Summary
Detta protokoll presenterar ett optimerat bioanalyssystem för fristående blad för att utvärdera effektiviteten av entomopatogena svampar (EPF) mot senapsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), en partenogenetisk insekt. Metoden beskriver datainsamlingsprocessen under petriskålsexperiment, vilket gör det möjligt för forskare att konsekvent mäta EPF:s virulens mot senapsbladlöss och andra partenogenetiska insekter.
Abstract
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en skadegörare som angriper olika korsblommiga grödor och överför växtvirus. För att uppnå miljövänlig skadedjursbekämpning är entomopatogena svampar (EPF) potentiella mikrobiella bekämpningsmedel för att bekämpa denna skadegörare. Därför är virulensscreening av EPF-isolat under petriskålförhållanden nödvändig före fältapplicering. Senapsbladlusen är dock en partenogenetisk insekt, vilket gör det svårt att registrera data under petriskålsexperiment. Ett modifierat system för bioanalyser av fristående blad utvecklades för att ta itu med detta problem, med hjälp av en mikrospruta för att inokulera konidier på bladlöss och förhindra drunkning genom att underlätta lufttorkning efter sporsuspension. Systemet bibehöll hög relativ luftfuktighet under hela observationsperioden, och bladskivan förblev fräsch i över tio dagar, vilket möjliggjorde partenogenetisk reproduktion av bladlössen. För att förhindra ansamling av avkommor implementerades en process med daglig borttagning med hjälp av en målarpensel. Detta protokoll visar ett stabilt system för att utvärdera virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss eller andra bladlöss, vilket gör det möjligt att välja potentiella isolat för bladlusbekämpning.
Introduction
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en ökänd skadegörare som angriper en mängd olika korsblommiga grödor och orsakar betydande ekonomiska förluster1. Flera systematiska insekticider har rekommenderats för att bekämpa bladlusangrepp, men den frekventa användningen av dessa insekticider ger upphov till farhågor om resistens mot bekämpningsmedel 2,3. När det gäller miljövänligt växtskydd kan entomopatogena svampar därför fungera som en lämplig alternativ bekämpningsstrategi. EPF är en insektspatogen med förmågan att infektera värdar genom att tränga in i deras nagelband, vilket gör den till ett potent medel för att bekämpa bladlöss och andra växtsugande insekter4. Dessutom har EPF visat sig vara en genomförbar och hållbar teknik för skadedjursbekämpning, som erbjuder fördelar som antagonism mot växtpatogener och främjande av växttillväxt5.
EPF kan erhållas genom bete med insektsjord eller isoleras från insektskadaver i fält 6,7. Innan ytterligare användning av svampisolat är det dock nödvändigt att göra en screening av patogeniciteten. Flera studier har genomförts om EPF:s effektivitet mot bladlöss, som är betydande skadegörare på grödor som kan orsaka allvarliga skador 8,9. Senapsbladlöss, bland olika arter av bladlöss, har testats för känslighet för flera stammar av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., och till och med Alternaria, som främst är känd som en saprofytisk och växtpatogen svamp men har visat vissa dödliga effekter mot senapsbladlöss10,11,12.
För att utvärdera EPF:s effektivitet mot bladlöss under laboratorieförhållanden kan bioassays delas in i två huvuddelar: inokuleringskammaren och svampinokulering. Det nuvarande protokollet beskriver konstruktionen av en inokuleringskammare, där bladlöss kan underhållas med hjälp av olika metoder, t.ex. ett utskuret blad med ett bladskaft inlindat i fuktig bomull, en utskuren bladskiva med en petriskål fodrad med fuktat filterpapper, direkt underhåll på krukväxter eller en utskuren bladskiva inbäddad i vattenagar i en petriskål eller behållare10. 11,13. Vanliga metoder för svampinokulering inkluderar konidisprutning, bladlusnedsänkning i en konidisuspension, bladdoppning i en konidisuspension och ympning av växtendofyter11,14,15,16. Även om det finns olika inokuleringsmetoder bör bioassayerna simulera appliceringsförhållanden i fält. Till exempel, i fallet med bladdoppningsmetoden12,17, kan effektiviteten av EPF utvärderas, men eftersom bladlössen angriper de svampladdade bladen, utsätts bladlössens ryggsida, som är en föredragen penetrationsplats, vanligtvis inte för svampen.
