Summary
Metoder for å måle ALDH1A1-aktivitet i levende celler er kritiske i kreftforskning på grunn av sin status som en biomarkør for stamme. I denne studien benyttet vi en isoform-selektiv fluorogen sonde for å bestemme de relative nivåene av ALDH1A1-aktivitet i et panel med fem eggstokkreftcellelinjer.
Abstract
Tilbakefall etter kreftbehandling tilskrives ofte utholdenheten til en underpopulasjon av tumorceller kjent som kreftstamceller (CSC), som er preget av deres bemerkelsesverdige tumorinitierende og selvfornyelseskapasitet. Avhengig av opprinnelsen til svulsten (f.eks. Eggstokkene), kan CSC-overflatens biomarkørprofil variere dramatisk, noe som gjør identifisering av slike celler via immunhistokjemisk farging en utfordrende innsats. Tvert imot har aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) dukket opp som en utmerket markør for å identifisere CSC, på grunn av sin konserverte ekspresjonsprofil i nesten alle stamceller, inkludert CSC. ALDH1A1-isoformen tilhører en superfamilie av 19 enzymer som er ansvarlige for oksydasjonen av forskjellige endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende karboksylsyreproduktene. Chan et al. utviklet nylig AlDeSense, en isoform-selektiv "turn-on" sonde for påvisning av ALDH1A1-aktivitet, samt et ikke-reaktivt matchende kontrollreagens (Ctrl-AlDeSense) for å ta hensyn til farging utenfor målet. Dette isoformselektive verktøyet har allerede vist seg å være et allsidig kjemisk verktøy gjennom påvisning av ALDH1A1-aktivitet i K562 myelogene leukemiceller, mammosfærer og melanomavledede CSC-xenotransplantater. I denne artikkelen ble sondens nytte vist gjennom ytterligere fluorimetri, konfokalmikroskopi og flowcytometrieksperimenter der den relative ALDH1A1-aktiviteten ble bestemt i et panel med fem eggstokkreftcellelinjer.
Introduction
Kreft stamceller (CSC) er en underpopulasjon av tumorceller som viser stamcellelignende egenskaper1. I likhet med deres ikke-kreftfremkallende kolleger har CSC-er den ekstraordinære evnen til selvfornyelse og spredning. Sammen med andre innebygde mekanismer, som oppregulering av ATP-bindende kassetttransportører, blir CSC ofte spart for innledende kirurgisk debulking, så vel som påfølgende adjuvant behandling2. På grunn av deres kritiske rolle i behandlingsresistens3, tilbakefall4 og metastase5, har CSC blitt en prioritet i kreftforskning. Selv om det finnes en rekke celleoverflateantigener (f.eks. CD133) som kan brukes til å identifisere CSC6, har utnyttelse av den enzymatiske aktiviteten til aldehyddehydrogenaser (ALDH) funnet i cytoplasma dukket opp som et attraktivt alternativ7. ALDH er en superfamilie av 19 enzymer som er ansvarlige for å katalysere oksidasjonen av reaktive endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende karboksylsyreproduktene8.
