Summary
В этом исследовании описаны два метода выделения многочисленных внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) из костного мозга крысы. Один метод сочетает в себе коммерческий набор для выделения нейтрофилов с центрифугированием с градиентом плотности, в то время как другой использует только центрифугирование с градиентом плотности. Оба подхода дают функциональные НВЛ, превосходящие таковые из нейтрофилов периферической крови.
Abstract
Основной целью данного исследования была разработка надежного и эффективного подхода к выделению нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) из костного мозга крыс. Эта попытка возникла из-за ограничений, связанных с традиционным методом извлечения НВЛ из периферической крови, в основном из-за нехватки доступных нейтрофилов для выделения. Исследование выявило две различные методологии получения нейтрофилов крыс из костного мозга: оптимизированная одноступенчатая процедура, которая давала удовлетворительные уровни очистки, и более трудоемкий двухступенчатый процесс, который демонстрировал повышенную эффективность очистки. Важно отметить, что оба метода дали значительное количество жизнеспособных нейтрофилов, от 50 до 100 миллионов на крысу. Эта эффективность отражала результаты, полученные при выделении нейтрофилов как из человеческих, так и из мышиных источников. Важно отметить, что нейтрофилы, полученные из костного мозга крыс, продемонстрировали сопоставимую способность секретировать НВЛ по сравнению с нейтрофилами, полученными из периферической крови. Тем не менее, метод, основанный на костном мозге, последовательно производил значительно большее количество как нейтрофилов, так и НВЛ. Этот подход продемонстрировал потенциал получения значительно большего количества этих клеточных компонентов для дальнейшего применения. Примечательно, что эти изолированные НВЛ и нейтрофилы имеют перспективы для целого ряда применений, охватывающих области воспаления, инфекций и аутоиммунных заболеваний.
Introduction
Нейтрофилы представляют собой важнейшую подгруппу лейкоцитов, которые играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Они характеризуются многолопастными ядрами и гранулами, содержащими различные протеазы и антимикробные пептиды1. Нейтрофилы в основном функционируют за счет дегрануляции, фагоцитоза и образования НВЛ. Наблюдение НВЛ было впервые сделано Takei et al. в 1996 году во время эксперимента, в котором нейтрофилы стимулировались ацетатом форболмиристата (PMA)2. Впоследствии, в 2004 году, процесс формирования НВЛ был назван Brinkmann et al.3 термином «NETosis». Их исследование еще больше пролило свет на решающую роль НВЛ в нейтрофил-опосредованном антимикробном ответе. НВЛ представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из хроматина, гистонов и антимикробных белков, которые высвобождаются из активированных нейтрофилов в ответ на инфекционные и воспалительные стимулы. НВЛ могут обездвиживать и убивать вторгшихся патогенов, захватывая их и подвергая воздействию высокой концентрации антимикробных пептидов и протеаз 1,3. Кроме того, НВЛ способствуют очищению апоптотических клеток и участвуют в разрешении воспаления. Недавние исследования также показывают, что чрезмерное образование НВЛ или нарушение деградации НВЛ может привести к повреждению тканей, аутоиммунным нарушениям, тромбогенезу и нарушению реваскуляризации 4,5,6,7,8,9,10.
Патогенетическая роль НВЛ при неконтролируемом фиброзе после инфаркта миокарда и формировании желудочковых аневризм была продемонстрирована на примере распространения периваскулярного фиброза 4,11. Модель инфаркта миокарда и выделение нейтрофилов из костного мозга у мышей хорошо известны. Полиморфноядерные (ПМН) лейкоциты, тип белых кровяных телец, в изобилии присутствующих в крови человека, служат отличным источником для выделения нейтрофилов человека. Этот метод устраняет необходимость забора костного мозга, что повышает безопасность и эффективность.