För att utvärdera den afhidicida effekten av EPF under laboratorieförhållanden föreslår detta protokoll att man använder metoden med fristående blad som beskrivs av Yokomi och Gottwald18 med vissa modifieringar, följt av konidiinokulering med hjälp av en mikrospruta. Denna metod bibehåller cirka 100 % luftfuktighet i bioanalyskammaren i minst sju dagar utan att kräva ytterligare påfyllning av vatten18,19. Att begränsa bladlöss till en yta säkerställer dessutom att de utsätts för konidisprutning och underlättar observationer20. Bladlöss kan dock fastna i den exponerade agarytan när de rör sig i inokuleringskammaren. Dessutom kan det vara svårt att registrera data i petriskålsförsöket med senapsbladlöss, som är partenogenetiska insekter, på grund av deras snabba utveckling och reproduktion. Det är svårt att skilja mellan vaccinerade vuxna individer och deras avkomma utan avlägsnande. Detaljerna om hur man går vidare med detta steg nämns sällan, och vissa inkonsekventa faktorer, såsom bladförbrukningsyta, måste optimeras.
Detta protokoll visar ett stabilt system för screening av virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss, vilket gör det möjligt att välja ut potentiella isolat mot olika bladlusarter från ett omfattande EPF-bibliotek. Fältinsamlade bladlöss kan identifieras, och en tillräcklig laboratoriepopulation av senapsbladlöss kan etableras för att utvärdera den afhidicida effekten av olika svampisolat med hjälp av en enkel och genomförbar metod med konsekventa resultat. Bladlöss har utvecklat flera evolutionära mekanismer som svar på intensiva och upprepade antropogena påfrestningar i jordbruksekosystem, vilket innebär utmaningar för livsmedelsförsörjningen9. Därför kan denna beskrivna metod utvidgas till att utvärdera potentiella EPF-isolat mot olika bladlusarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Det fullständiga flödesschemat visas i figur 1.
1. Insamling och underhåll av senapsbladlus
- Samling av senapsbladlöss
- Vänd bladen och kontrollera visuellt om det finns angrepp av senapsbladlöss på korsblommiga grödor på fältet.
- Registrera provtagningsplatsens information (dvs. GPS) och värdväxt(er) och bekräfta historiken för insekticidapplicering med jordbrukarna.
- Använd en insektssug eller en fin målarpensel (se materialförteckning) för att samla upp cirka 50 senapsbladlöss i ett 50 ml centrifugrör från korsblommiga grödor på fältet och ta med provet till laboratoriet inom 3 timmar.
- Förbered en provisorisk underhållspetriskål med utskurna korsblommiga blad och vatteninfiltrerat filterpapper i botten.
- Placera de fem bladlössen på den tillfälliga underhållspetriskålen under rumstemperatur (25 ± 2 °C) med en relativ luftfuktighet på 70 % och 12:12 timmar (ljus:mörk) fotoperiod i 14 dagar för att bekräfta att bladlössen skonar naturliga fiender innan vidare uppfödning.
OBS: För att säkerställa att fältinsamlade bladlöss är fria från naturliga fiender som parasitsteklar eller entomopatogena svampar är det viktigt att bekräfta frånvaron av dessa organismer innan man fortsätter med ytterligare uppfödning.
- Underhåll av senapsbladlöss
OBS: För att underhålla senapsbladlöss, använd bekämpningsmedelsfria (inklusive biopesticid) korsblommiga blad.- Ge en stabil och tillräcklig tillförsel av korsblommiga blad (ca 25 cm2).
OBS: Skaffa de korsblommiga bladen antingen från marknaden eller odla växterna. Inför en långsiktig, massiv uppfödning av senapsbladlöss kunde flera olika sorters korsblommiga växter testas för att hitta en lämplig korsblommare. När arten på det korsblommiga bladet har fixerats, ändra den inte. I denna studie användes Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) i 6-7-bladsstadiet (se Materialtabell). Kassera dessutom de 2-3 äldsta bladen. - Tillsätt vatten innan filterpappret i botten är helt torrt.
- Observera populationstätheten hos senapsbladlössen dagligen. Populationen bör växa till 2-3 gånger efter 7 dagar.
- När antalet bladlöss ökar, skär de ursprungligen utskurna bladen med senapsbladlöss i 4-6 mindre bitar och lägg varje liten bladbit med senapsbladlöss i en petriskål med färska utskurna blad och vatteninfiltrerat filterpapper.
