Summary
Metoder til måling af ALDH1A1-aktivitet i levende celler er kritiske i kræftforskning på grund af dets status som en biomarkør for stamme. I denne undersøgelse anvendte vi en isoform-selektiv fluorogen sonde til at bestemme de relative niveauer af ALDH1A1-aktivitet i et panel af fem ovariecancercellelinjer.
Abstract
Tilbagefald efter kræftbehandling tilskrives ofte persistensen af en underpopulation af tumorceller kendt som kræftstamceller (CSC'er), som er kendetegnet ved deres bemærkelsesværdige tumorinitierende og selvfornyelseskapacitet. Afhængigt af tumorens oprindelse (f.eks. æggestokke) kan CSC-overfladebiomarkørprofilen variere dramatisk, hvilket gør identifikationen af sådanne celler via immunhistokemisk farvning til en udfordrende indsats. Tværtimod har aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) vist sig at være en fremragende markør til identifikation af CSC'er på grund af dens bevarede ekspressionsprofil i næsten alle stamceller, herunder CSC'er. ALDH1A1-isoformen tilhører en superfamilie af 19 enzymer, der er ansvarlige for oxidationen af forskellige endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende carboxylsyreprodukter. Chan et al. udviklede for nylig AlDeSense, en isoform-selektiv "turn-on" sonde til påvisning af ALDH1A1-aktivitet samt et ikke-reaktivt matchende kontrolreagens (Ctrl-AlDeSense) for at tage højde for farvning uden for målet. Dette isoform-selektive værktøj har allerede vist sig at være et alsidigt kemisk værktøj gennem påvisning af ALDH1A1-aktivitet i K562 myeløve celler, mammosfærer og melanomafledte CSC-xenotransplantater. I denne artikel blev sondens anvendelighed fremvist gennem yderligere fluorimetri, konfokal mikroskopi og flowcytometrieksperimenter, hvor den relative ALDH1A1-aktivitet blev bestemt i et panel af fem ovariecancercellelinjer.
Introduction
Kræftstamceller (CSC'er) er en underpopulation af tumorceller, der udviser stamcellelignende egenskaber1. I lighed med deres ikke-kræftformede modstykker besidder CSC'er den ekstraordinære evne til selvfornyelse og formering. Sammen med andre indbyggede mekanismer, såsom opregulering af ATP-bindende kassettetransportører, spares CSC'er ofte fra indledende kirurgisk debulking-indsats samt efterfølgende adjuverende terapi2. På grund af deres kritiske rolle i behandlingsresistens3, tilbagefald4 og metastase5 er CSC'er blevet en prioritet inden for kræftforskning. Selvom der er en række celleoverfladeantigener (f.eks. CD133), der kan bruges til at identificere CSC'er6, har udnyttelse af den enzymatiske aktivitet af aldehyddehydrogenaser (ALDH'er), der findes i cytoplasmaet, vist sig som et attraktivt alternativ7. ALDH'er er en superfamilie af 19 enzymer, der er ansvarlige for at katalysere oxidationen af reaktive endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende carboxylsyreprodukter8.
