando posteriormente.
- Lave cada pocillo 3 veces agregando agua de grado de cultivo celular (100 μL por pocillo) y aspirando.
- Tripsinizar las células en tripsina al 0,25% durante 10 minutos, contarlas con un contador de células automatizado y colocar las células en 4 × 105 células por pocillo.
- Deje que las células se asienten y se adhieran durante la noche (12-16 h).
- Aspirar el medio de crecimiento y añadir medios libres de suero (500 μL por pocillo), complementados con 2 μM de la sonda o la sonda de control.
- Incubar con la sonda a temperatura ambiente durante 30 minutos y obtener imágenes de las células inmediatamente.
- Encienda el microscopio confocal y ajuste la muestra.
- Cargue la muestra cuidadosamente con el menor aumento; Encuentre las celdas para garantizar un posicionamiento adecuado.
- Asegúrese de que la lente del objetivo tenga un aumento de 10x y ubique las celdas.
- Para este experimento, se requieren el canal FITC (excitación: láser de 488 nm; emisión: 516-521 nm) y el canal T-PMT (luz transmitida). Localice y concéntrese en las células usando T-PMT para enfocarse en el mismo plano z durante todo el experimento para eliminar el sesgo.
- Ajuste la potencia del láser y la ganancia FITC a la configuración adecuada, donde la señal de las muestras Ctrl-AlDeSense AM es mínimamente detectable, mientras sigue viendo la señal en las muestras AlDeSense AM. Cada parámetro se puede ajustar deslizando la barra correspondiente. Es posible que la configuración deba ajustarse varias veces para identificar los parámetros correctos. Una vez optimizado, completa el resto del experimento dentro de esa línea celular usando parámetros idénticos.
- Tome tres imágenes por pocillo para un total de tres pozos por condición de tratamiento (nueve imágenes en total). Concéntrese en el plano adecuado usando T-PMT para evitar el sesgo en lugar de usar el canal de fluorescencia o la imagen combinada.
- Procese las imágenes para determinar el porcentaje de células ALDH1A1+.
- Usando el software de procesamiento de imágenes, divida el archivo czi en diferentes canales.
- Cuente el número total de células y el número total de células fluorescentes.
- Para determinar el porcentaje de células ALDH1A1+, divida el número de células fluorescentes por el número total de células en cada imagen. Es imperativo contar de la misma manera para cada imagen sin manipular las imágenes, ya que, por ejemplo, ajustar el brillo puede agregar una variable de confusión.
3. Aplicación de citometría de flujo para identificar células con alta actividad ALDH1A1
- Descongelar 1 × 106 células en un matraz de cultivo celular T25 en 5 ml del medio de cultivo celular apropiado.
- Mantener las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante dos o tres pasos. Asegúrese de que las células no excedan el 80% -90% de confluencia antes del paso.
- Tripsinizar, contar y granular las células en un tubo de centrífuga de 15 ml mediante centrifugación (180 × g) a 25 °C durante 5 min.
- Resuspender las células en 1 ml de solución de sonda de sonda/sonda de control de 2 μM en PBS. Mece las células a temperatura ambiente durante 60 minutos para garantizar que la exposición al tinte sea uniforme.
- Después del período de incubación, granular las células por centrifugación (180 × g) a 25 °C durante 5 min. Resuspender las células en 0,5 mL de PBS. Pase las células a través de un colador celular (malla de nylon de 35 μm) para eliminar los grupos de células que pueden obstruir el citómetro de flujo. Coloque inmediatamente las celdas en hielo.
- Encienda el instrumento y ejecute el protocolo de inicio.
- Compruebe si hay líquido de vaina y residuos vacíos.
- Ejecute las líneas con 10% de lejía y agua durante 5 minutos cada una.
- Ejecute perlas de control de calidad para garantizar el funcionamiento adecuado.
- En la pestaña de configuración, seleccione FSC (dispersión directa), SSC (dispersión lateral) y FITC (isotiocianato de fluoresceína) para el filtro de fluorescencia .
- Dibuje los siguientes gráficos en la puerta para la viabilidad, singletes y fluorescencia. Optimice la potencia del láser (específica para el instrumento del usuario) para que las poblaciones celulares estén dentro de los parámetros dados para su posterior análisis.
