Summary
Il presente protocollo descrive come utilizzare l'olio rosso O per tingere le goccioline lipidiche (LD), calcolare la dimensione e il numero di LD in un modello di epatociti grassi indotto da acidi grassi e utilizzare BODIPY 493/503 per osservare il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD mediante imaging di cellule vive.
Abstract
Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli che svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei lipidi e nella conservazione dei lipidi neutri nelle cellule. Sono associati a una varietà di malattie metaboliche, come l'obesità, la malattia del fegato grasso e il diabete. Nelle cellule epatiche, le dimensioni e il numero di LD sono segni di malattia del fegato grasso. Inoltre, la reazione allo stress ossidativo, l'autofagia cellulare e l'apoptosi sono spesso accompagnate da cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD. Di conseguenza, le dimensioni e la quantità delle LD sono alla base della ricerca attuale sul meccanismo della biogenesi delle LD. Qui, nelle cellule epatiche bovine indotte da acidi grassi, descriviamo come utilizzare l'olio rosso O per colorare le LD e per studiare le dimensioni e il numero di LD. La distribuzione dimensionale delle LD viene analizzata statisticamente. Il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD è anche osservato da un sistema di imaging di cellule vive. Il lavoro attuale fornisce un modo per osservare direttamente la tendenza al cambiamento delle dimensioni dei LD in diverse condizioni fisiologiche.
Introduction
L'accumulo di goccioline lipidiche (LD) negli epatociti è la caratteristica tipica della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che può progredire verso la fibrosi epatica e il carcinoma epatocellulare. È stato riscontrato che la prima manifestazione della malattia del fegato grasso è la steatosi, caratterizzata da accumulo di LD nel citoplasma dell'epatocita1. La steatosi epatica è invariabilmente associata ad un aumento del numero e/o ad una dimensione espansa delle LD2. Si ritiene che le LD siano generate dal reticolo endoplasmatico (ER), costituito da trigliceridi (TG) come nucleo, e sono circondate da proteine e fosfolipidi3. Come organello subcellulare responsabile della conservazione della TG, le LD mostrano caratteristiche diverse per quanto riguarda le loro dimensioni, numero, composizione lipidica, proteine e interazione con altri organelli, che influenzano l'omeostasi energetica cellulare4. Il livello di TG è positivamente correlato con le dimensioni delle LD e un contenuto di TG intracellulare più elevato potrebbe formare LD più grandi5. Le LD aumentano di dimensioni attraverso la sintesi locale di TG, l'incorporazione lipidica nell'ER e la fusione di più LD6. Le cellule (adipociti, epatociti, ecc.) che contengono grandi LD hanno un meccanismo speciale per aumentare efficacemente l'accumulo di lipidi mediante fusione LD. I cambiamenti dinamici delle LD riflettono i diversi stati del metabolismo energetico della cellula. È fondamentale sviluppare metodologie che permettano l'osservazione e l'analisi delle varie LD epatiche in cellule sane e anormali.
I principali coloranti non fluorescenti per LD sono Sudan Black B e rosso olio O. Sudan Black B colora lipidi neutri, fosfolipidi e steroidi7. L'olio rosso O viene utilizzato principalmente per la colorazione di LD di muscolo scheletrico, cardiomiociti, tessuto epatico, cellule adipose, ecc8., ed è considerato uno strumento standard per la rilevazione quantitativa della steatosi epatica nei topi e nell'uomo9. Il cambiamento dinamico delle LD è effettuato principalmente dalla tintura a fluorescenza. Il rosso del Nilo e il BODIPY sono entrambi coloranti lipidici fluorescenti comunemente usati10,11. Rispetto al rosso del Nilo, BODIPY ha una permeabilità tissutale più forte e si lega meglio con LDs12. I LD marcati con BODIPY possono essere utilizzati per la colorazione delle cellule viventi e la colocalizzazione con altri organelli13.
