Summary
L’analyse en temps réel des tissus vivants fournit des données fonctionnelles et mécanistiques importantes. Cet article décrit les protocoles et les variables critiques permettant d’assurer une génération précise et reproductible de données par un nouveau système fluidique multicanal sans pompe qui maintient et évalue un large éventail de modèles de tissus et de cellules.
Abstract
De nombreux modèles in vitro utilisés pour étudier la fonction tissulaire et la biologie cellulaire nécessitent un flux de milieux pour fournir une oxygénation adéquate et des conditions cellulaires optimales nécessaires au maintien de la fonction et de la viabilité. À cette fin, nous avons développé un système de culture en flux multicanal pour maintenir les tissus et les cellules en culture et évaluer en permanence la fonction et la viabilité par des capteurs en ligne et/ou la collecte de fractions de sortie. Le système combine une détection optique continue à 8 canaux du taux de consommation d’oxygène avec un collecteur de fractions intégré pour mesurer simultanément les taux de production de métabolites et la sécrétion d’hormones. Bien qu’il soit capable de maintenir et d’évaluer un large éventail de modèles de tissus et de cellules, y compris les îlots, les muscles et l’hypothalamus, nous décrivons ici ses principes de fonctionnement et les préparations/protocoles expérimentaux que nous avons utilisés pour étudier la régulation bioénergétique de la rétine de souris isolée, de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris (EPR)-choroïde-sclérotique et des cellules RPE humaines en culture. Les innovations dans la conception du système, telles que l’écoulement des fluides sans pompe, ont considérablement simplifié le fonctionnement d’un système d’écoulement multicanal. Des vidéos et des images sont présentées qui illustrent comment assembler, préparer l’instrument pour une expérience et charger les différents modèles de tissus/cellules dans les chambres de périfusion. De plus, des lignes directrices pour la sélection des conditions pour les expériences spécifiques au protocole et aux tissus sont définies et discutées, y compris la définition du rapport débit/tissu correct pour obtenir des conditions de culture cohérentes et stables et des déterminations précises des taux de consommation et de production. La combinaison d’un entretien optimal des tissus et d’une évaluation en temps réel de multiples paramètres permet d’obtenir des ensembles de données très instructifs qui seront d’une grande utilité pour la recherche en physiologie de l’œil et la découverte de médicaments pour le traitement des troubles de la vision.
Introduction
Les systèmes de périfusion ont une longue histoire dans les sciences de la vie. En particulier, pour l’étude de la fonction sécrétoire des îlots, ils ont été utilisés pour caractériser la cinétique de la sécrétion d’insuline en réponse aux sécrétagogues1. En plus de collecter les fractions d’écoulement pour le dosage ultérieur des hormones et des métabolites, des capteurs en temps réel ont été incorporés, principalement pour la détection de la consommation d’oxygène 2,3,4. Les efforts généralisés visant à mieux comprendre les mécanismes de médiation des maladies de l’œil ont été limités par le manque de méthodes physiologiquement pertinentes pour évaluer la régulation métabolique et la dérégulation des divers composants isolés de l’œil, y compris la rétine, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)-choroïde-sclérotique et les cellules RPE en culture. Les systèmes statiques conçus pour les cellules en culture ont été adaptés pour le tissu5, mais le tissu a besoin d’un flux pour une oxygénation adéquate. Les systèmes d’écoulement ont réussi à mesurer avec précision et reproductibilité les réponses en temps réel du taux de consommation d’oxygène (OCR) de la rétine et de l’EPR-choroïde-sclérotique, et les tissus restent métaboliquement stables pendant plus de 8 h, ce qui permet des protocoles très informatifs impliquant plusieurs composés d’essai 4,6,7,8,9 . Néanmoins, l’exploitation des systèmes fluidiques a toujours nécessité un appareil sur mesure et un personnel technique formé à des méthodologies non standardisées. De tels systèmes n’ont pas été adoptés comme méthodologie standard dans la plupart des laboratoires. Le BaroFuse est un système fluidique nouvellement développé qui ne repose pas sur des pompes, mais plutôt sur la pression du gaz pour conduire le débit à travers plusieurs canaux et chambres tissulaires (Figure 1). Chaque canal est surveillé en permanence pour l’OCR, et le flux sortant est collecté à l’aide d’un collecteur de fractions à plaque pour une analyse ultérieure du contenu. Il est important de noter que les chambres de périfusion tissulaire de l’instrument sont conçues pour accueillir des tissus de différentes géométries et tailles.
Le cœur de l’instrument est le système fluidique, où l’écoulement est conduit d’un réservoir scellé et pressurisé à travers un tube de petit diamètre intérieur (ID) (contribuant à la résistance à l’écoulement la plus importante dans le circuit de fluide) jusqu’aux chambres à tissu en verre qui abritent le tissu. La pression du module de réservoir de média (MRM) est fournie par des régulateurs basse pression et haute pression connectés à une bouteille de gaz contenant un mélange de gaz (généralement 21 % d’O 2, 5 % de CO 2, équilibre N2), et le réservoir est scellé par le haut par le module de chambre de périfusion (PCM) qui contient les assemblages de chambre tissulaire (TCA). Le débit est contrôlé par la longueur et le diamètre intérieur des tubes de résistance et le réglage de la pression d’un régulateur basse pression. Des tubes d’écoulement reliés à la partie supérieure des chambres tissulaires acheminent le fluide vers un récipient à déchets (qui est pesé en continu pour la détermination automatique du débit) ou dans des puits d’une plaque à 96 puits contrôlée par le collecteur de fractions. Le système de détection de l’O 2 mesure la durée de vie d’un colorant sensible à l’O2 peint à l’intérieur de chacune des chambres de tissu en verre en aval du tissu. Ces informations sont ensuite utilisées pour calculer l’OCR en continu. L’ensemble du système fluidique réside dans une enceinte à température contrôlée et le réservoir de gaz, le collecteur de fractions et l’ordinateur sont les principaux composants de l’instrument (Figure 2A). Enfin, le logiciel qui exécute l’instrument sert à contrôler son fonctionnement (y compris la préparation et la synchronisation des composés d’essai injectés, le système de mesure du débit et la synchronisation du collecteur de fractions), ainsi qu’à traiter et à représenter graphiquement les données OCR et d’autres mesures supplémentaires.
Dans cet article, nous décrivons les protocoles d’utilisation du système fluidique pour périfuser et évaluer l’OCR et le taux de production de lactate (LPR) pour divers composants isolés de l’œil. Le LPR est un paramètre reflétant le taux de glycolyse qui est très complémentaire à l’OCR, où la paire représente les deux principales branches de la production d’énergie à partir des glucides dans la cellule10. Comme la préparation du tissu et son chargement dans les chambres tissulaires sont mieux appris en regardant la procédure, la vidéo aidera à illustrer plusieurs des étapes critiques qui sont effectuées lors de la mise en place et de l’opération et qui ne sont pas facilement transmises par le texte seul.
