Summary
Данный протокол описывает процедуру редактирования генома макрофагов костного мозга мышей с использованием рибонуклеопротеидных комплексов Cas9-sgRNA, собранных in vitro и доставленных методом электропорации.
Abstract
Макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM) мышей, являются ключевым инструментом для изучения сложной биологии тканевых макрофагов. Будучи первичными клетками, они моделируют физиологию макрофагов in vivo более точно, чем иммортализированные клеточные линии макрофагов, и могут быть получены от мышей, уже несущих определенные генетические изменения. Тем не менее, нарушение функции генов в БМДМ остается технически сложной задачей. Здесь мы предлагаем протокол для эффективного редактирования генома CRISPR/Cas9 в BMDM, который позволяет вводить небольшие вставки и делеции (индели), которые приводят к мутациям со сдвигом фрейма, нарушающим функцию гена. Протокол описывает, как синтезировать однонаправляющие РНК (sgRNA-Cas9) и образовывать очищенные рибонуклеопротеидные комплексы (RNP) sgRNA-Cas9, которые могут быть доставлены с помощью электропорации. Он также предоставляет эффективный метод контроля эффективности редактирования с использованием рутинного секвенирования по Сэнгеру и свободно доступной онлайн-программы анализа. Протокол может быть выполнен в течение 1 недели и не требует построения плазмиды; Обычно это приводит к эффективности редактирования от 85% до 95%.
Introduction
Макрофаги являются клетками врожденного иммунитета, которые играют важнейшую роль в восстановлении тканей и иммунитете 1,2. Иммортализированные клеточные линии макрофагов, такие как мышиные клетки RAW 264.7 или клетки THP-1 человека, обладают несколькими полезными характеристиками, включая устойчивый рост и легкость разрушения генов за счет доставки векторов для РНК-интерференции или CRISPR/Cas9 3,4. Однако онкогенная трансформация резко изменяет их физиологию, что приводит к аберрантной активации одних путей и приглушенным реакциям других 5,6. Первичные макрофаги костного мозга (БМДМ) более точно повторяют физиологию макрофагов in vivo, но по-прежнему трудно поддаются генетическим манипуляциям из-за низкой эффективности как трансфекции плазмид, так и вирусной трансдукции в этих первичных иммунных клетках 7,8. Таким образом, необходимы более эффективные методы нарушения функции генов.
Редактирование генома CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для генетических манипуляций в ряде биологических систем, включая клетки млекопитающих 9,10,11,12. Белок Streptococcus pyogenes Cas9 эффективно и специфически расщепляет двухцепочечную ДНК в комплексе с последовательно-специфичной направляющей РНК. Репарация ДНК через негомологичное концевое соединение (NHEJ) расщепленной ДНК приводит к небольшим вставкам или делециям (индел), которые создают мутации со сдвигом фрейма. В ранних исследованиях Cas9 и sgРНК доставлялись через плазмидные или лентивирусные векторы, которые являются эффективными методами доставки для многих клеточных линий 9,10. Однако первичные клетки и, в частности, первичные иммунные клетки часто невосприимчивы к этим методам из-за низкой эффективности доставки векторов путем трансфекции или трансдукции. Впоследствии были разработаны методы получения комплексов sgRNA-Cas9 in vitro и их доставки с помощью электропорации, и эти методы достигли высокой эффективности в различных типах клеток13,14. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данного подхода для редактирования генома первичных макрофагов.
В данной работе мы приводим протокол использования рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП) sgRNA-Cas9 для редактирования генома в первичных МПДМ. Он содержит шаги по смягчению активации иммунных сенсоров, присутствующих в первичных иммунных клетках, и приводит к редактированию до 95% в целевых локусах с минимальной токсичностью. Этот протокол также включает в себя рабочие процессы для оценки эффективности редактирования с использованием рутинной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру с последующим анализом in silico с помощью Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, хорошо проверенного программного онлайн-инструмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дизайн сгРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается выбор последовательностей-мишеней и дизайн сгРНК. Полезно разрабатывать направляющие, которые находятся в первом крупном кодирующем экзоне, чтобы любой транслируемый белок был нарушен на ранней стадии открытой рамки считывания. Также полезно выбирать целевые последовательности, лежащие в пределах одного экзона, так как это упростит анализ эффективности редактирования (шаг 6). В примерах редактирования генома, предоставленных с помощью этого протокола, использовались sgRNA, нацеленные на первый экзон гена Src и ген Cblb , а также в некодирующий локус Rosa26 генома мыши.