- Placera petriskålen i en inkubator vid 25 °C med en fotoperiod på 12:12 h (ljus:mörk) och observera populationstätheten av senapsbladlöss dagligen.
- Ta bort de ursprungliga utskurna bladen efter att de flesta bladlössen migrerat till färska utskurna blad innan de ursprungliga bladen ruttnar.
- Ge en stabil och tillräcklig tillförsel av korsblommiga blad (ca 25 cm2).
2. Molekylär identifiering av senapsbladlus
OBS: För att bekräfta arten av fältinsamlad senapsbladlus utfördes molekylär identifiering med hjälp av två molekylära markörer: sekvenskarakteriserad amplifierad region (SCAR) baserad A05Le designad av Lu et al.21, och senapsbladluscytokromoxidas subenhet 1 (COI) region av senapsbladlusen.
- Extraktion av senapsbladlus genomiskt DNA
- Samla cirka 50 bladlöss i ett 1,5 ml centrifugrör.
OBS: Bladlöss som används för molekylär identifiering bör vara ättlingar till en enda bladlöss, och olika stadier kan också poolas i samma rör för DNA-extraktion. - Homogenisera bladlössen med en pelletsstöt och extrahera DNA med hjälp av Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Eluera det genomiska DNA:t med 50 μL förvärmt nukleasfritt vatten.
- Samla cirka 50 bladlöss i ett 1,5 ml centrifugrör.
- PCR-amplifiering och DNA-sekvensering
- Amplifiera mål-DNA-sekvenserna från bladlusgenomiskt DNA med PCR Master Mix (2x) med primerparen A05LeF/A05LeR och LeCO1F/LeCO1R (tabell 1) med olika PCR-program21.
OBS: PCR-reaktionen med en total volym på 20 μL består av 2 μL bladlus genomisk DNA-mall, 1 μL framåtriktade och 1 μL omvända primrar, 10 μL PCR Master Mix (se materialtabell) och 6 μL ddH2O. - Utför PCR i en termocykler (se materialtabell) med följande program: 94 °C i 5 min, 25 cykler med 94 °C i 45 s, 61 °C (för A05LeF/A05LeR) och 58 °C (för LeCO1F/LeCO1R) i 45 s, 72 °C i 1 min, följt av en slutlig förlängning på 72 °C i 5 min.
- Analysera PCR-produkten med 1 % agarosgelelektrofores för att bekräfta senapsbladlusens identitet (figur 2).
OBS: Om primerparet A05LeF/A05LeR lyckas amplifiera rätt storlek på DNA-fragmentet, har det på ett övertygande sätt identifierat den fältinsamlade bladlusen som senapsbladlus21. Primerparen listas i tabell 2. - Rena PCR-produkten från senapsbladlus COI-amplikon med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt gel/PCR-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning) och sekvensera PCR-produkten med hjälp av en kommersiell sekvenseringstjänst.
- Amplifiera mål-DNA-sekvenserna från bladlusgenomiskt DNA med PCR Master Mix (2x) med primerparen A05LeF/A05LeR och LeCO1F/LeCO1R (tabell 1) med olika PCR-program21.
- Sekvens analys
OBS: Enligt Lu et al.21 är DNA-böjningen av A05Le ett senapsbladlusspecifikt DNA-fragment; därför behöver A05Le PCR-produkten inte sekvenseras ytterligare.- Kontrollera läskvaliteten med Chromas-programvaran (se materialförteckning) efter att ha erhållit LeCO1-sekvensen.
- Trimma uppströms och nedströms läsningar av låg kvalitet genom att öppna en fasta-fil (eller txt-fil) och direkt ta bort läsningar av låg kvalitet.
- Skicka den trimmade sekvensen till NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) med standardparametrar.
OBS: Om amplikonstorlekarna för A05Le och LeCO1 primeruppsättningar är korrekta, teoretiskt, måste sekvenssprängsökningen mot NCBI:s standarddatabaser matcha senapsbladlus.
3. Beredning av entomopatogena svampar
OBS: Den EPF som används i denna studie är listad i tabell 1.
- Återvinning av EPF från svampbibliotek
- Tina den konserverade svampbuljongen (konidier suspenderad i 30 % glycerin) från frysen -80 °C.
