Summary
Методы измерения активности ALDH1A1 в живых клетках имеют решающее значение в исследованиях рака из-за его статуса биомаркера стволовости. В этом исследовании мы использовали изоформ-селективный флюорогенный зонд для определения относительных уровней активности ALDH1A1 в панели из пяти клеточных линий рака яичников.
Abstract
Рецидив после лечения рака часто связывают с сохранением субпопуляции опухолевых клеток, известных как раковые стволовые клетки (ЦСК), которые характеризуются своей замечательной способностью инициировать опухоль и самообновляться. В зависимости от происхождения опухоли (например, яичников) профиль поверхностных биомаркеров CSC может сильно различаться, что затрудняет идентификацию таких клеток с помощью иммуногистохимического окрашивания. Напротив, альдегиддегидрогеназа 1A1 (ALDH1A1) стала отличным маркером для идентификации ЦСК из-за ее консервативного профиля экспрессии почти во всех клетках-предшественниках, включая ЦСК. Изоформа ALDH1A1 принадлежит к суперсемейству из 19 ферментов, которые отвечают за окисление различных эндогенных и ксенобиотических альдегидов до соответствующих продуктов карбоновой кислоты. Chan et al. недавно разработали AlDeSense, изоформно-селективный «включающийся» зонд для обнаружения активности ALDH1A1, а также нереактивный контрольный реагент согласования (Ctrl-AlDeSense) для учета нецелевого окрашивания. Уже было продемонстрировано, что этот изоформоселективный инструмент является универсальным химическим инструментом благодаря обнаружению активности ALDH1A1 в клетках миелогенного лейкоза K562, маммосферах и ксенотрансплантатах CSC, полученных из меланомы. В этой статье полезность зонда была продемонстрирована с помощью дополнительных экспериментов по флуориметрии, конфокальной микроскопии и проточной цитометрии, где относительная активность ALDH1A1 была определена на панели из пяти клеточных линий рака яичников.
Introduction
Раковые стволовые клетки (ЦСК) представляют собой субпопуляцию опухолевых клеток, которые проявляют свойства, подобные стволовым клеткам1. Подобно своим нераковым аналогам, CSC обладают необычайной способностью к самообновлению и размножению. Вместе с другими встроенными механизмами, такими как активация АТФ-связывающих кассетных транспортеров, ЦСК часто избавлены от первоначальных хирургических усилий по удалению объема, а также от последующей адъювантной терапии2. Из-за их критической роли в резистентностик лечению 3, рецидива4 и метастазирования5 ЦСК стали приоритетом в исследованиях рака. Несмотря на то, что существует множество антигенов клеточной поверхности (например, CD133), которые могут быть использованы для идентификацииCSC6, использование ферментативной активности альдегиддегидрогеназ (ALDH), обнаруженных в цитоплазме, стало привлекательной альтернативой7. ALDH представляют собой суперсемейство из 19 ферментов, ответственных за катализ окисления реакционноспособных эндогенных и ксенобиотических альдегидов до соответствующих продуктов карбоновой кислоты8.