La description du protocole est divisée en 8 sections qui correspondent aux différentes phases de l’expérience (Figure 2B) : 1. préparation pré-expérimentale ; 2. préparation/équilibration du périfusat ; 3. Configuration de l’instrument ; 4. l’équilibre des tissus ; 5. Protocole expérimental ; 6. Décomposition de l’instrument ; 7. Traitement des données ; et 8. Dosages des fractions d’écoulement.
Protocol
Toutes les procédures de prélèvement de tissus sur des rats et des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Washington.
1. Préparation pré-expérimentale
REMARQUE : Les tâches suivantes sont effectuées au moins un jour avant l’expérience.
- Conception du protocole expérimental
- Affectation du placement des tissus dans les canaux : Choisissez le modèle de tissu ou de cellule à placer dans 3 des 4 canaux de chaque côté du MRM. Une chambre tissulaire de chaque côté est exécutée sans tissu à utiliser pour la correction de la ligne de base.
- Disposer les échantillons à l’aide de l’un des deux modèles typiques - différents protocoles de composés d’essai de chaque côté (par exemple, les canaux d’un côté de la MRM reçoivent les composés d’essai tandis que les canaux de l’autre côté agissent comme un contrôle) ; même protocole d’injection de composé d’essai des deux côtés de la MRM, mais des tissus ou un modèle de tissu différents par rapport au témoin de chaque côté de la MRM.
- Sélection du débit et de la quantité de tissu pour une mesure OCR optimale : Ajustez le débit jusqu’à ce que la variation du rapport de durée de vie multipliée par 100 soit d’environ 3.
REMARQUE : Les quantités typiques de tissu et les débits correspondants sont indiqués dans le tableau 1 pour les composants de l’œil, où l’instrument fonctionne mieux à des débits compris entre 6 et 80 μL/min/canal. - Calcul du volume de support/tampon requis : Calculez le volume de média à ajouter à chaque insert MRM au début de l’expérience comme suit :
VolumeMRM = 30 mL + Durée du protocole (en min) x Débit (en mL/min) x 4 canaux (Éq.1)
Par exemple, à 0,01 mL/min, une MRM de volume de départ de 60 mL permettra un protocole de 12,5 h (où 30 mL seront épuisés, tandis que 30 mL resteront), tandis qu’à 0,04 mL/min, uneMRM de volume de départ de 90 mL permettra un protocole de 6 h (avec 30 mL restants). - Protocole d’injection des composés d’essai : Sélectionner les composés d’essai à évaluer, la concentration à tester (généralement choisie pour donner une réponse proche de la maxime ou en fonction de la concentration) et la durée de l’exposition. Tenez compte de la solubilité et constituez des stocks dans le solvant souhaité tel que l’eau, le DMSO ou l’éthanol.
- Sélectionnez le moment des injections et des injections subséquentes afin que la réponse atteigne un état stable avant l’ajout d’un agent subséquent. Lorsque vous répétez des protocoles, faites correspondre le moment des injections afin que plusieurs cours puissent être moyennés.
REMARQUE : Les composés utilisés ici proviennent d’un test de stress mitochondrial (Mito) antérieur 11 et l’oligomycine et le cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) nécessitent du DMSO à la fois dans les solutions mères et dans le périfusat final. - Temps d’échantillonnage de l’écoulement : Sélectionnez les intervalles de collecte de fractions souhaités (de 1 à 60 min/échantillon), où des taux d’échantillonnage plus rapides sont choisis pour les changements rapides, et des intervalles de temps plus longs sont choisis à l’approche de l’état stationnaire. Utiliser des volumes de puits adéquats (0,3 à 1,5 ml) pour éviter les débordements pendant l’intervalle d’échantillonnage (choisir des volumes supérieurs au débit x l’intervalle de temps).
REMARQUE : Les temps d’échantillonnage varient selon le choix du protocole, mais pour un test d’effort Mito, nous avons généralement utilisé des intervalles de 5 minutes pendant la ligne de base et des intervalles de 15 minutes pendant les injections (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, où chaque heure est le début de l’intervalle d’échantillonnage). - Entrez les valeurs sélectionnées pour les composés d’essai et la collecte de fractions décrites ci-dessus dans l’interface utilisateur, qui génère des représentations graphiques de ces informations. Exporter et diffuser des fichiers pour l’évaluation et les discussions de groupe (figure supplémentaire 1).
- Présenter les accessoires et les consommables
- Indiquez les fournitures fournies et préemballées de manière aseptique par le fabricant, notamment : les TCA (paquet de 8), les ensembles de tubes d’écoulement (paquet de 8 tubes), les tubes d’injection de composés d’essai (2), les pinces, les colliers de serrage (3), les MRM, les inserts MRM (2), les barres d’agitation (2) et l’ensemble de tubes de purge (placés dans une enceinte de sécurité biologique).
- Ne réutilisez pas les pièces jetables qui entrent en contact avec un liquide, car cela entraînerait une augmentation de l’échec expérimental. Réutilisez les pinces et les barres d’agitation en les nettoyant et en les autoclavant entre les expériences.
2. Préparation et équilibrage du périfusat (Temps : 30 min sans compter le temps d’incubation)
- Préparer le milieu ou le tampon de bicarbonate de Krebs-Ringer (KRB) la veille en fonction des calculs de l’équation 1, généralement 200 mL, puis incuber pendant la nuit dans un incubateur à 39 °C/5 % de CO2 dans des flacons de culture tissulaire T225 avec pas plus de 90 ml dans chaque flacon.
- Si vous utilisez du KRB ou des milieux préparés dans le commerce (chauffés à température ambiante), préparez le périfusat le matin de l’expérience et placez-le dans l’incubateur à 5 % de CO2 pendant au moins 1 h. Préparez toutes les solutions de manière aseptique.
REMARQUE : Tous les liquides et les parties du système fluidique qui entrent en contact avec le liquide sont stériles au début de l’expérience. Cependant, l’assemblage du système et le chargement du tissu sont effectués à l’air libre.
3. Equilibration de la température et du gaz dissous pour la mise en place de l’instrument (Temps : 75 min)
- Fixation des assemblages de tubes au MRM
- Placez le MRM et un ensemble fluidique sur le banc à côté de l’instrument. Assurez-vous que les colliers de serrage (3), les barres d’agitation (2) et les pinces sont déjà sur le plateau à outils.
- Placez un insert MRM inutilisé avec une barre d’agitation de chaque côté du MRM (voir Figure 3).
- Fixez les TCA aux orifices d’injection aux deux extrémités du MRM de manière à ce que l’extrémité du tube soit positionnée directement au-dessus de la barre d’agitation. Assurez-vous que le plus long des deux assemblages d’injection de composé d’essai se trouve à l’arrière du MRM.