- Överför en liten mängd (cirka 10 μL) av konidisuspensionen till 6 cm 1/4 Sabouraud dextrosagar-tallrik (SDA) (0,75 g Sabouraud-dextrosbuljong med 1,5 g agar per 100 ml ddH2O) och fördela den jämnt med hjälp av en cellspridare i en laminär flödeshuv.
- Försegla petriskålen med paraffinfilm och inkubera den i mörker vid 25 °C i 10-14 dagar.
- Odla om svampisolaten genom att strö svampmassan på en 1/4 SDA-platta och inkubera svamparna i mörker vid 25 °C i 10-14 dagar innan konidiernaskördas 22.
OBS: Svampkulturen bör användas cirka 10 dagar innan bladlössen inokuleras. EPF-odling som är äldre än 14 dagar rekommenderas inte för användning i virulenstestet.
- Beredning av konidisuspension
- Skrapa konidierna från den 10-14 dagar gamla svampkulturen på 1/4 SDA-platta genom inokuleringsslinga efter tillsats av 2-3 ml 0,03 % Tween 80 (se materialförteckning).
- Samla upp svampsuspensionen i ett centrifugrör.
- Vred lösningen med högsta hastighet, räkna antalet konidier med hjälp av en hemocytometer under ett ljusmikroskop och justera koncentrationen av konidisuspensionen till 108 konidier/ml.
- Överför konidiasuspensionen till en UV-steriliserad mikrospruta.
OBS: Snurra konidisuspensionen igen innan du överför den, eftersom konidierna är benägna att fällas ut. Mikrosprutan ska utsättas för ultraviolett strålning i en laminär flödeshuv i 30 minuter före användning.
4. Virulensscreening mot senapsbladlus
- Förberedelse av nykläckta vuxna
- Flytta apterous (utan vinge) och alate (bevingade) adulta individer från den uppfödande petriskålen till nyligen utskurna blad för att reproducera nya avkommor av samma ålder. Ta bort de vuxna efter 24 timmar för att undvika överbeläggning och minimera produktionen av tilldelade avkommor23,24. Endast apterous adulta kommer att användas i ytterligare experiment.
- Flytta upp avkommor till vuxenstadiet och ta bort de avkommor som inte utvecklas till vuxenstadiet efter 48 timmar (Figur 3) för att förhindra åldersvariation mellan bladlössen för experimentet. Ta dessutom bort vuxna med alation.
- Beredning av inokuleringskammare
OBS: Det rekommenderas att förbereda korsblommiga blad med en diameter på 9 cm först, så att bladskivan kan bäddas in i vattenagarn innan den stelnar.- Rengör de korsblommiga bladen med kranvatten, ta bort smuts och rester och eventuella andra leddjur.
- Torka bort överflödigt vatten med en pappershandduk och kontrollera om det finns andra leddjur på ytan av de korsblommiga bladen med hjälp av ett stereomikroskop. Ta bort eventuella leddjur om sådana finns.
- Skär en bladskiva med en diameter på 9 cm antingen genom att direkt trycka den nedre petriskålen på bladet som en form eller genom att använda en sax.
OBS: Om bladen är mindre än 9 cm i diameter, kombinera ett par utskurna blad. - Förbered 1,5 % vattenagar för varje petriskål genom att värma och lösa upp 450 mg agar (se materialtabell) i 30 ml ddH2O med mikrovågsugn.
OBS: Mängden 1.5 % vattenagar kan justeras beroende på experimentskalan. - Häll 30 ml 1,5 % vattenagar i den 9 cm långa petriskålen innan den stelnar i huven för laminärt flöde, och vänta sedan tills agarns yta har svalnat till ~40 °C tills agarns yta är delvis stelnad.
OBS: Kontrollera om ytan är halvstelnad genom att försiktigt skaka petriskålen horisontellt. - Placera bladskivan, med den axiella ytan uppåt, ovanpå vattenagaren och bädda in bladskivan i agar.
OBS: Minimera exponeringen av agarytan. - När vattenagarn har stelnat helt, stäng locket på petriskålen.
OBS: Öppna locket för vattenförångning om många droppar kondenserar på locket omedelbart. - Placera 20 apterous vuxna på bladskivan.
OBS: Det rekommenderas att arbeta under ett stereomikroskop för att förhindra skador på deras mundelar.
- Inokulering och observation av EPF
- Öppna locket till inokuleringskammaren och spraya 0,3 ml konidisuspension (från steg 3.2) direkt på bladlössen och bladskivan från ca 15 cm ovanför bladskivan.
