Summary
Denne forskning skitserer to teknikker til isolering af rigelige neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) fra rotteknoglemarv. Den ene metode kombinerer et kommercielt neutrofilisoleringssæt med densitetsgradientcentrifugering, mens den anden kun anvender densitetsgradientcentrifugering. Begge tilgange giver funktionelle NET'er, der overgår dem fra perifere blodneutrofiler.
Abstract
Det primære mål med denne forskning var at udvikle en pålidelig og effektiv tilgang til isolering af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) fra rotteknoglemarv. Denne indsats opstod på grund af begrænsninger forbundet med den traditionelle metode til ekstraktion af NET'er fra perifert blod, hovedsageligt på grund af manglen på tilgængelige neutrofiler til isolering. Undersøgelsen afslørede to forskellige metoder til opnåelse af rotteneutrofiler fra knoglemarv: en strømlinet ettrinsprocedure, der gav tilfredsstillende rensningsniveauer, og en mere tidskrævende totrinsproces, der udviste forbedret rensningseffektivitet. Det er vigtigt, at begge teknikker gav en betydelig mængde levedygtige neutrofiler, der spænder mellem 50 og 100 millioner pr. Rotte. Denne effektivitet afspejlede resultaterne opnået ved isolering af neutrofiler fra både humane og murinkilder. Signifikant udviste neutrofiler afledt af rotteknoglemarv sammenlignelige evner til at udskille NET'er sammenlignet med neutrofiler opnået fra perifert blod. Den knoglemarvsbaserede metode producerede imidlertid konsekvent betydeligt større mængder af både neutrofiler og NET'er. Denne tilgang demonstrerede potentialet til at opnå betydeligt større mængder af disse cellulære komponenter til yderligere downstream-applikationer. Især disse isolerede NET'er og neutrofiler holder løfte om en række applikationer, der spænder over inflammation, infektion og autoimmune sygdomme.
Introduction
Neutrofiler udgør en kritisk delmængde af leukocytter, der spiller en afgørende rolle i det medfødte immunrespons. De er kendetegnet ved multilobede kerner og granulater indeholdende forskellige proteaser og antimikrobielle peptider1. Neutrofiler fungerer primært gennem degranulering, fagocytose og dannelse af NET'er. Observationen af NETs blev først foretaget af Takei et al. i 1996 under et eksperiment, hvor neutrofiler blev stimuleret med phorbolmyristatacetat (PMA)2. Derefter blev processen med NET-dannelse opfundet "NETosis" af Brinkmann et al.3 i 2004. Deres forskning belyste yderligere NETs afgørende rolle i neutrofilmedierede antimikrobielle responser. NETs er weblignende strukturer sammensat af kromatin, histoner og antimikrobielle proteiner, der frigives fra aktiverede neutrofiler som reaktion på infektiøse og inflammatoriske stimuli. NETs kan immobilisere og dræbe invaderende patogener ved at fange dem og udsætte dem for en høj koncentration af antimikrobielle peptider og proteaser 1,3. Derudover bidrager NETs til clearance af apoptotiske celler og deltager i inflammationsopløsning. Nylige undersøgelser viser også, at overdreven dannelse af NETs eller nedsat netnedbrydning kan føre til vævsskade, autoimmune lidelser, trombogenese og nedsat revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
NETs patogene rolle i ukontrolleret fibrose efter myokardieinfarkt og dannelsen af ventrikulære aneurismer er blevet påvist gennem udvidelsen af perivaskulær fibrose 4,11. Myokardieinfarktmodellen og isoleringen af neutrofiler fra knoglemarv hos mus er begge veletablerede. Polymorfonukleære (PMN) leukocytter, en type hvide blodlegemer, der er rigelige i humant blod, tjener som en fremragende kilde til isolering af humane neutrofiler. Denne metode eliminerer behovet for at høste knoglemarv og forbedrer dermed sikkerheden og effektiviteten.