Generelt er aldehydavgiftning avgjørende for å beskytte celler mot uønskede kryssbindingshendelser og oksidativt stress som kan skade stamcellenes integritet9. Videre styrer 1A1-isoformen retinsyremetabolismen, som igjen påvirker stammen via retinaldehydsignalering10. AlDeSense 11,12, en liten molekylær aktivitetsbasert sensing (ABS) sonde for selektivt å oppdage ALDH1A1-aktivitet, ble nylig utviklet. ABS-design oppnår analyttdeteksjon gjennom en kjemisk endring i stedet for en bindingshendelse, noe som muliggjør høy selektivitet og reduserte responser utenfor målet13,14,15,16. Designprinsippet for den isoformselektive fluorogene sonden er avhengig av en donor-fotoinducert elektronoverføring (d-PeT) slukkemekanisme17, som stammer fra den aldehydfunksjonelle gruppen, som tjener til å undertrykke sondens fluorescerende signatur18. Ved ALDH1A1-mediert omdannelse til karboksylsyre låses strålingen opp for å gi et svært fluorescerende produkt. Fordi d-PeT-slukking aldri er 100% effektiv, ble den gjenværende fluorescensen som kan føre til mulige falske positive resultater vurdert ved etablering av denne analysen gjennom utvikling av Ctrl-AlDeSense, et ikke-responsivt reagens med matchende fotofysiske egenskaper (f.eks. kvanteutbytte) og et identisk cytoplasmatisk fargemønster i celler. Når den brukes i tandem, kan denne unike sammenkoblingen pålitelig skille celler med høy ALDH1A1-aktivitet fra de som viser lave nivåer via fluorimetri, molekylær avbildning og flowcytometri. Flere viktige fordeler er forbundet med bruk av isoformselektive aktiverbare fargestoffer i forhold til tradisjonelle immunhistokjemiske metoder. For eksempel antas CSC å bli begravet dypt inne i en svulst, og dermed er mer tilgjengelig for et lite molekyl i forhold til store antistoffer19. I tillegg modifiserer ikke det omslåtte fluorescerende produktet kovalent noen cellulær komponent, noe som betyr at det lett kan fjernes via vaskesykluser for å forlate en CSC i umodifisert tilstand. Til slutt identifiserer turn-on-responsen bare levedyktige celler og funksjoner, omtrent som MTT-analysen, på grunn av sin avhengighet av NAD + -kofaktoren.
Figur 1: Skjematisk demonstrasjon av fluorescerende påkjøring av AlDeSense. Det isoformselektive fargestoffet aktiveres av ALDH1A1 og kan brukes til å identifisere forhøyet ALDH1A1-aktivitet i eggstokkreftceller via fluorimetri, molekylær avbildning og flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I tidligere arbeid har isoform-selektiv fluorogen sondeanalyse vellykket stratifisert ALDH høye (ALDH +) celler fra ALDH lave (ALDH-) celler i K562 humane kroniske leukemiceller, MDA-MB-231 humane brystkreftceller og B16F0 murine melanomceller. Dette er viktig fordi høyt ALDH1A1-proteinuttrykk for mange krefttyper betyr en dårligere klinisk prognose20. Dette forutsetter at forhøyede nivåer av ALDH1A1 er en indikasjon på CSC som kan unngå behandling, utvikle resistens og spre seg gjennom hele kroppen. Når det gjelder eggstokkreft, er det imidlertid studier som rapporterer motsatt funn (høyt ALDH1A1-uttrykk er knyttet til forbedret pasientoverlevelse)21,22,23,24. Selv om dette kan virke motstridende ved første øyekast, korrelerer ikke ekspresjon nødvendigvis med enzymaktivitet, som kan påvirkes av endringer i tumormikromiljøet (f.eks. pH-fluks, oksygengradienter), tilgjengeligheten av NAD + -kofaktoren eller aldehydsubstratene, nivåer av karboksylsyrer (produktinhibering) og posttranslasjonelle modifikasjoner som kan endre enzymaktivitet25 . I tillegg er eggstokkreft delt inn i fem hovedhistologiske typer (høygradig serøs, lavgradig serøs, endometrioid, klar celle og mucinøs), som vi antar vil inneholde variable nivåer av ALDH1A1-aktivitet26. Med mål om å undersøke ALDH1A1-aktivitet i eggstokktumorer, ble en isoform-selektiv fluorogen sondeanalyse ansatt for å identifisere ALDH1A1 + populasjoner i et panel av fem eggstokkreftcellelinjer som tilhører de forskjellige histologiske typene nevnt ovenfor. Cellelinjene som ble testet i denne studien inkluderer BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 og PEO4-celler, som dekker klare celle- og serøse histotyper. Her ble sondens allsidighet og generaliserbarhet fremhevet for å identifisere CSC for forskerne som søker å utføre lignende studier i andre immortaliserte kreftcellelinjer samt pasientprøver. Bruken av AlDeSense vil kaste lys over de biokjemiske veiene som er involvert i CSC-vedlikehold i komplekse vevsmikromiljøer og potensielt tjene som et klinisk verktøy for å bestemme prognose og måle kreftaggressivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mål total ALDH1A1-aktivitet i ovariekreftcellehomogenater via fluorimetri
- Tine 1 × 106 celler i en T25 cellekulturkolbe i 5 ml av følgende cellekulturmedier:
- IGROV-1 og PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S).
