Summary
Dieses Protokoll untersucht die Verwendung von extrazellulärem Vesikel (EV)-reichem Plasma als Indikator für die Gerinnungsfähigkeit von EV. EV-reiches Plasma wird durch einen Prozess der Differenzzentrifugation und anschließenden Rekalkifizierung gewonnen.
Abstract
Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei verschiedenen Erkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, insbesondere aufgrund ihrer starken gerinnungsfördernden Wirkung. Es besteht jedoch ein dringender Bedarf an einem Test am Krankenbett, um die gerinnungsfördernde Aktivität von EV im klinischen Umfeld zu bewerten. In dieser Studie wird die Verwendung der Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma als Maß für die prokoagulanziale Aktivität von EV vorgeschlagen. Standardisierte Verfahren wurden verwendet, um Natriumcitrat-Vollblut zu erhalten, gefolgt von einer Differenzzentrifugation, um EV-reiches Plasma zu erhalten. Das EV-reiche Plasma und Calciumchlorid wurden in den Testbecher gegeben, und die Änderungen der Viskoelastizität wurden in Echtzeit mit einem Analysator überwacht. Die natürliche Gerinnungszeit von EV-reichem Plasma, bezeichnet als EV-ACT, wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des EV-ACT, wenn EV aus dem Plasma gesunder Freiwilliger entfernt wurde, während es signifikant abnahm, wenn EV angereichert wurde. Darüber hinaus war EV-ACT in humanen Proben von Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs erheblich verkürzt, was auf erhöhte Plasma-EV-Spiegel und die Förderung der Bluthyperkoagulation hindeutet. Mit seinem einfachen und schnellen Verfahren ist der EV-ACT ein vielversprechender Test am Krankenbett zur Beurteilung der Gerinnungsfunktion bei Patienten mit hohen EV-Plasmaspiegeln.
Introduction
Thrombosen, die durch Hyperkoagulabilität verursacht werden, spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, darunter Hirntrauma1, Präeklampsie2, Tumore3 und Frakturpatienten4. Der Mechanismus, der der Hyperkoagulabilität zugrunde liegt, ist komplex, und in jüngster Zeit wurde der Schwerpunkt auf die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei Gerinnungsstörungen gelegt. EVs sind vesikelartige Körper mit einer Doppelschichtstruktur, die sich von der Zellmembran lösen und einen Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben. Sie sind mit einer Vielzahl von Krankheitsprozessen assoziiert, insbesondere mit Gerinnungsstörungen5. Mehrere Studien haben EVs als vielversprechenden Prädiktor für das Thromboserisiko identifiziert 6,7. Die gerinnungsfördernde Aktivität von EVs hängt von der Expression von Gerinnungsfaktoren ab, vor allem von Tissue Factor (TF) und Phosphatidylserin (PS). EVs mit robuster prokoagulanziöser Aktivität verbessern signifikant die katalytische Effizienz von Tenase und Prothrombin-Komplex und fördern dadurch Thrombin-vermitteltes Fibrinogen und lokale Thrombosen8. Erhöhte Konzentrationen von EVs und ihr kausaler Zusammenhang mit der Hyperkoagulabilität wurden bei zahlreichen Erkrankungen beobachtet9. Folglich ist die Standardisierung der Detektion von Elektrofahrzeugen und die Berichterstattung über ihre gerinnungsfördernde Aktivität ein wichtiges Forschungsgebiet10.
Bisher gibt es nur wenige kommerzielle Kits zum Nachweis der gerinnungsfördernden Aktivität von Elektrofahrzeugen. Der MP-Activity-Assay und der MP-TF-Assay, die von einem kommerziellen Unternehmen hergestellt werden, sind funktionelle Assays, die zur Messung der prokoagulanziellen Aktivität von EV in Plasma11 verwendet werden. Diese Assays verwenden ein ähnliches Prinzip wie enzymengebundene Immunosorbent-Assays, um PS und TF auf EVs nachzuweisen. Diese Kits sind jedoch teuer und auf wenige hochrangige Forschungseinrichtungen beschränkt. Der Prozess ist komplex und zeitaufwändig, was es schwierig macht, sie im klinischen Umfeld umzusetzen. Darüber hinaus mischt ein kommerziell entwickelter prokoagulanziöser Phospholipid-Assay (PPL) PS-freies Plasma mit Testplasma und misst die Gerinnungszeit, um PS-positive EVs quantitativnachzuweisen12. Diese Assays konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf PS und TF bei Elektrofahrzeugen und übersehen andere Gerinnungswege, an denen zirkulierende Elektrofahrzeuge beteiligt sein können12.