В целом, детоксикация альдегидами имеет решающее значение для защиты клеток от нежелательных событий сшивания и окислительного стресса, которые могут повредить целостность стволовых клеток9. Кроме того, изоформа 1А1 контролирует метаболизм ретиноевой кислоты, который, в свою очередь, влияет на стволовость через передачу сигналов10 ретинальдегида. Недавно был разработан датчик AlDeSense 11,12 на основе низкомолекулярной активности (ABS) для селективного обнаружения активности ALDH1A1. Конструкции ABS обеспечивают обнаружение аналита посредством химического изменения, а не связывания, что обеспечивает высокую селективность и снижает нецелевые реакции13,14,15,16. Принцип конструкции изоформ-селективного флюорогенного зонда основан на механизме17 гашения донорно-фотоиндуцированного переноса электрона (d-PeT), происходящего из альдегидной функциональной группы, который служит для подавления флуоресцентной сигнатуры зонда18. При опосредованном ALDH1A1 превращении в карбоновую кислоту разблокируется радиационная релаксация с образованием высокофлуоресцентного продукта. Поскольку гашение d-PeT никогда не бывает эффективным на 100%, остаточная флуоресценция, которая может привести к возможным ложноположительным результатам, учитывалась при создании этого анализа путем разработки Ctrl-AlDeSense, нечувствительного реагента с соответствующими фотофизическими характеристиками (например, квантовым выходом) и идентичным рисунком цитоплазматического окрашивания в клетках. При использовании в тандеме это уникальное сочетание может надежно отличать клетки с высокой активностью ALDH1A1 от тех, которые демонстрируют низкие уровни с помощью флуориметрии, молекулярной визуализации и проточной цитометрии. Несколько ключевых преимуществ связаны с использованием изоформселективных активируемых красителей перед традиционными иммуногистохимическими методами. Например, предполагается, что ЦСК похоронены глубоко внутри опухоли и, таким образом, более доступны для небольшой молекулы по сравнению с большими антителами19. Кроме того, перевернутый флуоресцентный продукт не ковалентно модифицирует какой-либо клеточный компонент, что означает, что его можно легко удалить с помощью циклов стирки, чтобы оставить CSC в неизмененном состоянии. Наконец, реакция включения идентифицирует только жизнеспособные клетки и функции, как и анализ МТТ, из-за его зависимости от кофактора NAD +.
Рисунок 1: Схема, демонстрирующая флуоресцентное включение AlDeSense. Изоформселективный краситель активируется ALDH1A1 и может быть использован для выявления повышенной активности ALDH1A1 в клетках рака яичников с помощью флуориметрии, молекулярной визуализации и проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В прошлой работе изоформ-селективный флуорогенный зондовый анализ успешно стратифицировал клетки ALDH high (ALDH +) из клеток ALDH low (ALDH-) в клетках хронического лейкоза человека K562, клетках рака молочной железы человека MDA-MB-231 и клетках меланомы мыши B16F0. Это важно, потому что для многих типов рака высокая экспрессия белка ALDH1A1 означает худший клинический прогноз20. Это предполагает, что повышенные уровни ALDH1A1 указывают на CSCs, которые могут уклоняться от лечения, развивать резистентность и распространяться по всему телу. Однако в случае рака яичников есть исследования, сообщающие об обратном (высокая экспрессия ALDH1A1 связана с улучшением выживаемости пациентов)21,22,23,24. Хотя на первый взгляд это может показаться противоречивым, экспрессия не обязательно коррелирует с активностью фермента, на которую могут влиять изменения микроокружения опухоли (например, поток pH, градиенты кислорода), доступность кофактора NAD + или альдегидных субстратов, уровни карбоновых кислот (ингибирование продукта) и посттрансляционные модификации, которые могут изменять активность фермента25 . Кроме того, рак яичников делится на пять основных гистологических типов (серозный рак высокой степени злокачественности, серозный рак низкой степени злокачественности, эндометриоидный, светлоклеточный и муцинозный), которые, как мы предполагаем, будут иметь различные уровни активности ALDH1A126. С целью изучения активности ALDH1A1 в опухолях яичников был использован изоформ-селективный флюорогенный зондовый анализ для идентификации популяций ALDH1A1+ в панели из пяти клеточных линий рака яичников, принадлежащих к различным гистологическим типам, упомянутым выше. Клеточные линии, протестированные в этом исследовании, включают клетки BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 и PEO4, охватывающие светлоклеточные и серозные гистотипы. При этом была подчеркнута универсальность и обобщаемость зонда для идентификации CSC для исследователей, которые стремятся провести аналогичные исследования на других иммортализированных линиях раковых клеток, а также на образцах пациентов. Использование AlDeSense прольет свет на биохимические пути, участвующие в поддержании CSC в сложных микроокружениях тканей, и потенциально послужит клиническим инструментом для определения прогноза и измерения агрессивности рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Измерьте общую активность ALDH1A1 в гомогенатах раковых клеток яичников с помощью флуориметрии.
- Размораживание 1 × 106 клеток в колбе для культивирования клеток Т25 в 5 мл следующих сред для культивирования клеток:
- IGROV-1 и PEO4: Мемориальный институт Розуэлл-Парк (RPMI) 1640 среда с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (P/S).