- Ensuite, fixez la conduite d’alimentation en gaz et l’ensemble de tube de purge aux orifices vacants arrière et avant, respectivement (voir Figure 4A).
- Mise en place des assemblages MRM/tubes dans le boîtier
- Placez le MRM (avec les assemblages de tubes fixés) dans l’élément chauffant MRM (Figure 4B).
- Placez les quatre assemblages de tubes dans les rainures des murs à la base de l’enceinte (deux de chaque côté) de manière à ce qu’ils dépassent de l’extérieur de l’enceinte une fois l’enceinte centrale mise en place.
- Fixez le MRM entre les pinces en serrant les deux roues sur le support du détecteur.
- Faire passer l’ensemble d’injection de composé d’essai le plus long dépassant de l’arrière de l’enceinte à travers les deux guides de tube situés sur le côté de l’enceinte de manière à ce que l’ouverture des tubes soit orientée vers l’avant (Figure 4C).
- Serrez chacun des assemblages d’injection de composé d’essai fermés.
- Montage de l’armoire et activation des régulateurs de température
- Basculez la multiprise qui alimente tous les appareils électriques du boîtier en position ON. Le ventilateur du support du détecteur s’allume et le régulateur de température MRM doit s’allumer et afficher une valeur de consigne de 38 °C (Figure 5).
- Allumez les agitateurs à 70 tr/min à l’aide de l’interface utilisateur pour vous assurer que les barres d’agitation tournent en douceur. Une fois que l’agitation correcte est observée, éteignez les agitateurs.
- Placez la partie centrale du boîtier sur le dessus de la base.
- Connectez le câble de la section centrale du boîtier au câble de la boîte électrique pour engager l’alimentation de l’interrupteur à levier du contrôleur de température ambiante et alimenter le chauffage à température ambiante.
- Placez le couvercle sur le boîtier et l’écran du régulateur de température supérieur (le régulateur de température ambiante) s’allumera et indiquera 36 °C. Démarrez une minuterie pendant 30 minutes, le temps qu’il faut au chauffage MRM pour atteindre la température de consigne.
- Insertion des TCA dans le PCM
- Utilisez l’outil d’insertion TCA pour insérer chacun des 8 TCA dans les trous PCM en appuyant fermement sur l’adaptateur avec la face de l’outil d’insertion jusqu’à ce que le haut du manchon de tubulure enroulé autour de la chambre tissulaire touche la surface circonscrivant les trous dans le PCM.
- Insérez complètement un TCA avant d’insérer le suivant. Mettez le PCM partiellement assemblé de côté à côté de l’entretoise PCM et des 6 vis.
REMARQUE : L’insertion incomplète d’un TCA empêchera l’espace libre d’atteindre le point de consigne de pression et le périfusat ne s’écoulera pas.
- Remplissage des deux inserts dans le MRM avec du périfusat pré-équilibré
- Pour ce faire, 30 min après l’assemblage de l’enceinte et l’atteinte de la température du MRM, transvasez le périfusat prééquilibré dans l’insert MRM préchauffé en distribuant doucement le liquide sur les côtés à l’aide d’une pipette de 50 ml.
REMARQUE : Ces étapes, ainsi que celles de la section 3.6, doivent être effectuées immédiatement pour éviter le transfert de gaz entre le périfusat dans le MRM et l’atmosphère.
- Pour ce faire, 30 min après l’assemblage de l’enceinte et l’atteinte de la température du MRM, transvasez le périfusat prééquilibré dans l’insert MRM préchauffé en distribuant doucement le liquide sur les côtés à l’aide d’une pipette de 50 ml.
- Assemblage du MRM/PCM pour créer un joint étanche au gaz et positionnement du détecteurd’O2
- Placez le PCM sur le MRM en insérant les tubes de résistance des TCA émanant du bas du PCM dans les inserts MRM, 4 de chaque côté du séparateur MRM. Orientez le PCM de manière à ce que les chambres tissulaires puissent reposer contre le détecteur d’O2 une fois qu’il est positionné.
- Fixez le PCM et le support PCM avec les 6 vis à l’aide du tournevis électrique.
- Fixez les TCA à l’intérieur des ailettes de support du PCM à l’aide de la bande élastique fournie en l’étirant autour des ailettes du PCM au niveau des joints en caoutchouc (Figure 6).
- Positionnez le détecteur O2 sur le support du détecteur de manière à ce que la face de celui-ci repose contre les ailettes du PCM. Vérifiez que les paires LED/photodétecteur sont alignées avec le colorant sensible à l’O2 dans les chambres tissulaires. Si nécessaire, ajustez les guides latéraux du détecteur O 2 après avoir desserré les vis de réglage sur le côté du support du détecteur O2.
- Placez le couvercle sur le dessus du boîtier.
- Équilibrer le gaz dans l’espace de tête dans le MRM avec le périfusat
- Avec la soupape haute pression entièrement sécurisée et fermée, ouvrez le robinet du réservoir de gaz en tournant le robinet de la bouteille sur le dessus du réservoir dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
- Ajustez le régulateur haute pression à une pression de 10 psi à l’aide du bouton situé sur le régulateur.
- Pressuriser le MRM en réglant le régulateur basse pression à 1,0 psi (Figure 7A).
- Desserrez le tube de purge (Figure 7B) pour permettre au gaz du réservoir de remplacer l’air dans l’espace libre MRM (les injecteurs de pâte à tester restent serrés) pendant 15 minutes. Confirmez le débit de gaz en immergeant l’extrémité du tube de purge dans un bécher d’eau pour observer le bouillonnement.
- Une fois que le débit a été confirmé, démarrez le détecteurd’O2 comme décrit ci-dessous à la section 3.8.
- Après 15 min, allumez l’agitateur à 70 tr/min et laissez fonctionner pour le reste de l’expérience. Après 15 minutes supplémentaires, serrez l’ensemble du tube de purge (Figure 7C).
- Abaissez la pression sur le régulateur basse pression à la pression de service qui permet d’atteindre le débit de liquide souhaité (tel que spécifié par le pack expérimental - généralement entre environ 0,5 et 0,7 psi). Si le débit est supérieur à 20 μL/min, réglez temporairement la pression à 0,3 psi pour laisser le temps de charger le tissu sans que les chambres ne débordent. Cela n’est pas nécessaire si le tissu est chargé dans les 15 minutes suivant la mise en place de la pince.
REMARQUE : Ne laissez pas le tampon s’écouler à l’extérieur de la chambre à tissus, car le liquide peut interférer avec la détection de l’O2.
- Démarrage du détecteur O2
- Activez le logiciel du détecteur O2 sur l’ordinateur portable en cliquant sur l’icône intitulée Détecteur d’oxygène.
- Une fois le programme ouvert (Figure supplémentaire 2), vérifiez que le port COM correct est sélectionné. Si nécessaire, le port COM peut être identifié en débranchant et en branchant le détecteur O2 de l’ordinateur afin que le numéro de port s’affiche. Si le port COM est débranché pendant l’exécution de l’application, celle-ci doit être fermée et rouverte avant utilisation.
