I metodi per misurare l'attività di ALDH1A1 nelle cellule vive sono fondamentali nella ricerca sul cancro a causa del suo status di biomarcatore della staminalità. In questo studio, abbiamo impiegato una sonda fluorogenica isoform-selettiva per determinare i livelli relativi di attività di ALDH1A1 in un pannello di cinque linee cellulari di cancro ovarico.
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Articolo metodologico
Applicazione di AlDeSense per stratificare cellule tumorali ovariche basate sull'attività dell'aldeide deidrogenasi 1A1
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La recidiva dopo il trattamento del cancro è spesso attribuita alla persistenza di una sottopopolazione di cellule tumorali note come cellule staminali tumorali (CSC), che sono caratterizzate dalla loro notevole capacità di iniziare il tumore e di auto-rinnovarsi. A seconda dell'origine del tumore (ad esempio, ovaie), il profilo del biomarcatore di superficie CSC può variare notevolmente, rendendo l'identificazione di tali cellule tramite colorazione immunoistochimica uno sforzo impegnativo. Al contrario, l'aldeide deidrogenasi 1A1 (ALDH1A1) è emersa come un eccellente marcatore per identificare le CSC, grazie al suo profilo di espressione conservato in quasi tutte le cellule progenitrici, comprese le CSC. L'isoforma ALDH1A1 appartiene a una superfamiglia di 19 enzimi responsabili dell'ossidazione di varie aldeidi endogene e xenobiotiche ai corrispondenti prodotti di acido carbossilico. Chan et al. hanno recentemente sviluppato AlDeSense, una sonda "turn-on" selettiva per l'isoforma per il rilevamento dell'attività di ALDH1A1, nonché un reagente di controllo di corrispondenza non reattivo (Ctrl-AlDeSense) per tenere conto della colorazione fuori bersaglio. Questo strumento selettivo per le isoforme ha già dimostrato di essere uno strumento chimico versatile attraverso la rilevazione dell'attività di ALDH1A1 nelle cellule di leucemia mieloide K562, nelle mammosfere e negli xenotrapianti CSC derivati dal melanoma. In questo articolo, l'utilità della sonda è stata mostrata attraverso ulteriori esperimenti di fluorimetria, microscopia confocale e citometria a flusso in cui la relativa attività di ALDH1A1 è stata determinata in un pannello di cinque linee cellulari di cancro ovarico.
Introduzione
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una sottopopolazione di cellule tumorali che presentano proprietà simili alle cellule staminali1. Simili alle loro controparti non cancerose, le CSC possiedono la straordinaria capacità di auto-rinnovarsi e proliferare. Insieme ad altri meccanismi incorporati, come la sovraregolazione dei trasportatori di cassette che legano ATP, le CSC sono spesso risparmiate dagli sforzi iniziali di debulking chirurgico, nonché dalla successiva terapia adiuvante2. A causa del loro ruolo critico nella resistenza al trattamento3, recidiva4 e metastas....
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Protocollo
1. Misurare l'attività totale di ALDH1A1 negli omogenati delle cellule tumorali ovariche tramite fluorimetria
- Scongelare 1 × 106 cellule in un matraccio di coltura cellulare T25 in 5 mL dei seguenti terreni di coltura cellulare:
- IGROV-1 e PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 terreno con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina (P/S).
- BG-1 e Caov-3: Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco con 10% FBS e 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 con 20% FBS, 1% P/S e 0,01 mg/mL di insulina.
- Mantenere le cellule in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO....
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Risultati
Attività totale di ALDH1A1 degli omogenati delle cellule tumorali ovariche
I turn-on di piegatura medi per ciascuna linea cellulare ottenuta da questo test sono: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); e OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2).
Figura 2
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Discussione
La panselettività è una delle principali limitazioni di molte sonde ALDH; Tuttavia, sono stati recentemente riportati diversi esempi selettivi per isoforme 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. .......
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Dichiarazioni
Divulghiamo un brevetto in corso (US20200199092A1) per la tecnologia AlDeSense.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R35GM133581 a JC) e dal Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (assegnato a SG). JC ringrazia la Fondazione Camille e Henry Dreyfus per il supporto. Gli autori ringraziano il Dr. Thomas E. Bearrood per il suo contributo iniziale alla preparazione delle scorte di AlDeSense e AlDeSense AM. Ringraziamo Oliver D. Pichardo Peguero e Joseph A. Forzano per la loro assistenza nella preparazione di vari precursori sintetici. Ringraziamo il Prof. Erik Nelson (Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Integrativa, UIUC) per le cellule Caov-3, IGROV-1 e PEO4. Ringraziamo il Prof. Paul Hergenrother (Dipartime....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina, 0,1% EDTA in HBSS senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio | Corning | 25-050-CI | |
| 1x tampone fosfato soluzione salina | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | sintetizzato internamente | ||
| BG-1 | Un regalo fornito dal Prof. Paul Hergenrother Lab, Università dell'Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Pallone | Thermo Fisher Scientific | ||
| Armadio di Biosicurezza 1300 serie A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | Un regalo fornito dal Prof. Erik Nelson Lab, Università dell'Illinois Urbana-Champaign | ||
| Omogeneizzatore cellulare | Fisher Scientific | ||
| Centrifuga 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Sintetizzato in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Preparato da cellula UIUC struttura multimediale | ||
| Provette in polistirene a fondo tondo Falcon con tappo a scatto per filtro cellulare, 5 mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Fornito da UIUC CMtO | ||
| FL microscopio | EVOS | ||
| Fluorometro | dei fotoni International | ||
| Forma Serie II CO2 con camicia d'acqua Incubatrice | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | Un dono fornito dal Prof. Erik Nelson Lab, Università dell'Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Agitatore | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | ||
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | Un regalo fornito dal Prof. Erik Nelson Lab, Università dell'Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Compresse inibitore della proteasi | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poli-L-lisina | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Preparato da UIUC cell media | ||
| facility RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/mL Insulina | Preparato da UIUC cell media facility |
Riferimenti
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC tr....
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Ristampe e permessi