- Определите 20 нуклеотидных геномных последовательностей для таргетирования, используя один из нескольких бесплатных онлайн-инструментов проектирования (Таблица 1). Выберите четыре-пять проводников, которые не перекрываются в пределах каждого гена, так как активность Cas9 варьируется в зависимости от конкретного выбранного проводника, и априорное предсказание высокоактивного гида невозможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно обеспечить правильную ориентацию направляющей относительно последовательности целевого локуса. Инструменты проектирования обычно обеспечивают направляющую последовательность в ориентации от 5 до 3 футов, независимо от того, на какую хромосомную цепь направлена. Чтобы проверить ориентацию цепи, убедитесь, что существует последовательность протоспейсерного смежного мотива (PAM) для S. pyogenes Cas9 (nGG) непосредственно через 3' от целевой геномной последовательности. Последовательность sgRNA не включает PAM.
2. синтез сгРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается, как синтезировать sgRNA с помощью ПЦР для создания матрицы для транскрипции in vitro (IVT), а затем очищать sgRNA с помощью спиновых колонок (рис. 1A). Специализированные синтетические сгРНК коммерчески доступны у нескольких поставщиков в качестве альтернативы ПЦР/ТВТ.
- Проведите ПЦР для получения матрицы ИВТ для РНК-полимеразы Т7. В реакции ПЦР используются универсальные праймеры, содержащие промотор РНК-полимеразы Т7 и трансактивирующую последовательность CRISPR РНК (tracrRNA) (табл. 2), а также короткие индивидуальные праймеры с ген-специфической направляющей последовательностью.
- Это шаг расширения без усиления перекрытия. Разбавьте ПЦР-буфер до 1x и добавьте дополнительно 1 мМ MgCl2. Затем добавляют 0,25 мкл высокоточной ДНК-полимеразы, 0,5 мМ дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТП), 0,02 мМ праймера, специфичного для гида, и 0,02 мМ универсального праймера обратной длины Т7 (табл. 2) до общего объема 46 мкл. Затем поместите трубку в амплификатор и выполните два цикла: 95 °C в течение 15 с, 37 °C в течение 15 с и 72 °C в течение 15 с. Охладите реакции на льду.
- Это этап амплификации ПЦР. К каждой реакции добавляют 2 мкл праймера прямого усиления 25 мМ и 2 мкл праймера с обратной амплификацией 25 мМ. Конечный объем реакции составляет 50 мкл. Денатурация в течение 30 с при 95 °C. Затем выполните 35 циклов: 95 °C в течение 15 с, 65 °C в течение 20 с и 72 °C в течение 15 с. Выполните дополнительное вытягивание при 72 °C в течение 2 мин.
- Проверяют продукт реакции ПЦР на 2% агарозном геле. В результате ПЦР с перекрывающимся расширением получается молекула дцДНК длиной 127.н. с промотором Т7 перед геноспецифическим 20-нуклеотидным гидом и тракрРНК непосредственно вниз по течению (рис. 1B).
- Очистка шаблонов IVT: Существует множество протоколов и наборов, которые хорошо подходят для этого. В этом протоколе используются твердофазные обратимые гранулы иммобилизации (SPRI). Смешайте 50 мкл ПЦР-продукта с 90 мкл гранул и следуйте инструкциям производителя. Элюируют ДНК, добавляя 40 мкл буфера (5 мМ Tris, 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]) и нагревают при 65 °C в течение 5 мин.