L'incidenza della steatosi epatica è significativamente più elevata nei ruminanti rispetto agli animali monogastrici14. Durante il periodo di transizione, le vacche da latte sperimentano uno stato di bilancio energetico negativo3. Grandi quantità di acidi grassi non esterificati (acido palmitico, acido oleico, acido linoleico, ecc.) sono sintetizzate in TG negli epatociti bovini, il che porta ad anomalie funzionali del fegato e riduce notevolmente la qualità dei prodotti lattiero-caseari e l'efficienza produttiva15. Il presente studio si propone di fornire un protocollo per analizzare la dimensione e il numero di LD, nonché per monitorare la dinamica di fusione LD. Abbiamo costruito un modello di formazione di LD aggiungendo diverse concentrazioni di acido linoleico (LA) negli epatociti16 e osservato i cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD durante il processo colorando le LD con O rosso olio. Inoltre, il processo di rapida fusione delle LD è stato osservato anche mediante colorazione con BODIPY 493/503.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con gli standard etici del Comitato per la cura degli animali dell'Università agricola di Henan (provincia di Henan, Cina).
1. Coltura cellulare di epatociti bovini
- Scongelare le cellule epatocitarie primarie17 e centrifugare 400 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Le cellule epatocitarie primarie sono state coltivate e mantenute a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato17. - Gettare la soluzione congelata con una pipetta e sospenderla con 1 mL di terreno contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM). Quindi, utilizzare una camera di conteggio delle celle per calcolare il numero di celle per millilitro, quindi calcolare la concentrazione della sospensione cellulare di cui sopra e regolare la concentrazione di cellule a 1 x 107 celle / ml.
- Aggiungere la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare da 60 mm contenente 3 ml del mezzo di cui sopra. Coltivare le cellule e incubarle a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
- Quando le cellule crescono all'80%, scartare il mezzo e risciacquare con soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi aggiungere 750 μL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule. Incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti, quindi neutralizzarle con la stessa quantità di FBS al 10%. Raccogliere la sospensione cellulare per centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
2. Colorazione O rosso olio
- Aggiungere 800 μL di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e DMEM in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti contenente vetrini di copertura. Prelevare 50 μL della sospensione cellulare (ottenuta al punto 1.3) e aggiungerli a 950 μL di PBS per miscelare. Utilizzare una camera di conteggio delle celle per calcolare il numero di celle per millilitro, quindi calcolare la concentrazione della sospensione cellulare di cui sopra. Infine, regolare la concentrazione cellulare a 4 x 104/mL in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
- Dopo 24 ore, scartare il terreno di coltura e lavare con PBS. Sospendere con 800 μL di terreno di induzione DMEM contenente 1 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA).
- Sciogliere un totale di 100 μL di LA (vedi Tabella dei materiali) in 900 μL di etanolo anidro e preparare una soluzione standard (100 mmol/L). Aggiungere un gradiente di 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L e 200 μmol/L LA nella piastra a 24 pozzetti. Ripetere ogni trattamento quattro volte. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
- Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS tre volte. Fissare con 400 μL di paraformaldeide al 4% per 20 min. Scartare la soluzione fissativa e lavarla con PBS tre volte.
- Incubare le cellule con alcool isopropilico al 60% per 5 minuti, quindi scartarlo. Aggiungere la soluzione di lavoro rosso olio O appena preparata (vedere la tabella dei materiali) (rapporto 3:2 di olio rosso O:acqua) per 20-30 minuti ed eliminare la soluzione colorante. Lavare le cellule con PBS da due a cinque volte fino a quando non c'è soluzione colorante in eccesso.
- Aggiungere 300 μL di soluzione colorante di ematossilina (rapporto ematossilina:acqua di 1:10) e ricolorare il nucleo per 1-2 minuti. Scartare la soluzione colorante e lavare le cellule con PBS da due a cinque volte. Estrarre i vetrini di vetro dalla piastra a 24 pozzetti e posizionarli su vetrini microscopici (il lato con le celle rivolte verso il basso) dopo aver lasciato cadere 10 μL di sigillante per compresse (vedere Tabella dei materiali) sul vetrino.