- Cliquez sur Démarrer , puis sur Enregistrer (et enregistrez les données dans le dossier de sauvegarde). Ensuite, cliquez sur Graphique.
- Remplacez la valeur moyenne en bas à gauche du graphique de durée de vie par 5 (ce qui indique au programme de calculer une moyenne mobile avec 5 points consécutifs). Une fois qu’une minute s’est écoulée et que le premier point de données s’affiche sur l’écran graphique, cliquez sur Mise à l’échelle automatique.
4. Période de charge et d’équilibration des tissus (Durée : 90 min)
- Positionnement des frittes dans les chambres tissulaires
- Retirez le couvercle et les sections centrales du boîtier.
- Une fois que le périfusat dans les chambres tissulaires s’est élevé au-dessus du haut de la fritte prépositionnée, poussez la fritte vers le bas avec la queue de fritte en tapotant légèrement sur le dessus de la fritte pour éliminer les bulles d’air qui se sont formées en dessous ou à l’intérieur de la fritte.
- Placez les frittes à environ 0,25 pouce au-dessus du fond de la chambre à tissus.
- Chargement des tissus dans les chambres tissulaires
- Une fois que le niveau du média est à 0,5 pouce du haut, chargez le tissu dans la chambre.
- Chargement de la rétine ou de la sclérotique choroïde de l’EPR : Récoltez la rétine ou la sclérotique choroïde de l’EPR comme décrit à la section 6. Pour charger le tissu, utilisez une pince à pointe fine pour placer doucement le tissu dans chaque chambre, en prenant soin de ne pas plier le tissu, tout en utilisant une lingette pour papier pour éviter que le liquide de la chambre à tissu ne s’égoutte sur le capteur O2 . Observez les tissus s’enfoncer vers et sur la fritte.
REMARQUE : Entre le moment du prélèvement du tissu et le chargement du tissu dans les chambres, s’assurer d’éviter tout traumatisme du tissu en ne laissant pas le tissu dans un tampon ou un milieu à base de bicarbonate hors de l’incubateur pendant plus de 10 minutes et en s’assurant que le tissu est baigné dans un tampon ou un milieu suffisant (au moins 1 mL/10 mg de tissu) pour empêcher le tissu de devenir hypoxique et de prévenir l’exposition à l’air. - Chargement des cellules d’EPR sur les membranes de transwell : Préparer les cellules d’EPR comme décrit précédemment 12 et dans le fichier supplémentaire 1. Cellules de passage utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA et semences sur polyéthylène téréphtalate, filtres gravés à la trace (inserts de culture cellulaire, taille des pores 0,4 mm) à un minimum de 2,0 x 105 cellules/cm2. Le jour de l’expérience, coupez les membranes en trois bandes de largeur égale et chargez-les avec des pinces dans les chambres tissulaires (voir Figure 8A).
- Fixation des assemblages de tubes d’écoulement aux chambres tissulaires
- Retirez les assemblages de tubes d’écoulement de l’emballage et placez le séparateur de tubes d’écoulement sur le rebord de la section centrale de l’enceinte de manière à ce que les adaptateurs de tubes d’écoulement se trouvent à l’intérieur de l’enceinte (Figure 8B,C).
- En veillant à ne pas appuyer trop fort sur les TCA (sinon ils se détacheront du MRM), fixez les adaptateurs de tubulure d’écoulement sur le dessus des TCA des chambres tissulaires (Figure 8D). Replacez le milieu du boîtier et rebranchez le câble de contrôle de la température ambiante.
- Avant de replacer le couvercle de l’enceinte, vérifiez que les composants du système fluidique à l’intérieur de l’enceinte, y compris le détecteurd’O2 , le PCM, les chambres tissulaires, les tubes d’écoulement, le MRM et l’élément chauffant, sont tous correctement positionnés, comme illustré à la Figure 8E.
- Replacez le couvercle du boîtier. Faites passer les huit tubes de sortie à travers le bras de guidage du collecteur de fractions.
- Activation du collecteur de fractions
- Assurez-vous que le collecteur de fractions est centré par rapport à la paroi droite de l’enceinte et au support du tube d’écoulement : le support gauche de la base du collecteur de fractions doit reposer contre le bord de la paroi de l’enceinte.
- Sur l’ordinateur portable, cliquez sur le raccourci de l’interface utilisateur et la page d’informations expérimentales s’ouvrira (Figure 3 supplémentaire en haut).
- Remplissez les informations dans les cases appropriées sur la page d’informations expérimentales (cela peut être fait avant le début de l’expérience), puis cliquez sur la page Collecteur de flux et de fractions en haut (Figure supplémentaire 3 en bas).
- Réglage des paramètres pour la mesure automatisée du débit
- Sélectionnez le temps d’intégration souhaité dans le menu déroulant Temps d’acquisition de l’échantillon en haut au milieu qui équilibre la précision souhaitée (qui est proportionnelle au temps d’intégration) et la résolution temporelle.
- Si aucune fraction d’écoulement sortant n’est collectée dans l’expérience, cliquez sur Démarrer et passez à la section 4.7. Si des fractions d’écoulement doivent être collectées, suivez les étapes décrites à la section 4.6.
- Collecte des fractions d’écoulement
- Dans le logiciel d’interface utilisateur, cochez la case Collecter les fractions ? sur la page d’informations sur l’expérience ou sur la page Collecteur de flux et de fractions. Cliquez ensuite sur le bouton Paramètres de calcul FC .
- Lorsque la nouvelle fenêtre s’ouvre, renseignez l’heure de la première injection dans le protocole (définie comme temps = 0) et le débit par canal, ainsi que les intervalles de temps pour chaque échantillon. Cliquez ensuite sur Calculer.
- Une fois les intervalles de la collection vérifiés, cliquez sur Générer et démarrer.
- Mesure des débits pour les différents canaux (en option)
- Si l’on doit mesurer les débits de canaux individuels (qui, dans des conditions normales, ne varient que de quelques pour cent), peser huit tubes de microcentrifugation (ou moins) et enregistrer leur poids.
- Placez le porte-tube contenant les tubes de microcentrifugation pré-pesés sur le chariot à plaques. Cliquez sur Mesurer le débit manuellement dans la section Autres utilitaires.
- Sélectionnez la durée de la mesure, puis cliquez sur Générer un modèle. Fermez la fenêtre et cliquez sur Démarrer. Le collecteur de fractions collectera le fluide des tubes d’écoulement pendant la durée de la mesure, puis le bras reviendra à sa position d’origine.
- Peser les tubes de microfuge après le prélèvement et utiliser la différence de poids divisée par la durée de mesure pour calculer le débit (où 1 mg = 1 μL).