- BG-1 и Caov-3: модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) с 10% FBS и 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 с 20% FBS, 1% P/S и 0,01 мг/мл инсулина.
- Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO2 в течение двух-трех проходов. Перед прохождением убедитесь, что слияние ячеек не превышает 80-90%.
- Трипсинизировать клетки в 0,25% трипсина в течение 10 мин, подсчитывать их с помощью автоматического счетчика клеток и гранулировать 1 × 107 клеток с помощью центрифугирования (180 × г) при 25 ° C в течение 5 мин.
- Тщательно удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации, промойте гранулу, ресуспендировав клетки в 1 мл 1x PBS, и повторно гранулируйте клетки с помощью центрифугирования в тех же условиях, которые описаны на шаге 4.
- Ресуспендируют клетки в растворе 1x ингибитора протеазы в 1x PBS. Используют 1 мл этого раствора на 2,5 × 106 клеток.
- Обработайте суспензию клеток ультразвуком на льду в течение 2 мин (импульс 1 с, амплитуда 40%) с помощью зонда-гомогенизатора клеток.
- Гранулы нерастворимые/мембранные фракции центрифугированием (3 200 × г) при 25 °C в течение 15 мин. Удалите и сохраните надосадочную жидкость, так как это гомогенат, который будет использоваться на последующих этапах. Разделите гомогенаты на три кюветы, чтобы провести эксперимент в трех экземплярах.
- Добавьте зонд к гомогенату, чтобы получить конечную концентрацию зонда 4 мкМ. Пипеткой вверх и вниз три раза, чтобы хорошо перемешать раствор.
- Измерьте флуоресцентный сигнал сразу после добавления и после желаемого времени инкубации на флуориметре. Время инкубации можно оптимизировать, чтобы увидеть максимальное включение складки (1 час в этом эксперименте). Время инкубации должно быть постоянным для всех сравниваемых клеточных линий.
- Установите длину волны возбуждения на 496 нм.
- Установите излучение на 510-600 нм.
- Установите ширину щели 0,5 мм.
- Поместите раствор пипеткой в кварцевую кювету объемом 1 мл, поместите в флуориметр и нажмите «Сканировать».
- Разделите конечную интенсивность флуоресценции при длине волны 516 нм (максимальная длина волны флуоресценции) на интенсивность на той же длине волны от начальных показаний, чтобы определить кратную активацию изоформселективного красителя.
2. Использование флуоресцентной микроскопии для визуализации клеток с высокой активностью ALDH1A1
- Размораживают 1 × 106 клеток в колбе для культивирования клеток Т25 в 5 мл соответствующих сред для культивирования клеток.
- Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO2 в течение двух-трех проходов. Перед прохождением убедитесь, что слияние ячеек не превышает 80-90%.
- За день до конфокальной визуализации планшет 4 × 105 клеток на предметном стекле с 8-луночной камерой.
- Покройте дно каждой лунки поли-L-лизином (0,1 мг/мл, 100 мкл на лунку) в течение 10 мин, а затем аспирируйте.
- Промойте каждую лунку 3 раза, добавив воду для культивирования клеток (100 мкл на лунку) и аспирируя.
- Трипсинизируйте клетки в 0,25% трипсина в течение 10 минут, подсчитайте их с помощью автоматического счетчика клеток и наложите на клетки 4 × 105 клеток на лунку.
- Дайте клеткам осесть и прикрепиться на ночь (12-16 ч).
- Аспирируйте питательную среду и добавьте среду, не содержащую сыворотку (500 мкл на лунку), дополненную 2 мкМ зонда или контрольного зонда.
- Инкубируйте с помощью зонда при комнатной температуре в течение 30 минут и сразу же сфотографируйте клетки.
- Включите конфокальный микроскоп и подстройтесь под образец.
- Осторожно загружайте образец при наименьшем увеличении; Найдите ячейки, чтобы обеспечить правильное позиционирование.
- Убедитесь, что объектив имеет 10-кратное увеличение, и найдите ячейки.
- Для этого эксперимента требуются канал FITC (возбуждение: лазер 488 нм; излучение: 516-521 нм) и канал T-PMT (проходящий свет). Найдите и сфокусируйтесь на клетках с помощью T-PMT, чтобы сфокусироваться на одной и той же z-плоскости на протяжении всего эксперимента, чтобы устранить смещение.