Generelt er aldehydafgiftning afgørende for at beskytte celler mod uønskede tværbindingshændelser og oxidativ stress, der kan skade stamcellernes integritet9. Desuden styrer 1A1-isoformen retinsyremetabolismen, hvilket igen påvirker stammenhed via retinaldehydsignalering10. AlDeSense 11,12, en lille molekyle aktivitetsbaseret sensing (ABS) sonde til selektivt at detektere ALDH1A1 aktivitet, blev for nylig udviklet. ABS-design opnår analysanddetektion gennem en kemisk ændring snarere end en bindingshændelse, hvilket giver mulighed for høj selektivitet og reduceret respons uden for målet13,14,15,16. Designprincippet for den isoform-selektive fluorogene sonde er afhængig af en donorfotoinduceret elektronoverførselsmekanisme (d-PeT)17, der stammer fra aldehydfunktionsgruppen, som tjener til at undertrykke sondens fluorescerende signatur18. Ved ALDH1A1-medieret omdannelse til carboxylsyren låses strålingsafslapning op for at give et stærkt fluorescerende produkt. Fordi d-PeT-slukning aldrig er 100% effektiv, blev den resterende fluorescens, der kan føre til mulige falske positive resultater, overvejet ved etablering af dette assay gennem udviklingen af Ctrl-AlDeSense, et ikke-responsivt reagens med matchende fotofysiske egenskaber (f.eks. Kvanteudbytte) og et identisk cytoplasmatisk farvningsmønster i celler. Når det bruges i tandem, kan denne unikke parring pålideligt skelne celler med høj ALDH1A1-aktivitet fra dem, der udviser lave niveauer via fluorimetri, molekylær billeddannelse og flowcytometri. Flere vigtige fordele er forbundet med brugen af isoform-selektive aktiverbare farvestoffer i forhold til traditionelle immunhistokemiske metoder. For eksempel antages CSC'er at være begravet dybt inde i en tumor og er dermed mere tilgængelige for et lille molekyle i forhold til store antistoffer19. Derudover ændrer det omvendte fluorescerende produkt ikke kovalent nogen cellulær komponent, hvilket betyder, at det let kan fjernes via vaskecyklusser for at efterlade en CSC i en umodificeret tilstand. Endelig identificerer turn-on-responsen kun levedygtige celler og funktioner, ligesom MTT-assayet, på grund af dets afhængighed af NAD + -cofaktoren.
Figur 1: Skematisk demonstration af fluorescerende tænding af AlDeSense. Det isoform-selektive farvestof aktiveres af ALDH1A1 og kan bruges til at identificere forhøjet ALDH1A1-aktivitet i ovariecancerceller via fluorimetri, molekylær billeddannelse og flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
I tidligere arbejde stratificerede isoform-selektiv fluorogensondeanalyse med succes ALDH-høje (ALDH +) celler fra ALDH-celler med lav (ALDH-) i K562 humane kroniske leukæmiceller, MDA-MB-231 humane brystkræftceller og B16F0 murine melanomceller. Dette er vigtigt, fordi høj ALDH1A1-proteinekspression for mange kræfttyper betyder en dårligere klinisk prognose20. Dette forudsætter, at forhøjede niveauer af ALDH1A1 er tegn på CSC'er, som kan undgå behandling, udvikle resistens og sprede sig i hele kroppen. I tilfælde af kræft i æggestokkene er der imidlertid undersøgelser, der rapporterer det modsatte fund (høj ALDH1A1-ekspression er forbundet med forbedret patientoverlevelse)21,22,23,24. Selvom dette kan virke modstridende ved første øjekast, korrelerer ekspression ikke nødvendigvis med enzymaktivitet, som kan påvirkes af ændringer i tumormikromiljøet (f.eks. pH-flux, iltgradienter), tilgængeligheden af NAD+-cofaktor- eller aldehydsubstraterne, niveauer af carboxylsyrer (produkthæmning) og posttranslationelle modifikationer, der kan ændre enzymaktiviteten25 . Derudover er kræft i æggestokkene opdelt i fem histologiske hovedtyper (serøs af høj kvalitet, lavkvalitets serøs, endometrioid, klar celle og mucinøs), som vi antager vil have variable niveauer af ALDH1A1-aktivitet26. Med det formål at undersøge ALDH1A1-aktivitet i ovarietumorer blev der anvendt et isoform-selektivt fluorogent sondeassay til at identificere ALDH1A1+ populationer i et panel af fem ovariecancercellelinjer, der tilhører de forskellige histologiske typer, der er nævnt ovenfor. De cellelinjer, der blev testet i denne undersøgelse, inkluderer BG-1-, Caov-3-, IGROV-1-, OVCAR-3- og PEO4-celler, der dækker klare celle- og serøse histotyper. Heri blev sondens alsidighed og generaliserbarhed fremhævet for at identificere CSC'er for forskerne, der søger at udføre lignende undersøgelser i andre udødeliggjorte kræftcellelinjer samt patientprøver. Brugen af AlDeSense vil kaste lys over de biokemiske veje, der er involveret i CSC-vedligeholdelse i komplekse vævsmikromiljøer og potentielt tjene som et klinisk værktøj til bestemmelse af prognose og måling af kræftaggressivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mål total ALDH1A1-aktivitet i ovariecancercellehomogenater via fluorimetri
- 1 × 106 celler optøs i en T25-cellekulturkolbe i 5 ml af følgende cellekulturmedier:
- IGROV-1 og PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S).