НВЛ также играют роль в фибрилляции предсердий, связанной с ремоделированием сердца. Тем не менее, крупные животные, такие как собаки и свиньи, использовались для моделирования фибрилляции предсердий, поскольку у мышей отсутствует предсердие, достаточно большое, чтобы установить цикл повторного входа или модель мерцательной аритмии, если только специфические ионные каналы или сигнальные пути не будут сбитыили нокаутированы. Несмотря на то, что можно индуцировать фибрилляцию предсердий у крыс и изолировать нейтрофилы из периферической крови крыс, как описано ранее, исследователи столкнулись с ограничением, в соответствии с которым из периферической крови можно было выделить только 2 нейтрофила x 105-5 x 105 (10 мл на крысу). Для извлечения достаточного количества НВЛ в каждый момент времени требовалось примерно 10-25 крыс (всего 5 x 106 нейтрофилов), что приводило к трудоемкому, дорогостоящему и часто малопродуктивномупроцессу. В связи с этим Ли Хэ и его коллеги представляют стратегию, ориентированную на костный мозг, для получения адекватных НВЛ у крыс14. В своей статье они дают всестороннее описание выделения нейтрофилов из костного мозга крыс и сравнивают возможности секреции НВЛ периферических нейтрофилов и нейтрофилов костного мозга крыс. Эти два метода преследуют различные экспериментальные цели, оба приводят к получению достаточного количества нейтрофилов костного мозга крыс при одновременном снижении количества необходимых крыс. Двухступенчатый метод выделения продемонстрировал превосходную очистку нейтрофилов, в то время как одностадийный метод оказался эффективным по времени при приемлемых уровнях очистки. Кроме того, исследователи сравнили образование нетоза и НВЛ между нейтрофилами костного мозга крыс и их периферическими аналогами, обнаружив одинаковую эффективность с PMN. Эти результаты вносят значительный вклад в исследования фибрилляции предсердий, связанные с нейтрофилами, и подчеркивают важность гибкого выбора различных источников для выделения нейтрофилов у различных экспериментальных животных с различным распределением нейтрофилов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с лицензией на проект (No 20211404A), выданной Комитетом по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета, в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета по уходу за животными и их использованию. В соответствии с этическими принципами, крысы, использованные в этом исследовании, содержались в контролируемой среде с 12-часовым циклом свет/темнота, температурой 22-24 °C и влажностью 50%-60%. Крысам давали доступ к пище и воде вволю. В этом исследовании использовались 6-8-недельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) весом около 250 г и не содержащие специфических патогенов. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
1. Выделение нейтрофилов крыс
- Забор костного мозга
- Поместите крысу в соответствующий контейнер для анестезии (см. Таблицу материалов). Вводите крысе 3% изофлурана до тех пор, пока животное не потеряет сознание. Проверьте отсутствие реакции на защемление пальца ноги или хвоста, чтобы убедиться в глубине анестезии.
- После того, как крыса будет глубоко обезболена, выполните вывих шейки матки, положив крысу на спину и держа ее за хвост одной рукой, а другой рукой захватив голову. Быстро и сильно вывихните шею, прикладывая внезапное и сильное усилие вверх к хвосту, одновременно тяну голову вниз до тех пор, пока шейный отдел позвоночника не будет разорван. Дождитесь подтверждения смерти, такого как остановка дыхания и отсутствие сердцебиения, прежде чем приступать к забору или утилизации тканей.
- Окуните крысу в 75% этанол и оставьте на несколько минут, чтобы стерилизовать шерсть и кожу. Положите крысу на спину и отрубите нижние конечности в области бедра, чтобы защитить головку бедренной кости. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать связку в скакательном суставе и отогните коленный сустав назад, чтобы обнажить бедренную и большеберцовую кости.
- С помощью щипцов и ножниц осторожно удалите все мышцы, сухожилия и другие ткани, связанные с костями. Промойте кости сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), чтобы удалить остатки тканей и кровь. Повторите еще два раза, в общей сложности три стирки. Очищенные косточки поместите в стерильный контейнер.
- Используйте шприц объемом 5 или 10 мл с иглой, чтобы проткнуть костный мозг через оба конца кости, чтобы ослабить матрикс костного мозга. Промойте костный мозг 10-15 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) другим шприцем до тех пор, пока видимый костный мозг не будет вымыт.
- Центрифугируют клетки костного мозга при 300 x g в течение 10 мин при 20 °C. Добавьте 5-10 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. таблицу материалов), чтобы ресуспендировать клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавьте в смесь в 4 раза больше объема HBSS. Центрифугируют клетки при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, удаляют надосадочную жидкость пипеткой и используют полученную гранулу для дальнейшего использования.
