Summary
מחקר זה מתאר שתי טכניקות לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בשפע ממח עצם של חולדה. שיטה אחת משלבת ערכת בידוד נויטרופילים מסחרית עם צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ואילו השנייה משתמשת רק בצנטריפוגה שיפוע צפיפות. שתי הגישות מניבות NETs פונקציונליים העולים על אלה של נויטרופילים היקפיים בדם.
Abstract
המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לפתח גישה אמינה ויעילה לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) ממח עצם של חולדה. מאמץ זה נבע ממגבלות הקשורות לשיטה המסורתית של חילוץ NETs מדם היקפי, בעיקר בשל המחסור בנויטרופילים זמינים לבידוד. המחקר חשף שתי מתודולוגיות שונות להשגת נויטרופילים של חולדות ממח עצם: הליך יעיל בן שלב אחד שהניב רמות טיהור משביעות רצון, ותהליך דו-שלבי גוזל זמן רב יותר שהציג יעילות טיהור משופרת. חשוב לציין ששתי הטכניקות הניבו כמות משמעותית של נויטרופילים בני קיימא, בטווח שבין 50 ל-100 מיליון לכל חולדה. יעילות זו שיקפה את התוצאות שהתקבלו מבידוד נויטרופילים הן ממקורות אנושיים והן ממקורות מורינים. באופן משמעותי, נויטרופילים שמקורם במח עצם של חולדה הפגינו יכולות דומות להפריש NETs בהשוואה לנויטרופילים שהתקבלו מדם היקפי. עם זאת, השיטה המבוססת על מח עצם ייצרה באופן עקבי כמויות גדולות יותר הן של נויטרופילים והן של NETs. גישה זו הדגימה את הפוטנציאל להשיג כמויות גדולות יותר באופן משמעותי של רכיבים תאיים אלה עבור יישומים נוספים במורד הזרם. יש לציין כי רשתות ונויטרופילים מבודדים אלה טומנים בחובם הבטחה למגוון יישומים, המשתרעים על פני תחומי הדלקת, הזיהום והמחלות האוטואימוניות.
Introduction
נויטרופילים מהווים תת-קבוצה קריטית של לויקוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית המולדת. הם מאופיינים גרעינים מרובי אונות וגרגירים המכילים פרוטאזות שונות ופפטידים מיקרוביאליים1. נויטרופילים מתפקדים בעיקר באמצעות דה-גרנולציה, פגוציטוזה והיווצרות רשתות חשמל. התצפית של NETs נעשתה לראשונה על ידי Takei et al. בשנת 1996 במהלך ניסוי שבו נויטרופילים היו מגורים עם phorbol myristate אצטט (PMA)2. לאחר מכן, תהליך היווצרות הרשת נטבע "NETosis" על ידי Brinkmann et al.3 בשנת 2004. המחקר שלהם האיר עוד יותר את התפקיד המכריע של NETs בתגובות מיקרוביאליות בתיווך נויטרופילים. NETs הם מבנים דמויי רשת המורכבים מכרומטין, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים המשתחררים מנויטרופילים פעילים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. רשתות יכולות לשתק ולהרוג פתוגנים פולשים על ידי לכידתם וחשיפתם לריכוז גבוה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ופרוטאזות 1,3. בנוסף, NETs תורמים לסילוק תאים אפופטוטיים ומשתתפים ברזולוציית דלקת. מחקרים אחרונים מצביעים גם על כך שהיווצרות מוגזמת של NETs או פגיעה בפירוק הרשת עלולה להוביל לנזק לרקמות, הפרעות אוטואימוניות, טרומבוגנזה ופגיעה ברה-וסקולריזציה 4,5,6,7,8,9,10.
התפקיד הפתוגני של NETs בפיברוזיס בלתי מבוקר לאחר אוטם שריר הלב והיווצרות מפרצות חדריות הוכח באמצעות הרחבת פיברוזיס פריווסקולרי 4,11. מודל אוטם שריר הלב והבידוד של נויטרופילים ממח עצם בעכברים מבוססים היטב. לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN), סוג של תאי דם לבנים המצויים בשפע בדם אנושי, משמשים כמקור מצוין לבידוד נויטרופילים אנושיים. שיטה זו מבטלת את הצורך לקצור מח עצם, ובכך משפרת את הבטיחות והיעילות.