- BG-1 og Caov-3: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 med 20% FBS, 1% P/S og 0,01 mg/ml insulin.
- Oprethold cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i to til tre passager. Sørg for, at cellerne ikke overstiger 80% -90% sammenløb før passage.
- Trypsiniser cellerne i 0,25% trypsin i 10 minutter, tæl dem ved hjælp af en automatiseret celletæller, og pellet 1 × 107 celler via centrifugering (180 × g) ved 25 ° C i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes forsigtigt via aspiration, pellets vaskes ved at resuspendere cellerne i 1 ml 1x PBS, og cellerne pelleteres igen via centrifugering under de samme betingelser som beskrevet i trin 4.
- Resuspender cellerne i en opløsning af 1x proteasehæmmer i 1x PBS. Brug 1 ml af denne opløsning pr. 2,5 × 106 celler.
- Sonikere cellesuspensionen på is i 2 minutter (1 s puls, 40% amplitude) med en cellehomogenisatorsonde.
- Uopløselige pillefraktioner/membranfraktioner via centrifugering (3.200 × g) ved 25 °C i 15 min. Supernatanten fjernes og beholdes, da dette er det homogenat, der skal anvendes i de efterfølgende trin. Opdel homogenaterne i tre kuvetter for at udføre eksperimentet i tre eksemplarer.
- Sonden tilsættes homogenatet for at opnå en endelig sondekoncentration på 4 μM. Der pipetteres op og ned tre gange for at blande opløsningen godt.
- Fluorescerende signal måles umiddelbart efter tilsætning og efter ønskede inkubationstider på et fluorimeter. Inkubationstiden kan optimeres til at se den maksimale foldtænding (1 time i dette eksperiment). Inkubationstiden skal være konstant på tværs af alle sammenlignede cellelinjer.
- Indstil excitationsbølgelængden til 496 nm.
- Indstil emissionen til 510-600 nm.
- Indstil slidsbredden til 0,5 mm.
- Pipetter opløsningen i en 1 ml kvartskuvette, læg den i fluorimeteret, og tryk på scan.
- Den endelige fluorescensintensitet divideres ved 516 nm (maksimal fluorescerende bølgelængde) med intensiteten ved samme bølgelængde fra begyndelsesaflæsningen for at bestemme foldaktiveringen af det isoform-selektive farvestof.
2. Anvendelse af fluorescensmikroskopi til billedceller med høj ALDH1A1-aktivitet
- 1 × 106 celler optøs i en T25-cellekulturkolbe i 5 ml af de relevante cellekulturmedier.
- Oprethold cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i to til tre passager. Sørg for, at cellerne ikke overstiger 80% -90% sammenløb før passage.
- Dagen før konfokal billeddannelse plade 4 × 105 celler i et 8-brønds kammerglas.
- Overtræk bunden af hvert hul med poly-L-lysin (0,1 mg/ml, 100 μL pr. hul) i 10 minutter, derefter aspirerende.
- Hvert hul vaskes 3x ved tilsætning af vand af cellekulturkvalitet (100 μL pr. brønd) og aspirering.
- Trypsiniser cellerne i 0,25% trypsin i 10 minutter, tæl dem ved hjælp af en automatiseret celletæller, og plade cellerne ved 4 × 105 celler pr. Brønd.
- Lad cellerne sætte sig og fastgøre natten over (12-16 timer).
- Opsug vækstmediet, og tilsæt serumfrie medier (500 μL pr. hul), suppleret med 2 μM sonden eller kontrolsonden.
- Inkuber med sonden ved stuetemperatur i 30 minutter og tag straks billeder af cellerne.
- Tænd for det konfokale mikroskop og juster for prøven.
- Prøven fyldes forsigtigt ved den laveste forstørrelse; Find cellerne for at sikre korrekt positionering.
- Sørg for, at objektivlinsen er ved 10x forstørrelse, og find cellerne.