- Измерьте концентрацию ДНК матрицы ИВТ с помощью поглощения на длине волны 260 нм. Для ТВТ необходима концентрация ДНК не менее 50 нг/мкл. Шаблон ИВТ можно хранить при температуре -20 °C.
- Реакция ИВТ
- Используйте коммерческий набор, предназначенный для получения высоких выходов ИВТ (см. таблицу материалов). Следуйте рекомендациям производителя по проведению реакции ТВТ. Используя 250 нг матрицы ИВТ в реакции 20 мкл, инкубируют при 37 °C в течение 4-16 ч.
- Проверяют продукт сгРНК IVT, запуская 1 мкл реакции на 2% агарозном геле. Следует наблюдать яркую полосу РНК, аналогичную 70.н. дцДНК (рис. 1C). Хотя это и не обязательно, для получения четких и более разрешенных полос используйте буфер для образца РНК с мочевиной и денатурируйте образец при 65 °C в течение 5 минут перед загрузкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слабые полосы с более высокой молекулярной массой и небольшие различия в миграции могут наблюдаться с некоторыми направляющими РНК из-за различий во вторичной структуре РНК.
- Дефосфорилируйте продукт ИВТ sgRN, чтобы свести к минимуму активацию RIG-I (чужеродного РНК-сенсора) и последующую гибель клеток после электропорации. Для каждой реакции IVT объемом 20 мкл добавляют 69 мкл молекулярной воды и 15 ЕД кишечной фосфатазы (CIP) телят в 1x буфер CIP. Инкубировать в течение 2 ч при 37 °C.
- Деградируйте матрицу IVT, чтобы свести к минимуму активацию клеточных датчиков ДНК, которые вызывают гибель клеток после электропорации. К каждой реакции ТВТ добавляют 2 ЕД РНКазы, свободной от РНКазы. Выдерживать 15 мин при температуре 37 °C. Продукт ИВТ можно хранить при температуре -20 °C в течение 1 дня или -80 °C в течение нескольких месяцев.
- Очистите продукт ИВТ с помощью центрифузов. Для этого шага наборы для очистки шариков SPRI уступают.
- Свяжите РНК со столбиком, добавив 220 мкл связывающего буфера к продукту IVT, а затем 1 мл 100% молекулярно-биологического этанола. Хорошо перемешайте и загрузите колонну. После этого следуйте инструкциям производителя. Окончательную промывку выполняйте в шкафу биобезопасности с ламинарным потоком, чтобы избежать загрязнения сгРНК.
- Выполняйте элюирование в ламинарном колпаке, чтобы избежать загрязнения. Элюируют РНК с помощью 30 мкл стерильного 10-мМ буфера Tris (pH 8,0).
- Измерьте концентрацию sgRNA, измерив поглощение на длине волны 260 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный выход сгРНК составляет не менее 100 мкг. - Храните sgRNA при температуре -80 °C. Делайте аликвоты, чтобы избежать более трех циклов замораживания-оттаивания.
3. Подготовка к электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы следует выполнять в ламинарном вытяжном шкафу, чтобы избежать загрязнения. В этом протоколе используется коммерчески доступная система электропорации (см. таблицу материалов) с наконечниками на 10 мкл.
- Разморозьте БМДМ за 48-72 ч до использования и разложите их на планшетах, обработанных нетканевой культурой (ТС).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной реакции необходимо 4 x 105 клеток. - Стерилизуйте пробирки для ПЦР для реакционной сборки. Приготовьте одну ПЦР-пробирку для каждой реакции и нагрейте их в амплификаторе в течение 10 минут при температуре 98 °C. Подготовьте пробирки порциями и храните их закрытыми. Поместите стерилизованные пробирки для ПЦР на лед, когда они будут готовы к использованию.
- Очистите дозаторную станцию 70% этиловым спиртом и поместите ее в ламинарный колпак. Установите параметры на 1 900 В, 20 мс и один импульс.