- Выделение нейтрофилов из костного мозга
- Для двухэтапного метода выполните следующие дополнительные действия:
- Изолируйте клетки костного мозга с помощью коммерциализированного набора для выделения нейтрофилов крыс в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
- Приготовьте градиент плотности, поместив 2 мл 55%-ного реагента (см. таблицу материалов), 2 мл 65% реагента, 2 мл 70%-ного реагента и 2 мл 80%-ного реагента в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 800 x g в течение 40 мин при 20 °C, при ускорении 5 и замедлении 0 или 1.
- Соберите 70%-ный градиентный слой, включая клеточные слои на границе между 65% и 70% градиентным реагентом, с помощью стерильной пипетки. Переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 15 мл HBSS в пробирку и осторожно переверните пробирку несколько раз, чтобы промыть клетки. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
- Для одношагового метода выполните следующие дополнительные действия:
- Подвергайте клетки костного мозга градиентам без использования набора для выделения нейтрофилов крыс.
- Соберите 70%-ный градиентный слой, включая клеточные слои на границе между 65% и 70% градиентом, с помощью стерильной пипетки. Переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл и промойте клетки HBSS. Центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
- Подсчитывают выделенные нейтрофилы с помощью гемоцитометра и оценивают жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть изменен в зависимости от количества крыс и желаемого количества выделенных нейтрофилов. Приемлемое количество костей получено от трех крыс при первом использовании этого метода в новых экспериментальных условиях. Все процедуры должны проводиться в стерильных условиях. Выделение нейтрофилов из костного мозга должно быть выполнено как можно быстрее, чтобы свести к минимуму повреждение клеток и потерю жизнеспособности.
- Для двухэтапного метода выполните следующие дополнительные действия:
2. Приобретение крысиных сеток
- Ресуспендант 0,5 x 108-1 x 108 изолированных нейтрофилов в среде RPMI 4 мл (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина) в стерильной чашке Петри 10 см.
- Добавьте 500 нМ PMA (см. таблицу материалов) к суспензии нейтрофилов, чтобы индуцировать нетоз. Инкубируют в течение 3 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Для отрицательного контроля добавляют ДНКазу I (10 Ед/мл) в суспензию нейтрофилов для деградации секретируемых НВЛ.
- Чтобы собрать НВЛ, удалите фильтрующий материал и аккуратно промойте НВЛ, прикрепленные к чашке Петри, HBSS. Затем используйте интенсивную промывку 4 мл свежей среды для каждой чашки, чтобы отделить НЭО от планшета.
- Часто собирайте промывное средство и пипетку для полной ресуспенднации NET.
- Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 20 °C, чтобы удалить плавающие клетки.
- Суспензию, содержащую НВЛ, переложить в стерильную пробирку и хранить при температуре −20 °C для дальнейшего использования в течение 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЭО чувствительны к разложению, поэтому для достижения наилучших результатов рекомендуется использовать свежесобранный материал.
3. Проверка наличия НЭО
- Фиксируют клетки (с шага 2.4) на покровных стеклах с 4% параформальдегидом в течение 15 мин и НЭТ (с шага 2.7) в течение 30 мин - 1 ч.
- Переверните покровный листок на каплю PBS/PBST на подставке для пробирок, покрытую парафиновой пленкой, и повторите процесс промывки трижды по 5 минут каждый.
- Пермеабилизацию клеток 0,5% Triton-X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре и трижды промыть в PBS/PBST по 1 мин. Запечатайте клетки 10% обычной ослиной сывороткой (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре на 1 час.
- Инкубируют клетки с антителами к нейтрофильной эластазе к крысам и антителами к миелопероксидазе крыс (см. таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
- Инкубируют клетки со вторичным антителом А488-конъюгированным антикроличьим антикроличьим IgG (H + L), А594-конъюгированным ослиным антимышиным IgG (H + L) и А594-конъюгированным козьим анти-мышиным IgG1 (см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
- Окрашивание клеточных ядер и скелетов НВЛ с помощью DAPI 10 мг/мл. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
- Капните каплю монтажного носителя на предметное стекло и переверните на него покровное стекло с ячейками. Дайте высохнуть в течение 1 ч для микроскопического анализа с помощью иммерсионных линз; В противном случае он готов к проверке.
ПРИМЕЧАНИЕ: При манипуляциях с НЭО необходимо соблюдать большую осторожность, даже после фиксации, так как они чрезвычайно хрупкие и могут быть легко потеряны во время приготовления.