- BG-1 og Caov-3: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 med 20% FBS, 1% P/S og 0,01 mg/ml insulin.
- Vedlikehold cellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i to til tre passasjer. Forsikre deg om at cellene ikke overstiger 80% -90% sammenløp før de passerer.
- Trypsiniser cellene i 0,25% trypsin i 10 minutter, tell dem ved hjelp av en automatisert celleteller, og pellet 1 ×10 7 celler via sentrifugering (180 × g) ved 25 ° C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten forsiktig via aspirasjon, vask pelleten ved å resuspendere cellene i 1 ml 1x PBS, og repellet cellene via sentrifugering under de samme forholdene som beskrevet i trinn 4.
- Resuspender cellene i en løsning av 1x proteasehemmer i 1x PBS. Bruk 1 ml av denne løsningen per 2,5 × 106 celler.
- Sonikere cellesuspensjonen på is i 2 minutter (1 s puls, 40% amplitude) med en cellehomogenisatorsonde.
- Pellet uløselige/membranfraksjoner via sentrifugering (3 200 × g) ved 25 °C i 15 minutter. Fjern og behold supernatanten, da dette er homogenatet som skal brukes i påfølgende trinn. Skill homogenatene i tre kyvetter for å utføre eksperimentet i triplikat.
- Tilsett sonden til homogenatet for å oppnå en endelig sondekonsentrasjon på 4 μM. Pipett opp og ned tre ganger for å blande oppløsningen godt.
- Mål det fluorescerende signalet umiddelbart etter tilsetning og etter ønskede inkubasjonstider på et fluorimeter. Inkubasjonstiden kan optimaliseres for å se maksimal fold turn-on (1 time i dette eksperimentet). Inkubasjonstiden må være konstant over alle cellelinjer sammenlignet.
- Sett eksitasjonsbølgelengden til 496 nm.
- Sett utslippet til 510-600 nm.
- Sett spaltbredden til 0,5 mm.
- Pipetter løsningen inn i en 1 ml kvartskuvette, plasser den i fluorimeteret og trykk på skanning.
- Del den endelige fluorescensintensiteten ved 516 nm (maksimal fluorescerende bølgelengde) med intensiteten ved samme bølgelengde fra den første avlesningen for å bestemme foldaktiveringen av isoform-selektiv fargestoff.
2. Bruk av fluorescensmikroskopi til bildeceller med høy ALDH1A1 aktivitet
- Tine 1 × 106 celler i en T25 cellekulturkolbe i 5 ml av det aktuelle cellekulturmediet.
- Vedlikehold cellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i to til tre passasjer. Forsikre deg om at cellene ikke overstiger 80% -90% sammenløp før de passerer.
- Dagen før konfokal avbildning, plate 4 × 105 celler i et 8-brønns kammerlysbilde.
- Belegg bunnen av hver brønn med poly-L-lysin (0,1 mg / ml, 100 μL per brønn) i 10 minutter, deretter aspirerende.
- Vask hver brønn 3x ved å tilsette vann av cellekulturkvalitet (100 μL per brønn) og aspirasjon.
- Trypsiniser cellene i 0,25% trypsin i 10 minutter, telle dem ved hjelp av en automatisert celleteller, og plate cellene ved 4 × 105 celler per brønn.
- La cellene slå seg ned og feste seg over natten (12-16 timer).
- Aspirer vekstmediet og tilsett serumfrie medier (500 μL per brønn), supplert med 2 μM av sonden eller kontrollsonden.
- Inkuber med sonden ved romtemperatur i 30 minutter og avbilde cellene umiddelbart.
- Slå på konfokalmikroskopet og juster for prøven.
- Legg prøven forsiktig ved laveste forstørrelse; Finn cellene for å sikre riktig posisjonering.
- Forsikre deg om at objektivlinsen har 10x forstørrelse og finn cellene.
- For dette eksperimentet kreves FITCH-kanalen (eksitasjon: 488 nm laser; utslipp: 516-521 nm) og T-PMT (overført lys) kanal. Finn og fokuser på cellene ved hjelp av T-PMT for å fokusere på samme z-plan for hele eksperimentet for å fjerne skjevhet.