NETs גם לשחק תפקיד בפרפור פרוזדורים הקשורים שיפוץ הלב. עם זאת, בעלי חיים גדולים כגון כלבים וחזירים נוצלו כדי למדל פרפור פרוזדורים, מכיוון שלעכברים אין אטריום גדול מספיק כדי ליצור מחזור כניסה מחדש או מודל AF, אלא אם כן תעלות יונים ספציפיות או מסלולי איתות הופלו או הושמדו12. בעוד שניתן לגרום לפרפור פרוזדורים בחולדות ולבודד נויטרופילים מדם היקפי של חולדות כפי שתואר קודם לכן, החוקרים נתקלו במגבלה לפיה ניתן לבודד רק 2 x 105-5 x 10 5 נויטרופילים מדם היקפי (10 מ"ל לחולדה). חילוץ מספיק NETs בכל נקודת זמן דרש בערך 10-25 חולדות (5 x 106 נויטרופילים בסך הכל), וכתוצאה מכך תהליך גוזל זמן, יקר, ולעתים קרובות תפוקה נמוכה13. בהקשר זה, לי הא ועמיתיו מציגים אסטרטגיה מוכוונת מח עצם להשגת רשתות נאותות מחולדות14. במאמרם הם מספקים תיאור מקיף של בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה ומשווים את יכולות הפרשת NET של נויטרופילים היקפיים ומח עצם של חולדות. שתי השיטות המתוארות מספקות מטרות ניסוי נפרדות, ושתיהן מביאות לכמויות מספיקות של נויטרופילים ממח עצם של חולדה תוך הפחתת מספר החולדות הדרושות. שיטת הבידוד הדו-שלבי הדגימה טיהור נויטרופילים מעולה, בעוד ששיטת הצעד האחד הוכיחה את עצמה כיעילה בזמן עם רמות טיהור מקובלות. יתר על כן, החוקרים השוו NETosis והיווצרות NET בין נויטרופילים של מח עצם חולדה לבין עמיתיהם ההיקפיים, ומצאו עוצמה שווה עם PMN. ממצאים אלה תורמים באופן משמעותי למחקרים הקשורים לנויטרופילים על פרפור פרוזדורים ומדגישים את החשיבות של בחירה גמישה של מקורות שונים לבידוד נויטרופילים בחיות ניסוי שונות עם התפלגות נויטרופילים שונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר בוצע תחת רישיון פרויקט (מס '20211404A) שניתן על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן לטיפול ושימוש בבעלי חיים. בהתאם להנחיות אתיות, החולדות ששימשו במחקר זה נשמרו בסביבה מבוקרת עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%. לחולדות ניתנה גישה למזון ומים עד לליביטום. בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו חולדות זכרים בני 6-8 שבועות מסוג Sprague Dawley (SD), במשקל של כ-250 גרם וללא פתוגנים ספציפיים. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. בידוד נויטרופילים של חולדות
- קצירת מח עצם
- הניחו את החולדה במיכל מתאים להרדמה (ראו טבלת חומרים). יש לתת איזופלורן 3% לחולדה עד שהחיה מאבדת את הכרתה. בדוק היעדר תגובה לצביטה בבוהן או צביטת זנב כדי להבטיח את עומק ההרדמה.
- לאחר שהחולדה מורדמת עמוק, בצעו נקע צוואר הרחם על ידי הנחת החולדה על גבה והחזקת זנבה ביד אחת תוך אחיזת הראש ביד השנייה. נקע את הצוואר במהירות ובחוזקה על ידי הפעלת כוח פתאומי וחזק כלפי מעלה על הזנב תוך משיכת הראש כלפי מטה עד לקטיעת עמוד השדרה הצווארי. המתן לאישור על מוות, כגון הפסקת נשימה וחוסר דופק, לפני שתמשיך באיסוף רקמות או בסילוקן.