- Stabilisation de la ligne de base
- Une fois que les tissus et/ou les cellules ont été chargés dans les chambres tissulaires, laissez le système s’équilibrer pendant 90 minutes pour établir une ligne de base plate de la consommation d’O2, moment auquel le premier composé d’essai peut être injecté (considéré comme un temps = 0).
- 30 min avant la première injection, entrez la valeur moyenne des 3 derniers FR par canal dans la page d’injection pour la préparation des injections de composé d’essai.
5. Protocole expérimental (Durée : 2-6 h)
REMARQUE : Une fois que la stabilisation de la ligne de base est en cours, les tâches suivantes consistent à injecter les composés d’essai et à changer les plaques sur le collecteur de fractions si plus d’une doit être utilisée.
- Préparation de l’injection de composé d’essai
- Entrez les noms des composés, les concentrations souhaitées (solutions finales et mères) et les temps d’injection des composés testés dans le tableau de l’interface utilisateur de la page Injection. Confirmez les informations affichées dans le programme, y compris les volumes dans le MRM restants au moment des injections et la quantité de solution mère à injecter pour atteindre les concentrations souhaitées (Figure 4 supplémentaire).
- Pour calculer la quantité de périfusat et de bouillon nécessaire à l’injection, remplissez les cases blanches du tableau d’injection et cliquez sur Calculer. À l’aide des valeurs calculées, diluer la solution mère de composé d’essai avec du périfusat avant l’injection de manière à ce que le volume injecté soit de 5 % du volume dans le MRM après injection.
- Préparez chaque composé d’essai en mélangeant la solution mère et le périfusat. Chargez les seringues pendant au moins 10 minutes avant l’injection et conservez-les dans un incubateur de CO2 (maintenu à des températures comprises entre 37 et 40 °C) jusqu’au moment de l’injection.
- Injection de composés d’essai
- Raccordez la seringue contenant le composé d’essai aux conduites d’injection (Figure 9A). Desserrer le tube pharmed à paroi souple menant à la conduite d’injection et injecter lentement les composés d’essai (figure 9B) à un débit d’environ 3 mL/min. Serrez à nouveau la tubulure sur la conduite d’injection, puis retirez la seringue (Figure 9C) ; Répétez l’opération pour l’autre côté du MRM.
- Après avoir injecté chaque composé d’essai, préparez chaque composé d’essai subséquent à injecter conformément à la page d’injection de l’interface utilisateur.
- Détermination du signal d’entrée O2 pour chaque canal
- À la fin de chaque expérience, injecter l’inhibiteur respiratoire KCN (3 mM) pour déterminer le signal de durée de vie de l’afflux pour chaque canal, qui est utilisé pour corriger la variation de la durée de vie de base du capteur et de la consommation non mitochondriale d’oxygène.
6. Mettre fin à l’expérience et décomposer le système (Durée : 30 min)
- Sauvegarde des données d’oxygène
- Cliquez sur le bouton Enregistrer en haut à gauche de la fenêtre graphique du logiciel du détecteur d’oxygène ; Nommez le fichier et stockez-le dans le dossier où il sera conservé. Cliquez sur le bouton Arrêter l’enregistrement dans la fenêtre principale pour enregistrer le fichier de sauvegarde.
- Enregistrement du fichier d’informations expérimentales de l’interface utilisateur
- Cliquez sur le bouton Enregistrer le profil en haut à gauche de la page générale de l’interface utilisateur ; Nommez le fichier et stockez-le dans le dossier où il sera conservé. Sur la page fraction et flux de l’interface utilisateur, cliquez sur le menu déroulant Outils , puis sur Enregistrer. Conservez le nom généré ou choisissez-en un autre et stockez le fichier où vous le souhaitez. Si nécessaire, il existe des fichiers de sauvegarde auxquels il est possible d’accéder et d’enregistrer.
- Démontage de l’instrument
- Étant donné que le KCN est volatil, jetez les assemblages fluidiques dans une hotte ; versez les médias des bacs à déchets MRM et FC dans un conteneur à déchets, rincez les inserts MRM et remuez soigneusement les barres avec de l’eau. Versez le contenu du conteneur à déchets (contenant du KCN) dans un conteneur à déchets chimiques étiqueté pour une élimination ultérieure par sécurité chimique. Avant la prochaine expérience, nettoyez soigneusement et autoclez les barres d’agitation et les pinces.
7. Traitement des données (Durée : 15-45 min)
- Ouvrez l’application de traitement des données sur un ordinateur Mac ou PC. Sélectionnez le fichier de données .csv généré par une expérience. Si le protocole de cette expérience est similaire à celui d’une expérience précédemment analysée, sélectionnez ce fichier de paramètres et cliquez sur Étape suivante. Sinon, cliquez simplement sur Étape suivante pour commencer à entrer les paramètres de l’expérience.
- Renseignez les différents paramètres de l’expérience. Lors de la détermination du point temporel de référence, sélectionnez le point temporel directement avant l’entrée en vigueur du KCN et la diminution des valeurs de durée de vie. Sélectionnez ce point à l’aide d’un curseur ou en tapant la valeur de temps dans la zone.
- Cliquez sur Calculer pour générer des graphiques OCR selon l’équation 2 :
OCR = ([O 2]entrée- [O 2]sortie) x FR = (217 nmol/mL - [O 2]sortie) x FR/base tissulaire (Éq. 2)
où la concentration d’O2 dans le KRB à l’équilibre avec 21 % d’O2 à 37 °C est de 217 nmol/mL, FR est le débit (en mL/min), la base tissulaire est la quantité de tissu chargée dans la chambre (c’est-à-dire le nombre de rétines, de cellules RPE-choroïde-sclère ou RPE). - Enregistrez les graphiques sous forme de fichiers .pdf en appuyant sur le bouton Exporter le graphique . Affichez l’OCR sous forme de valeurs absolues ou de fraction d’une valeur à l’état stationnaire en cochant les cases correspondant au composé de test à définir sur 1 dans la page des paramètres de modification.
8. Dosages des fractions d’écoulement
- Si les échantillons ne peuvent pas être analysés immédiatement après l’expérience, placez les plaques à 4 °C si elles sont analysées le lendemain, ou congelées si elles sont conservées plus longtemps. Si les plaques sont congelées, décongeler les échantillons à 4 °C (afin que les échantillons restent froids).
- Une fois les analyses effectuées sur les fractions de débit sélectionnées, les colonnes de données (une par canal) sont entrées dans un fichier .csv avec le temps (en min) dans la colonne la plus à gauche et la concentration dans la colonne de droite (en nmol/mL ou ng/mL) ; Lorsqu’il est pressé, un lien dans le programme de traitement des données télécharge un modèle.
- Téléchargez ce fichier dans le processeur de données pour calculer et tracer les données.