- Til dette eksperiment kræves FITC-kanalen (excitation: 488 nm laser; emission: 516-521 nm) og T-PMT (transmitteret lys) kanal. Find og fokuser på cellerne ved hjælp af T-PMT for at fokusere på det samme z-plan i hele eksperimentet for at fjerne bias.
- Juster lasereffekten og FITC-forstærkningen til den relevante indstilling, hvor signalet fra Ctrl-AlDeSense AM-prøverne kan detekteres minimalt, mens signalet stadig kan ses i AlDeSense AM-prøver. Hver parameter kan justeres ved at skubbe den tilsvarende stang. Indstillingerne skal muligvis justeres et par gange for at identificere de korrekte parametre. Når det er optimeret, skal du fuldføre resten af eksperimentet inden for den cellelinje ved hjælp af identiske parametre.
- Tag tre billeder pr. brønd for i alt tre brønde pr. behandlingstilstand (ni billeder i alt). Fokuser på det rigtige plan ved hjælp af T-PMT for at undgå bias i stedet for at bruge fluorescenskanalen eller det flettede billede.
- Behandl billederne for at bestemme procentdelen af ALDH1A1+ celler.
- Brug billedbehandlingssoftware til at opdele czi-filen i forskellige kanaler.
- Tæl det samlede antal celler og det samlede antal fluorescerende celler.
- For at bestemme procentdelen af ALDH1A1+ celler divideres antallet af fluorescerende celler med det samlede antal celler i hvert billede. Det er bydende nødvendigt at tælle på samme måde for hvert billede uden at manipulere billederne, da for eksempel justering af lysstyrken kan tilføje en forvirrende variabel.
3. Anvendelse af flowcytometri til at identificere celler med høj ALDH1A1-aktivitet
- 1 × 106 celler optøs i en T25-cellekulturkolbe i 5 ml af de relevante cellekulturmedier.
- Oprethold cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i to til tre passager. Sørg for, at cellerne ikke overstiger 80% -90% sammenløb før passage.
- Trypsiniser, tæl og pellet cellerne i et 15 ml centrifugerør via centrifugering (180 × g) ved 25 °C i 5 minutter.
- Resuspender cellerne i 1 ml 2 μM sonde-/kontrolsondeopløsning i PBS. Rock cellerne ved stuetemperatur i 60 minutter for at sikre, at eksponeringen for farvestoffet er jævn.
- Efter inkubationstiden pelleteres cellerne via centrifugering (180 × g) ved 25 °C i 5 minutter. Resuspender cellerne i 0,5 ml PBS. Kør cellerne gennem en cellesil (35 μm nylonnet) for at fjerne celleklumper, der kan tilstoppe flowcytometeret. Placer straks cellerne på is.
- Tænd instrumentet, og kør opstartsprotokollen.
- Kontroller for kappevæske og tomt affald.
- Kør linjerne med 10% blegemiddel og vand i 5 minutter hver.
- Kør kvalitetskontrolperler for at sikre korrekt funktion.
- På fanen Indstillinger skal du vælge FSC (forward scatter), SSC (side scatter) og FITC (fluorescein isothiocyanate) for fluorescensfilteret .
- Tegn følgende grafer for at gate for levedygtighed, singlets og fluorescens. Optimer lasereffekten (specifik for brugerens instrument), så cellepopulationerne er inden for de givne parametre til yderligere analyse.
- FSC-A versus SSC-A scatter plot: hovedcellepopulationen er nær midten af grafen.
- FSC-A versus FSC-W scatter plot: smalt vandret bånd, der indikerer singlets (snarere end celleklumper).
- FITC-A versus FSC-A scatter plot: observere fordelingen af celler sorteret af isoform-selektiv fluorgen turn-on sonde.
- FITC-A histogram: observer skiftet i befolkning baseret på FITC for at bestemme procentdelen af ALDH1A1+ celler.
- For at optimere FITC-lasereffekten skal du køre en prøve med sonden, så histogramkurvens højre hale er tæt på det maksimale FITC-A-signal. Kør derefter en prøve med kontrolsonden. En befolkningsforskydning skal kunne observeres for at afsløre det maksimale dynamiske område. Lasereffektoptimeringstrinnet skal muligvis gentages flere gange, men lasereffekten bør ikke ændres på tværs af prøver, når der er angivet en indstilling til et eksperiment.