- Осторожно извлеките трансфекционную трубку из упаковки, чтобы она оставалась стерильной, и наполните ее 3 мл буфера «Е». Перед электропорацией убедитесь, что буфер E имеет комнатную температуру. Вставьте трубку в станцию и надавите на нее до щелчка.
- Для каждой реакции аликвотируют 2,5 мкл sgRNA в концентрации 1,100 нг/мкл. Разбавляют sgRNA в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,9 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Оставьте его на льду.
- Подготовьте две планшеты: 12-луночную непокрытую пластину для клеток и дополнительную 24-луночную планшет для хранения питательной среды. Аликвота 1,5 мл среды, не содержащей антибиотиков, на реакцию в лунки 24-луночного планшета.
- Приготовьте белок Cas9. Существует несколько коммерческих и академических поставщиков стерильно-очищенного белка Cas9. Разбавьте Cas9 до конечной концентрации 20 мкМ холодным PBS + Ca/Mg. Для каждой реакции электропорации в стерильные ПЦР-пробирки вводят 1 мкл 20 мкМ Cas9. Оставить на льду.
- Подготовьте клетки к электропорации.
- Удалите питательную среду. Промойте клетки с помощью PBS без CaCl2 и MgCl2 (PBS-Ca/Mg), чтобы удалить сывороточные и двухвалентные катионы, способствующие адгезии. Затем добавьте PBS + 1 мМ ЭДТА и инкубируйте при комнатной температуре около 5 минут, пока клетки не начнут отделяться.
- Осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить клетки. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл с низким уровнем связывания с белками. Гранулируйте клетки при 500 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаги прилипают к пластиковой посуде. Использование центрифужных пробирок с низким связыванием с белками значительно повышает выход клеток. - Работайте быстро, чтобы избежать длительной инкубации клеток в PBS + EDTA. Удалите большую часть надосадочной жидкости, оставив в пробирке около 1 мл надосадочной жидкости. Ресуспендируйте клетки в оставшейся надосадочной жидкости, а затем переложите в пробирку с микрофуге объемом 1,5 мл с низким связыванием с белками.
- Удалите маленькую аликвоту ячеек для подсчета. Гранулируйте оставшиеся клетки центрифугированием при 500 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Во время центрифугирования подсчитайте клетки и нагрейте пробирки с Cas9 и sgRNA до комнатной температуры.
- Удалите всю надосадочную жидкость из гранулы ячейки. Ресуспендируйте клетки в PBS + Ca/Mg в концентрации 4 x 107 клеток/мл (4 x 105 клеток на реакцию 10 мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый комплект поставляется с ограниченным количеством электропорационного буфера (буфер R, буфер T). Тем не менее, мы обнаружили, что эффективность электропорации с использованием PBS + Ca/Mg эквивалентна запатентованным буферам. - При электропорации sgRNA для разных генов аликвотируйте клетки в разные пробирки с низким уровнем связывания с белками для каждого гена, чтобы избежать перекрестной контаминации между sgRNA. Держите клетки при комнатной температуре до тех пор, пока не будете готовы к электропорации.
4. Сборка РНП
- Храните sgRNA и Cas9 при комнатной температуре, чтобы избежать выпадения осадка. Добавьте 2,5 мкл sgRNA к 1 мкл разбавленного Cas9 в стерилизованных ПЦР-пробирках. Медленно дозируйте sgRNA в течение 15 с, перемешивая, чтобы предотвратить выпадение осадка.
- Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплекса RNP.
5. Доставка РНП методом электропорации
- Подготовьте электропорационный наконечник (кювету). Нажмите на поршень, чтобы удлинить шток. Вставьте стержень в наконечник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что наконечник надежно закреплен и что поршень плавно скользит и выходит за пределы оболочки наконечника. Если наконечник расположен неправильно, в него могут попасть пузырьки воздуха, что приведет к выходу наконечника из строя. - Ресуспендируйте ячейки, пипетируя вверх и вниз, а затем загрузите ячейками наконечник для электропорации. Извлеките всю объемную емкость наконечника в 10 мкл, избегая пузырьков.