- Juster lasereffekten og FITC-forsterkningen til riktig innstilling, der signalet fra Ctrl-AlDeSense AM-prøvene er minimalt detekterbart, mens det fortsatt ser signal i AlDeSense AM-prøver. Hver parameter kan justeres ved å skyve den tilsvarende linjen. Innstillingene må kanskje justeres noen ganger for å identifisere de riktige parametrene. Når du er optimalisert, fullfører du resten av eksperimentet innenfor den cellelinjen ved å bruke identiske parametere.
- Ta tre bilder per brønn for totalt tre brønner per behandlingstilstand (ni bilder totalt). Fokuser på riktig plan ved hjelp av T-PMT for å unngå skjevhet i stedet for å bruke fluorescenskanalen eller det sammenslåtte bildet.
- Behandle bildene for å bestemme prosentandelen av ALDH1A1+ celler.
- Ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, dele czi filen i forskjellige kanaler.
- Telle totalt antall celler og totalt antall fluorescerende celler.
- For å bestemme prosentandelen av ALDH1A1 + -celler, del antall fluorescerende celler med totalt antall celler i hvert bilde. Det er viktig å telle på samme måte for hvert bilde uten å manipulere bildene, da for eksempel justering av lysstyrken kan legge til en forvirrende variabel.
3. Anvendelse av flowcytometri for å identifisere celler med høy ALDH1A1 aktivitet
- Tine 1 × 106 celler i en T25 cellekulturkolbe i 5 ml av det aktuelle cellekulturmediet.
- Vedlikehold cellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i to til tre passasjer. Forsikre deg om at cellene ikke overstiger 80% -90% sammenløp før de passerer.
- Trypsinize, telle og pelletere cellene i et 15 ml sentrifugerør via sentrifugering (180 × g) ved 25 °C i 5 minutter.
- Resuspender cellene i 1 ml 2 μM sonde-/kontrollsondeoppløsning i PBS. Rock cellene ved romtemperatur i 60 minutter for å sikre at eksponeringen for fargestoffet er jevn.
- Etter inkubasjonsperioden pelleterer du cellene via sentrifugering (180 × g) ved 25 °C i 5 minutter. Resuspender cellene i 0,5 ml PBS. Kjør cellene gjennom en cellesil (35 μm nylonnett) for å fjerne celleklumper som kan tette strømningscytometeret. Legg umiddelbart cellene på is.
- Slå på instrumentet og kjør oppstartsprotokollen.
- Se etter hylstervæske og tøm avfall.
- Kjør linjene med 10% blekemiddel og vann i 5 min hver.
- Kjør kvalitetskontrollperler for å sikre riktig funksjon.
- I innstillingsfanen velger du FSC (fremoverpunkt), SSC (sidepunkt) og FITC (fluoresceinisotiocyanat) for fluorescensfilteret.
- Tegn følgende grafer for å sikre levedyktighet, singleter og fluorescens. Optimaliser lasereffekten (spesifikk for brukerens instrument) slik at cellepopulasjonene er innenfor de gitte parametrene for videre analyse.
- FSC-A versus SSC-A spredningsplott: hovedcellepopulasjonen er nær midten av grafen.
- FSC-A versus FSC-W spredningsplott: smalt horisontalt bånd som indikerer singleter (i stedet for celleklumper).
- FITC-A versus FSC-A spredningsplott: observer fordelingen av celler sortert etter isoform-selektiv fluorogen turn-on sonde.
- FITC-A histogram: observer skiftet i befolkningen basert på FITC for å bestemme prosentandelen av ALDH1A1 + celler.
- For å optimalisere FITC-lasereffekten, kjør en prøve med sonden slik at høyre hale av histogramkurven er nær det maksimale FITC-A-signalet. Deretter kjører du en prøve med kontrollsonden. En befolkningsforskyvning bør være observerbar for å avsløre det maksimale dynamiske området. Laserstrømoptimaliseringstrinnet må kanskje gjentas flere ganger, men lasereffekten bør ikke endres på tvers av prøver når en innstilling er angitt for et eksperiment.