- Dopo la sigillatura, osservare e visualizzare i LD delle cellule sotto la lente dell'olio del microscopio ottico (vedi Tabella dei materiali). Misurare il diametro dei LD con il software cellSens e analizzare il numero e la dimensione dei LD.
3. Misurazione delle dimensioni e del numero di LD
- Acquisizione di immagini: accendere successivamente l'interruttore del computer e del microscopio, posizionare il vetrino sulla piattaforma di carico, aprire il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) e collegare il computer per visualizzare l'immagine.
- Trova le immagini a bassa potenza e gocciola una quantità appropriata di olio di cedro sul vetrino di imaging. Regolare il fattore di osservazione a 100x, impostare l'esposizione automatica e acquisire le immagini regolando il campo visivo appropriato. Selezionare tre diapositive di celle colorate per ciascun gruppo per l'imaging.
- Misurazione del diametro: selezionare casualmente 60 LD per ogni immagine per misurare i diametri. Dopo la misurazione di ciascuna immagine, salvare le immagini e inviare i risultati della misurazione in una tabella per la successiva analisi delle dimensioni medie e del rapporto di distribuzione dei LD.
- Misurazione della quantità: selezionare tre immagini per ogni diapositiva macchiata e fotografata e selezionare casualmente tre celle per la misurazione della quantità in ogni immagine. Contare e analizzare il numero di LD intorno alla cella e calcolare il numero medio di LD nella cella.
4. Osservazione dinamica della fusione LD
- Seguire le fasi della coltura cellulare come indicato nei passaggi 1.1-1.3. Quando le cellule crescono fino all'80%, scartare il terreno e risciacquare con PBS, quindi digerirle con 750 μL di tripsina per 3 minuti. Quindi, aggiungere 750 μL del mezzo, centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Sospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura, contare e regolare la concentrazione cellulare a 5 x 105 cellule/ml in un piatto da 35 mm. Coltura a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
- Quando le cellule sono cresciute fino all'80%, cambiare il terreno in DMEM + 150 μmol / L LA per 24 ore e continuare la coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per accumulare le LD.
- Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule aderenti con PBS e incubarle con una sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 da 10 μg/mL (vedi Tabella dei materiali) al buio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule nel piatto di coltura con PBS tre volte e aggiungere DMEM + 150 μmol / L LA.
NOTA: Evitare l'esposizione alla luce durante e dopo la colorazione BODIPY da 10 μg/ml; 1 mg/mL BODIPY è stato diluito con PBS (1:100). - Posizionare il piatto di coltura nella scanalatura del microscopio della stazione cellulare vivente (vedi Tabella dei materiali) per osservare i cambiamenti dinamici dei LD. Accendere l'alimentazione della postazione di lavoro della cellula vivente in base alla sequenza iniziale ed evitare la luce.
- Accendere l'alimentazione, la sorgente luminosa di trasmissione, la fonte di alimentazione del microscopio, la sorgente luminosa fluorescente della lampada al mercurio, la fonte di alimentazione della fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD), la fonte di alimentazione dell'host del computer, la valvola CO 2 e l'incubatore di CO2.
- Aggiungere acqua distillata alla scanalatura sulla piattaforma di carico, assicurandosi di non andare oltre la presa d'aria.
- Accendi il computer ed esegui "NIS-Elements". Innanzitutto, trova il campo visivo appropriato sull'obiettivo 4x, quindi regolalo successivamente sull'obiettivo 40x. Selezionare E100 per osservare il campione al microscopio e L100 per visualizzare in anteprima e fotografare il campione sul computer.