- Отрегулируйте мощность лазера и усиление FITC до соответствующей настройки, при которой сигнал от образцов Ctrl-AlDeSense AM минимально обнаруживается, сохраняя при этом сигнал в образцах AlDeSense AM. Каждый параметр можно регулировать, сдвинув соответствующую полосу. Возможно, настройки придется корректировать несколько раз, чтобы определить правильные параметры. После оптимизации завершите оставшуюся часть эксперимента в этой клеточной линии, используя идентичные параметры.
- Сделайте три снимка на скважину, чтобы получить в общей сложности три скважины на одно условие обработки (всего девять изображений). Сфокусируйтесь на правильной плоскости с помощью T-PMT, чтобы избежать смещения, а не на флуоресцентном канале или объединенном изображении.
- Обработайте изображения, чтобы определить процент клеток ALDH1A1+.
- Используя программное обеспечение для обработки изображений, разделите файл czi на разные каналы.
- Подсчитайте общее количество ячеек и общее количество флуоресцентных ячеек.
- Чтобы определить процентное содержание клеток ALDH1A1+, разделите количество флуоресцентных ячеек на общее количество ячеек на каждом изображении. Крайне важно считать одинаково для каждого изображения, не манипулируя изображениями, поскольку, например, регулировка яркости может добавить смешанную переменную.
3. Применение проточной цитометрии для идентификации клеток с высокой активностью ALDH1A1
- Размораживают 1 × 106 клеток в колбе для культивирования клеток Т25 в 5 мл соответствующих сред для культивирования клеток.
- Поддерживайте клетки в инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO2 в течение двух-трех проходов. Перед прохождением убедитесь, что слияние ячеек не превышает 80-90%.
- Трипсинизируют, подсчитывают и гранулируют клетки в центрифужной пробирке объемом 15 мл с помощью центрифугирования (180 × г) при 25 ° C в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клетки в 1 мл 2 мкМ раствора зонда/контрольного зонда в PBS. Встряхните клетки при комнатной температуре в течение 60 минут, чтобы обеспечить равномерное воздействие красителя.
- После инкубационного периода гранулируют клетки с помощью центрифугирования (180 × г) при 25 ° C в течение 5 минут. Ресуспендируют клетки в 0,5 мл PBS. Пропустите клетки через клеточный фильтр (нейлоновая сетка 35 мкм), чтобы удалить клеточные комки, которые могут засорить проточный цитометр. Сразу же поместите клетки на лед.
- Включите прибор и запустите протокол запуска.
- Проверьте, нет ли жидкости в оболочке и пустых отходов.
- Запустите линии с 10% отбеливателем и водой в течение 5 минут каждая.
- Запустите бусины контроля качества, чтобы обеспечить правильную работу.
- На вкладке настроек выберите FSC (прямое рассеяние), SSC (боковое рассеяние) и FITC (флуоресцеин изотиоцианат) для флуоресцентного фильтра.
- Нарисуйте следующие графики, чтобы определить жизнеспособность, синглеты и флуоресценцию. Оптимизируйте мощность лазера (в зависимости от прибора пользователя) так, чтобы популяции клеток находились в пределах заданных параметров для дальнейшего анализа.
- Диаграмма рассеяния FSC-A и SSC-A: основная популяция клеток находится недалеко от центра графика.
- Диаграмма рассеяния FSC-A и FSC-W: узкая горизонтальная полоса, указывающая на синглеты (а не на скопления клеток).
- Диаграмма рассеяния FITC-A и FSC-A: наблюдайте за распределением клеток, отсортированных изоформоселективным флюорогенным датчиком.
- Гистограмма FITC-A: наблюдайте за сдвигом популяции на основе FITC, чтобы определить процент клеток ALDH1A1+.