OBS: Virvla konidiasuspensionen igen innan du sprayar. Sprutområdena bör testas innan experimentet då de kan variera mellan olika sprutor. I det här fallet rekommenderas 0,3 ml med 15 cm avstånd. Besprutningsområdet ska täcka hela bladskivan och ett tunt lager konidisuspension ska täcka bladskivan. Om dropparna konvergerar till stillastående vatten på bladet bör inokuleringsvolymen minskas. Rengör bordet med 70 % etanol före inokulering och mellan olika isolat. - Vänta tills konidisuspensionen har torkat och stäng sedan locket för att förhindra att senapsbladlöss drunknar.
OBS: Bladlöss strövar sällan omkring under experimentet; Det är dock fortfarande nödvändigt att se till att bladlössen inte rymmer. - Försegla inokuleringskammaren med paraffinfilm för att bibehålla hög relativ luftfuktighet och placera inokuleringskammaren i en inkubator vid 25 °C med fotoperiod kl. 12.12 (ljus:mörk).
- Öppna locket till inokuleringskammaren för att räkna dödligheten i stereomikroskop var 12:e timme i 5 dagar.
- Torka av honungsdaggen som fastnat på locket med en pappershandduk och ta bort de nyuppkomna bladlössen med en fin målarpensel. Rengör locket med kranvatten var 24:e timme.
OBS: Observationsperioden kan variera för olika arter av bladlöss baserat på vuxen livslängd. - Håll kadavret på bladskivan för mykos för att bekräfta framgångsrik inokulering.
- Öppna locket till inokuleringskammaren och spraya 0,3 ml konidisuspension (från steg 3.2) direkt på bladlössen och bladskivan från ca 15 cm ovanför bladskivan.
- Bekräftelse av konidiernas grobarhet
OBS: Detta steg är valfritt. För att bekräfta konidiernas grobarhet parvis när virulensscreeningen utförs för att säkerställa konidiernas aktivitet.- Droppa en droppe 5 μL konidisuspension på 1/4 SDA för tre replikat.
- Efter 18 timmar, beräkna grobarheten med ljusmikroskopet. Räkna minst 100 sporer slumpmässigt i en enda droppe för att bekräfta svampens groningshastighet.
OBS: Normalt bör grobarheten för de isolat som används i experimentet vara högre än 90 %.
5. Bioassay av utvalda EPF-isolat
Anmärkning: EPF-isolat som uppvisade hög virulens, som valdes från steg 4, utsattes för en bioassay mot senapsbladlöss med användning av fyra koncentrationer av konidisuspensioner (från 104 till 107 konidier/ml).
- Beredning av konidisuspension
- Upprepa steg 3.1 för att återställa de valda EPF-isolaten.
- Upprepa steg 3.2 för att bereda fyra koncentrationer av konidisuspension, inklusive 104, 105,10 6 och 107 konidier/ml.
- Förberedelse av nykläckta vuxna
- Upprepa steg 4.1 för att förbereda nykläckta vuxna.
- Beredning av inokuleringskammare
- Upprepa steg 4.1. för att förbereda inokuleringskammaren.
- Inokulering och observation av EPF
- Upprepa steg 4.3. EPF-inokulering och observation med de fyra koncentrationerna av konidisuspension.
6. Statistisk analys
- Beräkning av korrigerad mortalitet
- Beräkna korrigerad mortalitet med hjälp av Abbotts formel25, som visas nedan:
Korrigerad mortalitet (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT representerar mortaliteten för behandlingsgruppen och MC representerar mortaliteten för kontrollgruppen.
OBS: Mortaliteten i kontrollgruppen bör inte vara högre än 20 %. - Öppna programvaruplattformen SPSS (se materialförteckningen), skapa variabler som "behandling" och "cor_mor" (som representerar korrigerad dödlighet) och ange de beräknade resultaten för inokulering av olika isolat vid samma tidpunkt med samma inokulerade koncentration.
- Välj Analysera, Jämför medelvärden och proportioner, Oberoende prover T-test i SPSS för oberoende t-testanalys .
- I SPSS matar du in behandlingen i rutan "Grupperingsvariabel" och cor_mor i "Testvariabeln/testvariablerna". Definiera grupper med olika svampisolat. Tryck på OK för att analysera.