NETs spiller også en rolle i atrieflimren forbundet med hjertemodellering. Imidlertid blev store dyr som hunde og svin brugt til at modellere atrieflimren, da mus mangler et atrium, der er stort nok til at etablere en genoptagelsescyklus eller AF-modellen, medmindre specifikke ionkanaler eller signalveje slås ned eller slås ud12. Mens det er muligt at inducere atrieflimren hos rotter og isolere neutrofiler fra rotte perifert blod som tidligere beskrevet, stødte forskerne på en begrænsning, hvorved kun 2 x 105-5 x 105 neutrofiler kunne isoleres fra perifert blod (10 ml pr. Rotte). Ekstraktion af tilstrækkelige NETs på hvert tidspunkt krævede ca. 10-25 rotter (5 x 106 neutrofiler i alt), hvilket resulterede i en tidskrævende, dyr og ofte lavt udbytteproces 13. I denne henseende præsenterer Li He og kolleger en knoglemarvsorienteret strategi for at opnå tilstrækkelige NET'er fra rotter14. I deres artikel giver de en omfattende beskrivelse af isolerende neutrofiler fra rotteknoglemarv og sammenligner NET-sekretionsfunktionerne hos rotteperifere og knoglemarvsneutrofiler. De to skitserede metoder imødekommer forskellige eksperimentelle mål, hvilket begge resulterer i tilstrækkelige mængder rotteknoglemarvsneutrofiler, samtidig med at antallet af nødvendige rotter reduceres. To-trins isolationsmetoden viste overlegen neutrofilrensning, mens et-trinsmetoden viste sig tidseffektiv med acceptable rensningsniveauer. Desuden sammenlignede forskerne NETosis og NET-dannelse mellem rotteknoglemarvsneutrofiler og deres perifere modstykker og fandt samme styrke som PMN. Disse resultater bidrager væsentligt til neutrofilrelaterede undersøgelser af atrieflimren og understreger vigtigheden af fleksibelt at vælge forskellige kilder til neutrofilisolering hos forskellige forsøgsdyr med forskellige neutrofilfordelinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev udført under en projektlicens (nr. 20211404A) udstedt af Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University for pleje og brug af dyr. I overensstemmelse med etiske retningslinjer blev rotterne anvendt i denne undersøgelse opretholdt i et kontrolleret miljø med en 12 timers lys/mørk cyklus, temperatur på 22-24 °C og fugtighed på 50%-60%. Rotterne fik adgang til mad og vand ad libitum. De dyr, der blev anvendt i denne undersøgelse, var 6-8 uger gamle Sprague Dawley (SD) hanrotter, der vejede ca. 250 g og specifikt patogenfri. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Isolering af rotteneutrofiler
- Høst af knoglemarv
- Anbring rotten i en passende beholder til anæstesi (se materialetabel). Rotten får 3 % isofluran, indtil dyret er bevidstløst. Kontroller, om der ikke er noget svar på en tåklemme eller haleklemme for at sikre dybden af anæstesi.
- Når rotten er dybt bedøvet, skal du udføre cervikal dislokation ved at placere rotten på ryggen og holde halen med den ene hånd, mens du tager fat i hovedet med den anden hånd. Forskyd nakken hurtigt og fast ved at anvende en pludselig og stærk opadgående kraft på halen, mens du trækker hovedet nedad, indtil halshvirvelsøjlen er afskåret. Vent på bekræftelse af døden, såsom ophør af vejrtrækning og mangel på hjerteslag, før du fortsætter med vævsindsamling eller bortskaffelse.
- Dyp rotten i 75% ethanol og lad den sidde i et par minutter for at sterilisere pels og hud. Læg rotten på ryggen og afskær underbenene ved hoften for at beskytte lårbenshovedet. Brug dissektionssaks til at skære gennem ledbåndet ved haseleddet og fold knæleddet bagud for at udsætte lårbenet og skinnebenet.
