Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l'altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.
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Articolo metodologico
Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo principale di questa ricerca è stato quello di sviluppare un approccio affidabile ed efficiente per isolare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) dal midollo osseo di ratto. Questo sforzo è sorto a causa delle limitazioni associate al metodo tradizionale di estrazione dei NET dal sangue periferico, principalmente a causa della scarsità di neutrofili disponibili per l'isolamento. Lo studio ha rivelato due metodologie distinte per ottenere neutrofili di ratto dal midollo osseo: una procedura semplificata in una sola fase che ha prodotto livelli di purificazione soddisfacenti e un processo in due fasi più dispendioso in termini di tempo che ha mostrato una maggiore efficienza di purificazione. È importante sottolineare che entrambe le tecniche hanno prodotto una notevole quantità di neutrofili vitali, compresa tra 50 e 100 milioni per ratto. Questa efficienza rispecchia i risultati ottenuti isolando neutrofili da fonti sia umane che murine. Significativamente, i neutrofili derivati dal midollo osseo di ratto hanno mostrato capacità comparabili di secernere NET rispetto ai neutrofili ottenuti dal sangue periferico. Tuttavia, il metodo basato sul midollo osseo ha costantemente prodotto quantità notevolmente maggiori sia di neutrofili che di NET. Questo approccio ha dimostrato il potenziale per ottenere quantità significativamente maggiori di questi componenti cellulari per ulteriori applicazioni a valle. In particolare, questi NET isolati e neutrofili sono promettenti per una vasta gamma di applicazioni, che abbracciano i regni dell'infiammazione, dell'infezione e delle malattie autoimmuni.
Introduzione
I neutrofili costituiscono un sottogruppo critico di leucociti che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata. Sono caratterizzati da nuclei e granuli multilobati contenenti varie proteasi e peptidi antimicrobici1. I neutrofili funzionano principalmente attraverso la degranulazione, la fagocitosi e la formazione di NET. L'osservazione dei NET è stata fatta per la prima volta da Takei et al. nel 1996 durante un esperimento in cui i neutrofili sono stati stimolati con acetato di miristato di forbolo (PMA)2. Successivamente, il processo di formazione di NET è stato coniato "NETosis" da Brinkmann et
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Protocollo
Lo studio è stato condotto nell'ambito di una licenza di progetto (n. 20211404A) concessa dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan, in conformità con le linee guida del Comitato Etico degli Animali dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan per la cura e l'uso degli animali. In conformità con le linee guida etiche, i ratti utilizzati in questo studio sono stati mantenuti in un ambiente controllato con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura a 22-24 °C e umidità del 50%-60%. Ai ratti è stato dato accesso a cibo e acqua ad libitum. Gli animali utilizzati in questo studio erano ratti maschi Sprague Dawley....
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Risultati
Il protocollo qui delineato delinea due metodi distinti, ciascuno caratterizzato da una migliore purificazione o da passaggi semplificati. Entrambi i metodi hanno prodotto circa 0,5 x 108-1 x 108 neutrofili per ratto. L'analisi della citometria a flusso, utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V-FITC/PI, ha mostrato una vitalità cellulare superiore al 90%, paragonabile alle controparti murine e umane (Figura 1). Mentre la contaminazione dei linfoc.......
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Discussione
L'isolamento dei neutrofili costituisce un passo fondamentale nello studio di NETosis, dove la selezione di un metodo di isolamento appropriato è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Un fattore importante da valutare è l'insorgenza di contaminazione linfocitaria durante l'isolamento. Affrontare questa sfida è particolarmente significativo quando si isolano i neutrofili di ratto dal midollo osseo. Nonostante il distinto intervallo di densità dei neutrofili (1,0814-1,0919, con un picco a 1,0919) rispetto ai linf.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A488-coniugato asino anti-coniglio IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-coniugato asino anti-topo IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-capra coniugata anti-topo IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Mieloperossidasi anti-ratto | Abcam, Inghilterra | ab134132 | |
| Elastasi neutrofila anti-ratto | Abcam, Inghilterra | ab21595 | |
| Citometro a immagine Celigo | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurano | RWD, Cina | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Siero d'asino normale | Solarbio, Cina | SL050 | |
| Paraformaldeide | biosharp, Cina | BL539A | |
| Penicillina-streptomicina | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma, USA& | nbsp; P1585 | |
| Kit per il dosaggio del DNA Picogreen dsDNA | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Kit di isolamento dei neutrofili di ratto | Solarbio, Cina | P9200 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Solarbio, Cina | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Macchina universale per anestesia animale | RWD, Cina | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) ratti | Dashuo, Cina | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) tampone | Solarbio, Cina | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, tedesco | 1139ML100 |
Riferimenti
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.
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Ristampe e permessi