- Kør hver prøve i 10.000 tællinger (udført i tre eksemplarer).
- Gentag trin 3.12 for hver cellelinje, da der vil være variation i optagelse og ALDH1A1-aktivitet.
- Efter afslutningen af prøveindsamlingen køres linjerne med 10% blegemiddel og vand i 5 minutter hver, og derefter startes nedlukning af instrumentet.
- Behandl dataene ved hjælp af flowcytometrisoftwaren, og port den ønskede cellepopulation. Indstil portene, så alle begivenheder falder ind i enten ALDH1A1- eller ALDH1A1+-porten. Brug valget af rektangelport til at indstille ALDH1A1-porten, så >99,5% af hændelserne i kontrolsondeprøverne forekommer inden for denne port. De resterende celler betragtes som ALDH1A1+. De samme porte kan derefter anvendes på sondeprøven for at kvantificere antallet af hændelser, der betragtes som ALDH1A1- og ALDH1A1+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlet ALDH1A1-aktivitet af ovariecancercellehomogenater
De gennemsnitlige fold-turn-ons for hver cellelinje opnået fra dette assay er: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1, 72 ± 0, 06); PEO4 (2,51 ± 0,29); og OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figur 2).
Figur 2: Foldfluorescerende tænding af isoform-selektivt farvestof i homogenater af hver ovariecancercellelinje målt ved fluorimetri (gennemsnit ± standardafvigelse) (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Molekylær billeddannelse af ALDH1A1+ subpopulationer i dyrkede ovariecancerceller
Ved inkubation af cellerne med en sonde eller kontrolsonde blev procentdelen af ALDH1A1+ celler bestemt i hver cellelinje. Ved at indstille lasereffekten og forstærkningen for at minimere signalet i den Ctrl-AlDeSense AM-behandlede prøve blev fluorescenssignalet optimeret i de AlDeSense AM-behandlede celler (figur 3). Ved at tælle antallet af ALDH1A1+ celler blev procentdelen af ALDH1A1+ celler bestemt til at være: BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); og Caov-3 (93,7% ± 3,4%) (figur 4).
Figur 3: Repræsentative konfokale billeder . (A, C, E, G, I) Ctrl-AlDeSense AM farvede celler og (B, D, F, H, J) AlDeSense AM farvede celler. Fra venstre mod højre viser billederne brightfield, fluorescens og fletning. Vægtbjælker er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Den gennemsnitlige procentdel af ALDH1A1+ celler i hver ovariecancercellelinje målt ved konfokalmikroskopi (gennemsnitlig ± standardafvigelse) (n = 9). Procentdelen af ALDH1A1+ celler er BG-1 (3,2% ± 1,6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); og Caov-3 (93,7% ± 3,4%). Klik her for at se en større version af denne figur.
Identifikation af population af ALDH1A1+ celler ved hjælp af flowcytometri
Med anvendelsen af den isoform-selektive fluorogene sonde blev populationen af ALDH1A1+ celler med succes identificeret på tværs af forskellige ovariecancercellelinjer. Under den posteksperimentelle dataanalyse kunne ALDH1A1+ cellepopulationen inden for hver cellelinje kvantificeres ved at gating for de øverste 0,5% af de lyseste celler inden for den Ctrl-AlDeSense AM-behandlede population (figur 5). Analyse af panelet af ovariecancerceller har afsløret, at procentdelene af ALDH1A1 + celler er: BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); og Caov-3 (70,1% ± 2,4%) (figur 6).
Figur 5: Repræsentative spredningsdiagrammer og histogramoverlejring. (A, D, G, J, M) Repræsentative spredningsdiagrammer af Ctrl-AlDeSense AM-farvning efter en 1 times inkubation med celler. (B,E,H,K,N) Repræsentative scatter plots af AlDeSense AM farvning efter en 1 time inkubation med celler. (C,F,L,J,O) Histogramoverlejring af Ctrl-AlDeSense AM og AlDeSense AM-farvning af disse tilstande. Cellelinjer, der farves, er (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 og (M-O) Caov-3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Den gennemsnitlige procentdel af ALDH1A1+ celler i hver ovariecancercellelinje målt ved flowcytometri (gennemsnitlig ± standardafvigelse) (n = 3). Procentdelen af ALDH1A1+ celler var BG-1 (4,9% ± 0,4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); og Caov-3 (70,1% ± 2,4%). Klik her for at se en større version af denne figur.
