Summary
Dit onderzoek schetst twee technieken voor het isoleren van overvloedige neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) uit het beenmerg van ratten. De ene methode combineert een commerciële neutrofielenisolatiekit met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, terwijl de andere alleen dichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt. Beide benaderingen leveren functionele NET's op die die van perifere bloedneutrofielen overtreffen.
Abstract
Het primaire doel van dit onderzoek was het ontwikkelen van een betrouwbare en efficiënte aanpak voor het isoleren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) uit het beenmerg van ratten. Deze inspanning kwam voort uit beperkingen die verband houden met de traditionele methode om NET's uit perifeer bloed te extraheren, voornamelijk als gevolg van de schaarste aan beschikbare neutrofielen voor isolatie. De studie onthulde twee verschillende methoden voor het verkrijgen van neutrofielen van ratten uit het beenmerg: een gestroomlijnde eenstapsprocedure die bevredigende zuiveringsniveaus opleverde, en een meer tijdrovend tweestapsproces dat een verbeterde zuiveringsefficiëntie vertoonde. Belangrijk is dat beide technieken een aanzienlijke hoeveelheid levensvatbare neutrofielen opleverden, variërend van 50 tot 100 miljoen per rat. Deze efficiëntie weerspiegelde de resultaten die werden verkregen door neutrofielen te isoleren uit zowel menselijke als muizenbronnen. Het is veelbetekenend dat neutrofielen afkomstig van het beenmerg van ratten vergelijkbare mogelijkheden vertoonden om NET af te scheiden in vergelijking met neutrofielen verkregen uit perifeer bloed. De op beenmerg gebaseerde methode produceerde echter consequent aanzienlijk grotere hoeveelheden van zowel neutrofielen als NET's. Deze aanpak toonde het potentieel aan om aanzienlijk grotere hoeveelheden van deze cellulaire componenten te verkrijgen voor verdere stroomafwaartse toepassingen. Met name deze geïsoleerde NET's en neutrofielen zijn veelbelovend voor een reeks toepassingen, op het gebied van ontstekingen, infecties en auto-immuunziekten.
Introduction
Neutrofielen vormen een cruciale subset van leukocyten die een cruciale rol spelen in de aangeboren immuunrespons. Ze worden gekenmerkt door meerlobbige kernen en korrels die verschillende proteasen en antimicrobiële peptiden bevatten1. Neutrofielen werken voornamelijk door degranulatie, fagocytose en de vorming van NET's. De waarneming van NET's werd voor het eerst gedaan door Takei et al. in 1996 tijdens een experiment waarbij neutrofielen werden gestimuleerd met phorbolmyristaatacetaat (PMA)2. Vervolgens werd het proces van NET-vorming in 2004 door Brinkmann et al.3 "NETosis" genoemd. Hun onderzoek belichtte verder de cruciale rol van NET in neutrofielen-gemedieerde antimicrobiële reacties. NET's zijn webachtige structuren die zijn samengesteld uit chromatine, histonen en antimicrobiële eiwitten die vrijkomen uit geactiveerde neutrofielen als reactie op infectieuze en inflammatoire stimuli. NET's kunnen binnendringende ziekteverwekkers immobiliseren en doden door ze te vangen en bloot te stellen aan een hoge concentratie antimicrobiële peptiden en proteasen 1,3. Bovendien dragen NET's bij aan de klaring van apoptotische cellen en nemen ze deel aan het oplossen van ontstekingen. Recente studies geven ook aan dat een overmatige vorming van NET's of verminderde NET-afbraak kan leiden tot weefselbeschadiging, auto-immuunziekten, trombogenese en verminderde revascularisatie 4,5,6,7,8,9,10.
De pathogene rol van NET bij ongecontroleerde fibrose na een myocardinfarct en de vorming van ventriculaire aneurysma's is aangetoond door de uitbreiding van perivasculaire fibrose 4,11. Het myocardinfarctmodel en de isolatie van neutrofielen uit het beenmerg bij muizen zijn beide goed ingeburgerd. Polymorfonucleaire (PMN) leukocyten, een type witte bloedcellen dat overvloedig aanwezig is in menselijk bloed, dienen als een uitstekende bron voor het isoleren van menselijke neutrofielen. Deze methode elimineert de noodzaak om beenmerg te oogsten, waardoor de veiligheid en efficiëntie worden verbeterd.