- Начиная с отрицательной контрольной сгРНК, перенесите 10 мкл клеток из электропорационного наконечника в пробирку с образцом, содержащую 3,5 мкл РНП с шага 4. Пипеткой вверх и вниз три раза, чтобы хорошо перемешать. Наберите 10 мкл смеси обратно в наконечник, убедившись, что на нем нет пузырьков.
- Поместите наконечник в электропорационную станцию, опустив его в буфер. Избегайте контакта наконечником с пластиковыми поверхностями, чтобы сохранить стерильность. Нажмите кнопку Старт на сенсорном дисплее.
- После завершения на дисплее отобразится успешный пульс. Извлеките пипетку из прибора и поместите ячейки в сухую лунку 12-луночной пластины без покрытия с этикеткой.
- Промойте наконечник пипеткой вверх и вниз дважды в 15 мл PBS + Ca/Mg. Отложите пипетку с прикрепленным наконечником. Следите за тем, чтобы наконечник ни к чему не касался и оставался стерильным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во многих экспериментах возможно повторное использование наконечника для нескольких образцов, например, после неактивного отрицательного контрольного образца sgRNA или во время первоначальной оценки активности направляющей, когда тестируется от четырех до пяти sgRNA для каждого гена, и единственным считыванием является эффективность редактирования. Тем не менее, во время функционального анализа на отредактированных клетках для каждого гена рекомендуется использовать новый наконечник, так как небольшое количество sgRNA или клеточного переноса может повлиять на результаты эксперимента. - Немедленно добавьте 1 мл среды, не содержащей антибиотиков (аликвотированной на шаге 3.6) к клеткам и осторожно встряхните планшет, чтобы перемешать.
- Повторите шаги 5.2-5.6 для остальных реакций.
- Верните клетки в инкубатор.
- Проверяют жизнеспособность клеток через 1-2 ч после электропорации. Клетки должны быть на >90% адгезивными. Дополнительно: Добавьте гентамицин (5 мкг/мл) в клетки через 1-2 часа после электропорации, чтобы предотвратить контаминацию, если это не помешает последующим экспериментам.
6. Оценка эффективности редактирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая часть редактирования завершается через 48 часов.
- Проверяют монослой ячейки через 48 ч после электропорации. Если ячейки сливаются более чем на 50%, то действуйте дальше. Если ячейки сливаются <50%, подождите еще 1-2 дня. Для анализа геномной ДНК для определения эффективности редактирования требуется 1 x 105 клеток, в дополнение к клеткам, необходимым для последующего эксперимента.
- Подготовьте геномную ДНК (гДНК).
- Промойте клетки PBS (-Ca/Mg). Добавьте 1 мл PBS + 1 мМ ЭДТА. Инкубируйте при комнатной температуре около 5 мин, пока клетки не начнут отделяться от пластины.
- Отделите ячейки пипеткой. Переложите в пробирку с низким уровнем связывания белка с микрофьюгом.
- Подсчитайте ячейки и удалите кратно 1 х 105 ячеек. Оставшиеся клетки могут быть повторно покрыты для использования в дальнейших экспериментах. Как правило, эксперименты проводятся через 5 дней после электропорации, чтобы предотвратить распад белка.
- Гранулируйте клетки для анализа гДНК в течение 15 с на максимальной скорости в пробирку микрофуги.
- Ресуспендируйте гранулу в 50 мкл лизисного буфера. Вихрь, чтобы отделить любые клетки, прилипшие к стенкам пробирки, и нагревать при 98 °C в течение 10 минут, чтобы лизировать клетки и инактивировать эндогенную ДНКазу.
- Положите трубочки на лед.
- Добавьте 1 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Инкубировать не менее 1 ч при 37 °C; Для удобства его можно оставить на ночь.
- Нагревают до 98 °C в течение 10 мин до инактивации протеиназы К.
- Центрифуга при комнатной температуре в течение 5 мин на максимальной скорости. Удалите надосадочную жидкость, в которой содержится ДНК. Этот сырой препарат без дополнительной очистки хорошо подходит для большинства реакций ПЦР.