- Beräkna korrigerad mortalitet med hjälp av Abbotts formel25, som visas nedan:
- Beräkning av mediantid för dödlig tid (LT 50) och medianvärde för dödlig koncentration (LC50)
- Öppna SPSS, skapa variablerna "totalt", "svar" och "varaktighet"/"koncentration" och mata in det registrerade resultatet i kalkylbladet.
- Välj Analysera, Regression, Probit i SPSS för att beräkna LT 50 och/eller LC50.
OBS: Om den kumulativa mortaliteten inte överstiger 50 % så småningom kan LT 50 och/eller LC50 inte uppskattas. - Ange total i rutan "Totalt observerat", svar i rutan "Svarsfrekvens", varaktighet/koncentration i rutan "Kovariat(er)". Tryck på OK för att analysera.
OBS: Tryck i allmänhet på Alternativ och ställ in "Signifikansnivå för användning av heterogenitetsfaktor" till 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det presenterade flödesschemat illustrerar senapsbladlössens stabila tillstånd från fältinsamling till virulensscreening. Upprätthållandet av bladlöss från fältinsamling säkerställde en stabil ökning av bladluskolonier med tillräcklig födotillgång. De fältinsamlade bladlössen bekräftades vara senapsbladlöss genom användning av molekylära markörer, inklusive PCR-amplikonstorlek och LeCO1-sekvensering. Virulensscreeningen, som utfördes med hjälp av metoden med fristående blad, visade en konsekvent överlevnad för senapsbladlöss, där kontrollgruppen uppvisade en överlevnadsgrad på 85 % (figur 4).
Under virulensscreeningen uppvisade Cc-NCHU-213 den snabbaste förmågan att döda bladlöss, vilket resulterade i 50 % och 90 % dödlighet 3 dagar respektive 4,5 dagar efter inokulering (DPI) (Figur 4). Varierande bladlössdödande förmåga observerades dock bland de fem B. bassiana-isolaten. Bb-NCHU-141, -143 och -153 uppvisade en långsam förmåga att döda bladlöss, med endast 5 % dödlighet vid 3 d.p.i., även när man utesluter effekterna av 0,03 % Tween 80-besprutning eller andra dödliga faktorer (Figur 4). Därför användes den korrigerade mortalitetsformeln för att normalisera kontrolldödligheten. De flesta EPF-isolat mot senapsbladlöss uppvisade korrigerade mortaliteter högre än 70 % inom 5 d.p.i., med undantag för Pl-NCHU-152 (tabell 3). Bland dessa EPF-isolat uppvisade Bb-NCHU-286 den högsta mortaliteten på 100 % (tabell 3). Dessutom observerades EPF-mykos på kadaver av senapsbladlöss infekterade med Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum och Cordyceps cateniannulata under virulensscreeningen, vilket tyder på effektiviteten hos detta system (figur 5).
Baserat på resultaten av virulensscreeningen valdes två EPF-isolat, nämligen Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213, som uppvisade snabb insektsdödande aktivitet (40 % respektive 50 % mortalitet vid 3 d.p.i.), ut för bioassay mot senapsbladlöss. Resultaten visade signifikant olika korrigerade mortaliteter för Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213 vid 3 och 4 d.p.i. med en inokulering av 107 konidier/ml (Figur 6). I LT50-analysen uppvisade behandlingen med 107 konidier/ml av Cc-NCHU-213 en signifikant kortare varaktighet jämfört med andra behandlingar (tabell 4). Dessutom var LC50-värdet för Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) lägre än för Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), vilket indikerar att Cc-NCHU-213 har större virulens mot senapsbladlöss (tabell 5).
Figur 1: Experimentellt flödesschema för screening av EPF-virulens mot senapsbladlöss . A) Inrättande av ett system för uppfödning av senapsbladlus. b) Utarbetande av den europeiska fredsfaciliteten. C) Vaccinering av svampar. (D) Statistisk analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Elektrofores av senapsbladlus genomiskt DNA amplifierat med A05Le och Le CO1 primer sets. Elektrofores utfördes på en 1% agarosgel. M = 100 bp DNA-stege; bp = baspar. Den röda asterisken indikerar målböjningen för PCR-amplifiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skillnader mellan apterous fourth instar-nymf och adulta senapsbladlöss . (A) Fjärde stjärnnymf. (B) Vuxen. Skenbenen på bakbenen hos den fjärde stjärnnymfen är vitaktiga (markerade med röd pil). Nyuppkomna bladlöss avlägsnades med fin kamelborste under virulenstester. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Dödlighetsvärmekarta över 13 EPF-isolat mot senapsbladlöss genom metoden med fristående blad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Observation av svampmykos hos 13 EPF-isolat. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemfigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Korrigerad mortalitet för svampisolaten Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213 mot senapsbladlus. Felstaplarna representerar standardavvikelsen (SD). Mortaliteten för Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213 vid samma tidpunkt med samma inokulerade koncentration jämfördes med hjälp av oberoende t-test, och mortaliteter markerade med en asterisk visade sig vara signifikant olika (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Isolera | Art | Värd eller källa* | Plats |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemfigi | jord | Yilan Yilan |
| Ml-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | jord | Yilan Yilan |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | jord | Yilan Yilan |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | jord | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papillosa | Chiayi |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua Chunghua |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | jord | Taichung |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tabell 1: EPF-isolat som användes i denna studie.