Mens flere ALDH-isoformer (dvs. ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 og ALDH3A1) har været forbundet med CSC'er, blev ALDH1A1 valgt som mål for denne undersøgelse, fordi ekspressionsniveauerne i forbindelse med kræft i æggestokkene er forhøjet 21,27, og denne isoform har vist sig at forværre lægemiddelresistens28,29 og forbedre tumorigenese 30,31 . Resultaterne fra konfokal billeddannelse og flowcytometri stemmer overens i rækkefølgen af den stigende population af ALDH1A1+ celler. Derudover afslører cellehomogenateksperimenterne den gennemsnitlige aktivitet inden for en cellelinje. I forbindelse kan konklusioner om mængden af aktivitet inden for ALDH1A1+ subpopulationer af hver cellelinje ekstrapoleres. Det kan konkluderes, at BG-1 har den laveste ALDH1A1-aktivitet og den laveste ALDH1A1+-befolkning. Det skal bemærkes, at vi valgte BG1-cellelinjen til at blive brugt som en negativ kontrol i denne undersøgelse på grund af den ubetydelige ekspression af ALDH1A1. Derudover afslørede konfokal billeddannelse og flowcytometri den største procentdel af ALDH1A1 + celler i Caov-3-celler, men cellelinjens samlede aktivitet var kun tredje højeste. Alternativt indeholdt OVCAR-3-celler den tredje højeste ALDH1A1+ population, men udviste den højeste samlede aktivitet. Ekstrapolering fra disse resultater har subpopulationen af ALDH1A1+ OVCAR-3-celler højere aktivitet end subpopulationen af ALD1A1+ Caov-3-celler. Gennem yderligere analyse af ALDH1A1-populationen inden for cellelinjer eller vævsprøver kan ALDH1A1's rolle belyses yderligere, og de fænotypiske ændringer som følge af forhøjet ALDH1A1-aktivitet kan undersøges.
| Cellelinje | Histologisk type | Fluorimetri (fold, tænd) | Konfokal (% positiv) | Flow (% positiv) | ||
| BG-1 | Dårligt differentieret adenokarcinom | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| PEO4 | Høj kvalitet serøst cystadenocarcinom | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| OVCAR-3 | Høj kvalitet serøst adenocarcinom | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| IGROV-1 | Endometrioid adenokarcinom | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Caov-3 | Høj kvalitet serøst adenocarcinom | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Tabel 1: Oversigt over resultater fra cellehomogenater, konfokal mikroskopi og flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pan-selektivitet er en væsentlig begrænsning for mange ALDH-sonder; Imidlertid er der for nylig rapporteret flere isoform-selektive eksempler 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Den isoform-selektive fluorogene sonde, der anvendes i denne undersøgelse, repræsenterer den første rationelt designede sonde, der kun reagerer med ALDH1A1-isoformen, selv i nærvær af konkurrerende enzymer, der er til stede i store overskydende mængder11,12. Et andet kendetegn ved denne sonde er dens unikke fluorogene natur, som er kendetegnet ved lav fluorescensemission før sondeaktivering. Dette er i modsætning til kommercielle sæt såsom ALDEFLUOR-assayet, som har et fluorescerende substrat (BODIPY aminoacetaldehyd [BAAA]), der altid er i en "on-state"32. BAAA identificerer ALDH+ celler baseret på den forudsætning, at det aktiverede carboxylatprodukt (som er lige så fluorescerende) bevares i større grad i celler, der udtrykker ALDH på høje niveauer. For at tage højde for ikke-specifik akkumulering af sonden i ALDH-celler skal der påføres en hæmmer for at blokere ALDH'er, der er til stede i en kontrolprøve. Dette ledsages imidlertid af flere bemærkelsesværdige ulemper. For det første, hvis hensigten er at identificere CSC'er via ALDH1A1-aktivitet, mislykkes anvendelsen af inhibitorstrategien, fordi den også blokerer andre isoformer i varierende grad. For det andet kan inhibitorens ikke-specifikke opførsel forringe en celles evne til at afgifte reaktive aldehyder på globalt plan. Den første af disse bekymringer behandles i designet af AlDeSense, fordi den kun reagerer med en enkelt isoform som nævnt ovenfor (supplerende figur 1). For at forbedre den anden bekymring erstatter Ctrl-AlDeSense hæmmerens rolle. Specifikt udviser kontrolreagenset et næsten identisk fluorescerende signal som ikke-aktiveret AlDeSense, optages i lige høj grad af celler og lokaliserer overvejende til cytoplasmaet. Ethvert signal ud over den basislinje, der er fastlagt af kontrollen, skal derfor repræsentere ALDH1A1-medieret sondeaktivering.