NET spelen ook een rol bij boezemfibrilleren geassocieerd met cardiale remodellering. Grote dieren zoals honden en varkens werden echter gebruikt om boezemfibrilleren te modelleren, omdat muizen geen atrium hebben dat groot genoeg is om een herintredingscyclus of het AF-model tot stand te brengen, tenzij specifieke ionkanalen of signaalroutes worden neergehaald of uitgeschakeld12. Hoewel het mogelijk is om atriumfibrilleren bij ratten te induceren en neutrofielen te isoleren uit perifeer bloed van ratten, zoals eerder beschreven, stuitten onderzoekers op een beperking waarbij slechts 2 x 105-5 x 105 neutrofielen konden worden geïsoleerd uit perifeer bloed (10 ml per rat). Voor het extraheren van voldoende NET's op elk tijdstip waren ongeveer 10-25 ratten nodig (5 x 106 neutrofielen in totaal), wat resulteerde in een tijdrovend, duur en vaak laag renderend proces13. In dit verband presenteren Li He en collega's een beenmerggerichte strategie om adequate NET's van ratten teverkrijgen14. In hun artikel geven ze een uitgebreide beschrijving van het isoleren van neutrofielen uit het beenmerg van ratten en vergelijken ze de NET-secretiemogelijkheden van perifere neutrofielen van ratten en neutrofielen van beenmerg. De twee geschetste methoden komen tegemoet aan verschillende experimentele doelen, die beide resulteren in voldoende hoeveelheden beenmergneutrofielen van ratten en tegelijkertijd het aantal benodigde ratten verminderen. De tweestapsisolatiemethode toonde een superieure neutrofielenzuivering aan, terwijl de eenstapsmethode tijdbesparend bleek met acceptabele zuiveringsniveaus. Bovendien vergeleken de onderzoekers NETosis en NET-vorming tussen beenmergneutrofielen van ratten en hun perifere tegenhangers, waarbij ze een gelijke potentie vonden met PMN. Deze bevindingen dragen aanzienlijk bij aan neutrofielen-gerelateerde studies van atriumfibrilleren en onderstrepen het belang van het flexibel selecteren van verschillende bronnen voor neutrofielenisolatie in verschillende proefdieren met verschillende neutrofielenverdelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd uitgevoerd onder een projectlicentie (nr. 20211404A) verleend door de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University, in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University voor de verzorging en het gebruik van dieren. In overeenstemming met ethische richtlijnen werden de ratten die in dit onderzoek werden gebruikt, gehouden in een gecontroleerde omgeving met een licht/donkercyclus van 12 uur, een temperatuur van 22-24 °C en een luchtvochtigheid van 50%-60%. De ratten kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. De dieren die in deze studie werden gebruikt, waren 6-8 weken oude mannelijke ratten van Sprague Dawley (SD), met een gewicht van ongeveer 250 g en vrij van specifieke pathogeen. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Isolatie van neutrofielen van ratten
- Oogsten van beenmerg
- Plaats de rat in een geschikte container voor anesthesie (zie Materiaaltabel). Dien 3% isofluraan toe aan de rat totdat het dier bewusteloos is. Controleer op de afwezigheid van een reactie op een teenknijp of staartknijp om de diepte van de anesthesie te garanderen.
- Zodra de rat diep verdoofd is, voert u cervicale dislocatie uit door de rat op zijn rug te leggen en zijn staart met één hand vast te houden terwijl u met de andere hand het hoofd vastpakt. Ontwricht de nek snel en stevig door een plotselinge en sterke opwaartse kracht op de staart uit te oefenen terwijl u het hoofd naar beneden trekt totdat de cervicale wervelkolom is doorgesneden. Wacht op bevestiging van overlijden, zoals stoppen met ademen en gebrek aan hartslag, voordat u doorgaat met het verzamelen of weggooien van weefsel.
- Dompel de rat in 75% ethanol en laat hem een paar minuten zitten om de vacht en huid te steriliseren. Leg de rat op zijn rug en snijd de onderste ledematen bij de heup door om de kop van het dijbeen te beschermen. Gebruik een dissectieschaar om het ligament bij het spronggewricht door te knippen en vouw het kniegewricht naar achteren om het dijbeen en het scheenbeen bloot te leggen.