- טבלו את החולדה באתנול 75% ותנו לה לשבת כמה דקות כדי לעקר את הפרווה והעור. השכיבו את החולדה על גבה וקטעו את הגפיים התחתונות בירך כדי להגן על ראש עצם הירך. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את הרצועה במפרק ההוק ולקפל את מפרק הברך לאחור כדי לחשוף את עצם הירך והשוקה.
- בעזרת מלקחיים ומספריים, הסירו בזהירות את כל השרירים, הגידים ורקמות אחרות המחוברות לעצמות. שטפו את העצמות בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר את שאריות הרקמות והדם. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות, ובסך הכל שלוש כביסות. הכניסו את העצמות הנקיות למיכל סטרילי.
- השתמש מזרק 5 או 10 מ"ל עם מחט כדי לדחוף את המוח דרך שני הקצוות של העצם כדי לשחרר את מטריצת מח. שטפו את מח העצם במדיה של 10-15 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) עם מזרק אחר, עד שלא ניתן יהיה לשטוף את מח העצם הנראה לעין.
- צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. הוסף 5-10 מ"ל חיץ ליזה של תאי דם אדומים (ראה טבלת חומרים) כדי להשהות מחדש את התאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. מוסיפים פי 4 מנפח HBSS לתערובת. צנטריפוגה את התאים ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant עם פיפטה, ולהשתמש גלולה שנוצר לשימוש נוסף.
- בידוד נויטרופילים ממח עצם
- עבור השיטה הדו-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
- בודדו תאי מח עצם באמצעות ערכת בידוד נויטרופילים של חולדות ממוסחרת בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
- הכינו שיפוע צפיפות על ידי שכבות 2 מ"ל של מגיב פרקול 55% (ראה טבלת חומרים), 2 מ"ל של 65% מגיב, 2 מ"ל של 70% מגיב, ו -2 מ"ל של 80% מגיב בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 800 x גרם במשך 40 דקות ב 20 ° C, כאשר התאוצה מוגדרת ל 5 וההאטה מוגדרת ל 0 או 1.
- אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מגיב מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 15 מ"ל HBSS לתוך הצינור ובעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.
- עבור השיטה החד-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
- יש להעביר את תאי מח העצם לשיפועים מבלי להשתמש בערכת בידוד הנויטרופילים של החולדה.
- אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל ושטפו את התאים עם HBSS. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.
- ספרו את הנויטרופילים המבודדים באמצעות המוציטומטר והעריכו את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן.
הערה: ניתן לשנות את הפרוטוקול בהתאם למספר החולדות ולמספר הרצוי של נויטרופילים מבודדים. כמות מקובלת של עצמות מתקבלת משלוש חולדות כאשר שיטה זו משמשת לראשונה בסביבה ניסיונית חדשה. כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. בידוד נויטרופילים ממח העצם צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את הנזק לתאים ואת אובדן הכדאיות.
- עבור השיטה הדו-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
2. רכישת רשתות חולדות
- יש להשהות מחדש 0.5 x 108-1 x 108 נויטרופילים מבודדים במדיית RPMI של 4 מ"ל (בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ.
- הוסף PMA של 500 ננומטר (ראה טבלת חומרים) לתרחיף הנויטרופילים כדי לגרום ל- NETosis. יש לדגור במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- עבור הבקרה השלילית, הוסף DNase I (10 U/mL) לתרחיף הנויטרופילים כדי לפרק את הרשתות המופרשות.
- כדי לקצור את הרשתות, הסירו את המדיה ושטפו בעדינות את הרשתות המחוברות לצלחת הפטרי עם HBSS. לאחר מכן, השתמשו בשטיפה אינטנסיבית עם 4 מ"ל של מדיה טרייה עבור כל צלחת כדי לנתק את הרשתות מהצלחת.
- יש לאסוף את מדיום הכביסה והפיפטה לעתים קרובות להשעיה מוחלטת של הרשתות.
- צנטריפוגה את המתלה ב 300 × גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C כדי להסיר תאים צפים.