Das Plasma-Koagulationssystem ist kompliziert und besteht sowohl aus "unsichtbaren" als auch aus "sichtbaren" Komponenten, einschließlich Koagulanzien, Antikoagulanzien, fibrinolytischen Systemen und EVs, die im Plasma suspendiert sind. Physiologisch sorgen diese Komponenten für ein dynamisches Gleichgewicht. Bei pathologischen Zuständen tragen signifikant erhöhte EVs im Kreislauf zur Hyperkoagulabilität bei, insbesondere bei Patienten mit Hirntrauma, Präeklampsie, Frakturen und verschiedenen Krebsarten13. Derzeit umfasst die Bewertung des Gerinnungsstatus in klinischen Laboratorien in erster Linie die Beurteilung des Gerinnungssystems, des Antikoagulationssystems und der Fibrinolyse 14,15,16,17. Die Prothrombinzeit, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit, die Thrombinzeit und das international normalisierte Verhältnis werden üblicherweise verwendet, um die Gerinnungsfaktorspiegel im Gerinnungssystem zu bewerten18. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass diese Tests die Hyperkoagulabilität bestimmter Krankheiten nicht vollständig widerspiegeln19. Andere Testmethoden, wie die Thromboelastometrie (TEG), die Rotations-TEG und die Sonoklotenanalyse, messen viskoelastische Veränderungen im Vollblut20,21. Da Vollblutproben zahlreiche Blutzellen und Blutplättchen enthalten, ist es wahrscheinlicher, dass diese Tests den Gerinnungsstatus der gesamten Probe anzeigen. Einige Forscher haben über die Rolle von Blutzellen und Blutplättchen bei der gerinnungsfördernden Aktivität berichtet22,23. Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab auch, dass frühere Gerinnungsfunktionstests Schwierigkeiten haben, Veränderungen in der prokoagulanziellen Aktivität von Mikropartikeln zu erkennen24. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass die prokoagulanziöse Funktion von EVs durch viskoelastische Messungen der aktivierten Gerinnungszeit (ACT) in EV-reichem Plasma bewertet werden kann.
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Protocol
Die Entnahme menschlicher Proben wurde von der medizinischen Ethikkommission des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt. Die Entnahme von menschlichem venösem Blut folgte streng der von der Nationalen Gesundheitskommission Chinas herausgegebenen Richtlinie, nämlich WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. Kurz gesagt, Blut wurde von gesunden Personen mit informierter Zustimmung aus der vorderen Armvene entnommen, und die Proben wurden mit 3,2% Natriumcitrat-Antikoagulans in einem Verhältnis von 1:9 gemischt. Als nur Proben von Natriumcitrat-Antikoagulanzien gesammelt wurden, wurde das erste Sammelgefäß verworfen. Der Verarbeitungsablauf wurde innerhalb von 0,5 h nach der Probenentnahme eingeleitet. Erwachsene gesunde Probanden wurden nach Einholung der Einverständniserklärung für die Probenentnahme rekrutiert. Die Ausschlusskriterien der Patienten waren: (1) eine kürzlich aufgetretene intravaskuläre Thrombose, (2) Beeinträchtigung der Leber- und Nierenfunktion, (3) Bluthochdruck, Hyperlipidämie, Diabetes und andere chronische Krankheiten, (4) Behandlung mit Aspirin oder Antikoagulanzien, (5) Menstruation und Schwangerschaft.
1. Isolierung von EV-reichem Plasma
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 120 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um Blutzellen zu entfernen. Der Überstand ist plättchenreiches Plasma. Dann wird die obere Hälfte des Überstandes mit einer Pipette in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt.
- Zentrifugieren Sie das plättchenreiche Plasma bei 1500 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Blutplättchen zu entfernen. Der Überstand ist plättchenarmes Plasma. Anschließend wird das obere 1/2 des Überstandes in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt.
- Zentrifugieren Sie das plättchenarme Plasma bei 13000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen. Bei dem Überstand handelt es sich um EV-reiches Plasma. Übertragen Sie dann die obere Hälfte des Überstandes zur anschließenden Prüfung in ein neues Zentrifugenröhrchen.
2. Detektion von EV-ACT der Probe durch den Analysator
- Schalten Sie den Gerinnselanalysator ein (siehe Materialtabelle) und heizen Sie das Gerät auf 37 °C vor. Installieren Sie die Einwegsonde und den Testbecher und starten Sie dann die Qualitätskontrolle der Maschine.