- Kjør hver prøve for 10 000 tellinger (gjort i tre eksemplarer).
- Gjenta trinn 3.12 for hver cellelinje, da det vil være variasjon i opptak og ALDH1A1-aktivitet.
- Etter ferdigstillelse av prøveinnsamling, kjør linjene med 10% blekemiddel og vann i 5 minutter hver, og start deretter nedleggelse av instrumentet.
- Behandle dataene ved hjelp av flowcytometri-programvaren og gate ønsket cellepopulasjon. Sett portene slik at alle hendelser faller inn i enten ALDH1A1- eller ALDH1A1+-porten. Bruk rektangelportvalget, sett ALDH1A1-porten slik at >99,5% av hendelsene i kontrollprobeprøvene forekommer innenfor denne porten. De resterende cellene vil bli betraktet som ALDH1A1+. De samme portene kan deretter brukes på sondeprøven for å kvantifisere antall hendelser som betraktes som ALDH1A1- og ALDH1A1+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Total ALDH1A1-aktivitet av ovariekreftcellehomogenater
De gjennomsnittlige foldekampanjene for hver cellelinje oppnådd fra denne analysen er: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1, 72 ± 0, 06); PEO4 (2,51 ± 0,29); og OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figur 2).
Figur 2 Fold fluorescerende påkobling av isoform-selektivt fargestoff i homogenater av hver eggstokkreftcellelinje målt ved fluorimetri (gjennomsnittlig ± standardavvik) (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Molekylær avbildning av ALDH1A1+ subpopulasjoner i dyrkede eggstokkreftceller
Ved inkubering av cellene med en sonde eller kontrollsonde ble prosentandelen ALDH1A1+ celler bestemt i hver cellelinje. Ved å justere lasereffekten og forsterkningen for å minimere signalet i den Ctrl-AlDeSense AM-behandlede prøven, ble fluorescenssignalet optimalisert i AlDeSense AM-behandlede celler (figur 3). Ved å telle antall ALDH1A1+-celler ble prosentandelen ALDH1A1+-celler bestemt til å være: BG-1 (3,2 % ± 1,6 %); PEO4 (18,0 % ± 3,6 %); OVCAR-3 (39, 8% ± 3, 9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); og Caov-3 (93,7 % ± 3,4 %) (figur 4).
Figur 3: Representative konfokale bilder . (A,C,E,G,I) Ctrl-AlDeSense AM-fargede celler og (B,D,F,H,J) AlDeSense AM-fargede celler. Fra venstre til høyre viser bildene lysfelt, fluorescens og sammenslåing. Skalastenger er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gjennomsnittlig prosentandel av ALDH1A1+-celler i hver eggstokkreftcellelinje målt ved konfokalmikroskopi (gjennomsnitt ± standardavvik) (n = 9). Prosentandelen av ALDH1A1+ celler er BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0 % ± 3,6 %); OVCAR-3 (39, 8% ± 3, 9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); og Caov-3 (93,7 % ± 3,4 %). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Identifisering av populasjon av ALDH1A1+ celler ved hjelp av flowcytometri
Ved bruk av isoform-selektiv fluorogen sonde ble populasjonen av ALDH1A1+-celler vellykket identifisert på tvers av forskjellige eggstokkreftcellelinjer. Under den posteksperimentelle dataanalysen kunne ALDH1A1+-cellepopulasjonen innenfor hver cellelinje kvantifiseres ved å gå for de øverste 0,5 % av de lyseste cellene i den Ctrl-AlDeSense AM-behandlede populasjonen (figur 5). Analyse av panelet av eggstokkreftceller har avslørt prosentandelen av ALDH1A1 + celler er: BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66 % ± 0,9 %); OVCAR-3 (7, 6% ± 0, 1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); og Caov-3 (70,1 % ± 2,4 %) (figur 6).