- Diagrama de dispersión FSC-A versus SSC-A: la población de células principales está cerca del centro del gráfico.
- Diagrama de dispersión FSC-A versus FSC-W: banda horizontal estrecha indicativa de singletes (en lugar de grupos celulares).
- Diagrama de dispersión FITC-A versus FSC-A: observe la distribución de las células clasificadas por la sonda de encendido fluorogénico selectivo de isoformas.
- Histograma FITC-A: observe el cambio en la población basado en FITC para determinar el porcentaje de células ALDH1A1+.
- Para optimizar la potencia del láser FIFC, ejecute una muestra con la sonda de modo que la cola derecha de la curva del histograma esté cerca de la señal FITC-A máxima. Posteriormente, ejecute una muestra con la sonda de control. Un cambio de población debe ser observable para revelar el rango dinámico máximo. El paso de optimización de la potencia del láser puede tener que repetirse varias veces, pero la potencia del láser no debe alterarse en las muestras una vez que se ha designado un ajuste para un experimento.
- Ejecute cada muestra durante 10,000 recuentos (hecho por triplicado).
- Repita el paso 3.12 para cada línea celular, ya que habrá variabilidad en la absorción y la actividad de ALDH1A1.
- Después de completar la recolección de muestras, ejecute las líneas con cloro al 10% y agua durante 5 minutos cada una, luego inicie el apagado del instrumento.
- Procese los datos utilizando el software de citometría de flujo y compruebe la población celular deseada. Establezca las puertas para que todos los eventos caigan en la puerta ALDH1A1- o ALDH1A1+. Con la selección de la puerta rectangular, configure la puerta ALDH1A1- de modo que el >99,5% de los eventos en las muestras de la sonda de control se produzcan dentro de esta puerta. Las células restantes se considerarán ALDH1A1+. Estas mismas puertas se pueden aplicar a la muestra de la sonda para cuantificar el número de eventos considerados ALDH1A1- y ALDH1A1+.
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Representative Results
Actividad total de ALDH1A1 de los homogeneizados de células de cáncer de ovario
Los giros de pliegue promedio para cada línea celular obtenida de este ensayo son: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); y OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2).
Figura 2: Encendido fluorescente del pliegue del colorante selectivo de isoformas en homogeneizados de cada línea celular de cáncer de ovario medido por fluorimetría (media ± desviación estándar) (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Imágenes moleculares de subpoblaciones ALDH1A1+ en células cultivadas de cáncer de ovario
Al incubar las células con una sonda o sonda de control, se determinó el porcentaje de células ALDH1A1+ en cada línea celular. Al ajustar la potencia y la ganancia del láser para minimizar la señal en la muestra tratada con Ctrl-AlDeSense AM, la señal de fluorescencia se optimizó en las células tratadas con AlDeSense AM (Figura 3). Al contar el número de células ALDH1A1+, se determinó que el porcentaje de células ALDH1A1+ era: BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); y Caov-3 (93,7% ± 3,4%) (Figura 4).
Figura 3: Imágenes confocales representativas . (A,C,E,G,I) Células teñidas Ctrl-AlDeSense AM y (B,D,F,H,J) Células teñidas AlDeSense AM. De izquierda a derecha, las imágenes exhiben campo claro, fluorescencia y fusión. Las barras de escala son de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Porcentaje medio de células ALDH1A1+ en cada línea celular de cáncer de ovario medido por microscopía confocal (media ± desviación estándar) (n = 9). El porcentaje de células ALDH1A1+ son BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); y Caov-3 (93,7% ± 3,4%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Identificación de la población de células ALDH1A1+ mediante citometría de flujo
Con la aplicación de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma, la población de células ALDH1A1+ se identificó con éxito en diferentes líneas celulares de cáncer de ovario. Durante el análisis de datos post-experimental, la población celular ALDH1A1+ dentro de cada línea celular podría cuantificarse mediante la activación del 0,5% superior de las células más brillantes dentro de la población tratada con Ctrl-AlDeSense AM (Figura 5). El análisis del panel de células de cáncer de ovario ha revelado que los porcentajes de células ALDH1A1+ son: BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); y Caov-3 (70,1% ± 2,4%) (Figura 6).