NOTA: E100 e L100 sono pulsanti di regolazione del microscopio sulla postazione di lavoro della cella vivente (vedere la tabella dei materiali), che rappresentano rispettivamente l'oculare e lo schermo del computer. - Progettare i parametri come il canale di fluorescenza (ad esempio, Ph-40x, isotiocianato di fluoresceina [FITC], otturatore) e il tempo di ripresa previsto per l'esperimento. Impostare il tempo di scatto in tempo, incluso il tempo di intervallo di ripresa di 5 minuti tra ogni due immagini e un tempo di ripresa totale di 6 ore.
NOTA: le riprese a lungo termine devono utilizzare la funzione di stabilizzazione della messa a fuoco PFS (Perfect Focus System). Per questo, prima regola il campo visivo e la lunghezza della messa a fuoco, quindi fai clic su PFS sullo schermo del computer e infine regola la spirale di messa a fuoco fine. - Selezionare diverse modalità di canale, canale singolo o tutto, selezionare un campo visivo diverso, fare clic sull'anteprima, regolare il campo visivo, impostare questi parametri e fare clic su Avvia corsa per avviare le riprese. Fai un colpo di prova per 5 minuti prima; Può richiedere molto tempo dopo che l'operazione è normale.
- Dopo aver eseguito le riprese, scegli File > Salva come > Salva tipo > formato avi per esportare i dati in un video in formato 'avi'. Utilizzare il formato immagine '.nd2' per salvare il programma dati ed esportare le foto.
- Per spegnere la macchina, spegnerla in ordine inverso.
5. Statistiche e analisi dei risultati
- Analizza i dati utilizzando ANOVA unidirezionale. Segnala i risultati come media ± errore standard.
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Representative Results
La colorazione delle LD cellulari è mostrata nella Figura 1. I punti rossi riflettono i LD delle cellule e i punti blu riflettono i nuclei. Si può vedere che le dimensioni e il numero di LD in ciascuna immagine sono diversi sotto il trattamento di LA.
Con l'aumento del dosaggio di LA, il diametro medio e il numero di LD hanno mostrato una tendenza significativamente in aumento, a seconda della concentrazione di LA (Figura 2). Come mostrato nella Figura 2A, il numero di LD per cellula era negativamente correlato con diverse concentrazioni di LA. Il numero mediano di LD per cellula è stato di 136 per il gruppo trattato con 100 μmol/L LA, diminuendo a 118 e 105 per i gruppi trattati con 150 μmol/L e 200 μmol/L LA, rispettivamente. Il diametro medio delle LD nel gruppo di controllo era di 0,72 μm, 1,38 μm per il gruppo trattato con 100 μmol/L LA, 1,51 μm per il gruppo trattato con 150 μmol/L LA e 1,64 μm per il gruppo trattato con 200 μmol/L LA (Figura 2B).
In questo studio, i LD con un diametro <1 μm sono stati definiti piccoli e i LD con un diametro >4 μm sono stati definiti grandi. Si è constatato che anche le proporzioni di distribuzione delle LD cambiavano con la concentrazione di LA, come mostrato nella figura 3; la percentuale di piccole LD è diminuita e la percentuale di grandi LD è aumentata. La percentuale di LD di piccolo diametro era del 43,33% a 100 μmol/L LA, del 36,43% a 150 μmol/L LA e del 29,8% a 200 μmol/L LA. Per LD di grande diametro, la percentuale più alta è stata del 6,11% in 200 μmol / L LA, quindi 3,15% e 1,48% in 150 e 100 μmol / L LA, rispettivamente. Nel gruppo 200 μmol/L LA, sono stati ovviamente osservati LD super grandi (diametro >5 μm), che rappresentano circa il 6,30%, superiori ai gruppi 100 μmol/L LA (5,93%) e 150 μmol/L LA (4,82%). I risultati hanno indicato che un'alta concentrazione di LA ha aumentato le dimensioni delle LD e diminuito il numero di LD. Nel frattempo, la proporzione di grandi LD è aumentata e la proporzione di piccole LD è diminuita.