- Оцените эффективность редактирования с помощью секвенирования по Сэнгеру.
- Проектируйте праймеры для ПЦР на 200-300.о. выше по течению от самых 5' направляющих участков и на 200-300.о. ниже по течению от самых 3' направляющих сайтов. Типичный размер ампликона ~500.н. Спроектируйте вложенный праймер секвенирования на расстоянии не менее 125.н. от ближайшего направляющего участка (рис. 2A).
- Проводят ПЦР с использованием 2 мкл гДНК.
- Подготовьте ПЦР-продукт для секвенирования. В этом протоколе используется лечение щелочной фосфатазой (ExoI/SAP) экзонуклеазой I/креветок. Коммерческие наборы для очистки ДНК также работают, но требуют больше ручного времени.
- Приготовьте 15 мкл препарата для ПЦР. Добавьте 7,5 мкл воды, 1 мкл 10-кратного буфера ExoI, 10 ЕД ExoI и 1 ЕД SAP, чтобы разрушить dNTP и праймеры, которые мешают секвенированию по Сэнгеру.
- Инкубируют при 37 °C в течение 30 мин, затем при 85 °C в течение 20 мин для деактивации ферментов.
- Провести секвенирование по Сэнгеру на продукте ПЦР, обработанном Exo/SAP; использовать известное количество маркера размера ДНК для оценки размера продукта ПЦР, присутствующего в образце. Реакции секвенирования могут потребовать оптимизации, так как программному обеспечению TIDE требуются высококачественные хроматограммы последовательностей для точной оценки эффективности редактирования. Хроматограмма последовательности для неотредактированного локуса должна давать четкие пики с минимальным фоном (рис. 2B, C).
- Чтобы оценить эффективность редактирования, используйте TIDE для анализа файлов хроматограмм секвенирования по Сэнгеру с использованием отредактированной гДНК и неотредактированной контрольной гДНК. (Таблица 1, Рисунок 2). Загрузите файлы секвенирования по Сэнгеру и запустите программное обеспечение с настройками по умолчанию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаблон ИВТ представляет собой ПЦР-продукт с дозировкой 127.о. (рис. 1B). Полноразмерный продукт ИВТ представляет собой 98-нт РНК, которая мигрирует аналогично двухцепочечному фрагменту ДНК длиной 70.н. (рис. 1С).
После электропорации клетки должны быть >90% жизнеспособными, с общим количеством клеток >70% от исходного количества клеток. Полученный пул мутантных клеток должен иметь разнообразный набор инделов, начинающийся вблизи сайта расщепления Cas9. Анализ генов-мишеней с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру должен показать наличие нескольких нуклеотидов в каждой позиции ниже по течению от сайта расщепления Cas9 (рис. 2).
Рисунок 1: Обзор процесса редактирования sgRNA-Cas9. (A) Схема дизайна направляющей, генерации sgRNA и доставки Cas9-sgRNA. (B) Продукт ПЦР от IVT для Src sgRNAs 1, 2 и 3, разрешенных на 2% агарозном геле. Стрелка указывает на правильные продукты ПЦР с 127.н. (C) Продукты РНК после IVT для Src sgRNAs 1, 2 и 3 разрешались на 2% агарозном геле. В скобках указаны правильные продукты сгРНК. Вариабельная миграция sgRNA обусловлена вторичной структурой РНК. Этот рисунок перепечатан из первой магистерской диссертацииавтора 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Высокая эффективность редактирования, достигнутая для нескольких целевых генов. (A) Схема праймеров для секвенирования ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. (B) Схема рабочего процесса для TIDE для оценки эффективности редактирования. (C) Репрезентативная хроматограмма секвенирования по Сэнгеру локуса ROSA26 из БМДМ, электропорированная контрольной нетаргетной sgRNA-Cas9 RNP (вверху) и ROSA26-специфичной sgRNA (внизу); выделен участок спайности Cas9. Вывод TIDE (справа) с рассчитанной эффективностью редактирования и процентом последовательностей, содержащих указанное количество инделов. (Д,Э) Хроматограммы секвенирования по Сэнгеру генов (D) Src и Cblb в отредактированных BMDM. Этот рисунок перепечатан из первой магистерской диссертацииавтора 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Умеренное повышение эффективности редактирования за счет коммерческого усилителя электропорации. БМДМ были электропорированы с помощью низкоэффективных направляющих для оценки эффекта коммерческого усилителя редактирования. Перед электропорацией к собранным РНП добавляли 1 мкл энхансера до конечной концентрации 4 мкМ. Эффективность редактирования указанной Src sgRNA оценивали с помощью TIDE. Этот рисунок перепечатан из первой магистерской диссертацииавтора 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя инструмента | URL-адрес | ||
| Synthego - Инструмент для проектирования CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Институт Броуда - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Отслеживание инделов путем разложения (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Таблица 1: URL-адреса онлайн-инструментов.