- Чтобы оптимизировать мощность лазера FITC, запустите образец с помощью зонда так, чтобы правый хвост кривой гистограммы был близок к максимальному сигналу FITC-A. Затем запустите образец с помощью контрольного щупа. Сдвиг населения должен быть наблюдаемым, чтобы выявить максимальный динамический диапазон. Этап оптимизации мощности лазера, возможно, придется повторять несколько раз, но мощность лазера не должна изменяться в разных образцах после того, как настройка была назначена для эксперимента.
- Выполните каждую выборку для 10 000 отсчетов (в трех экземплярах).
- Повторите шаг 3.12 для каждой клеточной линии, так как будет вариабельность поглощения и активности ALDH1A1.
- После завершения отбора проб запустите линии с 10% отбеливателем и водой в течение 5 минут каждая, затем инициируйте отключение прибора.
- Обработайте данные с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии и определите желаемую популяцию клеток. Установите ворота таким образом, чтобы все события попадали либо в ворота ALDH1A1, либо в ALDH1A1+. Используя выбор прямоугольного затвора, установите затвор ALDH1A1- таким образом, чтобы >99,5% событий в образцах контрольного зонда происходили в пределах этого затвора. Остальные ячейки будут считаться ALDH1A1+. Эти же затворы затем могут быть применены к образцу зонда для количественной оценки количества событий, рассматриваемых ALDH1A1- и ALDH1A1+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая активность ALDH1A1 гомогенатов раковых клеток яичников
Средние сгибы для каждой клеточной линии, полученные в результате этого анализа, составляют: BG-1 (1,12 ± 0,01); ИГРОВ-1 (1,30 ± 0,03); Каов-3 (1,72 ± 0,06); ПЭО4 (2,51 ± 0,29); и OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (рис. 2).
Рисунок 2: Складчатое флуоресцентное включение изоформселективного красителя в гомогенатах каждой клеточной линии рака яичников, измеренное с помощью флуориметрии (среднее ± стандартное отклонение) (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Молекулярная визуализация субпопуляций ALDH1A1+ в культивируемых клетках рака яичников
При инкубации клеток с помощью зонда или контрольного зонда определяли процентное содержание клеток ALDH1A1+ в каждой клеточной линии. Настроив мощность и усиление лазера для минимизации сигнала в образце, обработанном Ctrl-AlDeSense AM, сигнал флуоресценции был оптимизирован в клетках, обработанных AlDeSense AM (рис. 3). Путем подсчета количества клеток ALDH1A1+ процент клеток ALDH1A1+ был определен следующим образом: BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); ОВКАР-3 (39,8% ± 3,9%); ИГРОВ-1 (51,7% ± 5,4%); и Caov-3 (93,7% ± 3,4%) (рис. 4).
Рисунок 3: Репрезентативные конфокальные изображения . (A, C, E, G, I) Клетки, окрашенные Ctrl-AlDeSense AM, и (B, D, F, H, J) клетки, окрашенные AlDeSense AM. Слева направо изображения демонстрируют светлое поле, флуоресценцию и слияние. Масштабные линейки имеют длину 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Средний процент клеток ALDH1A1+ в каждой клеточной линии рака яичников, измеренный с помощью конфокальной микроскопии (среднее ± стандартное отклонение) (n = 9). Процент клеток ALDH1A1+ составляет BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); ОВКАР-3 (39,8% ± 3,9%); ИГРОВ-1 (51,7% ± 5,4%); и Caov-3 (93,7% ± 3,4%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Идентификация популяции клеток ALDH1A1+ с помощью проточной цитометрии
С применением изоформ-селективного флюорогенного зонда популяция клеток ALDH1A1+ была успешно идентифицирована в различных клеточных линиях рака яичников. Во время постэкспериментального анализа данных популяция клеток ALDH1A1+ в каждой клеточной линии может быть количественно определена путем стробирования для верхних 0,5% самых ярких клеток в популяции, обработанной Ctrl-AlDeSense AM (рис. 5). Анализ панели раковых клеток яичников показал, что процентное содержание клеток ALDH1A1+ составляет: BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); ОВКАР-3 (7,6% ± 0,1%); ИГРОВ-1 (35,4% ± 2,8%); и Caov-3 (70,1% ± 2,4%) (рис. 6).