Supplerende figur 1: Reaktiviteten af AlDeSense og ALDEFLUOR. (A) Normaliseret fluorescens turn-on af AlDeSense efter inkubation med hver ALDH isoform og (B) reaktivitet af ALDEFLUOR med hver ALDH isoform. Alle målinger blev udført i tre eksemplarer; fejlbjælker er ± SD. Klik her for at downloade denne fil.
Den første anvendelse af den isoform-selektive fluorogene sonde, der er valgt til at fremhæve, er måling af ALDH1A1-aktivitet i cellehomogenater. Under omstændigheder, hvor specialiseret instrumentering såsom konfokale mikroskoper eller flowcytometre ikke er tilgængelige, kan brugen af almindelige fluorimetere hurtigt rapportere om total ALDH1A1-aktivitet i en prøve. På samme måde udvider den lette prøveforberedelse (homogenater kan tilgås fra prøver, der spænder fra cellekulturer til udskåret væv) anvendeligheden af dette assay. Der er et par nøgleparametre, der skal overvejes, når den isoform-selektive fluorogene sonde optimeres til brug med homogenater. Den første involverer modulering af antallet af celler pr. Lysatprøve. Hvis det dynamiske område, defineret som omfanget af fluorescerende signalændring, f.eks. ikke er tilstrækkeligt lavt, kan antallet af celler pr. prøve øges. Ligeledes kan inkubationstiden også justeres således, at mere fluorogen sonde kan aktiveres for at give en stærkere fluorescerende aflæsning. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at en væsentlig begrænsning af denne metode er manglende evne til at skelne mellem subpopulationer af celler, der udviser varierende niveauer af ALDH1A1-aktivitet. Da celler kombineres og lyseres uanset deres ALDH1A1-status, beregnes mængden af enzymaktivitet som gennemsnit over alle celler, der er til stede i prøven. Dette resulterer i et andet resultat sammenlignet med konfokalmikroskopi og flowcytometrianalyser, hvor det er procentdelen af ALDH+ celler, der rapporteres. Mens BG-1-celler viser det laveste fold-tændingsrespons såvel som den mindste population af ALDH1A1+-celler, bliver rækkefølgen af de resterende fire cellelinjer inkonsekvent. For eksempel identificerer homogenassayet OVCAR-3-celler for at have den højeste samlede ALDH1A1-aktivitet, mens den kun rangerer tredje baseret på konfokal mikroskopi og flowcytometri. Vores fortolkning af disse data er, at en ALDH1A1+ celle skal have varierende aktivitetsniveauer. Endelig er det vigtigt at bemærke, at denne type 'turn-on' eksperiment ikke ville være muligt ved hjælp af akkumuleringsbaserede sonder.