4. Количественная оценка НЭО
- Приготовьте буфер Tris-EDTA (TE) и рабочий раствор PicoGreen (реагент для анализа dsDNA) в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
- Готовят стандарты, разбавляя исходную ДНК до концентраций 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения концентрации НВЛ был использован набор для анализа дцДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителя. Буферные реагенты для анализа Tris-EDTA (TE) и реагенты для анализа дцДНК были приготовлены с использованием 19-кратного объема двойной дистиллированной воды или 199-кратного объема TE-буфера соответственно. Затем готовили стандартные растворы (1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1 мкг/мл), и каждые 50 мкл образца соединяли с 450 мкл ТЭ-буфера. - Добавьте по 50 мкл каждого образца в 450 мкл TE буфера.
- Добавьте 100 мкл стандартов или образцов вместе с равным объемом рабочего раствора реагента в каждую лунку в 96-луночном планшете, включая стандарты и образцы.
- Выдерживайте планшет при комнатной температуре 2-5 мин, избегая попадания прямых солнечных лучей.
- Считывание образцов с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера со спектром излучения около 530 нм и спектром поглощения около 480 нм.
- Рассчитайте концентрацию НВЛ в каждой пробе, используя стандартную кривую, созданную стандартами.
5. Анализ секреции НВЛ методом клеточной цитометрии
- Добавьте окрашивание ядра (см. Таблицу материалов) к клеткам, инкубируемым в 96-луночном планшете, до достижения конечной концентрации 10 нг/мл и инкубируйте в течение 30 мин.
- Добавьте окраску внеклеточной ДНК (cfDNA, см. таблицу материалов) к клеткам до достижения конечной концентрации 300 нМ и инкубируйте в течение 10 минут.
- Смешайте флуоресцентные красители с помощью осторожного пипетирования. Не выбрасывайте надосадочную жидкость и не промывайте гранулы.
- Загрузите планшет с образцом в цитометр.
- Установите параметры фокусировки и времени экспозиции для различных каналов: синий (например: 377/50 нм, em: 470/22 нм), обычно с экспозицией 30 000 мс, зеленый (например: 483/32 нм, eM: 536/40 нм), обычно с экспозицией 5 000 мс.
- Получение однородных изображений всей пластины по разным каналам.
- Проанализируйте количество окрашиваний ядер для разных групп. Если они похожи, секрецию НВЛ можно определить по количеству красок cfDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, изложенный в настоящем документе, определяет два различных метода, каждый из которых характеризуется улучшенной очисткой или оптимизированными этапами. Оба метода дали приблизительно 0,5 x 108-1 x 108 нейтрофилов на крысу. Анализ проточной цитометрии с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексина V-FITC/PI показал жизнеспособность клеток выше 90%, сопоставимую с аналогичными аналогами мышей и человека (рис. 1). В то время как контаминация лимфоцитов казалась неизбежной при выделении нейтрофилов из костного мозга, двухэтапный метод продемонстрировал повышенный уровень чистоты 90% по сравнению с 50%, достигаемыми одностадийным методом (рис. 2).
Сопоставимые ответы в секреции НВЛ были различимы между периферическими нейтрофилами и нейтрофилами костного мозга, независимо от стимуляции PMA (рис. 3). Кроме того, крысиные НЭТ демонстрировали ограниченные возможности сшивки друг с другом (рис. 4). В попытке глубже погрузиться в процесс нетоза крыс, PMA был использован в качестве индуктора. НЭО были обнаружены с помощью окрашивания cfDNA, а полные изображения были получены с помощью анализатора клеточной визуализации. Примечательно, что нейтрофилы крыс демонстрировали более высокую склонность к спонтанному нетозу в отличие от нейтрофилов мышей и человека, даже без внешней стимуляции. Инкубация с PMA приводила к увеличению содержания cfDNA на 10% через 4 ч (рис. 5). При воздействии 500 нМ ПМА костный мозг каждой крысы давал конечную концентрацию 8-12 мкг/мл НЭТ-ДНК. Примечательно, что внутриклеточное содержимое было экструдировано в нейтрофилах крыс во время нетоза, что привело к наблюдению многочисленных внутриклеточных компонентов. Кроме того, крысиные НЭО проявляли склонность к образованию марляобразной пленки из-за повышенных адгезионных тенденций, представляя отчетливый облачный вид.