Рисунок 5: Репрезентативные точечные диаграммы и наложение гистограммы. (A, D, G, J, M) Репрезентативные диаграммы рассеяния окрашивания Ctrl-AlDeSense AM после 1-часовой инкубации с клетками. (Б,Э,Х,К,Н) Репрезентативные диаграммы рассеяния окрашивания AlDeSense AM после 1-часовой инкубации с клетками. (C, F, L, J, O) Наложение гистограммы окрашивания этих состояний Ctrl-AlDeSense AM и AlDeSense AM. Окрашиваются клеточные линии: (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 и (M-O) Caov-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Средний процент клеток ALDH1A1+ в каждой клеточной линии рака яичников, измеренный с помощью проточной цитометрии (среднее ± стандартное отклонение) (n = 3). Процент клеток ALDH1A1+ составлял BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); ОВКАР-3 (7,6% ± 0,1%); ИГРОВ-1 (35,4% ± 2,8%); и Caov-3 (70,1% ± 2,4%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В то время как несколько изоформ ALDH (т.е. ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 и ALDH3A1) были связаны с CSC, ALDH1A1 был выбран в качестве мишени для этого исследования, потому что в контексте рака яичников уровни экспрессии повышены 21,27, и было показано, что эта изоформа усугубляет лекарственную устойчивость28,29 и усиливает онкогенез 30,31 . Результаты конфокальной визуализации и проточной цитометрии согласуются в порядке увеличения популяции клеток ALDH1A1+. Кроме того, эксперименты с клеточным гомогенатом показывают среднюю активность в клеточной линии. В связи с этим можно экстраполировать выводы о количестве активности в субпопуляциях ALDH1A1+ каждой клеточной линии. Можно сделать вывод, что BG-1 имеет самую низкую активность ALDH1A1 и самую низкую популяцию ALDH1A1+. Следует отметить, что мы выбрали клеточную линию BG1 для использования в качестве отрицательного контроля в этом исследовании из-за незначительной экспрессии ALDH1A1. Кроме того, конфокальная визуализация и проточная цитометрия выявили наибольший процент клеток ALDH1A1+ в клетках Caov-3, но общая активность клеточной линии была только третьей по величине. В качестве альтернативы, клетки OVCAR-3 содержали третью по величине популяцию ALDH1A1+, но проявляли самую высокую общую активность. Экстраполируя эти результаты, субпопуляция клеток ALDH1A1+ OVCAR-3 имеет более высокую активность, чем субпопуляция клеток ALD1A1+ Caov-3. Благодаря дальнейшему анализу популяции ALDH1A1 в клеточных линиях или образцах тканей можно дополнительно выяснить роль ALDH1A1 и исследовать фенотипические изменения в результате повышенной активности ALDH1A1.
| Клеточная линия | Гистологический тип | Флуориметрия (включение сгиба) | Конфокальный (% положительный) | Расход (% положительный) | ||
| БГ-1 | Низкодифференцированная аденокарцинома | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| ПЭО4 | Серозная цистаденокарцинома высокой степени злокачественности | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| ОВКАР-3 | Серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| ИГРОВ-1 | Эндометриоидная аденокарцинома | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Каов-3 | Серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Таблица 1: Сводка результатов клеточных гомогенатов, конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Панселективность является основным ограничением многих зондов ALDH; Однако недавно было зарегистрировано несколько изоформоселективных примеров 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Изоформоселективный флюорогенный зонд, используемый в этом исследовании, представляет собой первый рационально спроектированный зонд, который реагирует только с изоформой ALDH1A1 даже в присутствии конкурирующих ферментов, присутствующих в больших избыточных количествах11,12. Еще одной отличительной особенностью этого зонда является его уникальная флуорогенная природа, которая характеризуется низким флуоресцентным излучением до активации зонда. Это противоречит коммерческим наборам, таким как анализ ALDEFLUOR, в котором используется флуоресцентный субстрат (аминоацетальдегид BODIPY [BAAA]), который всегда находится в состоянии «во включенном состоянии»32. BAAA идентифицирует клетки ALDH+ на основе предпосылки, что активированный карбоксилатный продукт (который в равной степени флуоресцентный) в большей степени сохраняется в клетках, экспрессирующих ALDH на высоких уровнях. Чтобы учесть неспецифическое накопление зонда в ALDH-клетках, необходимо применять ингибитор для блокирования ALDH, присутствующих в контрольном образце. Однако это сопровождается несколькими заметными недостатками. Во-первых, если цель состоит в том, чтобы идентифицировать CSC через активность ALDH1A1, применение стратегии ингибитора терпит неудачу, поскольку она также блокирует другие изоформы в разной степени. Во-вторых, неспецифическое поведение ингибитора может ухудшить способность клетки к детоксикации реакционноспособных альдегидов на глобальном уровне. Первая из этих проблем учтена при разработке AlDeSense, поскольку он реагирует только с одной изоформой, как упоминалось выше (дополнительный рисунок 1). Чтобы решить вторую проблему, Ctrl-AlDeSense заменяет роль ингибитора. В частности, контрольный реагент проявляет почти такой же флуоресцентный сигнал, как и неактивированный AlDeSense, в равной степени поглощается клетками и локализуется преимущественно в цитоплазме. Таким образом, любой сигнал, выходящий за пределы исходного уровня, установленного контролем, должен представлять собой опосредованную ALDH1A1 активацию зонда.