- Verwijder met een tang en schaar voorzichtig alle spieren, pezen en andere weefsels die met de botten zijn verbonden. Spoel de botten af met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) om achtergebleven weefselresten en bloed te verwijderen. Herhaal dit nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten. Plaats de schoongemaakte botten in een steriele container.
- Gebruik een spuit van 5 of 10 ml met een naald om het merg door beide uiteinden van het bot te prikken om de beenmergmatrix los te maken. Spoel het beenmerg met 10-15 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media met een andere spuit, totdat er geen zichtbaar beenmerg meer kan worden weggespoeld.
- Centrifugeer de beenmergcellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Voeg 5-10 ml lysebuffer voor rode bloedcellen toe (zie materiaaltabel) om de cellen te resuspenderen en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 4 keer het volume HBSS toe aan het mengsel. Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatans weg met een pipet en gebruik de resulterende pellet voor verder gebruik.
- Isolatie van neutrofielen uit het beenmerg
- Voer voor de tweestapsmethode de volgende aanvullende stappen uit:
- Isoleer beenmergcellen met behulp van de in de handel gebrachte isolatiekit voor neutrofielen bij ratten volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Bereid een dichtheidsgradiënt voor door 2 ml 55% percoll-reagens (zie materiaaltabel), 2 ml 65% van het reagens, 2 ml 70% reagens en 2 ml 80% reagens in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml in lagen aan te brengen. Centrifugeer de buis bij 800 x g gedurende 40 minuten bij 20 °C, met de versnelling ingesteld op 5 en de vertraging op 0 of 1.
- Verzamel de 70% gradiëntlaag, inclusief de cellagen op de grens tussen 65% en 70% gradiëntreagens, met behulp van een steriele pipet. Breng de celsuspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Voeg 15 ml HBSS toe aan de buis en keer de buis voorzichtig meerdere keren om om de cellen te wassen. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Voer voor de methode in één stap de volgende aanvullende stappen uit:
- Onderwerp beenmergcellen aan de gradiënten zonder gebruik te maken van de isolatiekit voor neutrofielen bij ratten.
- Verzamel de 70% gradiëntlaag, inclusief de cellagen op de grens tussen 65% en 70% gradiënt, met behulp van een steriele pipet. Breng de celsuspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml en was de cellen met HBSS. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Tel de geïsoleerde neutrofielen met behulp van een hemocytometer en beoordeel de levensvatbaarheid met behulp van trypanblauwe kleuring.
OPMERKING: Het protocol kan worden aangepast afhankelijk van het aantal ratten en het gewenste aantal geïsoleerde neutrofielen. Van drie ratten wordt een aanvaardbare hoeveelheid botten verkregen wanneer deze methode voor het eerst in een nieuwe experimentele setting wordt gebruikt. Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. De isolatie van neutrofielen uit het beenmerg moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om celbeschadiging en verlies van levensvatbaarheid tot een minimum te beperken.
- Voer voor de tweestapsmethode de volgende aanvullende stappen uit:
2. Verwerving van NET's voor ratten
- Resuspendeer 0,5 x 108-1 x 108 geïsoleerde neutrofielen in 4 ml RPMI-media (aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine) in een steriele petrischaal van 10 cm.
- Voeg 500 nM PMA (zie Materiaaltabel) toe aan de neutrofielensuspensie om NETosis te induceren. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Voeg voor de negatieve controle DNase I (10 E/ml) toe aan de neutrofielensuspensie om de uitgescheiden NET's af te breken.
- Om de NET's te oogsten, verwijdert u de media en wast u de NET's die aan de petrischaal zijn bevestigd voorzichtig met HBSS. Gebruik vervolgens intensief spoelen met 4 ml vers medium voor elke plaat om de NET's van de plaat los te maken.
- Vang het wasmedium en de pipet regelmatig op voor volledige resuspensie van NET.
- Centrifugeer de suspensie bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 20 °C om eventuele zwevende cellen te verwijderen.
- Breng de suspensie met de NET's over in een steriele buis en bewaar deze bij -20 °C voor verder gebruik binnen 2 weken.
OPMERKING: NET's zijn gevoelig voor degradatie, dus het wordt aanbevolen om vers geoogst materiaal te gebruiken voor de beste resultaten.