Figura 5: Diagramas de dispersión representativos y superposición de histogramas. (A,D,G,J,M) Diagramas de dispersión representativos de tinción Ctrl-AlDeSense AM después de una incubación de 1 h con células. (B,E,H,K,N) Diagramas de dispersión representativos de tinción AlDeSense AM después de una incubación de 1 h con células. (C,F,L,J,O) Superposición de histograma de la tinción Ctrl-AlDeSense AM y AlDeSense AM de estas condiciones. Las líneas celulares que se tiñen son (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 y (M-O) Caov-3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Porcentaje medio de células ALDH1A1+ en cada línea celular de cáncer de ovario medido por citometría de flujo (media ± desviación estándar) (n = 3). El porcentaje de células ALDH1A1+ fueron BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); y Caov-3 (70,1% ± 2,4%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Si bien varias isoformas de ALDH (es decir, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 y ALDH3A1) se han relacionado con las CSC, ALDH1A1 se seleccionó como el objetivo para este estudio porque, en el contexto del cáncer de ovario, los niveles de expresión son elevados 21,27, y se ha demostrado que esta isoforma exacerba la resistencia a los medicamentos28,29 y mejora la tumorigénesis 30,31 . Los resultados de la imagen confocal y la citometría de flujo están de acuerdo en el orden de la creciente población de células ALDH1A1+. Además, los experimentos de homogeneización celular revelan la actividad promedio dentro de una línea celular. En conjunto, se pueden extrapolar conclusiones sobre la cantidad de actividad dentro de las subpoblaciones ALDH1A1+ de cada línea celular. Se puede concluir que BG-1 tiene la actividad ALDH1A1 más baja y la población ALDH1A1+ más baja. Cabe destacar que seleccionamos la línea celular BG1 para ser utilizada como control negativo en este estudio, debido a la expresión insignificante de ALDH1A1. Además, las imágenes confocales y la citometría de flujo revelaron el mayor porcentaje de células ALDH1A1+ en las células Caov-3, pero la actividad general de la línea celular fue solo la tercera más alta. Alternativamente, las células OVCAR-3 contenían la tercera población ALDH1A1+ más alta, pero exhibieron la mayor actividad general. Extrapolando a partir de estos resultados, la subpoblación de células ALDH1A1+ OVCAR-3 tiene mayor actividad que la subpoblación de células ALD1A1+ Caov-3. A través de un análisis adicional de la población ALDH1A1 dentro de líneas celulares o muestras de tejido, el papel de ALDH1A1 puede dilucidarse aún más y se pueden investigar los cambios fenotípicos como resultado de la actividad elevada de ALDH1A1.
| Línea celular | Tipo histológico | Fluorimetría (pliegue encendido) | Confocal (% positivo) | Flujo (% positivo) | ||
| BG-1 | Adenocarcinoma pobremente diferenciado | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| PEO4 | Cistadenocarcinoma seroso de alto grado | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| OVCAR-3 | Adenocarcinoma seroso de alto grado | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| IGROV-1 | Adenocarcinoma endometrioide | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Caov-3 | Adenocarcinoma seroso de alto grado | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Tabla 1: Resumen de resultados de homogeneizados celulares, microscopía confocal y citometría de flujo.