| Primerns namn | Sekvens (5' - 3') | Produktens storlek (bp) | Hänvisning | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Denna studie | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabell 2: Primerpar som används för molekylär identifiering av senapsbladlöss.
| Isolera | Art | Korrigerad mortalitet (%) |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemfigi | 76.47 |
| Ml-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabell 3: Korrigerad dödlighet för 13 EPF-isolat mot senapsbladlöss 5 dagar efter inokulering (d.p.i.).
| Isolera | Art | Konconc.(konidier/ml) | N* | LT50 (dagar)† | 95 % konfidensgränser | Lutning (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 A | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3,948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Antal observerade insekter. | |||||||
| †LT50-värden markerade med olika bokstäver ansågs vara signifikant olika eftersom deras 95-procentiga konfidensgränser inte överlappade varandra. | |||||||
| ‡X2, Chi-två-värde i Pearsons bra-för-passform-test; df, frihetsgrader | |||||||
Tabell 4: LT50-värden för svampisolat Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213 mot senapsbladlöss under olika konidikoncentrationer. *Antal observerade insekter. †LT50-värden markerade med olika bokstäver ansågs vara signifikant olika eftersom deras 95-procentiga konfidensgränser inte överlappade varandra. ‡X2, Chi-två-värde i Pearsons bra-för-passform-test; df, frihetsgrader.
| Isolera | Art | N* | LC50 (konidier/ml)† | 95 % konfidensgränser | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2,30 × 105 a | 8.63 × 104–5.70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 A | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Antal observerade insekter. | ||||||
| †LC50-värden markerade med olika bokstäver ansågs skilja sig avsevärt åt eftersom deras konfidensgränser på 95 % inte överlappade varandra. | ||||||
| ‡X2, Chi-två-värde i Pearsons bra-för-passform-test; df, frihetsgrader | ||||||
Tabell 5: LC50-värden för svampisolat Mb-NCHU-197 och Cc-NCHU-213 mot senapsbladlöss. *Antal observerade insekter. †LC50-värden markerade med olika bokstäver ansågs vara signifikant olika eftersom deras 95-procentiga konfidensgränser inte överlappade varandra. ‡X2, Chi-två-värde i Pearsons bra-för-passform-test; df, frihetsgrader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korsblommiga växter, en grupp grönsaker, angrips ofta av flera bladlusarter, inklusive senapsbladlus (L. erysimi) och kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Båda arterna har rapporterats i Taiwan27, och det är möjligt för dem att samexistera på insamlingsplatsen. För att särskilja närbesläktade bladlusarter användes i denna studie en molekylär identifieringsteknik med hjälp av en multiplex primer set21. Genom att designa en molekylär markör från senapsbladlusens COI-genfragment lyckades vi identifiera senapsbladlusen, vilket bekräftar tillförlitligheten hos den molekylära markören A05Le för detta ändamål21.