Le LD di grandi dimensioni si sono generalmente formate attraverso la fusione di piccole LD. La fusione LD attraverso l'imaging di cellule vive è stata osservata per dimostrarlo (Figura 4). Le cellule sono state trattate con 150 μmol/L LA per 24 ore e colorate con BODIPY. Nella normale condizione di crescita cellulare a 37 °C e 5% di CO2, le cellule sono state osservate continuamente per 6 ore con una workstation di cellule vive. Le immagini sono state catturate ogni 5 minuti. Come mostrato nella Figura 4, nei primi 15 minuti, c'erano ancora evidenti LD più piccoli. Quindi, i LD hanno iniziato lentamente a fondersi da 20 minuti e sono stati completamente fusi in LD più grandi di 35 minuti.
Figura 1: Goccioline lipidiche. Cellule di epatociti coltivate in diverse concentrazioni di LA e colorate con olio rosso O. I punti rossi riflettevano LD macchiati di rosso olio e i punti blu-viola riflettevano il nucleo con ematossilina. Sono stati selezionati tre vetrini per la colorazione e l'imaging in ogni trattamento. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Numero e dimensione dei LD. Cellule di epatociti coltivate in un gradiente di concentrazione da 0 a 200 μmol/L LA e colorate con O. (A) Numero medio di LD per cellula. Il numero di LD in 27 cellule è stato contato in ciascun gruppo. (B) Il diametro medio delle LD in una cella. La dimensione di 60 LD è stata contata in ciascun gruppo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Proporzione LD. Cellule di epatociti coltivate in diverse concentrazioni di LA e colorate con O rosso olio. È stato calcolato il rapporto proporzionale di LD di diverse dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Fusione LD. Le cellule degli epatociti sono state coltivate con 150 μmol/L LA e incubate con la sonda BODIPY 493/503. Dopo un'osservazione continua per 6 ore sotto un'immagine con ingrandimento 40x, sono stati fotografati i LD sotto la fluorescenza e i campi luminosi. Le immagini sono state catturate ogni 5 minuti. La fusione era contrassegnata con scatole rosse. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
A seconda degli stati patologici, le LD epatiche subiscono enormi cambiamenti nelle loro dimensioni e numero. Le LD sono ampiamente presenti nelle cellule degli epatociti e svolgono un ruolo chiave nella salute e nella malattia del fegato18. La quantità e la dimensione delle LD sono alla base delle attuali ricerche sulla biogenesi delle LD19. La dimensione e il numero di LD per cellule e tessuti riflettono la loro capacità di immagazzinare e rilasciare energia. I cambiamenti dinamici delle LD mantengono la stabilità delle attività metaboliche lipidiche20,21. Un accumulo anormale di LD si verifica in varie condizioni patologiche e può essere un indicatore di malattia metabolica22,23. Questo protocollo fornisce un metodo accurato per misurare la dimensione e la quantità di LD in un modello di cellule epatocitarie indotte da acidi grassi e osservare la fusione delle LD in modo più efficiente e intuitivo.
Studiare le dimensioni e i cambiamenti dinamici delle LD è di grande importanza per comprendere l'insorgenza di malattie legate ai disturbi del metabolismo lipidico e un intervento efficace. In questo esperimento, i passaggi chiave sono stati la misurazione e l'analisi delle dimensioni e della quantità di LD. In primo luogo, sono state utilizzate diverse concentrazioni di LA per indurre l'accumulo di LD negli epatociti. Altri acidi grassi, come oleato e palmitato, potrebbero anche essere usati per causare l'accumulo di LD nelle cellule degli epatociti24,25. Dopo il trattamento con diverse concentrazioni di LA, è stato riscontrato che la dimensione delle LD è aumentata in modo dose-dipendente. Questi risultati hanno indicato che la colorazione O rosso olio misurava accuratamente il diametro delle LD. Si è anche scoperto che un'alta concentrazione di LA potrebbe aumentare la percentuale di LD di grandi dimensioni, suggerendo che i piccoli LD si sono fusi rapidamente tra loro. La fusione rapida è uno dei cambiamenti dinamici nelle LD; La fusione rapida LD può avvenire in pochi minuti o anche decine di secondi ed è principalmente mediata dai suoi fosfolipidi superficiali e dalla proteina22,26. Nel presente studio, la fusione LD è stata chiaramente osservata da 20 minuti a 35 minuti utilizzando la marcatura BODIPY 493/503 da una workstation di cellule viventi. L'intervallo di ripresa tra le immagini può essere impostato in pochi secondi o minuti e il tempo di ripresa totale può essere impostato da 1 ora a diversi giorni, il che offre praticità per osservare i cambiamenti dinamici dei LD in celle diverse.