- העבירו את המתלה המכיל את ה-NETs לצינור סטרילי ואחסנו בטמפרטורה של -20°C לשימוש נוסף תוך שבועיים.
הערה: רשתות רגישות להתכלות, ולכן מומלץ להשתמש בחומר שזה עתה נקטף לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
3. אימות נוכחות של NETs
- תקן את התאים (משלב 2.4) על גבי כיסויים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ו- NETs (משלב 2.7) למשך 30 דקות עד שעה אחת.
- הפכו את הכיסוי על טיפת PBS/PBST על מעמד מבחנה מכוסה סרט פרפין וחזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
- יש להחדיר את התאים עם 0.5% Triton-X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים ב-PBS/PBST למשך דקה אחת כל אחד. אטמו את התאים עם סרום חמור 10% רגיל (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- לדגור על התאים עם נוגדן נויטרופיל אלסטאז נגד חולדה ונוגדן myeloperoxidase נגד חולדה (ראה טבלה של חומרים) במשך הלילה ב 4 ° C. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
- לדגור על התאים עם נוגדן משני A488-מצומד חמור נגד ארנב IgG (H + L), חמור מצומד A594-anti-mouse IgG (H + L), ו A594-מצומד עז נגד עכבר IgG1 (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה בחושך. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
- גרעיני תאי צביעה ושלדי נטו עם 10 מ"ג/מ"ל DAPI. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
- הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על מגלשת זכוכית והפכו את הכיסוי עם תאים עליו. תן לו להתייבש במשך 1 שעה לניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה; אחרת, הוא מוכן לבדיקה.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת מניפולציה של רשתות, גם לאחר קיבוע, מכיוון שהן שבירות ביותר ויכולות בקלות ללכת לאיבוד במהלך ההכנה.
4. כימות רשתות
- הכן את מאגר Tris-EDTA (TE) ואת פתרון העבודה PicoGreen (מגיב בדיקת dsDNA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- הכינו תקנים על ידי דילול DNA מלאי לריכוזים של 1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מיקרוגרם/מ"ל.
הערה: כדי לכמת את ריכוז ה-NETs, נעשה שימוש בערכת בדיקת dsDNA (ראה טבלת חומרים), בהתאם להנחיות היצרן. חיץ Tris-EDTA (TE) וריאגנטים לבדיקת dsDNA הוכנו באמצעות נפח של פי 19 של מים מזוקקים כפול או נפח של פי 199 של חיץ TE, בהתאמה. לאחר מכן הוכנו תמיסות סטנדרטיות (1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מק"ג/מ"ל), וכל 50 מיקרוליטר מהמדגם שולבו עם 450 מיקרוליטר של חיץ TE. - הוסף 50 μL מכל דגימה למאגר TE של 450 μL.
- הוסף 100 μL של תקנים או דוגמאות יחד עם נפח שווה של פתרון עבודה מגיב בדיקה לכל באר בלוח 96 בארות, כולל תקנים ודגימות.
- דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות, תוך הימנעות מאור ישיר.
- קרא את הדגימות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי עם ספקטרום פליטה של כ-530 ננומטר וספקטרום ספיגה של כ-480 ננומטר.
- חשב את ריכוז ה- NETs בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת על ידי התקנים.
5. ניתוח הפרשת NETs על ידי ציטומטריה של התא
- הוסיפו כתם גרעין (ראו טבלת חומרים) לתאים המודגרים בצלחת בת 96 הקידוחים כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל ולדגור במשך 30 דקות.
- הוסיפו לתאים כתם DNA ללא תאים (cfDNA, ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לריכוז סופי של 300 ננומטר ולדגור במשך 10 דקות.
- מערבבים את הצבעים הפלואורסצנטיים על ידי פיפטינג עדין. אין להשליך את הסופרנאטנט או לשטוף את הכדור.
- טען את צלחת הדגימה במכשיר הציטומטר.