- Brug tang og saks til forsigtigt at fjerne muskler, sener og andet væv, der er forbundet med knoglerne. Skyl knoglerne med Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) for at fjerne eventuelle resterende vævsrester og blod. Gentag to gange mere, i alt tre vaske. Anbring de rensede knogler i en steril beholder.
- Brug en 5 eller 10 ml sprøjte med en nål til at stikke marven gennem begge ender af knoglen for at løsne marvmatrixen. Skyl knoglemarven med 10-15 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier med en anden sprøjte, indtil ingen synlig knoglemarv kan skylles ud.
- Centrifuger knoglemarvscellerne ved 300 x g i 10 minutter ved 20 °C. Tilsæt 5-10 ml lysbuffer for røde blodlegemer (se materialetabel) for at resuspendere cellerne og inkubere ved stuetemperatur i 3 minutter. Tilsæt 4 gange mængden af HBSS til blandingen. Cellerne centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, supernatanten kasseres med en pipette, og den resulterende pellet anvendes til videre brug.
- Isolering af neutrofiler fra knoglemarv
- Udfør følgende yderligere trin for totrinsmetoden:
- Isoler knoglemarvsceller ved hjælp af det kommercialiserede neutrofile isolationssæt til rotter ved at følge producentens anvisninger (se materialetabellen).
- Der fremstilles en densitetsgradient ved lagdeling af 2 ml 55 % perkollreagens (se materialetabellen), 2 ml 65 % reagenset, 2 ml 70 % reagens og 2 ml 80 % reagens i et nyt 15 ml centrifugeglas. Glasset centrifugeres ved 800 x g i 40 minutter ved 20 °C med accelerationen indstillet til 5 og retardationen indstillet til 0 eller 1.
- Saml 70 % gradientlaget, herunder cellelagene ved grænsen mellem 65 % og 70 % gradientreagens, ved hjælp af en steril pipette. Overfør cellesuspensionen til et nyt 15 ml centrifugeglas. Tilsæt 15 ml HBSS i røret og vend forsigtigt røret flere gange for at vaske cellerne. Centrifuger røret ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Udfør følgende yderligere trin for ettrinsmetoden:
- Udsæt knoglemarvsceller for gradienterne uden at bruge rotteneutrofilisoleringssættet.
- Opsaml 70 % gradientlaget, herunder cellelagene ved grænsen mellem 65 % og 70 % gradient, ved hjælp af en steril pipette. Overfør cellesuspensionen til et nyt 50 ml centrifugerør og vask cellerne med HBSS. Centrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Tæl de isolerede neutrofiler ved hjælp af et hæmocytometer og vurder levedygtigheden ved hjælp af trypanblå farvning.
BEMÆRK: Protokollen kan ændres afhængigt af antallet af rotter og det ønskede antal isolerede neutrofiler. En acceptabel mængde knogler opnås fra tre rotter, når denne metode anvendes for første gang i en ny forsøgsindstilling. Alle procedurer skal udføres under sterile forhold. Isolering af neutrofiler fra knoglemarv bør udføres så hurtigt som muligt for at minimere celleskader og tab af levedygtighed.
- Udfør følgende yderligere trin for totrinsmetoden:
2. Erhvervelse af rotte-NETs
- Resuspender 0,5 x 108-1 x 108 isolerede neutrofiler i 4 ml RPMI-medier (suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin) i en steril 10 cm petriskål.
- Der tilsættes 500 nM PMA (se materialetabel) til den neutrofile suspension for at inducere NETosis. Der inkuberes i 3 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Til den negative kontrol tilsættes DNase I (10 E/ml) i neutrofilsuspensionen for at nedbryde de udskillede NETs.
- For at høste NET'erne skal du fjerne mediet og forsigtigt vaske NET'erne, der er fastgjort til petriskålen, med HBSS. Brug derefter intens skylning med 4 ml friske medier til hver plade for at løsne nettene fra pladen.
- Vaskemediet og pipetten opsamles ofte for fuldstændig resuspension af NETs.