Derudover er den isoform-selektive fluorogene sonde et molekylært billeddannelsesmiddel til visualisering af ALDH1A1+ cellepopulationer. Det skal bemærkes, at selvom konfokalmikroskopi blev anvendt i denne demonstration, er denne fluorogene sonde kompatibel med et stort udvalg af billeddannelsesopsætninger, herunder automatiserede celletællere, epifluorescensmikroskoper og vidvinkelbelysningsinstrumenter. Et af de vigtigste trin i dette eksperiment er brugen af Ctrl-AlDeSense til at etablere de passende tærskelparametre (f.eks. Pinhole størrelse, lasereffekt, FITC gain). I denne henseende skal indstillingerne justeres således, at Ctrl-AlDeSense-signalet er lige over baggrunden. I tilfælde af at en bruger finder ud af, at det er nødvendigt at øge lasereffekten for at se dette signal, anbefales det at forlænge farvestoffarvningsperioden eller belastningskoncentrationen frem for at øge lasereffekten (over 50%) på grund af øget fototoksicitet eller sondeblegning. En begrænsning af konfokal billeddannelse er variabilitet, når du gating med Ctrl-AlDeSense. På trods af denne advarsel var den observerede cellelinjerækkefølge baseret på stigende procentdele af ALDH1A1+ celler identiske med resultaterne opnået via flowcytometri. I modsætning til molekylær billeddannelse, hvor det maksimale antal celler, der visualiseres, er begrænset af synsfeltet, analyserer et typisk flowcytometrieksperiment op til titusinder af celler. Overvejelserne om farvningstid og belastningskoncentration svarer til dem, der diskuteres for molekylær billeddannelse. Et yderligere element, der skal overvejes, er jævn farvestoffarvning i cellesuspensionen for at sikre, at falsk positive ALDH1A1+ populationer ikke fejlidentificeres.
Afslutningsvis fremhæver denne artikel processen til optimering af AlDeSense til en række forskellige modaliteter ved hjælp af ovariecancerceller som et eksempel. Dette repræsenterer et vigtigt første skridt i retning af at besvare, hvorfor der findes modstridende rapporter om ALDH1A1-ekspression i denne kræfttype21,22,23,24. Ud over hvad vi har vist, forestiller vi os, at denne isoform-selektive fluorogene sonde kan bruges i en screeningskampagne med høj kapacitet til at identificere ALDH1A1-selektive hæmmere, der kan dukke op som lægemiddelkandidater. Derudover kan denne sonde fortsat finde anvendelse til at identificere CSC'er hos levende dyr, som vi har demonstreret i vores første publikation11. Den grønne lys-emissive karakteristik af isoform-selektiv fluorogen sonde primer den til multiplexeringseksperimenter, hvor den kan bruges sammen med rødemitterende fluorescerende proteiner, småmolekylefarvestoffer eller analytresponsive sonder. Desuden findes der en rød version af isoform-selektiv fluorogen sonde, som yderligere kan udvide denne multiplexeringskapacitet12. Endelig kan denne sonde på den medicinske front bruges som et prognostisk værktøj i den kliniske indstilling til beslutningstagning på behandlingsstedet. Kvantificering af ALDH1A1-aktivitet og ALDH1A1+ cellepopulationer kan tjene som en metode til at bestemme kræftaggressivitet, hvilket giver mulighed for personlige behandlingsstrategier for bedre livskvalitet. Desuden kan en aflæsning ved hjælp af AlDeSense leveres og fortolkes i løbet af få timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi afslører et verserende patent (US20200199092A1) for AlDeSense-teknologien.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R35GM133581 til JC) og Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (tildelt SG). JC takker Camille og Henry Dreyfus Foundation for støtte. Forfatterne takker Dr. Thomas E. Bearrood for hans indledende bidrag til at forberede lagre af AlDeSense og AlDeSense AM. Vi takker Oliver D. Pichardo Peguero og Joseph A. Forzano for deres hjælp med at forberede forskellige syntetiske prækursorer. Vi takker professor Erik Nelson (Institut for Molekylær og Integrativ Fysiologi, UIUC) for Caov-3, IGROV-1 og PEO4 celler. Vi takker professor Paul Hergenrother (Institut for Kemi, UIUC) for BG-1-celler. Vi takker kernefaciliteterne på Carl R. Woese Institute for Genomic Biology for adgang til Zeiss LSM 700 Confocal Microscope og tilhørende software. Vi takker flowcytometrifaciliteten for adgang til BD LSR II CMtO-analysator. Vi takker Dr. Sandra McMasters og Cell Media Facility for hjælp til at forberede cellekulturmedier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