| Название праймера | Последовательность | ||
| Праймер для конкретных гидов | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Праймер для конкретных гидов - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Праймер для конкретных гидов - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Праймер для гидов - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAGttttagagctagaa | ||
| Руководство по праймеру - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Праймер для конкретных гидов - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Праймер для конкретных гидов - Руководство по SRG 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Праймер для конкретных гидов - Руководство по SRG 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Обратная длинная универсальная грунтовка | АААААААГАКГГАКТАКТКГГКККкТТТТТТТКаагттгааакггактагККТТТТТТТТТТТТААКТТГКТТТТТКТААААААК | ||
| Универсальный праймер для прямого усиления | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Универсальный праймер для обратного усиления | ААААААГАКЦАКГГГГ | ||
Таблица 2: Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР для генерации матрицы для ИВТ сгРНК. 20 нуклеотидных последовательностей-мишеней для ген-специфических праймеров пишутся с заглавной буквы.
| BMDM Среда роста. Хранить при температуре 4 С. | |||
| ДМЕМ | |||
| Фетальная бычья сыворотка | 0.1 | ||
| L-глютамин | 0,2 М | ||
| Надосадочная жидкость MCSF из клеток 3T3-MCSF** | 0.1 | ||
| Пируват натрия | 11 мг/мл | ||
| Буфер лизиса. Хранить при температуре 4 С. | |||
| 2-меркаптоэтанол (добавлять непосредственно перед использованием) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 мМ | ||
| Трис | 20 мМ | ||
| Тритон-Х 100 | 0.005 | ||
| **Клетки 3T3-MCSF выращиваются в DMEM+10% FCS. Надосадочную жидкость с MCSF собирают на 5-й день после достижения 100% слияния. В качестве альтернативы можно использовать рекомбинантный MCSF 10 нг/мл вместо кондиционированной среды | |||
Таблица 3: Составы сред и буферов.
Дополнительный файл 1: Необработанный файл секвенирования для макета ROSA_ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Необработанный файл секвенирования для ROSA_TargettingGuide Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Необработанный файл секвенирования для ScrambleGuide Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Необработанный файл секвенирования для SrcG5+SrcG6 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 5: Необработанный файл секвенирования для CBLB_Mock Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 6: Необработанный файл секвенирования для CBLB_TargetingGuide Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 7: Необработанный файл секвенирования для Mock_Guide2Locus Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 8: Необработанный файл секвенирования для Mock_Guide6Locus Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 9: Необработанный файл секвенирования для SrcGuide2_Enhancer Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 10: Необработанный файл секвенирования для SrcGuide2_NoEnhance Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 11: Необработанный файл секвенирования для SrcGuide6_Enhancer Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 12: Необработанный файл секвенирования для SrcGuide6_NoEnhancer Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Редактирование генома с использованием электропорированных комплексов Cas9-sgRNA позволяет эффективно нарушать функцию генов при МПДМ. Эффективность редактирования зависит от целевой последовательности и гена. Как правило, проводится скрининг от четырех до пяти сгРНК для выявления высокоактивной. Некоторые локусы имеют более низкую эффективность редактирования, скорее всего, из-за структуры хроматина. В этих случаях можно внести несколько модификаций для повышения эффективности редактирования. Совместная доставка двух активных sgRNA к одному и тому же экзону приводит к улучшению редактирования некоторых генов. Однако, по нашим наблюдениям, при совместном использовании двух направляющих TIDE может потерять точность. Поэтому могут потребоваться альтернативные методы оценки редактирования, такие как вестерн-блоттинг. Кроме того, включение коммерчески доступного усилителя NHEJ часто повышает эффективность редактирования на ~20% (рис. 3).