HINWEIS: Wenn der Signalwert des viskosen Widerstands auf dem Bildschirm als gerade Linie angezeigt wird, bedeutet dies, dass die Erkennung nicht beeinträchtigt wird und die Qualitätskontrolle des Analysatorstatus qualifiziert ist. Das Testverfahren kann nach Qualifizierung des Selbsttests gestartet werden. - Geben Sie Probeninformationen in das System ein. Anschließend werden 200 μl EV-reiches Plasma in den Testbecher gegeben, gefolgt von 20 mM 170 μl Calciumchlorid. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start. Der magnetische Rührstab im Testbecher mischt die Probe und das Kalziumchlorid vollständig. Schließen Sie die Abdeckung, und die Sonde beginnt, die Änderung des Probenwiderstands zu erkennen.
HINWEIS: Nachdem der Test abgeschlossen ist, gibt der Analysator automatisch die Meldung "Test abgeschlossen" aus. Die Uhrzeit von EV-ACT wird vom System angezeigt und aufgezeichnet. Das Ergebnis wird in der Zeiteinheit "Sekunde" ausgedrückt. Entsorgen Sie die Sonde und testen Sie den Becher.
3. Durchflusszytometrie-basierte Qualitätskontrolle der EV-reichen Plasmaprobe
- EVs wurden zunächst anhand ihrer Größe (0,1-1 μm) identifiziert. Stellen Sie die Parameter des Durchflusszytometers im Voraus ein und stellen Sie das "Gate" von EV mit handelsüblichen Polystyrolkügelchen (0,5, 0,9 und 3,0 μm) ein (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Kügelchenmischung besteht aus fluoreszierenden Kugeln mit unterschiedlichen Durchmessern, die den Größenbereich von Mikrovesikeln (0,5 und 0,9 μm) und Blutplättchen (0,9 μm und 3 μm) abdecken. - Stellen Sie die Spannung der Durchlassstreuung und der Seitenstreuung ein und stellen Sie sicher, dass die 0,9 μm-Mikrokugeln in den entsprechenden Bereich fallen. Der EV-Bereich kann entsprechend dem Durchmesser der Mikrokugel gezeichnet werden.
- 50 μl EV-reiches Plasma in das Durchflussrohr überführen, gefolgt von 450 μl filtrierter Phosphatpuffersalzlösung. Mischen Sie die Flüssigkeit im Durchflussrohr gründlich durch. Abschließend werden die Proben mittels Durchflusszytometrie25 detektiert.
- Verwenden Sie Ultra Rainbow Fluoreszenzpartikel (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der EVs.In kurz zu quantifizieren, fügen Sie der Probe vor der Durchflussdetektion 10 μl der Partikel hinzu und berechnen Sie die EV-Konzentration nach Abschluss der Probendetektion mit der folgenden Formel: 10.120 * EV (#) / (Mikroperlen * Volumen) * Verdünnungsfaktor26.
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Representative Results
Die Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma wurde mit einem viskoelastischen Methodenanalysator zur Messung der Plasmakoagulationszeit gemessen. Die Maschine besteht aus vier Hauptkomponenten: einem elektronischen Signalwandler, einer Sonde, einem Detektionsbehälter und einem Heizelement (Abbildung 1A,B). Die Sonde nutzt hochfrequente Schwingungen mit geringer Amplitude, um Änderungen der Plasmaviskosität zu erkennen. Die tägliche Qualitätskontrolle umfasst in erster Linie die Kontrolle der Luftqualität, um die Stabilität der Testplattform zu beurteilen und physikalische Störungen der Sonde zu identifizieren. Die Leistungsqualitätskontrolle umfasst Tests mit Öl mit Standardviskosität, um sicherzustellen, dass der von der Sonde erfasste Widerstandswert innerhalb des eingestellten Bereichs liegt.
Nach der Gewinnung von EV-reichem Plasma wurden EVs mittels Durchflusszytometrie zur Kontrolle der Probenqualität gemessen. Unqualifizierte Proben zeigen einen ausgeprägten Cluster mit etwas größerer Partikelgröße in der Nähe des "Gates" von EV (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu zeigen qualifizierte EV-reiche Stichproben, dass die meisten Signale als eine einzige Gruppe in das "Gate" von EV fallen (Abbildung 2B).