Representative Results
Pour illustrer la résolution des données générées à partir de composants isolés de l’œil, l’OCR et la LPR ont été mesurées avec trois types de tissus (rétine, RPE-choroïde-sclérotique et cellules RPE) selon un protocole couramment utilisé (le test d’effort mitochondrial10 ; Figure 10, Figure 11 et Figure 12). La quantité de tissu utilisée pour chaque tissu est indiquée dans le tableau 1. Les données ont été traitées et représentées graphiquement à l’aide du progiciel développé pour le système fluidique. La préparation de la rétine et de l’EPR-choroïde-sclérotique est relativement simple et prend moins de 20 minutes pour chaque type de tissu. L’OCR était constante pendant la période d’injection des composés d’essai, ce qui indique une santé et une fonction stables du tissu et soutient la validité de la méthode (figure 10). Une fois validé pour chaque type de tissu, nous n’avons pas jugé nécessaire d’effectuer des contrôles où aucun composé d’essai n’est injecté pour chaque expérience. Conformément aux données obtenues à l’aide de méthodes de périfusion plus conventionnelles 6,8,13, l’OCR diminue en réponse à l’oligomycine et augmente l’OCR en réponse à la FCCP. Les changements dans la LPR étaient dans la direction opposée à ceux observés pour l’OCR : l’oligomycine a augmenté la LPR, qui a ensuite diminué (mais seulement légèrement) en réponse à la FCCP (Figure 11). Pour comparer la signification statistique de l’effet de chaque composé d’essai séquentiel, des tests t ont été effectués (qui sont calculés automatiquement par le logiciel fourni avec l’instrument). Étant donné que l’objectif de l’article était de décrire comment effectuer la méthode, le nombre de répétitions transportées n’était pas toujours assez élevé pour produire une signification statistique. En général, cependant, lorsque le nombre de répétitions était de 3 ou plus, les effets de la FCCP et de l’oligomycine sur l’OCR et la LPR étaient significatifs.
Les cellules RPE n’ont pas été analysées auparavant avec des systèmes d’écoulement, mais ont réagi de la même manière à RPE-choroïde-sclère (ce qui est cohérent avec l’idée qu’une grande partie de l’OCR est due aux cellules RPE ; Graphique 11). Ces exemples illustratifs mettent en évidence la capacité du système à maintenir la viabilité des tissus, comme en témoignent la stabilité de l’OCR dans les canaux de contrôle et le rapport signal sur bruit élevé pour les changements de l’OCR de l’ampleur induite par l’oligomycine et le FCCP, qui était supérieur à 100 pour 1. De plus, les dosages des fractions d’écoulement peuvent être utilisés pour corréler le taux d’absorption ou de production d’un large éventail de composés échangeant avec le liquide extracellulaire sont complémentaires à l’OCR (dans ce cas, LPR). Ces caractéristiques de l’instrument ont permis de quantifier avec précision les différences caractéristiques dans les réponses tissulaires entre les types de tissus, réalisées en parallèle. L’OCR par l’EPR-choroïde-sclère et les cellules RPE sont systématiquement plus sensibles à l’oligomycine que la rétine (Figure 11 et Figure 12), bien que pour l’EPR-choroïde-sclère, la durée d’exposition à la FCCP n’ait pas été assez longue pour atteindre l’état d’équilibre. Un point à prendre en compte lors de l’utilisation du DMSO comme solvant. À des concentrations plus élevées, le DMSO (0,2 %) a eu un effet transitoire sur l’OCR par la rétine (reflétant probablement un effet d’un changement de pression osmotique provoqué par l’effet du DMSO sur la perméabilité membranaire).
Sur la base de l’hypothèse que le KCN inhibe complètement la respiration par son action directe sur la cytochrome c oxydase, l’OCR à la fin de l’exposition au KCN est fixé à 0 et toutes les valeurs OCR sont calculées en fonction de la variation par rapport à la valeur KCN. L’OCR peut se produire indépendamment de la chaîne respiratoire et de la cytochrome c oxydase. Cependant, l’ampleur de cette contribution à l’OCR global n’est généralement pas supérieure à quelques pour cent (données non présentées) et la durée prolongée pendant laquelle les tissus sont exposés au KCN garantit que les substrats d’oxydases qui ne font pas partie de la chaîne de transport d’électrons ont été épuisés.
Analyse statistique
Des expériences uniques ont été montrées comme indiqué dans les figures, mais avec plusieurs canaux qui ont été moyennés. Les données ont ensuite été représentées graphiquement sous la forme de la moyenne ± l’erreur-type (ET ; calculée en écart-type/√n).
Graphique 1. Schéma du système fluidique/d’évaluation. Les principaux composants comprennent l’enceinte, les éléments de contrôle de la température, les systèmes de chambre fluidique et tissulaire, la régulation de la pression du gaz dans l’espace de tête au-dessus du périfusat, le collecteur de fractions/surveillance du débit et les détecteurs d’O2 . Abréviations : MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. (A) Image des principaux composants de l’instrument. Les principaux composants sont constitués d’un réservoir de gaz (régulateurs de pression), d’un boîtier, d’un collecteur de fractions et d’un ordinateur. (B) Organigramme expérimental montrant les principales catégories d’étapes et le temps nécessaire pour les réaliser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Vue du MRM. Le MRM est représenté avec un insert MRM (à gauche) et des barres d’agitation (à droite) placés dans le bas des inserts MRM (placés de chaque côté du diviseur MRM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Assemblage de tubes et ensemble de tubes de purge dans le MRM. (A) Ensemble de tube d’injection de composé d’essai et ensemble de tube de purge fixé aux orifices du MRM. (B-C) L’ensemble d’injection de pâte à tester et l’ensemble de tube de purge (B) sont placés dans la rainure à l’avant de l’enceinte (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Mise sous tension du régulateur de température MRM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 6. Chambres à tissus et réservoir de gaz. Positionnement du détecteur O2 sur le support du détecteur (qui prend également en charge le MRM et le PCM) et placement de la bande autour des ailettes du PCM qui aident à fixer les chambres tissulaires en place. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7. (A) Régulateurs haute et basse pression sur le réservoir d’essence. (B-C) Tube de purge. Le tube de purge permet à l’espace libre dans le MRM d’évacuer l’air et de se remplir de gaz du réservoir d’alimentation. Photos montrant le tube de purge ouvert (B) et le tube de purge fermé (C). L’ensemble d’injection de composé d’essai reste fermé tout au long du processus de purge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 8. Chambre tissulaire et configuration de l’écoulement. (A) Dimensions de la membrane Transwell après qu’elle a été coupée en trois bandes de largeur égale. (B) Support multitube d’écoulement. (C) Support multitube d’écoulement positionné sur la lèvre de l’enceinte avec les adaptateurs de tubulure près des chambres à tissus. (D) Image des ensembles de tubes d’écoulement fixés aux chambres tissulaires. (E) Vue aérienne de l’enceinte sans le couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 9. Injection de composé dans le MRM. Injection d’un composé d’essai à travers l’orifice d’injection dans le MRM à l’aide d’une seringue de 5 mL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 10. Courbes OCR et LPR en réponse aux composés d’essai. OCR et LPR par rétine isolée de souris (1 rétine/canal) en réponse à la présence ou à l’absence (contrôle) de composés d’essai comme indiqué. Chaque courbe est la moyenne de 6 répétitions d’une seule expérience (les barres d’erreur sont des ET ; les valeurs de p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs d’état stationnaire de chaque agent de test avec celles de l’agent de test précédent). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 11. Courbes OCR. OCR par RPE-choroïde-sclère et rétine isolées de souris (1 rétine ou 2 RPE-choroïde-sclérotique/canal) mesurées en parallèle en réponse aux composés d’essai comme indiqué. Les données sont la moyenne des répétitions d’une seule expérience (n = 2 et 4 pour l’EPR, la choroïde, la sclérotique et la rétine respectivement ; les valeurs de p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs à l’état d’équilibre de chaque agent de test avec celles de l’agent de test précédent). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 12. Courbes OCR et LPR à partir de cellules RPE. OCR et LPR à partir de cellules RPE attachées à des membranes transwell qui ont été coupées en bandes et chargées dans les chambres de périfusion. Les données sont la moyenne des répétitions d’une seule expérience (n = 3, avec 1,5 membrane/canal (360 000 cellules/canal) ; les valeurs p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs à l’état d’équilibre de chaque agent d’essai avec celles de l’agent d’essai précédent). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| TISSUS/CELLULES | Quantité/Canal | DÉBIT : mL/min |
| Rétine (souris) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroïde-sclère (souris) | 2 | 0.02 |
| Cellules RPE sur membranes Transwell | 360 000 cellules (4 x 1/3 bandes filtrantes) | 0.016 |
Tableau 1. Spécifications de fonctionnement recommandées pour différents tissus.