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Discussion
La panselectividad es una limitación importante de muchas sondas ALDH; Sin embargo, recientemente se han reportado varios ejemplos selectivos de isoformas 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. La sonda fluorogénica selectiva de isoformas utilizada en este estudio representa la primera sonda diseñada racionalmente que reacciona solo con la isoforma ALDH1A1, incluso en presencia de enzimas competidoras que están presentes en grandes cantidades excesivas11,12. Otra característica distintiva de esta sonda es su naturaleza fluorogénica única, que se caracteriza por una baja emisión de fluorescencia antes de la activación de la sonda. Esto es contrario a los kits comerciales como el ensayo ALDEFLUOR, que presenta un sustrato fluorescente (BODIPY aminoacetaldehído [BAAA]) que siempre está en un estado "on-state"32. BAAA identifica las células ALDH + basándose en la premisa de que el producto carboxilato activado (que es igualmente fluorescente) se retiene en mayor medida en las células que expresan ALDH en niveles altos. Para tener en cuenta la acumulación no específica de la sonda en las células ALDH-, se debe aplicar un inhibidor para bloquear las ALDH que están presentes en una muestra de control. Sin embargo, esto va acompañado de varios inconvenientes notables. En primer lugar, si la intención es identificar las CSC a través de la actividad ALDH1A1, la aplicación de la estrategia inhibidora falla porque también bloquea otras isoformas en diversos grados. En segundo lugar, el comportamiento no específico del inhibidor puede afectar la capacidad de una célula para desintoxicar aldehídos reactivos a nivel global. La primera de estas preocupaciones se aborda en el diseño de AlDeSense, porque solo reacciona con una sola isoforma como se mencionó anteriormente (Figura complementaria 1). Para mejorar la segunda preocupación, Ctrl-AlDeSense reemplaza el papel del inhibidor. Específicamente, el reactivo de control exhibe una señal fluorescente casi idéntica a la AlDeSense no activada, es absorbida en igual medida por las células y se localiza predominantemente en el citoplasma. Por lo tanto, cualquier señal más allá de la línea de base establecida por el control debe representar la activación de la sonda mediada por ALDH1A1.
Figura complementaria 1: La reactividad de AlDeSense y ALDEFLUOR. (A) Activación de fluorescencia normalizada de AlDeSense después de la incubación con cada isoforma de ALDH y (B) reactividad de ALDEFLUOR con cada isoforma de ALDH. Todas las mediciones se realizaron por triplicado; las barras de error están ± SD. Haga clic aquí para descargar este archivo.
La primera aplicación de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma elegida para destacar es la medición de la actividad de ALDH1A1 en homogeneizados celulares. En circunstancias en las que no se dispone de instrumentación especializada, como microscopios confocales o citómetros de flujo, el uso de fluorímetros comunes puede informar rápidamente sobre la actividad total de ALDH1A1 dentro de una muestra. En esta línea, la facilidad de preparación de la muestra (se puede acceder a homogeneizados a partir de muestras que van desde cultivos celulares hasta tejido extirpado) amplía la aplicabilidad de este ensayo. Hay algunos parámetros clave que deben tenerse en cuenta al optimizar la sonda fluorogénica selectiva de isoformas para su uso con homogeneizados. El primero consiste en modular el número de células por muestra de lisado. Por ejemplo, si el rango dinámico, definido como la extensión del cambio de señal fluorescente, no es lo suficientemente bajo, se puede aumentar el número de células por muestra. Del mismo modo, el tiempo de incubación también se puede ajustar de modo que se pueda activar más sonda fluorogénica para producir una lectura fluorescente más fuerte. Sin embargo, cabe destacar que una limitación importante de este método es la incapacidad de distinguir entre subpoblaciones de células que exhiben niveles variables de actividad ALDH1A1. Dado que las células se combinan y lisan independientemente de su estado ALDH1A1, la cantidad de actividad enzimática se promedia en todas las células presentes en la muestra. Esto da como resultado un resultado diferente en comparación con la microscopía confocal y los análisis de citometría de flujo, donde es el porcentaje de células ALDH + lo que se informa. Mientras que las células BG-1 muestran la respuesta de encendido de pliegue más baja, así como la población más pequeña de células ALDH1A1+, el orden de las cuatro líneas celulares restantes se vuelve inconsistente. Por ejemplo, el ensayo de homogeneización identifica que las células OVCAR-3 tienen la mayor actividad general de ALDH1A1, mientras que ocupa el tercer lugar según la microscopía confocal y la citometría de flujo. Nuestra interpretación de estos datos es que una célula ALDH1A1+ debe tener diferentes niveles de actividad. Por último, es importante tener en cuenta que este tipo de experimento de "encendido" no sería posible utilizando sondas basadas en acumulación.