3. Verificatie van de aanwezigheid van NET's
- Bevestig de cellen (uit stap 2.4) op dekglaasjes met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten en NET's (uit stap 2.7) gedurende 30 minuten tot 1 uur.
- Keer het dekglaasje om op een PBS/PBST-druppel op een met paraffinefilm bedekte reageerbuisstandaard en herhaal het wasproces driemaal gedurende 5 minuten.
- Permeabiliseer de cellen met 0,5% Triton-X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was driemaal in PBS/PBST gedurende elk 1 minuut. Sluit de cellen af met het 10% normale ezelinnenserum (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Incubeer de cellen met het anti-rat neutrofiele elastase antilichaam en anti-rat myeloperoxidase antilichaam (zie tabel met materialen) gedurende een nacht bij 4 °C. Was vervolgens het dekglaasje driemaal in PBS/PBST gedurende 5 minuten.
- Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam A488-geconjugeerde ezel anti-konijn IgG (H + L), A594-geconjugeerde ezel anti-muis IgG (H + L) en A594-geconjugeerde geit anti-muis IgG1 (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Was vervolgens het dekglaasje driemaal in PBS/PBST gedurende 5 minuten.
- Kleurcelkernen en NET-skeletten met 10 mg/ml DAPI. Was vervolgens het dekglaasje driemaal in PBS/PBST gedurende 5 minuten.
- Plaats een druppel montagemedium op een glasplaatje en keer het dekglaasje met cellen erop. Laat het 1 uur drogen voor microscopische analyse met immersielenzen; anders is het klaar voor inspectie.
OPMERKING: Grote voorzichtigheid is geboden bij het manipuleren van NET's, zelfs na fixatie, omdat ze uiterst kwetsbaar zijn en gemakkelijk verloren kunnen gaan tijdens de bereiding.
4. Kwantificering van NET's
- Bereid Tris-EDTA (TE)-buffer en PicoGreen (dsDNA-assay-reagens) werkoplossing volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Bereid standaarden voor door het DNA van de voorraad te verdunnen tot concentraties van 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml en 1 μg/ml.
OPMERKING: Om de concentratie van NET te kwantificeren, werd de dsDNA-testkit (zie Tabel met materialen) gebruikt, in overeenstemming met de richtlijnen van de fabrikant. Tris-EDTA (TE)-buffer en dsDNA-testreagentia werden klaargemaakt met respectievelijk een 19-voudig volume dubbel gedestilleerd water of een 199-voudig volume TE-buffer. Vervolgens werden standaardoplossingen (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml en 1 μg/ml) bereid en werd elke 50 μl van het monster gecombineerd met 450 μl TE-buffer. - Voeg 50 μL van elk monster toe aan de 450 μL TE-buffer.
- Voeg 100 μL standaarden of monsters samen met een gelijk volume testreagenswerkoplossing toe aan elk putje in een plaat met 96 putjes, inclusief standaarden en monsters.
- Incubeer de plaat 2-5 minuten bij kamertemperatuur en vermijd direct licht.
- Lees de monsters af met behulp van een fluorescentie-microplaatlezer met een emissiespectrum van ongeveer 530 nm en een absorptiespectrum van ongeveer 480 nm.
- Bereken de concentratie van NET's in elk monster met behulp van de standaardcurve die door de standaarden wordt gegenereerd.
5. Analyse van NET-secretie door middel van celcytometrie
- Voeg nucleuskleuring (zie Materiaaltabel) toe aan de cellen die zijn geïncubeerd in de plaat met 96 putjes om een uiteindelijke concentratie van 10 ng/ml te bereiken en incubeer gedurende 30 minuten.
- Voeg celvrije DNA-kleuring (cfDNA, zie Materiaaltabel) toe aan de cellen om een eindconcentratie van 300 nM te bereiken en incubeer gedurende 10 minuten.
- Meng de fluorescerende kleurstoffen door voorzichtig te pipetteren. Gooi het supernatans niet weg en was de pellet niet.
- Laad de monsterplaat in het cytometerinstrument.
- Stel de parameters voor scherpstelling en belichtingstijd in voor de verschillende kanalen: blauw (bijv. 377/50 nm, em: 470/22 nm), meestal met een belichting van 30.000 ms, groen (bijv. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) meestal met een belichting van 5.000 ms.