- Centrifuger suspensionen ved 300 × g i 10 minutter ved 20 °C for at fjerne eventuelle flydende celler.
- Suspensionen indeholdende NETs overføres til et sterilt glas og opbevares ved -20 °C til videre brug inden for 2 uger.
BEMÆRK: NETs er følsomme over for nedbrydning, så det anbefales at bruge friskhøstet materiale for de bedste resultater.
3. Kontrol af tilstedeværelsen af NETs
- Fastgør cellerne (fra trin 2.4) på dæksedler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og NETs (fra trin 2.7) i 30 min til 1 time.
- Vend dækslet på en PBS / PBST-dråbe på et paraffinfilmdækket reagensglasstativ, og gentag vaskeprocessen tre gange i 5 minutter hver.
- Permeabiliser cellerne med 0,5% Triton-X-100 i 10 min ved stuetemperatur og vask tre gange i PBS / PBST i 1 min hver. Forsegl cellerne med det 10% normale æselserum (se materialetabel) ved stuetemperatur i 1 time.
- Cellerne inkuberes med anti-rotte neutrofile elastase antistof og anti-rotte myeloperoxidase antistof (se tabel over materialer) natten over ved 4 °C. Vask derefter dæksedlen i PBS/PBST tre gange i 5 minutter hver.
- Inkuber cellerne med det sekundære antistof A488-konjugeret æselanti-kanin IgG (H + L), A594-konjugeret æsel anti-mus IgG (H + L) og A594-konjugeret ged anti-mus IgG1 (se materialetabel) ved stuetemperatur i 1 time i mørke. Vask derefter dæksedlen i PBS/PBST tre gange i 5 minutter hver.
- Plettede cellekerner og NET-skeletter med 10 mg/ml DAPI. Vask derefter dæksedlen i PBS/PBST tre gange i 5 minutter hver.
- Placer en dråbe monteringsmedium på et glasglas, og vend dækslet med celler på det. Lad det tørre i 1 time til mikroskopisk analyse med nedsænkningslinser; Ellers er den klar til inspektion.
BEMÆRK: Der skal udvises stor forsigtighed ved manipulation af NET'er, selv efter fiksering, da de er ekstremt skrøbelige og let kan gå tabt under forberedelsen.
4. Kvantificering af NETs
- Forbered Tris-EDTA (TE) buffer og PicoGreen (dsDNA assay reagens) arbejdsløsning i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
- Forbered standarder ved at fortynde stam-DNA til koncentrationer på 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml og 1 μg/ml.
BEMÆRK: For at kvantificere koncentrationen af NET'er blev dsDNA-analysesættet (se materialetabellen) anvendt i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Tris-EDTA (TE) buffer og dsDNA assay reagenser blev klargjort under anvendelse af henholdsvis et 19 gange volumen dobbeltdestilleret vand eller et 199 gange volumen TE-buffer. Derefter blev der fremstillet standardopløsninger (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml og 1 μg/ml), og hver 50 μL af prøven blev kombineret med 450 μL TE-buffer. - Der tilsættes 50 μL af hver prøve til 450 μL TE-buffer.
- Der tilsættes 100 μL standarder eller prøver sammen med et tilsvarende volumen assayreagensarbejdsløsning til hvert hul i en plade med 96 brønde, inklusive standarder og prøver.
- Inkuber pladen ved stuetemperatur i 2-5 min, undgå direkte lys.
- Prøverne aflæses ved hjælp af en fluorescensmikropladelæser med et emissionsspektrum på ca. 530 nm og et absorbansspektrum på ca. 480 nm.
- Koncentrationen af NETs i hver prøve beregnes ved hjælp af standardkurven genereret af standarderne.
5. Analyse af NETs sekretion ved cellecytometri
- Tilsæt kerneplet (se materialetabel) til cellerne inkuberet i 96-brøndpladen for at nå en endelig koncentration på 10 ng / ml og inkubere i 30 minutter.
- Tilsæt cellefrit DNA (cfDNA, se materialetabel) plet til cellerne for at nå en endelig koncentration på 300 nM og inkuber i 10 min.