Дополнительный рисунок 1: Реакционная способность AlDeSense и ALDEFLUOR. (A) Включение нормализованной флуоресценции AlDeSense после инкубации с каждой изоформой ALDH и (B) реакционная способность ALDEFLUOR с каждой изоформой ALDH. Все измерения проводились в трех экземплярах; Полосы ошибок ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Первым применением изоформоселективного флуорогенного зонда, выбранного для выделения, является измерение активности ALDH1A1 в клеточных гомогенатах. В условиях, когда специализированные приборы, такие как конфокальные микроскопы или проточные цитометры, недоступны, использование обычных флуориметров может быстро сообщать об общей активности ALDH1A1 в образце. Таким образом, простота пробоподготовки (гомогенаты могут быть получены из образцов, начиная от клеточных культур и заканчивая иссеченной тканью) расширяет применимость этого анализа. Существует несколько ключевых параметров, которые необходимо учитывать при оптимизации изоформоселективного флюорогенного зонда для использования с гомогенатами. Первый включает в себя модуляцию количества клеток на образец лизата. Например, если динамический диапазон, определяемый как степень изменения флуоресцентного сигнала, недостаточно низок, количество клеток на образец может быть увеличено. Аналогичным образом, время инкубации также может быть отрегулировано таким образом, чтобы можно было активировать больше флуорогенного зонда для получения более сильного флуоресцентного считывания. Однако следует отметить, что основным ограничением этого метода является неспособность различать субпопуляции клеток, проявляющих различные уровни активности ALDH1A1. Поскольку клетки объединяются и лизируются независимо от их статуса ALDH1A1, количество активности фермента усредняется по всем клеткам, присутствующим в образце. Это приводит к другому результату по сравнению с конфокальной микроскопией и анализом проточной цитометрии, где сообщается о процентном соотношении клеток ALDH +. В то время как клетки BG-1 демонстрируют наименьшую реакцию включения в разы, а также наименьшую популяцию клеток ALDH1A1+, порядок остальных четырех клеточных линий становится непоследовательным. Например, гомогенатный анализ идентифицирует клетки OVCAR-3 как обладающие самой высокой общей активностью ALDH1A1, тогда как он занимает только третье место на основе конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Наша интерпретация этих данных заключается в том, что клетка ALDH1A1+ должна иметь различные уровни активности. Наконец, важно отметить, что этот тип эксперимента «включения» был бы невозможен с использованием зондов, основанных на накоплении.