- Leg zeer uniforme beelden vast van de hele plaat op verschillende kanalen.
- Analyseer het aantal kernkleuringen voor verschillende groepen. Als ze vergelijkbaar zijn, kan de NET-secretie worden bepaald aan de hand van het aantal cfDNA-vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierin beschreven protocol schetst twee verschillende methoden, elk gekenmerkt door verbeterde zuivering of gestroomlijnde stappen. Beide methoden leverden ongeveer 0,5 x 108-1 x 108 neutrofielen per rat op. Flowcytometrie-analyse, waarbij gebruik werd gemaakt van de annexine V-FITC/PI-apoptosedetectiekit, vertoonde een cellevensvatbaarheid van meer dan 90%, vergelijkbaar met die van muizen en mensen (Figuur 1). Hoewel besmetting met lymfocyten onvermijdelijk leek tijdens de isolatie van neutrofielen uit het beenmerg, vertoonde de tweestapsmethode een verbeterde zuiverheidsgraad van 90% in vergelijking met de 50% die werd bereikt door de eenstapsmethode (Figuur 2).
Vergelijkbare responsen in NET-secretie waren waarneembaar tussen perifere en beenmergneutrofielen, ongeacht PMA-stimulatie (Figuur 3). Bovendien vertoonden NET's bij ratten beperkte mogelijkheden om met elkaar te verknopen (figuur 4). In een poging om dieper in het proces van NETosis bij ratten te duiken, werd PMA gebruikt als inductoren. NET's werden gedetecteerd via cfDNA-kleuring en uitgebreide beelden werden vastgelegd met behulp van een Cell Imaging Analyzer. Met name neutrofielen van ratten vertoonden een hogere neiging tot spontane NETosis in tegenstelling tot neutrofielen van muizen en mensen, zelfs zonder externe stimulatie. Incubatie met PMA leidde tot een toename van 10% in het cfDNA-gehalte na 4 uur (Figuur 5). Bij blootstelling aan 500 nM PMA leverde het beenmerg van elke rat een eindconcentratie op van 8-12 μg/ml NET-DNA. Het is opmerkelijk dat de intracellulaire inhoud tijdens NETosis onvolledig werd geëxtrudeerd in neutrofielen van ratten, wat resulteerde in de observatie van talrijke intracellulaire componenten. Bovendien vertoonden NET's van ratten de neiging om een gaasachtige film te vormen als gevolg van verbeterde hechtingsneigingen, met een duidelijk wolkachtig uiterlijk.
Figuur 1: Beoordeling van de levensvatbaarheid van neutrofielen op basis van beenmergisolatie. De optimale bron voor neutrofielenisolatie bij ratten is beenmerg, wat de daaropvolgende verwerving van extracellulaire neutrofiele vallen vergemakkelijkt. Deze figuur is overgenomen uit He et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zuivering van neutrofielen uit perifeer bloed en beenmerg via Wright-Giemsa-kleuring. (A) Perifere bloedoorsprong. (B) Oorsprong van het beenmerg via de eenstapsmethode. (C) Oorsprong van het beenmerg via de tweestapsmethode. Beenmergextractie dient als de voorkeursbenadering voor de isolatie van neutrofielen bij ratten en de daaruit voortvloeiende verwerving van extracellulaire neutrofielenvallen. Schaalbalk = 20 μm. Vergroting = 400x. Deze figuur is overgenomen uit He et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: NET-secretie bij incubatie met PMA of PMA + DNase I. Beenmergextractie is de voorkeursroute voor de isolatie van neutrofielen bij ratten en de daaropvolgende verzameling van extracellulaire neutrofiele vallen. Deze figuur is overgenomen uit He et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescerende analyse. Immunofluorescerende kleuring van de kern (blauw, A), MPO (groen, B) en samenvoegbeeld (C). NET: neutrofiele extracellulaire val; MPO: Myeloperoxidase. Beenmergextractie is de favoriete methode voor het isoleren van neutrofielen bij ratten en het vervolgens verzamelen van extracellulaire neutrofiele vallen. Schaalbalk = 50 μm. Vergroting = 200x. Deze figuur is overgenomen uit He et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Uitgebreide