In termini di analisi della colorazione delle dimensioni delle LD, la colorazione O rosso olio è più conveniente ed economica della colorazione fluorescente ed è più ampiamente utilizzata per misurare la dimensione apparente delle LD9. Non ha bisogno di essere trattato contro la luce. Inoltre, i requisiti delle apparecchiature non sono difficili da raggiungere e la lente dell'olio di un normale microscopio ottico può essere utilizzata per l'osservazione fotografica. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono selezionare diversi gruppi di immagini per misurare casualmente le dimensioni e la quantità di LD; È semplice e comodo da usare e può aumentare la dimensione del campione e ridurre l'errore. Inoltre, in base alla dimensione LD misurata e analizzata, il rapporto di distribuzione delle diverse dimensioni LD può essere osservato direttamente. L'analisi statistica può essere effettuata con il metodo sopra dopo la colorazione O rosso olio, e questo metodo può essere applicato anche ad altre cellule, compresa una vasta gamma di cellule colpite dall'accumulo lipidico. Nella fase iniziale della tintura, si è scoperto che il rosso olio O non era facile da pulire dopo la tintura e c'erano notevoli residui di colorante. Nella fase successiva, il colorante è stato filtrato e il tempo di tintura appropriato è stato selezionato attraverso test continui. Dopo la tintura, aumentare i tempi di pulizia potrebbe evitare il problema di cui sopra.
Il colorante fluorescente BODIPY 493/503 è una delle sonde più comuni per la visualizzazione LD27. In questo studio, la fusione LD è stata eseguita etichettando il verde LD con BODIPY e osservando il processo con una workstation di cellule viventi. Il rosso del Nilo è anche un colorante fluorescente comunemente usato per i lipidi neutri, ma la sua ampia banda di eccitazione (450-560 nm), la colorazione non specifica, la scarsa permeabilità dei tessuti e altre carenze possono influenzare i risultati della colorazione LD in una certa misura. Rispetto alla colorazione a fluorescenza rosso Nilo, la banda di eccitazione di BODIPY 493/503 era più stretta (460-490 nm) e poteva essere co-etichettata con vari coloranti fluorescenti11. In secondo luogo, BODIPY evita efficacemente l'interferenza dei pigmenti vegetali28. Infine, BODIPY ha una forte permeabilità tissutale, bassa sensibilità alla polarità ambientale e non è facile estinguere12; pertanto, è ampiamente usato nella colorazione a fluorescenza dei LD. Tuttavia, l'analisi della fusione LD ha alcune limitazioni. Al fine di ottenere un'immagine di osservazione continua delle cellule viventi, la lente non può essere spostata, quindi solo una fusione LD locale può essere osservata nella visione e l'efficienza di fusione LD dell'intera cellula non può essere analizzata in modo più accurato.
In conclusione, questo studio fornisce un metodo semplice e riproducibile per l'analisi della morfologia e delle dimensioni della LD, che può essere ampiamente applicato all'analisi LD nello studio del metabolismo lipidico cellulare. Questo lavoro ha anche dimostrato il processo di fusione dei LD, gettando le basi per ulteriori studi sui LD in futuro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
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