Рисунок 1: Оценка жизнеспособности нейтрофилов по выделению костного мозга. Оптимальным источником для выделения нейтрофилов крыс является костный мозг, что облегчает последующее получение нейтрофильных внеклеточных ловушек. Эта цифра адаптирована из He et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очистка нейтрофилов из периферической крови и костного мозга с помощью окрашивания по методу Райта-Гимзы. (А) Происхождение периферической крови. (Б) Определение происхождения костного мозга одностадийным методом. (C) Определение происхождения костного мозга двухэтапным методом. Экстракция костного мозга служит предпочтительным подходом для выделения нейтрофилов крыс и последующего получения внеклеточных ловушек нейтрофилов. Масштабная линейка = 20 мкм. Увеличение = 400x. Эта цифра адаптирована из He et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Секреция НВЛ при инкубации с ПМА или ПМА + ДНКаза I. Экстракция костного мозга представляет собой предпочтительный путь для выделения нейтрофилов крыс и последующего сбора внеклеточных ловушек нейтрофилов. Эта цифра адаптирована из He et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунофлуоресцентный анализ. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядра (синий, А), МПО (зеленый, В) и изображение слияния (С). НЭО: внеклеточная ловушка нейтрофилов; МПО: Миелопероксидаза. Экстракция костного мозга является предпочтительным методом для выделения нейтрофилов крыс и последующего сбора внеклеточных ловушек нейтрофилов. Масштабная линейка = 50 мкм. Увеличение = 200x. Эта цифра адаптирована из He et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Комплексный анализ cfDNA с помощью анализатора клеточной визуализации в различных условиях. Флуоресцентное окрашивание cfDNA (зеленый) и ядра (синий). Экстракция костного мозга является основным методом выделения нейтрофилов крыс и последующего сбора нейтрофильных внеклеточных ловушек. Масштабная линейка = 500 мкм. Эта цифра адаптирована из He et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение нейтрофилов представляет собой ключевой шаг в изучении нетоза, где выбор соответствующего метода выделения имеет первостепенное значение для получения надежных результатов. Важным фактором, который следует взвесить, является возникновение контаминации лимфоцитов во время выделения. Решение этой проблемы особенно важно при выделении нейтрофилов крыс из костного мозга. Несмотря на четкий диапазон плотности нейтрофилов (1,0814-1,0919, с пиком на 1,0919) по сравнению с лимфоцитами (1,0337-1,0765, с пиком на 1,0526), контаминация лимфоцитами остается неизбежной. Отчасти это можно объяснить обилием лимфоцитов в костном мозге и повышенной плотностью незрелых лимфоцитов15. Такие методы, как разделение по градиенту плотности, такие как использование Перколла и Фиколла, могут помочь в сдерживании загрязнения лимфоцитами, хотя достижение полной элиминации лимфоцитов может быть сложной задачей. Специализированный раствор Percoll, откалиброванный по определенному градиенту плотности, может быть использован для минимизации загрязнения за счет использования разницы в плотности между нейтрофилами крыс и другими клетками костного мозга. Поэтому исследователи должны разумно оценивать потенциальное влияние загрязнения лимфоцитов на результаты экспериментов и принимать меры по смягчению его влияния.
В этом исследовании подчеркивается важность адаптации методов изоляции к конкретным экспериментальным условиям. В методе, описанном ранее14, одношаговый метод показал себя менее требовательным с точки зрения времени и усилий. Таким образом, он был одобрен для получения НВЛ из-за несущественного влияния контаминирующих лимфоцитов на секрецию НВЛ. Эти лимфоциты могут быть впоследствии удалены на заключительной стадии центрифугирования. И наоборот, для исследований, связанных с выделением нейтрофилов и последующей оценкой нетоза и секреции НВЛ, был рекомендован двухэтапный метод14. Такой подход позволил провести точное количественное определение НВЛ, продуцируемых нейтрофилами, при этом минимизировав влияние потенциальных искажающих факторов, возникающих в результате загрязнения других клеток.