- הגדר את הפרמטרים למיקוד ולזמן חשיפה עבור הערוצים השונים: כחול (לדוגמה: 377/50 ננומטר, em: 470/22 ננומטר), בדרך כלל עם חשיפה של 30,000 ננומטר, ירוק (לדוגמה: 483/32 ננומטר, eM: 536/40 ננומטר) בדרך כלל עם חשיפה של 5,000 אלפיות השנייה.
- צלם תמונות אחידות במיוחד של כל הלוח בערוצים שונים.
- נתח את ספירת כתמי הגרעין עבור קבוצות שונות. אם הם דומים, הפרשת NETs יכולה להיקבע על ידי ספירת כתמי cfDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שתי שיטות נפרדות, שכל אחת מהן מאופיינת בטיהור משופר או בצעדים יעילים. שתי השיטות הניבו בערך 0.5 x 108-1 x 108 נויטרופילים לכל חולדה. ניתוח ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בערכת זיהוי אפופטוזיס ANNEXIN V-FITC/PI, הראה כדאיות תאים מעל 90%, בדומה לעמיתיהם בעכבר ובבני אדם (איור 1). בעוד שזיהום לימפוציטים נראה בלתי נמנע במהלך בידוד נויטרופילים ממח העצם, השיטה הדו-שלבית הדגימה רמת טוהר משופרת של 90% בהשוואה ל-50% שהושגו בשיטה החד-שלבית (איור 2).
תגובות דומות בהפרשת NET הובחנו בין נויטרופילים היקפיים לנויטרופילים של מח עצם, ללא קשר לגירוי PMA (איור 3). יתר על כן, רשתות של חולדות הציגו יכולות קישור צולבות מוגבלות זו עם זו (איור 4). במאמץ להעמיק בתהליך ה-NETosis של חולדות, PMA הועסק כמשרה. NETs זוהו באמצעות צביעת cfDNA, ותמונות מקיפות צולמו באמצעות מנתח הדמיה תאית. יש לציין כי נויטרופילים של חולדות הפגינו נטייה גבוהה יותר לנטאוזיס ספונטני בניגוד לנויטרופילים של עכברים ובני אדם, גם ללא גירוי חיצוני. הדגירה עם PMA הובילה לעלייה של 10% בתכולת cfDNA לאחר 4 שעות (איור 5). כאשר נחשפה ל-PMA של 500 ננומטר, מח העצם של כל חולדה הניב ריכוז סופי של 8-12 מיקרוגרם/מ"ל דנ"א נטו. ראוי לציין כי התוכן התוך-תאי הושחל באופן לא מלא בנויטרופילים של חולדות במהלך NETosis, וכתוצאה מכך נצפתה תצפית על רכיבים תוך-תאיים רבים. בנוסף, רשתות חולדות הפגינו נטייה ליצור סרט דמוי גזה בשל נטיות הדבקה משופרות, והציגו מראה דמוי ענן מובהק.
איור 1: הערכת כדאיות נויטרופילים מבידוד מח עצם. המקור האופטימלי לבידוד נויטרופילים של חולדות הוא מח עצם, המאפשר רכישת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות לאחר מכן. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טיהור נויטרופילים מדם היקפי וממח עצם באמצעות צביעת רייט-גימסה. (A) מקור דם היקפי. (B) מקור מח העצם בשיטה החד-שלבית. (C) מקור מח עצם בשיטה הדו-שלבית. מיצוי מח עצם משמש כגישה המועדפת לבידוד נויטרופילים של חולדות ולרכישה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים כתוצאה מכך. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הגדלה = 400x. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הפרשה נטו לאחר הדגירה עם PMA או PMA + DNase I. מיצוי מח עצם מייצג את המסלול המועדף לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף הבא של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח אימונופלואורסצנטי. צביעה אימונופלואורסצנטית של הגרעין (כחול, A), MPO (ירוק, B) ומיזוג תמונה (C). NET: מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים; MPO: Myeloperoxidase. מיצוי מח עצם הוא השיטה המועדפת לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים לאחר מכן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הגדלה = 200x. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח מקיף של cfDNA באמצעות אנלייזר הדמיה של תאים בתנאים שונים. צביעה פלואורסצנטית של cfDNA (ירוק) וגרעין (כחול). מיצוי מח עצם הוא הגישה העיקרית לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות כתוצאה מכך. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בידוד הנויטרופילים מהווה צעד מכריע בחקר NETosis, שבו בחירת שיטת בידוד מתאימה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת תוצאות אמינות. גורם חשוב לשקול הוא התרחשות של זיהום לימפוציטים במהלך הבידוד. התמודדות עם אתגר זה משמעותית במיוחד כאשר מבודדים נויטרופילים של חולדות ממח העצם. למרות טווח הצפיפות המובהק של נויטרופילים (1.0814-1.0919, עם שיא של 1.0919) בהשוואה ללימפוציטים (1.0337-1.0765, עם שיא של 1.0526), זיהום בלימפוציטים נותר בלתי נמנע. ניתן לייחס זאת בחלקו לשפע הלימפוציטים במח העצם ולצפיפות המוגברת של לימפוציטים לא בשלים15. טכניקות כגון הפרדת שיפוע צפיפות, כגון שימוש בפרקול ופיקול, יכולות לסייע בבלימת זיהום לימפוציטים, אם כי השגת חיסול לימפוציטים מלא עשויה להיות מאתגרת. ניתן להשתמש בתמיסת פרקול מיוחדת, המכוילת לשיפוע צפיפות מסוים, כדי למזער את הזיהום על ידי ניצול שונות הצפיפות בין נויטרופילים של חולדות ותאי מח עצם אחרים. לכן, על החוקרים להעריך באופן מושכל את ההשפעה הפוטנציאלית של זיהום לימפוציטים על תוצאות הניסוי שלהם ולנקוט צעדים כדי למתן את השפעתו.
מחקר זה מדגיש את החשיבות של התאמת שיטות בידוד לדרישות ניסוי ספציפיות. בשיטה שתוארה קודם לכן14, שיטת הצעד האחד הדגימה שהיא פחות תובענית מבחינת זמן ומאמץ. ככזה, הוא אושר לרכישת NET בשל ההשפעה חסרת המשמעות של לימפוציטים מזהמים על הפרשת NET. לימפוציטים אלה יכולים להיות מסולקים לאחר מכן בשלב הצנטריפוגה הסופי. לעומת זאת, למאמצים הכרוכים בבידוד נויטרופילים והערכה עוקבת של NETosis והפרשת NET, הומלץ על השיטה הדו-שלבית14. גישה זו אפשרה כימות מדויק של NETs המיוצרים על ידי נויטרופילים תוך מזעור ההשפעה של גורמים מבלבלים פוטנציאליים הנובעים מזיהומי תאים אחרים.
ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול הבידוד כדי לשפר הן את התנובה והן את הטוהר. לדוגמה, ניצול של ערכת מגיבים הדרגתיים בצפיפות אופטימלית יכול להניב יותר נויטרופילים. שיטות צנרת ושטיפה עדינות יכולות גם להפחית את אובדן התאים ולחזק את הטוהר. פעולות פתרון בעיות כגון ניטור רמת החומציות והטמפרטורה, לצד התאמת פרמטרים של צנטריפוגות, יכולות לתת מענה יעיל לאתגרים בהם נתקלים בתהליך הבידוד. אילוץ נלווה של בידוד מח עצם טמון בסבירות של נויטרופילים לא בשלים וזיהום תאי מח עצם אחרים, ובכך להשפיע הן על הטוהר והן על היבול. פיתוח גישה יעילה לסילוק לימפוציטים יכול לשפר את יעילות הבידוד הכוללת. אילוץ נוסף נוגע לצורך בהקרבת בעלי חיים לצורך בידוד מח עצם, שעשוי שלא להתאים למחקרי אורך של נויטרופילים של חולדות in vivo.