analyse van cfDNA via cell imaging analyzer onder verschillende omstandigheden. Fluorescerende kleuring van cfDNA (groen) en nucleus (blauw). Beenmergextractie is de primaire benadering voor de isolatie van neutrofielen bij ratten en de daaruit voortvloeiende verzameling van extracellulaire neutrofiele vallen. Schaalbalk = 500 μm. Deze figuur is overgenomen uit He et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De isolatie van neutrofielen vormt een cruciale stap in het bestuderen van NETosis, waarbij de selectie van een geschikte isolatiemethode van het grootste belang is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Een belangrijke factor om af te wegen is het optreden van lymfocytenbesmetting tijdens isolatie. Het aanpakken van deze uitdaging is vooral belangrijk bij het isoleren van neutrofielen van ratten uit het beenmerg. Ondanks het duidelijke dichtheidsbereik van neutrofielen (1,0814-1,0919, met een piek van 1,0919) in vergelijking met lymfocyten (1,0337-1,0765, met een piek van 1,0526), blijft besmetting met lymfocyten onontkoombaar. Dit kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de overvloed aan lymfocyten in het beenmerg en de verhoogde dichtheid van onrijpe lymfocyten15. Technieken zoals dichtheidsgradiëntscheiding, zoals het gebruik van Percoll en Ficoll, kunnen helpen bij het terugdringen van lymfocytenbesmetting, hoewel het bereiken van volledige eliminatie van lymfocyten een uitdaging kan zijn. Een gespecialiseerde Percoll-oplossing, gekalibreerd op een specifieke dichtheidsgradiënt, kan worden gebruikt om besmetting te minimaliseren door te profiteren van de dichtheidsvariatie tussen neutrofielen van ratten en andere beenmergcellen. Daarom moeten onderzoekers de mogelijke impact van lymfocytenbesmetting op hun experimentele resultaten oordeelkundig beoordelen en maatregelen nemen om de invloed ervan te verminderen.
Deze studie onderstreept het belang van het afstemmen van isolatiemethoden om te voldoen aan specifieke experimentele vereisten. In de eerder beschreven methode14 bleek de eenstapsmethode minder veeleisend te zijn in termen van tijd en moeite. Als zodanig werd het goedgekeurd voor NET-acquisitie vanwege de onbeduidende impact van besmette lymfocyten op de NET-secretie. Deze lymfocyten kunnen vervolgens worden geëlimineerd tijdens de laatste centrifugatiefase. Omgekeerd werd voor inspanningen die neutrofielenisolatie en daaropvolgende evaluatie van NETosis en NET-secretie met zich meebrengen, de tweestapsmethode aanbevolen14. Deze aanpak maakte een nauwkeurige kwantificering mogelijk van NET's geproduceerd door neutrofielen, terwijl de invloed van potentiële verstorende factoren als gevolg van andere celbesmettingen werd geminimaliseerd.
Er kunnen wijzigingen worden aangebracht in het isolatieprotocol om zowel de opbrengst als de zuiverheid te verbeteren. Het gebruik van een geoptimaliseerde reagensset met dichtheidsgradiënt kan bijvoorbeeld meer neutrofielen opleveren. Behoedzame pipetteer- en wasmethoden kunnen ook celverlies verminderen en de zuiverheid versterken. Probleemoplossingsacties zoals het bewaken van de pH en temperatuur van de buffer, naast het aanpassen van centrifugatieparameters, kunnen de uitdagingen die zich voordoen tijdens het isolatieproces effectief aanpakken. Een bijbehorende beperking van beenmergisolatie ligt in de waarschijnlijkheid van onrijpe neutrofielen en andere beenmergcelbesmetting, waardoor zowel de zuiverheid als de opbrengst worden beïnvloed. Het bedenken van een gestroomlijnde aanpak om lymfocyten te verdrijven, zou de algehele isolatie-efficiëntie kunnen verbeteren. Een andere beperking heeft betrekking op de noodzaak van het offeren van dieren voor beenmergisolatie, wat mogelijk ongeschikt is voor longitudinaal onderzoek naar neutrofielen van ratten in vivo.