Figur 5: Representative spredningsplott og histogramoverlegg. (A,D,G,J,M) Representative spredningsplott av Ctrl-AlDeSense AM-farging etter en 1 timers inkubasjon med celler. (B,E,H,K,N) Representative spredningsplott av AlDeSense AM-farging etter en 1 timers inkubasjon med celler. (C,F,L,J,O) Histogramoverlegg for Ctrl-AlDeSense AM og AlDeSense AM-farging av disse tilstandene. Cellelinjer som farges er (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 og (M-O) Caov-3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Gjennomsnittlig prosentandel av ALDH1A1+-celler i hver eggstokkreftcellelinje målt ved flowcytometri (gjennomsnitt ± standardavvik) (n = 3). Prosentandelen av ALDH1A1+ celler var BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66 % ± 0,9 %); OVCAR-3 (7, 6% ± 0, 1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); og Caov-3 (70,1 % ± 2,4 %). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mens flere ALDH-isoformer (dvs. ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 og ALDH3A1) har vært knyttet til CSC, ble ALDH1A1 valgt som mål for denne studien fordi uttrykksnivåene i sammenheng med eggstokkreft er forhøyet 21,27, og denne isoformen har vist seg å forverre stoffresistens28,29 og forbedre tumorigenese 30,31 . Resultater fra konfokal avbildning og flowcytometri er samstemte i rekkefølgen av den økende populasjonen av ALDH1A1+-celler. I tillegg avslører cellehomogenatforsøkene den gjennomsnittlige aktiviteten i en cellelinje. I forbindelse kan konklusjoner om mengden aktivitet innen ALDH1A1+ subpopulasjoner av hver cellelinje ekstrapoleres. Det kan konkluderes med at BG-1 har den laveste ALDH1A1-aktiviteten og den laveste ALDH1A1+-populasjonen. Merk at vi valgte BG1-cellelinjen som skal brukes som negativ kontroll i denne studien, på grunn av det ubetydelige uttrykket av ALDH1A1. I tillegg avslørte konfokal avbildning og flowcytometri den største prosentandelen av ALDH1A1+-celler i Caov-3-celler, men cellelinjens samlede aktivitet var bare tredje høyest. Alternativt inneholdt OVCAR-3-celler den tredje høyeste ALDH1A1+-populasjonen, men viste den høyeste totale aktiviteten. Ekstrapolering fra disse resultatene har underpopulasjonen av ALDH1A1+ OVCAR-3-celler høyere aktivitet enn underpopulasjonen av ALD1A1+ Caov-3-celler. Gjennom videre analyse av ALDH1A1-populasjonen i cellelinjer eller vevsprøver, kan ALDH1A1s rolle belyses ytterligere og fenotypiske endringer som følge av forhøyet ALDH1A1-aktivitet kan undersøkes.
| Cellelinje | Histologisk type | Fluorimetri (brett slås på) | Konfokal (% positiv) | Flow (% positiv) | ||
| BG-1 | Dårlig differensiert adenokarsinom | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| PEO4 | Serøs cystadenokarsinom av høy grad | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| OVCAR-3 | Høygradig serøs adenokarsinom | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| IGROV-1 | Endometrioid adenokarsinom | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Caov-3 | Høygradig serøs adenokarsinom | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Tabell 1: Oppsummering av resultater fra cellehomogenater, konfokalmikroskopi og flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pan-selektivitet er en stor begrensning for mange ALDH-sonder; Imidlertid har flere isoform-selektive eksempler nylig blitt rapportert 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Den isoformselektive fluorogene sonden som ble brukt i denne studien, representerer den første rasjonelt utformede sonden som bare reagerer med ALDH1A1-isoformen, selv i nærvær av konkurrerende enzymer som er tilstede i store overskuddsmengder11,12. Et annet kjennetegn ved denne sonden er dens unike fluorogene natur, som er preget av lav fluorescensutslipp før sondeaktivering. Dette er i motsetning til kommersielle sett som ALDEFLUOR-analysen, som har et fluorescerende substrat (BODIPY aminoacetaldehyd [BAAA]) som alltid er i en 'on-state'32. BAAA identifiserer ALDH + -celler basert på premisset om at det aktiverte karboksylatproduktet (som er like fluorescerende) beholdes i større grad i celler som uttrykker ALDH i høye nivåer. For å ta hensyn til uspesifikk akkumulering av sonden i ALDH-celler, må en inhibitor påføres for å blokkere ALDHer som er tilstede i en kontrollprøve. Dette er imidlertid ledsaget av flere bemerkelsesverdige ulemper. For det første, hvis hensikten er å identifisere CSC via ALDH1A1-aktivitet, mislykkes anvendelsen av inhibitorstrategien fordi den også blokkerer andre isoformer i varierende grad. For det andre kan inhibitorens ikke-spesifikke oppførsel svekke en celles evne til å avgifte reaktive aldehyder på globalt nivå. Den første av disse bekymringene er adressert i utformingen av AlDeSense, fordi den bare reagerer med en enkelt isoform som nevnt ovenfor (tilleggsfigur 1). For å bøte på den andre bekymringen, erstatter Ctrl-AlDeSense rollen som inhibitoren. Spesielt utviser kontrollreagenset et nesten identisk fluorescerende signal som ikke-aktivert AlDeSense, tas opp i like stor grad av celler, og lokaliseres hovedsakelig til cytoplasma. Ethvert signal utover grunnlinjen etablert av kontrollen må derfor representere ALDH1A1-mediert sondeaktivering.