Además, la sonda fluorogénica selectiva de isoformas es un agente de imagen molecular para la visualización de poblaciones celulares ALDH1A1+. Cabe destacar que, aunque se empleó microscopía confocal en esta demostración, esta sonda fluorogénica es compatible con una gran variedad de configuraciones de imágenes, incluidos contadores celulares automatizados, microscopios de epifluorescencia e instrumentos de iluminación de campo amplio. Uno de los pasos más importantes en este experimento es el uso de Ctrl-AlDeSense para establecer los parámetros de umbral apropiados (por ejemplo, tamaño del agujero de alfiler, potencia del láser, ganancia FIFC). En este sentido, la configuración debe ajustarse de tal manera que la señal Ctrl-AlDeSense esté justo encima del fondo. En el caso de que un usuario encuentre que es necesario aumentar la potencia del láser para ver esta señal, se recomienda extender el período de tinción del tinte o la concentración de carga sobre el aumento de la potencia del láser (por encima del 50%) debido al aumento de la fototoxicidad o al blanqueo de la sonda. Una limitación de las imágenes confocales es la variabilidad cuando se conecta con Ctrl-AlDeSense. A pesar de esta advertencia, el orden de la línea celular observado basado en porcentajes crecientes de células ALDH1A1+ fue idéntico a los resultados obtenidos mediante citometría de flujo. A diferencia de las imágenes moleculares, donde el número máximo de células visualizadas está limitado por el campo de visión, un experimento típico de citometría de flujo analiza hasta decenas de miles de células. Las consideraciones del tiempo de tinción y la concentración de carga son similares a las discutidas para la imagen molecular. Un elemento adicional que debe considerarse es incluso la tinción de tinte en la suspensión celular para garantizar que las poblaciones falsas positivas de ALDH1A1+ no se identifiquen erróneamente.
Para concluir, este artículo destaca el proceso para optimizar AlDeSense para una variedad de modalidades, utilizando células de cáncer de ovario como ejemplo. Esto representa un primer paso importante para responder por qué existen informes contradictorios con respecto a la expresión de ALDH1A1 en este tipo de cáncer21,22,23,24. Más allá de lo que hemos demostrado, prevemos que esta sonda fluorogénica selectiva de isoformas se puede utilizar en una campaña de detección de alto rendimiento para identificar inhibidores selectivos de ALDH1A1 que pueden surgir como candidatos a fármacos. Además, esta sonda puede seguir encontrando uso para identificar CSC en animales vivos, como hemos demostrado en nuestra publicación inicial11. La característica emisiva de luz verde de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma la prepara para experimentos de multiplexación donde se puede usar en conjunto con proteínas fluorescentes emisoras de rojo, colorantes de moléculas pequeñas o sondas sensibles al analito. Además, existe una versión roja de la sonda fluorogénica selectiva de isoformas, que puede ampliar aún más esta capacidad de multiplexación12. Finalmente, en el frente médico, esta sonda se puede utilizar como una herramienta de pronóstico en el entorno clínico para la toma de decisiones de tratamiento en el punto de atención. La cuantificación de la actividad de ALDH1A1 y las poblaciones de células ALDH1A1+ puede servir como método para determinar la agresividad del cáncer, lo que permite estrategias de tratamiento personalizadas para una mejor calidad de vida. Además, utilizando AlDeSense, una lectura puede ser entregada e interpretada en cuestión de horas.
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Disclosures
Divulgamos una patente pendiente (US20200199092A1) para la tecnología AlDeSense.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM133581 a JC) y el Centro de Cáncer en Illinois Graduate Scholarship (otorgado a SG). JC agradece el apoyo de la Fundación Camille y Henry Dreyfus. Los autores agradecen al Dr. Thomas E. Bearrood por su contribución inicial a la preparación de las existencias de AlDeSense y AlDeSense AM. Agradecemos al Sr. Oliver D. Pichardo Peguero y al Sr. Joseph A. Forzano por su ayuda en la preparación de diversos precursores sintéticos. Agradecemos al Prof. Erik Nelson (Departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, UIUC) por las células Caov-3, IGROV-1 y PEO4. Agradecemos al Prof. Paul Hergenrother (Departamento de Química, UIUC) por las células BG-1. Agradecemos a las instalaciones centrales del Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica por el acceso al microscopio confocal Zeiss LSM 700 y al software correspondiente. Agradecemos a la Flow Cytometry Facility por el acceso al analizador BD LSR II CMtO. Sandra McMasters y al Cell Media Facility por su ayuda en la preparación de los medios de cultivo celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
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