Такой подход имеет ряд преимуществ. Прямая доставка sgRNA-Cas9 в клетки не требует трудоемких этапов создания плазмиды или производства лентивирусного вектора для трансдукции БМДМ. Процесс синтеза sgRNA, электропорации и генерации мутантных клеток может быть завершен за 1 неделю. Этот метод также может быть использован с BMDM, полученными от генетически модифицированных мышей, для создания клеток с двойной мутацией. Несмотря на то, что существуют химические методы трансфицирования первичных иммунных клеток миРНК или мРНК17, эти химические методы значительно менее эффективны, чем электропорация, при доставке комплексов Cas9-sgРНК к иммунным клеткам18. Существует несколько типов электропорационных устройств, доступных в продаже. Ожидается, что эти устройства будут работать аналогично при доставке комплексов Cas9-sgRNA, хотя параметры напряжения, вероятно, должны быть оптимизированы для каждого отдельного устройства. Хотя этот протокол использовался в основном на БМДМ мышей, в ограниченных экспериментах аналогичные результаты были получены с БМДМ крыс (неопубликованные данные). Возможно, что другие типы первичных макрофагов, такие как мышиные перитонеальные макрофаги или альвеолярные макрофаги, также могут быть подвержены этому подходу, хотя это еще не было проверено.
Этот метод имеет некоторые ограничения. Количество клеток, производимых по этому протоколу, несколько ограничено; Наши стандартные условия генерируют 4 x 105 ячеек за одну электропорацию. Тем не менее, можно значительно увеличить выход, так как эффективность не снижается в реакции 10 мкл с ячейками до 2,4 x 106 с использованием того же количества RNP (неопубликованные данные). Кроме того, доступны наконечники для электропорации на 100 мкл. Еще один недостаток этого метода – дороговизна; Затраты как на электропоратор, так и на расходные материалы для электропорации значительны. Эти расходы могут быть значительно снижены за счет повторного использования наконечников при использовании разных sgRNA, нацеленных на один и тот же ген, и за счет использования PBS вместо проприетарных буферов. Хотя состав проприетарных буферов неизвестен, предположительно состав электролита PBS с 0,9 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2 приближен к электропроводности запатентованного буфера. Эти изменения снижают стоимость расходных материалов примерно на 80% в этом протоколе.
В протоколе есть несколько критических шагов, отклонения от которых могут кардинально повлиять на эффективность редактирования генов. Одна из потенциальных подводных камней заключается в том, что стандартные комплекты ИВТ, которые не рассчитаны на высокую урожайность, часто производят недостаточное количество продукта ИВТ. Кроме того, использование стандартных полипропиленовых пробирок для микрофуг вместо трубок с низким связыванием может привести к значительной потере клеток из-за адгезии. Неполное дефосфорилирование продукта ИВТ и наличие остаточной ДНК в препарате sgRNA может привести к активации иммунных сенсоров макрофагов и последующей токсичности. Более высокие или более длительные импульсы напряжения также могут привести к усилению гибели клеток.
Таким образом, этот протокол редактирования генома, который использует электропорацию для доставки РНП Cas9-sgRNA, является эффективным методом разрушения генов в БМДМ мышей. Это позволяет пользователям быстро проводить скрининг фенотипов в первичных клетках, которые более точно повторяют сложную биологию макрофагов in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована грантом NIH 5R01AI144149. Схематические фигуры были созданы с помощью BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