De isolatie van neutrofielen bij mensen is voornamelijk afhankelijk van perifeer bloed. Conventionele methoden omvatten Ficoll-Paque, Percoll en immunomagnetische parelscheiding 16,17,18. De Ficoll-benadering scheidt leukocytenpopulaties op basis van drijfvermogen en vertrouwt op een contrastmiddel om neutrofielen te onderscheiden. Het biedt eenvoud en kosteneffectiviteit, maar doet concessies aan zuiverheid en opbrengst en brengt uitdagingen met zich mee bij het elimineren van rode bloedcellen. Aan de andere kant maakt Percoll gebruik van dichtheidsgradiënten, wat een grotere zuiverheid en opbrengst van neutrofielen oplevert ten koste van gespecialiseerde apparatuur en hogere kosten en tijd19. Immunomagnetische parelscheiding is een nieuwere, meer specifieke techniek waarbij gebruik wordt gemaakt van antilichaam-geconjugeerde magnetische kralen die specifiek binden aan neutrofielen met minimale besmetting door andere leukocyten. Hoewel het vatbaar is voor automatisering, vereist het gespecialiseerde apparatuur en brengt het hogere kosten met zich mee als gevolg van hielkosten. Bij het selecteren van een neutrofielenisolatiemethode moeten onderzoekers opbrengst, zuiverheid, kosten en complexiteit afwegen. Momenteel is de handigste methode voor menselijke neutrofielenisolatie het gebruik van PolymorphPrep20. Deze aanpak levert in korte tijd sterk gezuiverde neutrofielen op in aanzienlijke hoeveelheden. Het principe van PolymorphPrep hangt af van celscheiding op basis van dichtheid.
Bij muizen is het isoleren van neutrofielen uit perifeer bloed af te raden vanwege de lage bloedvolumes en de uitdaging om voldoende hoeveelheid en zuiverheid te garanderen voor stroomafwaartse experimenten. Ondanks dat ratten voldoende bloedhoeveelheden leveren (10 ml per rat), verschillen hun perifere bloedkenmerken van mensen en muizen. Ratten vertonen inherent tekortkomingen in de extractie van neutrofielen, waarbij monocyten de meest voorkomende cellen met een kern zijn13,14. Vandaar dat perifere bloedisolatie slechts 2 x 105-5 x 105 neutrofielen van een enkele rat oplevert. Beenmerg dient als een meer levensvatbare bron van neutrofielen en biedt een direct beschikbare en overvloedige voorraad, ongeacht de infectiestatus van het dier. Als alternatief is het induceren van een ontstekingsomgeving in de buikholte of thorax om de infiltratie van neutrofielen voor isolatie te verbeteren onbetrouwbaar en ingewikkeld. Als zodanig komt beenmergextractie naar voren als een praktische, betrouwbare route voor de isolatie van neutrofielen bij ratten21.
NETosis omvat diverse cellulaire processen die DNA-decondensatie, autofagie en intracellulaire matrixuitdrijving omvatten1. Bij mensen is de NET-extrusie uitgebreid, waarbij restanten van het celmembraan achterblijven. Intrigerend is dat neutrofielenstudies bij ratten uiteenlopende patronen vertonen, waardoor na stimulatie meer intracellulaire inhoud wordt onthuld. Ondanks PMA-stimulatie vertonen neutrofielen van ratten onvolledige NET-extrusie, in lijn met hun spontane NETosis. Vreemd genoeg vertonen NET's bij ratten een neiging tot geaggregeerde vormen (aggNET's) in plaats van een uitgebreide netwerkstructuur, mogelijk als gevolg van een verminderd vermogen tot verknoping. Dit fenomeen kan een aanzienlijke invloed hebben op de aggregatie van neutrofielen, waardoor de bredere immuunrespons bij ratten wordt beïnvloed. Toekomstige toepassingen van beenmergisolatie zouden kunnen bestaan uit het onderzoeken van verschillende signaalroutes en immuuncellen in NETosis. Bovendien kan deze methode de exploratie van NETosis in verschillende ziektemodellen vergemakkelijken, waardoor de rol van neutrofielen in verschillende pathologieën wordt ontrafeld. Uiteindelijk zijn nieuwe technieken voor het isoleren en karakteriseren van NET veelbelovend voor het ontrafelen van de mechanismen die NETosis aansturen en de functionele implicaties ervan in verschillende diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Financiering: Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nrs. 82004154, 81900311, 82100336 en 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