- Bland fluorescerende farvestoffer ved forsigtig pipettering. Supernatanten må ikke kasseres, og pellets må ikke vaskes.
- Læg prøvepladen i cytometerinstrumentet.
- Indstil parametrene for fokus og eksponeringstid for de forskellige kanaler: blå (f.eks. 377/50 nm, em: 470/22 nm), normalt med en eksponering på 30.000 ms, grøn (f.eks. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) normalt med en eksponering på 5.000 ms.
- Tag meget ensartede billeder af hele pladen i forskellige kanaler.
- Analyser kerneplettællingerne for forskellige grupper. Hvis de ligner hinanden, kan NETs sekretion bestemmes af cfDNA-plettallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen skitseret heri afgrænser to forskellige metoder, der hver især er kendetegnet ved forbedret rensning eller strømlinede trin. Begge metoder gav ca. 0,5 x 108-1 x 108 neutrofiler pr. rotte. Flowcytometrianalyse, der anvender annexin V-FITC / PI apoptosedetektionssæt, udviste cellelevedygtighed over 90%, sammenlignelig med mus og humane modstykker (figur 1). Mens lymfocytkontaminering syntes uundgåelig under neutrofilisolering fra knoglemarv, viste totrinsmetoden et forbedret renhedsniveau på 90% sammenlignet med de 50%, der blev opnået ved ettrinsmetoden (figur 2).
Sammenligneligt respons i NET-sekretion kunne ses mellem perifere neutrofiler og knoglemarvsneutrofiler, uanset PMA-stimulering (figur 3). Desuden udviste rotte-NET'er begrænsede tværbindingsmuligheder med hinanden (figur 4). I et forsøg på at dykke dybere ned i processen med rotte-NETosis blev PMA anvendt som inducer. NET'er blev detekteret via cfDNA-farvning, og omfattende billeder blev taget ved hjælp af en Cell Imaging Analyzer. Især udviste rotteneutrofiler en højere tilbøjelighed til spontan NETosis i modsætning til muse- og humane neutrofiler, selv uden ekstern stimulering. Inkubation med PMA førte til en stigning på 10% i cfDNA-indholdet efter 4 timer (figur 5). Når hver rotte blev udsat for 500 nM PMA, gav knoglemarven en slutkoncentration på 8-12 μg/mL NETTO DNA. Det er bemærkelsesværdigt, at intracellulært indhold blev ufuldstændigt ekstruderet i rotteneutrofiler under NETosis, hvilket resulterede i observation af adskillige intracellulære komponenter. Derudover udviste rotte-NET'er en tilbøjelighed til at danne en gazelignende film på grund af forbedrede vedhæftningstendenser, der præsenterede et tydeligt skylignende udseende.