Observationerna visade att det är svårt att skilja mellan apterösa fjärdestjärnnymfer och vuxna senapsbladlöss enbart baserat på deras storlek eller morfologi utan erfarenhet. Ett avgörande kännetecken är dock bakbenens skenben, som ser vitt ut hos fjärdestjärnnymfer men inte hos vuxna (Figur 3). Tidigare studier på L. attenuatum, B. bassiana mot bomullsbladlöss och M. brunneum mot bladlöss har visat att ruggning kan vara en strategi för att undvika infektion28,29,30. Felaktig identifiering av bladlusstadier kan därför leda till fel i virulensbedömningen, eftersom ömsning kan påverka effektiviteten av EPF28,29,31. För att ta itu med detta problem och säkerställa större noggrannhet och precision vid utvärdering av virulens, uteslut bladlöss med vitaktiga delar på bakbenets skenben som inte har nått vuxenstadiet om de inte avsiktligt använder bladlusnymfer. Dessa bladlöss mognar inte helt och kan genomgå ruggning, vilket kan göra det möjligt för dem att undkomma infektionsprocessen av EPF. Dessutom rekommenderas ett tidsförlopp med observation och dataregistrering var 12:e timme. 12-timmarsintervallet är att föredra för att påvisa skillnader mellan flera lovande isolat med liknande bladlössdödande förmåga och underlättar den exakta beräkningen av LT50. Tidsintervallet kan dock justeras baserat på andra insektsarters olika livscykler eller bestämmas genom ett småskaligt förtest.
Även om metoden med fristående blad kan lämna minimal honungsdagg på bladskivan, fastnar det mesta av honungsdaggen på petriskålens lock eftersom bladskivan är i närheten. Den kan torkas eller tvättas bort under observationsperioden. Honungsdagg är dock utan tvekan närvarande i den praktiska miljön för odling av grödor när bladlöss invaderar32. Den honungsdagg som finns i inokuleringskammaren kan i viss mån simulera situationen när EPF inokuleras i bladlöss på fältet. Bladlössens nagelband innehåller mestadels honungsdagg, som fungerar som en näringskälla för svampen och kan stimulera groningen av EPF16. Således kan kombinationen av EPF-applicering och honungsdaggproduktion av bladlöss vara fördelaktig.
För att bekräfta att bladlusdöden beror på infektion överförs kadaver vanligtvis från EPF-inokuleringskammaren till fuktigt filterpapper eller ett odlingsmedium för observation av svamputväxt 11,14,33,34. Men i denna studie användes vattenagar i inokuleringskammaren för att upprätthålla hög luftfuktighet, vilket gjorde att bladlösskadaverna kunde stanna kvar på bladen utan att behöva flyttas för observation av svamputväxt. Även om metoden med fristående blad ger information om den aflösicida effekten av EPF-isolat, har den fortfarande begränsningar. Vattenagarn som används för att upprätthålla bladskivans tillstånd kan göra att bladlöss fastnar när de rör sig i inokuleringskammaren. För att ta itu med detta problem ökades andelen vattenagar till 3 %, vilket gav en tillräckligt fast yta för att ryska vetebladlöss (Diuraphis noxia) skulle kunna gå på20. I detta experiment kunde senapsbladlöss röra sig bekvämt på vattenagarytor med koncentrationer som varierade från 1,5 % till 3 %. Men allt eftersom observationsperioden fortskred fastnade några bladlöss upp och ner med benen uppåt och måste räddas tillbaka till bladskivan. Detta kan bero på skillnader i bladlusstorlek eller rörlighet, vilket tyder på att enbart en ökning av agarkoncentrationen kanske inte löser problemet. Se därför till att bladskivan helt täcker agarytan genom att använda ett blad som passar bättre till petriskålens storlek, vilket kan hjälpa till att lindra detta problem. I jämförelse med metoden med fristående blad som beskrivs av Yokomi och Gottwald18 har denna studie förbättrat en aspekt genom att använda en bladstorlek som ungefär passar bra för petriskålen. Detta möjliggör relativ kvantifiering av livsmedelskonsumtionen och minimerar den exponerade agarytan. Dessutom måste bladet "bäddas in" i den halvstelnade vattenagar, medan det i den ursprungliga referensen beskrevs som "placerat" på vattenagar18. Att bädda in bladskivan i vattenagarn minskar sannolikheten för att bladlöss fastnar på agarytan och underlättar observation, eftersom bladlössen är begränsade till ena sidan.
Detta protokoll ger detaljerade instruktioner om hur man går vidare med metoden med fristående blad och EPF-inokulering, tillsammans med några modifieringar som har underlättat operationer, observationer och konsekventa resultat. Den fastställer också en standardiserad metod för att välja EPF-isolat mot växtsugande skadegörare under laboratorieförhållanden. Dessutom kan en standardkontroll med kända effektiva eller kommersiellt tillgängliga produkter utföras för framtida kommersialisering av EPF-isolat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt inblandad i detta arbete.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av 109-2313-B-005 -048 -MY3 från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