Figure supplémentaire 1. Représentation graphique d’un plan d’expérience. Le moment et la composition de l’exposition aux composés d’essai, ainsi que le moment de la collecte des fractions. L’incrément de concentration (Conc Inc) est le changement de concentration à mettre en œuvre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Interface utilisateur au démarrage. Interface utilisateur de la fenêtre de démarrage du logiciel de détection de l’O 2 qui surveille l’O2 dans les chambres tissulaires insérées dans le PCM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3. Interface utilisateur pour les paramètres de l’expérience. Interface utilisateur pour la saisie des informations expérimentales (à gauche) et la sélection des heures de collecte des fractions d’écoulement (à droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4. Interface utilisateur de la page d’injection. Page d’injection qui calcule les volumes d’injection en fonction des concentrations souhaitées de composé d’essai et du volume restant dans le MRM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : Méthodes de préparation des échantillons de tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
En raison de l’importance de la bioénergétique dans tous les aspects de la fonction cellulaire et du maintien de divers composants de l’œil, il existe un besoin critique de méthodes pour étudier sa régulation. En particulier, la rétine neurale et l’EPR dépendent du métabolisme à la fois pour la production d’énergie et pour la signalisation intra et intercellulaire14,15,16,17. En raison de leur capacité oxydative élevée, les tissus isolés de l’œil ne sont pas bien maintenus dans des conditions statiques18,19 et, par conséquent, l’étude des composants isolés de l’œil nécessite des systèmes d’écoulement capables à la fois de maintenir et d’évaluer les processus métaboliques. Le système fluidique a été développé pour générer des données OCR et LPR à partir d’un large éventail de types de tissus et, dans cet article, nous avons présenté des protocoles détaillés qui se sont avérés produire des résultats optimaux.
Le principal déterminant pour générer des données robustes à l’aide du système d’écoulement comprend le pré-équilibrage du milieu/tampon à base de CO2 à 39 °C (pour s’assurer que le périfusat n’est pas sursaturé de gaz dissous qui se dégazerait pendant l’expérience). En particulier, le milieu ou le tampon KRB stocké à 4 °C sera sursaturé par rapport à 37 °C et dégazera pendant l’expérience si les temps de pré-équilibrage sont insuffisants. De plus, les tissus chargés dans les chambres tissulaires ne doivent pas être traumatisés par une mauvaise isolation des tissus due à une déchirure ou à une séparation incomplète des tissus, ou par une exposition trop longue des tissus à l’air atmosphérique dans une faible quantité de tampon à base de bicarbonate. Le contrôle de la température, la stabilité de l’écoulement et la fiabilité de la détection del’O2 ont peu de variabilité et ces facteurs ne contribuent pas de manière significative au taux de défaillance.
L’instrument dispose de huit canaux d’écoulement/chambres tissulaires qui fonctionnent simultanément et qui sont alimentés en périfusat à partir de deux réservoirs, quatre chambres tissulaires pour chaque réservoir. Pour obtenir les trajectoires temporelles les plus précises de l’OCR, les courbes cinétiques sont corrigées par des chambres qui ne sont pas chargées de tissus. Ainsi, un protocole expérimental typique impliquerait deux groupes de trois chambres tissulaires. En général, les protocoles se répartissent en deux catégories : d’une part, les différents protocoles de composés d’essai de chaque côté (par exemple, drogue/véhicule d’un côté du MRM, et véhicule de l’autre) ; le second est le même protocole d’injection de composé d’essai des deux côtés de la MRM, mais un tissu ou un modèle de tissu différent de chaque côté de la MRM. Dans cet article, les effets de l’oligomycine et de la FCCP sur la rétine ont été comparés à l’OCR par des tissus qui n’ont été exposés à aucun composé test, et deux tissus ont été évalués de manière concomitante dans le même protocole et les mêmes conditions pour identifier le comportement spécifique des tissus. Ce dernier a été illustré dans cette étude en montrant une augmentation de la plage dynamique du taux métabolique par RPE-choroïde-sclérotique par rapport à la rétine en parallèle dans la même expérience. D’autres rapports ont décrit un plus large éventail de modèles d’étude, y compris la mesure des effets des différents niveaux d’O2 sur l’OCR et le LPR, et les dépendances à la concentration des carburants, des médicaments et des toxines20,21. De plus, bien que nous ayons limité l’analyse des fractions d’écoulement à la mesure du lactate et au calcul de la LPR, le contenu d’information d’une expérience augmente considérablement si plusieurs composés et classes de composés dans les fractions d’écoulement sont dosés, tels que les hormones, les neurotransmetteurs, les signaux cellulaires et les métabolites qui peuvent sortirdes cellules. Chapitre 23.