Tilleggsfigur 1: Reaktiviteten til AlDeSense og ALDEFLUOR. (A) Normalisert fluorescens-påkobling av AlDeSense etter inkubasjon med hver ALDH-isoform og (B) reaktivitet av ALDEFLUOR med hver ALDH-isoform. Alle målinger ble gjort i tre eksemplarer; feilfelt er ± SD. Klikk her for å laste ned denne filen.
Den første anvendelsen av isoform-selektiv fluorogen sonde valgt å fremheve er måling av ALDH1A1-aktivitet i cellehomogenater. Under omstendigheter der spesialisert instrumentering som konfokale mikroskoper eller strømningscytometre ikke er tilgjengelige, kan bruk av vanlige fluorimetre raskt rapportere om total ALDH1A1-aktivitet i en prøve. Langs disse linjene utvider den enkle prøveprepareringen (homogenater kan nås fra prøver som spenner fra cellekulturer til utskåret vev) anvendeligheten av denne analysen. Det er noen viktige parametere som må vurderes når man optimaliserer isoform-selektiv fluorogen sonde for bruk med homogenater. Den første innebærer å modulere antall celler per lysatprøve. For eksempel, hvis det dynamiske området, definert som omfanget av fluorescerende signalendring, ikke er tilstrekkelig lavt, kan antall celler per prøve økes. På samme måte kan inkubasjonstiden også justeres slik at flere fluorogene sonder kan aktiveres for å gi en sterkere fluorescerende avlesning. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at en stor begrensning av denne metoden er manglende evne til å skille mellom underpopulasjoner av celler som viser varierende nivåer av ALDH1A1-aktivitet. Siden celler kombineres og lyseres uavhengig av deres ALDH1A1-status, blir mengden enzymaktivitet gjennomsnittet over alle celler som er tilstede i prøven. Dette gir et annet utfall sammenlignet med konfokalmikroskopi og flowcytometrianalyser, der det er prosentandelen ALDH+-celler som rapporteres. Mens BG-1-celler viser den laveste fold turn-on-responsen, så vel som den minste populasjonen av ALDH1A1 + -celler, blir rekkefølgen av de resterende fire cellelinjene inkonsekvent. For eksempel identifiserer homogenatanalysen OVCAR-3-celler for å ha den høyeste totale ALDH1A1-aktiviteten, mens den bare rangerer tredje basert på konfokal mikroskopi og flowcytometri. Vår tolkning av disse dataene er at en ALDH1A1+-celle må ha varierende aktivitetsnivå. Til slutt er det viktig å merke seg at denne typen "turn-on" -eksperiment ikke ville være mulig ved bruk av akkumuleringsbaserte sonder.