Figur 1: Vurdering af neutrofils levedygtighed fra knoglemarvsisolering. Den optimale kilde til rotte neutrofil isolering er knoglemarv, hvilket letter efterfølgende neutrofil ekstracellulær fælde erhvervelse. Denne figur er tilpasset fra He et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Neutrofil oprensning fra perifert blod og knoglemarv via Wright-Giemsa-farvning. (A) Perifer blodoprindelse. (B) Knoglemarvsoprindelse via ettrinsmetoden. (C) Knoglemarvsoprindelse via totrinsmetoden. Knoglemarvsekstraktion tjener som den foretrukne tilgang til rotte neutrofilisolering og den efterfølgende erhvervelse af neutrofile ekstracellulære fælder. Skalabjælke = 20 μm. Forstørrelse = 400x. Denne figur er tilpasset fra He et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: NETTO sekretion ved inkubation med PMA eller PMA + DNase I. Knoglemarvsekstraktion repræsenterer den foretrukne vej til rotte neutrofil isolering og den efterfølgende indsamling af neutrofile ekstracellulære fælder. Denne figur er tilpasset fra He et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunofluorescerende analyse. Immunofluorescerende farvning af kernen (blå, A), MPO (grøn, B) og fusionere billede (C). NET: Neutrofil ekstracellulær fælde; MPO: Myeloperoxidase. Knoglemarvsekstraktion er den foretrukne metode til rotte neutrofil isolering og den efterfølgende indsamling af neutrofile ekstracellulære fælder. Skalabjælke = 50 μm. Forstørrelse = 200x. Denne figur er tilpasset fra He et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Omfattende analyse af cfDNA via cellebilleddannelsesanalysator under forskellige forhold. Fluorescerende farvning af cfDNA (grøn) og kerne (blå). Knoglemarvsekstraktion er den primære tilgang til rotte neutrofil isolering og den efterfølgende samling af neutrofile ekstracellulære fælder. Skalabjælke = 500 μm. Denne figur er tilpasset fra He et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering af neutrofiler udgør et afgørende trin i studiet af NETosis, hvor valget af en passende isolationsmetode er afgørende for at opnå pålidelige resultater. En vigtig faktor at veje er forekomsten af lymfocytforurening under isolering. Håndtering af denne udfordring er særlig vigtig, når man isolerer rotteneutrofiler fra knoglemarv. På trods af det særskilte tæthedsområde for neutrofiler (1,0814-1,0919, med en top ved 1,0919) sammenlignet med lymfocytter (1,0337-1,0765, med en top ved 1,0526), forbliver forurening med lymfocytter uundgåelig. Dette kan delvis tilskrives overflod af lymfocytter i knoglemarven og den øgede tæthed af umodne lymfocytter15. Teknikker såsom densitetsgradientseparation, såsom anvendelse af Percoll og Ficoll, kan hjælpe med at bremse lymfocytforurening, selvom det kan være udfordrende at opnå fuldstændig lymfocyteliminering. En specialiseret Percoll-opløsning, kalibreret til en specifik densitetsgradient, kan anvendes til at minimere forurening ved at udnytte densitetsvariansen mellem rotteneutrofiler og andre knoglemarvsceller. Derfor bør forskere omhyggeligt vurdere den potentielle indvirkning af lymfocytforurening på deres eksperimentelle resultater og træffe foranstaltninger til at afbøde dens indflydelse.
Denne undersøgelse understreger betydningen af at skræddersy isolationsmetoder til at matche specifikke eksperimentelle krav. I den tidligere beskrevne metode14 viste ettrinsmetoden sig at være mindre krævende med hensyn til tid og kræfter. Som sådan blev det godkendt til NET-erhvervelse på grund af den ubetydelige virkning af forurenende lymfocytter på NET-sekretion. Disse lymfocytter kunne efterfølgende elimineres under det sidste centrifugeringstrin. Omvendt blev totrinsmetoden anbefalet14 til bestræbelser, der medførte neutrofilisolering og efterfølgende evaluering af NETosis og NET-sekretion. Denne fremgangsmåde tillod præcis kvantificering af NET'er produceret af neutrofiler, samtidig med at indflydelsen af potentielle forstyrrende faktorer, der stammer fra andre cellekontamineringer, minimeres.
Der kan foretages ændringer i isolationsprotokollen for at forbedre både udbytte og renhed. For eksempel kan brugen af et optimeret densitetsgradientreagenssæt give flere neutrofiler. Skånsomme pipetterings- og vaskemetoder kan ligeledes mindske celletab og styrke renheden. Fejlfindingshandlinger såsom overvågning af bufferens pH og temperatur sammen med justering af centrifugeringsparametre kan effektivt løse udfordringer, der opstår under isoleringsprocessen. En tilknyttet begrænsning af knoglemarvsisolering ligger i sandsynligheden for umoden neutrofil og anden knoglemarvscellekontaminering, hvilket påvirker både renhed og udbytte. Udtænkning af en strømlinet tilgang til at udvise lymfocytter kan forbedre den samlede isolationseffektivitet. En anden begrænsning vedrører nødvendigheden af dyreofring til knoglemarvsisolering, som kan være uegnet til langsgående undersøgelser af rotteneutrofiler in vivo.