La mise en charge de la rétine isolée ou de l’EPR-choroïde-sclérotique est simple, et une fois isolés, ces tissus sont simplement placés dans le haut des chambres tissulaires avec des pinces et laissés s’enfoncer jusqu’à la fritte. Les cellules d’EPR cultivées sur des inserts filtrants développent une polarisation appropriée et des marqueurs de maturité de l’EPR après 4 à 8 semaines de culture. Il n’est pas possible de retirer l’EPR pour l’analyse des cellules vivantes une fois qu’il est attaché à la membrane du transwell, si l’on veut maintenir la maturité et la polarisation de l’EPR24. La chambre de périfusion peut accueillir des bandes de la membrane transwell qui sont coupées avec un scalpel alors qu’elles sont immergées dans le tampon et rapidement insérées dans les chambres tissulaires. Bien que les bandes filtrantes de coupe aient été placées dans un système statique24, aucune autre méthode fluidique n’est disponible pour évaluer ces types de cellules importantes. Les réponses des cellules RPE ont été rapides et plus dynamiques que celles de la rétine ou de la sclérotique choroïde, probablement en partie en raison de l’accès immédiat des faces apicale et basale des cellules RPE configurées en monocouche sur l’insert membranaire.
Un autre facteur permettant de s’assurer que les données ont le rapport signal/bruit le plus élevé est la sélection du rapport optimal de tissus chargés dans les chambres de périfusion par rapport au débit. Trop peu de tissu par rapport au débit entraîne une différence de concentration d’O2 dissous entre l’entrée et la sortie qui est très faible et difficile à mesurer de manière fiable. En revanche, si l’écoulement est trop lent, la concentration d’O2 devient si faible que le tissu est affecté par l’hypoxie. Néanmoins, le débit de liquide entraîné par la pression du gaz peut être maintenu à des débits allant jusqu’à 5 mL/min ne nécessitant que de petites quantités de tissu pour des mesures OCR et LPR précises. Dans les expériences présentées ici, environ 20 mL/min/canal ont été utilisés, ce qui convenait soit à une rétine, soit à deux sclérotiques choroïdiennes RPE, soit à 360 000 cellules RPE. Pour minimiser les effets du système qui retardent et dispersent l’exposition du tissu au composé d’essai injecté, plusieurs tailles de chambres tissulaires sont fournies, de sorte que la quantité de tissu (et le débit) soit adaptée à la taille appropriée de la chambre.
Les données issues des analyses présentées dans cet article ont été représentées de deux manières : en termes absolus de magnitude par rapport au taux ou en termes de variations fractionnaires par rapport à un état d’équilibre ou à une ligne de référence. L’accent a été mis sur l’illustration de la mesure des réponses aux composés d’essai. Cependant, le système fluidique est bien adapté pour évaluer et comparer les effets du traitement tissulaire avant l’analyse de périfusion, tels que les modifications génétiques. Il est plus difficile de vérifier si un traitement est différent du témoin si l’on analyse les effets du traitement sur les réponses normalisées des composés d’essai. Si l’analyse nécessite des magnitudes absolues, la puissance statistique des analyses d’échantillons prétraités est maximisée si leur évaluation et leurs contrôles sont effectués dans la même expérience de périfusion.
À l’exception de l’agitateur, toutes les pièces qui entrent en contact avec le liquide sont fournies par le fabricant en tant que consommables et ont été stérilisées. Ces pièces ne doivent pas être réutilisées, car les expériences seront parfois perdues en raison d’un nettoyage incomplet et de surfaces contaminées. Au début de l’installation, le système est stérile. Cependant, des milieux sont ajoutés à la MRM et les tissus sont chargés dans les chambres dans des conditions non stériles. Nous avons mesuré l’OCR dans le système qui est assemblé avec des pièces stériles, mais où l’expérience elle-même est réalisée dans des conditions non stériles. Il faut environ 14 h pour que les bactéries s’accumulent au point d’avoir un OCR mesurable (résultats non publiés). Si des protocoles de moins de 10 h environ sont utilisés, l’accumulation de bactéries et les effets qui en découlent seront négligeables.
De nombreux chercheurs utilisent des instruments conçus pour mesurer l’OCR sous incubation statique d’une monocouche de cellules avec un débit relativement élevé25,26. En revanche, l’instrument fluidique que nous avons testé et décrit dans cet article maintient les tissus en assurant une livraison adéquate d’O2, ce qui est essentiel pour les plus grandes distances de diffusion présentes dans les échantillons de tissus. De plus, il est capable de collecter des fractions permettant l’évaluation de plusieurs paramètres en parallèle de l’OCR, ce qui améliore considérablement la capacité d’étudier les relations entre eux. Enfin, les concentrations de gaz dissous (tels que l’O2 et le CO 2) peuvent être contrôlées, ce qui augmente la durée des expériences avec des milieux et des tampons à base de bicarbonate, ce qui permet à l’utilisateur d’étudier les effets de l’O 2. Il convient de souligner qu’une limite pour les deux méthodologies est l’impossibilité d’étudier le lavage des composés d’essai, une fonctionnalité que d’autres systèmes de périfusion ont 4,27,28. Un autre élément à prendre en compte lors de la détermination de la modalité d’analyse optimale est le fait que les systèmes fluidiques utilisent plus de milieux et de composés d’essai que les systèmes statiques. Les dépenses supplémentaires sont minimisées avec les systèmes fluidiques actuels en raison des faibles débits que le système peut être utilisé.
Dans l’ensemble, une description détaillée des protocoles permettant d’effectuer des expériences avec un nouvel instrument d’évaluation du débit est décrite. Les données générées avec la rétine et l’EPR-choroïde-sclérotique ont récapitulé les résultats antérieurs obtenus avec des systèmes beaucoup plus difficiles à utiliser (et difficilement disponibles). Il a également été démontré que le système peut maintenir et évaluer les cellules RPE attachées aux membranes transwell, un modèle cellulaire très important qui n’a pas été analysé auparavant avec des systèmes d’écoulement en raison de la fragilité des cellules. Les principales parties du protocole consistent en un temps de mise en place de 75 minutes, suivi d’une période d’équilibration de 90 minutes et du protocole expérimental le rendant adapté à une utilisation de routine par des laboratoires qui ne sont pas spécialisés dans l’exploitation de systèmes fluidiques. Bien que nous nous soyons concentrés sur la mesure de la réponse aiguë des tissus aux composés testés, le système est très approprié pour comparer des tissus provenant de diverses sources telles que des modèles animaux ou des modèles cellulaires qui ont été génétiquement modifiés ou qui ont subi des traitements/conditions d’essai. De plus, la portée des tests qui peuvent être effectués sur les fractions d’écoulement est large et comprend les métabolites, les molécules de signalisation cellulaire et les hormones/neurotransmetteurs sécrétés, ainsi que l’analyse multi-composants générée par spectrométrie de masse sur les fractions ainsi que sur les tissus.
Disclosures
I.R.S., M.G. et K.B. ont des liens financiers avec EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), le fabricant/distributeur du système de périfusion BaroFuse décrit dans cette étude. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) et R01 EY006641, R01 EY017863 et R21 EY032597 (J.B.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
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