I tillegg er isoform-selektiv fluorogen sonde et molekylært avbildningsmiddel for visualisering av ALDH1A1+ cellepopulasjoner. Selv om konfokalmikroskopi ble brukt i denne demonstrasjonen, er denne fluorogene sonden kompatibel med et stort utvalg av bildebehandlingsoppsett, inkludert automatiserte celletellere, epifluorescensmikroskoper og bredfeltbelysningsinstrumenter. Et av de viktigste trinnene i dette eksperimentet er bruken av Ctrl-AlDeSense for å etablere passende terskelparametere (f.eks. pinhole størrelse, laserkraft, FITC gevinst). I denne forbindelse bør innstillingene justeres slik at Ctrl-AlDeSense-signalet er like over bakgrunnen. I tilfelle en bruker finner ut at det er nødvendig å øke lasereffekten for å se dette signalet, anbefales det å forlenge fargestofffargen eller lastkonsentrasjonen fremfor å øke lasereffekten (over 50%) på grunn av økt fototoksisitet eller sondebleking. En begrensning av konfokal avbildning er variabilitet når gating med Ctrl-AlDeSense. Til tross for dette forbeholdet var den observerte cellelinjerekkefølgen basert på økende prosentandel av ALDH1A1+-celler identisk med resultatene oppnådd via flowcytometri. I motsetning til molekylær avbildning, hvor det maksimale antall celler visualisert er begrenset av synsfeltet, analyserer et typisk flowcytometri-eksperiment opptil titusenvis av celler. Hensynene til fargetid og lastekonsentrasjon ligner det som diskuteres for molekylær avbildning. Et ekstra element som må vurderes er til og med fargefarging i cellesuspensjonen for å sikre at falske positive ALDH1A1+-populasjoner ikke blir feilidentifisert.
Til slutt fremhever denne artikkelen prosessen for å optimalisere AlDeSense for en rekke modaliteter, ved å bruke eggstokkreftceller som et eksempel. Dette representerer et viktig første skritt mot å svare på hvorfor motstridende rapporter eksisterer angående ALDH1A1-uttrykk i denne krefttypen21,22,23,24. Utover det vi har vist, ser vi for oss at denne isoformselektive fluorogene sonden kan brukes i en høy gjennomstrømningsscreeningskampanje for å identifisere ALDH1A1-selektive hemmere som kan dukke opp som legemiddelkandidater. I tillegg kan denne sonden fortsette å finne bruk for å identifisere CSC hos levende dyr, som vi har vist i vår første publikasjon11. Den grønne lysemissive egenskapen til den isoformselektive fluorogene sonden primer den for multipleksingseksperimenter der den kan brukes sammen med rødemitterende fluorescerende proteiner, småmolekylære fargestoffer eller analyttresponsive sonder. Videre eksisterer en rød versjon av isoform-selektiv fluorogen sonde, som ytterligere kan utvide denne multipleksingskapasiteten12. Til slutt, på den medisinske fronten, kan denne sonden brukes som et prognostisk verktøy i den kliniske settingen for pasientnær beslutningstaking. Kvantifisering av ALDH1A1-aktivitet og ALDH1A1 + cellepopulasjoner kan tjene som en metode for å bestemme kreftaggressivitet, noe som muliggjør personlige behandlingsstrategier for bedre livskvalitet. Videre, ved hjelp av AlDeSense, kan en avlesning leveres og tolkes i løpet av noen timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi offentliggjør et ventende patent (US20200199092A1) for AlDeSense-teknologien.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av The National Institutes of Health (R35GM133581 til JC) og Cancer Center ved Illinois Graduate Scholarship (tildelt SG). JC takker Camille og Henry Dreyfus Foundation for støtte. Forfatterne takker Dr. Thomas E. Bearrood for hans første bidrag til å forberede aksjer av AlDeSense og AlDeSense AM. Vi takker Oliver D. Pichardo Peguero og Joseph A. Forzano for deres hjelp med å forberede ulike syntetiske forløpere. Vi takker professor Erik Nelson (Institutt for molekylær og integrativ fysiologi, UIUC) for Caov-3, IGROV-1 og PEO4 celler. Vi takker Prof. Paul Hergenrother (Kjemisk institutt, UIUC) for BG-1 celler. Vi takker kjernefasilitetene ved Carl R. Woese Institute for Genomic Biology for tilgang til Zeiss LSM 700 Confocal Microscope og tilhørende programvare. Vi takker Flow Cytometry Facility for tilgang til BD LSR II CMtO Analyzer. Vi takker Dr. Sandra McMasters og Cell Media Facility for hjelp til å forberede cellekulturmedier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