בידוד נויטרופילים לבני אדם מסתמך בעיקר על דם היקפי. שיטות קונבנציונליות כוללות Ficoll-Paque, Percoll, והפרדת חרוזים אימונומגנטית 16,17,18. גישת פיקול מפרידה אוכלוסיות לויקוציטים על בסיס ציפה ומסתמכת על חומר ניגוד כדי להבדיל נויטרופילים. הוא מציע פשטות וחסכוניות אך מתפשר על טוהר ותנובה ומציב אתגרים בסילוק תאי הדם האדומים. מצד שני, פרקול מנצלת שיפועי צפיפות, ומניבה טוהר נויטרופילים ותשואה גדולים יותר על חשבון ציוד מיוחד והגדלת ההוצאות והזמן19. הפרדת חרוזים אימונומגנטית היא טכניקה חדשה וספציפית יותר המשתמשת בחרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לנויטרופילים עם זיהום מינימלי מלויקוציטים אחרים. למרות שניתן לבצע אוטומציה, היא דורשת ציוד מיוחד וכרוכה בעלויות גבוהות יותר עקב הוצאות חרוזים. בעת בחירת שיטת בידוד נויטרופילים, החוקרים חייבים לשקול יבול, טוהר, עלות ומורכבות. נכון לעכשיו, השיטה הנוחה ביותר לבידוד נויטרופילים אנושיים כוללת שימוש ב- PolymorphPrep20. גישה זו מניבה נויטרופילים מטוהרים מאוד בכמויות משמעותיות תוך זמן קצר. עקרון PolymorphPrep תלוי בהפרדת תאים בהתאם לצפיפות.
בעכברים, בידוד נויטרופילים מדם היקפי אינו מומלץ בשל נפחי דם נמוכים והאתגר של הבטחת כמות מספקת וטוהר לניסויים במורד הזרם. למרות שהחולדות מספקות כמויות דם מספיקות (10 מ"ל לחולדה), מאפייני הדם ההיקפיים שלהן שונים מבני אדם ועכברים. חולדות מטבען מציגות ליקויים במיצוי נויטרופילים, כאשר מונוציטים הם התאים בעלי הגרעין הנפוצים ביותר13,14. לפיכך, בידוד דם היקפי מספק רק 2 x 105-5 x 105 נויטרופילים מחולדה אחת. מח העצם משמש כמקור נויטרופילים בר קיימא יותר, ומציע אספקה זמינה ושופעת ללא קשר למצב הזיהום של החיה. לחלופין, גרימת סביבה דלקתית בחלל הבטן או בבית החזה כדי להגביר את חדירת הנויטרופילים לבידוד אינה אמינה ומורכבת. לפיכך, מיצוי מח עצם מתגלה כמסלול מעשי ואמין לבידוד נויטרופילים של חולדות21.
NETosis כוללת תהליכים תאיים מגוונים הכוללים עיבוי DNA, אוטופגיה וגירוש מטריצה תוך תאית1. בבני אדם, שחול נטו הוא מקיף, ומשאיר אחריו שרידים של קרום התא. באופן מסקרן, מחקרי נויטרופילים של חולדות מציגים דפוסים שונים, החושפים יותר תוכן תוך-תאי לאחר גירוי. למרות גירוי PMA, נויטרופילים של חולדות מפגינים שחול רשת לא שלם, ומתיישרים עם ה-NETosis הספונטני שלהם. באופן מוזר, רשתות חולדה מדגימות נטייה לצורות מצטברות (aggNETs) ולא למבנה רשת נרחב, אולי בגלל יכולת קישור צולב מופחתת. תופעה זו עשויה להשפיע באופן משמעותי על צבירת נויטרופילים, ולהשפיע על התגובה החיסונית הרחבה יותר בחולדות. יישומים עתידיים של בידוד מח עצם עשויים לכלול חיטוט במסלולי איתות שונים ובתאי חיסון ב- NETosis. בנוסף, שיטה זו יכולה להקל על חקר NETosis במודלים שונים של מחלות, ולחשוף את תפקידי הנויטרופילים על פני פתולוגיות שונות. בסופו של דבר, טכניקות חדשניות לבידוד ואפיון NETs טומנות בחובן הבטחה לפענוח המנגנונים המניעים את NETosis ואת השלכותיו התפקודיות על פני מודלים מגוונים של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
מימון: עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82004154, 81900311, 82100336 ו-81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