Neutrofil isolering for mennesker er overvejende afhængig af perifert blod. Konventionelle metoder omfatter Ficoll-Paque, Percoll og immunomagnetisk perleseparation 16,17,18. Ficoll-tilgangen adskiller leukocytpopulationer baseret på opdrift og er afhængig af et kontrastmiddel til at differentiere neutrofiler. Det giver enkelhed og omkostningseffektivitet, men går på kompromis med renhed og udbytte og giver udfordringer med at eliminere røde blodlegemer. På den anden side udnytter Percoll densitetsgradienter, hvilket giver større neutrofil renhed og udbytte på bekostning af specialudstyr og øgede udgifter og tid19. Immunomagnetisk perleseparation er en nyere, mere specifik teknik, der anvender antistofkonjugerede magnetiske perler, der specifikt binder til neutrofiler med minimal forurening fra andre leukocytter. Selvom det kan automatiseres, kræver det specialudstyr og medfører højere omkostninger på grund af perleudgifter. Når forskere vælger en neutrofil isolationsmetode, skal de afveje udbytte, renhed, omkostninger og kompleksitet. I øjeblikket involverer den mest hensigtsmæssige metode til human neutrofilisolering anvendelse af PolymorphPrep20. Denne fremgangsmåde giver højt rensede neutrofiler i betydelige mængder inden for et kort tidsrum. PolymorphPreps princip afhænger af celleseparation i henhold til densitet.
Hos mus er isolering af neutrofiler fra perifert blod ikke tilrådeligt på grund af lave blodvolumener og udfordringen med at sikre tilstrækkelig mængde og renhed til nedstrømsforsøg. På trods af at rotter giver tilstrækkelige blodmængder (10 ml pr. Rotte), adskiller deres perifere blodegenskaber sig fra mennesker og mus. Rotter udviser i sagens natur mangler i neutrofilekstraktion, hvor monocytter er de mest rigelige kerneceller13,14. Derfor giver perifer blodisolering kun 2 x 105-5 x 105 neutrofiler fra en enkelt rotte. Knoglemarv tjener som en mere levedygtig neutrofil kilde, der tilbyder en let tilgængelig og rigelig forsyning uanset dyrets infektionsstatus. Alternativt er det upålideligt og indviklet at inducere et inflammatorisk miljø i bughulen eller thoraxen for at forbedre neutrofilinfiltration til isolering. Som sådan fremstår knoglemarvsekstraktion som en praktisk, pålidelig vej til rotteneutrofilisolering21.
NETosis involverer forskellige cellulære processer, der omfatter DNA-dekondensation, autofagi og intracellulær matrixudvisning1. Hos mennesker er NET-ekstrudering omfattende og efterlader rester af cellemembranen. Interessant nok udviser rotteneutrofile undersøgelser divergerende mønstre og afslører mere intracellulært indhold efter stimulering. På trods af PMA-stimulering udviser rotteneutrofiler ufuldstændig NET-ekstrudering, hvilket stemmer overens med deres spontane NETosis. Mærkeligt nok viser rotte-NET'er en tilbøjelighed til aggregerede former (aggNETs) snarere end omfattende netværksstruktur, potentielt på grund af nedsat tværbindingsevne. Dette fænomen kan påvirke neutrofilaggregering betydeligt og påvirke det bredere immunrespons hos rotter. Fremtidige anvendelser af knoglemarvsisolering kan indebære sondering af forskellige signalveje og immunceller i NETosis. Derudover kan denne metode lette NETosis-udforskning i forskellige sygdomsmodeller og afsløre neutrofilers roller på tværs af forskellige patologier. I sidste ende er nye teknikker til isolering og karakterisering af NET'er lovende for at optrævle de mekanismer, der driver NETosis og dens funktionelle implikationer på tværs af forskellige dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 82004154, 81900311, 82100336 og 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