Кроме того, изоформоселективный флуорогенный зонд является молекулярным визуализирующим агентом для визуализации клеточных популяций ALDH1A1+. Следует отметить, что, хотя в этой демонстрации использовалась конфокальная микроскопия, этот флуорогенный зонд совместим с большим ассортиментом установок визуализации, включая автоматические счетчики клеток, эпифлуоресцентные микроскопы и приборы для широкопольного освещения. Одним из наиболее важных шагов в этом эксперименте является использование Ctrl-AlDeSense для установления соответствующих пороговых параметров (например, размера точечного отверстия, мощности лазера, усиления FITC). В связи с этим настройки следует настроить таким образом, чтобы сигнал Ctrl-AlDeSense находился чуть выше фона. В случае, если пользователь обнаруживает, что необходимо увеличить мощность лазера, чтобы увидеть этот сигнал, рекомендуется продлить период окрашивания красителя или концентрацию нагрузки по сравнению с увеличением мощности лазера (выше 50%) из-за повышенной фототоксичности или отбеливания зонда. Ограничением конфокальной визуализации является вариабельность при стробировании с помощью Ctrl-AlDeSense. Несмотря на это предостережение, наблюдаемый порядок клеточных линий, основанный на увеличении процента клеток ALDH1A1+, был идентичен результатам, полученным с помощью проточной цитометрии. В отличие от молекулярной визуализации, где максимальное количество визуализируемых клеток ограничено полем зрения, типичный эксперимент по проточной цитометрии анализирует до десятков тысяч клеток. Соображения времени окрашивания и концентрации нагрузки аналогичны тем, которые обсуждались для молекулярной визуализации. Дополнительным элементом, который необходимо учитывать, является равномерное окрашивание красителя в клеточной суспензии, чтобы гарантировать, что ложноположительные популяции ALDH1A1+ не будут неправильно идентифицированы.
В заключение, в этой статье освещается процесс оптимизации AlDeSense для различных модальностей на примере раковых клеток яичников. Это представляет собой важный первый шаг к ответу на вопрос, почему существуют противоречивые сообщения об экспрессии ALDH1A1 при этом типе рака 21,22,23,24. Помимо того, что мы показали, мы предполагаем, что этот изоформоселективный флюорогенный зонд может быть использован в высокопроизводительной скрининговой кампании для выявления ALDH1A1-селективных ингибиторов, которые могут появиться в качестве кандидатов на лекарства. Кроме того, этот зонд может продолжать находить применение для идентификации CSC у живых животных, как мы продемонстрировали в нашей первоначальной публикации11. Характеристика излучения зеленого света изоформ-селективного флюорогенного зонда подготавливает его для экспериментов по мультиплексированию, где его можно использовать в тандеме с флуоресцентными белками, излучающими красный цвет, низкомолекулярными красителями или зондами, чувствительными к анализируемым веществам. Кроме того, существует красная версия изоформ-селективного флюорогенного зонда, которая может еще больше расширить эту мультиплексирующую способность12. Наконец, на медицинском фронте этот зонд может быть использован в качестве прогностического инструмента в клинических условиях для принятия решений о лечении в месте оказания медицинской помощи. Количественная оценка активности ALDH1A1 и популяций клеток ALDH1A1+ может служить методом определения агрессивности рака, что позволяет разрабатывать персонализированные стратегии лечения для улучшения качества жизни. Более того, с помощью AlDeSense показания могут быть доставлены и интерпретированы за считанные часы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы раскрываем патент, находящийся на рассмотрении (US20200199092A1) на технологию AlDeSense.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R35GM133581 для JC) и стипендией для выпускников Онкологического центра в Иллинойсе (присуждена SG). JC благодарит Фонд Камиллы и Генри Дрейфусов за поддержку. Авторы благодарят доктора Томаса Э. Беарруда за его первоначальный вклад в подготовку акций AlDeSense и AlDeSense AM. Мы благодарим г-на Оливера Д. Пичардо Пегеро и г-на Джозефа А. Форзано за их помощь в подготовке различных синтетических прекурсоров. Мы благодарим профессора Эрика Нельсона (Департамент молекулярной и интегративной физиологии, UIUC) за клетки Caov-3, IGROV-1 и PEO4. Мы благодарим профессора Пауля Хергенротера (химический факультет, UIUC) за клетки BG-1. Мы благодарим основные объекты Института геномной биологии им. Карла Р. Вёзе за доступ к конфокальному микроскопу Zeiss LSM 700 и соответствующему программному обеспечению. Мы благодарим Центр проточной цитометрии за доступ к анализатору BD LSR II CMtO. Мы благодарим доктора Сандру МакМастерс и Cell Media Facility за помощь в подготовке сред для клеточных культур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