В протокол изоляции могут быть внесены изменения для повышения выхода и чистоты. Например, использование оптимизированного набора реагентов с градиентом плотности может дать больше нейтрофилов. Щадящие методы пипетирования и промывки также могут уменьшить потерю клеток и повысить чистоту. Такие действия по поиску и устранению неисправностей, как мониторинг pH и температуры буфера, наряду с регулировкой параметров центрифугирования, могут эффективно решать проблемы, возникающие в процессе изоляции. Связанное с этим ограничение выделения костного мозга заключается в вероятности загрязнения клеток костного мозга незрелыми нейтрофилами и другими клетками костного мозга, что влияет как на чистоту, так и на выход. Разработка оптимизированного подхода к изгнанию лимфоцитов может повысить общую эффективность изоляции. Еще одно ограничение связано с необходимостью жертвоприношения животных для выделения костного мозга, что может быть непригодно для лонгитюдных исследований нейтрофилов крыс in vivo.
Выделение нейтрофилов для человека преимущественно опирается на периферическую кровь. Традиционные методы охватывают разделение шариков по методу Фиколла-Пака, Перколла и иммуномагнитное разделение шариков 16,17,18. Подход Фиколла разделяет популяции лейкоцитов на основе плавучести и полагается на контрастное вещество для дифференциации нейтрофилов. Он отличается простотой и экономичностью, но идет на компромисс в отношении чистоты и выхода, а также создает проблемы с выведением красных кровяных телец. С другой стороны, Перколл использует градиенты плотности, обеспечивая большую чистоту и выход нейтрофилов за счет специализированного оборудования и увеличения затрат и времени19. Иммуномагнитное разделение шариков – это новый, более специфичный метод, использующий конъюгированные антитела магнитные шарики, которые специфически связываются с нейтрофилами с минимальным загрязнением от других лейкоцитов. Несмотря на то, что он поддается автоматизации, он требует специализированного оборудования и несет более высокие затраты из-за затрат на бисер. При выборе метода выделения нейтрофилов исследователи должны взвесить выход, чистоту, стоимость и сложность. В настоящее время наиболее удобным методом выделения нейтрофилов человека является использование PolymorphPrep20. Такой подход позволяет получить высокоочищенные нейтрофилы в значительных количествах в течение короткого промежутка времени. Принцип работы PolymorphPrep основан на разделении клеток по плотности.
У мышей выделение нейтрофилов из периферической крови нецелесообразно из-за малых объемов крови и проблемы обеспечения достаточного количества и чистоты для последующих экспериментов. Несмотря на то, что крысы обеспечивают достаточное количество крови (10 мл на крысу), их характеристики периферической крови отличаются от характеристик человека и мышей. Крысы по своей природе демонстрируют дефицит экстракции нейтрофилов, при этом моноциты являются наиболее распространенными ядросодержащими клетками13,14. Следовательно, выделение периферической крови дает только 2 x 105-5 x 105 нейтрофилов от одной крысы. Костный мозг служит более жизнеспособным источником нейтрофилов, обеспечивая легкодоступный и обильный запас независимо от инфекционного статуса животного. С другой стороны, индуцирование воспалительной среды в брюшной полости или грудной клетке для усиления инфильтрации нейтрофилов для изоляции является ненадежным и сложным. Таким образом, экстракция костного мозга становится практичным и надежным способом выделения нейтрофилов у крыс21.
Нетоз включает в себя различные клеточные процессы, включающие деконденсацию ДНК, аутофагию и изгнание внутриклеточного матрикса1. У людей экструзия НВЛ носит комплексный характер, оставляя после себя остатки клеточной мембраны. Интересно, что исследования нейтрофилов на крысах демонстрируют дивергентные паттерны, выявляя больше внутриклеточного содержимого после стимуляции. Несмотря на стимуляцию ПМА, нейтрофилы крыс демонстрируют неполную экструзию НВЛ, что соответствует их спонтанному нетозу. Любопытно, что крысиные сети демонстрируют склонность к агрегированным формам (aggNET), а не к обширной сетевой структуре, возможно, из-за пониженной способности к сшивке. Это явление может существенно влиять на агрегацию нейтрофилов, влияя на более широкий иммунный ответ у крыс. Будущие применения изоляции костного мозга могут включать зондирование различных сигнальных путей и иммунных клеток в нетозе. Кроме того, этот метод может облегчить исследование нетоза в различных моделях заболеваний, раскрывая роль нейтрофилов при различных патологиях. В конечном счете, новые методы выделения и характеристики НВЛ обещают разгадать механизмы, управляющие NETosis, и его функциональные последствия на различных животных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Финансирование: Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NoNo 82004154, 81900311, 82100336 и 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