Um die EV-Konzentration in EV-reichen Plasmaproben von gesunden Probanden zu bewerten, wurde eine Superspeed-Zentrifugation (1.00.000 x g, 70 min) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Anstieg der EV-Konzentration die EV-ACT verkürzte, während eine Abnahme der EV-Konzentration die EV-ACT verlängerte (Abbildung 3A). Die EV-ACT-Zeit kann eine negative Korrelation mit den EV-Werten aufweisen. Es wurden mehrere Proben von klinischen Patienten untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass EV-reiche Plasmaproben von Patienten mit Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs (von links nach rechts) im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant kürzere EV-ACT-Zeiten aufwiesen (Abbildung 3B).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine schnelle und kostengünstige experimentelle Methode zum Nachweis der prokoagulanziellen Aktivität von EV vorläufig etabliert wurde, die vielversprechend für klinische Anwendungen bei Untersuchungen am Krankenbett ist.
Abbildung 1: Das schematische Diagramm und das physische Bild des Gerinnselanalysators. (A) und (B) stellen die Hauptkomponenten des Analysators bzw. die Betriebseinstellungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Durchflusszytometrie von EV in EV-reichem Plasma. (A) Unqualifizierte EV-reiche Plasmaproben. (B) Qualifizierte EV-reiche Plasmaproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse des EV-ACT der Probe. (A) EV-ACT-Ergebnisse nach EV-Entfernung und EV-Konzentration in EV-reichen Proben von gesunden Probanden (von links nach rechts, Suspension des Sediments nach Superzentrifugation, EV-reiches Plasma und Überstand nach Ultrazentrifugation). (B) EV-ACT-Ergebnisse von EV-reichen Proben von gesunden Probanden und Patienten (von links nach rechts, Präeklampsie, Hüftfraktur, Lungenkrebs und gesunde Probanden). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie wurde die Herstellung von EV-reichem Plasma beschrieben und die Rationalität der Methode mittels Durchflusszytometrie überprüft. Anschließend wurden die rekalzifizierten Plasmaproben für die ACT-Zeit unter Verwendung eines Gerinnselanalysators analysiert, der auf Viskoelastizitätsprinzipien24 basiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurde festgestellt, dass die Konzentration von EVs, die durch Ultrazentrifugation erhalten wurden, die EV-ACT-Zeit verkürzte, während der Überstand nach der Ultrazentrifugation, der die EV-Werte reduziert hatte, verlängerte EV-ACT-Zeiten aufwies. Diese Ergebnisse deuten auf einen engen Zusammenhang zwischen den EV-ACT-Ergebnissen und den EV-Werten hin. In Abbildung 3B wurden die EV-ACT von Plasmaproben von Patienten mit Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs mit gesunden Probanden verglichen, wobei signifikant kürzere EV-ACT-Zeiten in den Krankheitsgruppen festgestellt wurden. Frühere Berichte wiesen auf erhöhte Konzentrationen von gerinnungsfördernden EVs im Plasma für diese Krankheiten hin 27,28,29. Es sollte jedoch beachtet werden, dass andere im Plasma vorhandene Faktoren die EV-ACT-Ergebnisse beeinflussen können, und eine weitere Untersuchung dieser Einflussfaktoren ist gerechtfertigt. Dieser Assay schlägt vor, die entscheidende Rolle von EVs im hyperkoagulablen Zustand bestimmter Krankheiten anzuerkennen und das Fehlen einer kostengünstigen und schnellen Nachweismethode für die prokoagulanziale Aktivität von EV zu beheben.
Innerhalb des isolierten Blutprobensystems können gerinnungsrelevante Substanzen in Blutzellen, Blutplättchen, Zellmetaboliten (hauptsächlich EVs) und andere "unsichtbare" Komponenten (wie Gerinnungsfaktoren und gerinnungshemmende Faktoren) unterteilt werden30,31,32. Angesichts der Komplexität des Gerinnungsmechanismus wurde das Detektionssystem auf EV-reiches Plasma vereinfacht, um Interferenzen durch andere Faktoren zu minimieren. Zu den wichtigsten Schritten in diesem Prozess gehören die Vermeidung der Erzeugung künstlicher EVs während der Probenverarbeitung und die Minimierung der Thrombozytenkontamination. Daher ist es notwendig, das Differenzzentrifugationsverfahren innerhalb von 0,5 h einzuleiten und die Detektion innerhalb von 2 h nach der Probenentnahme abzuschließen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Verwendung einer ausreichend hohen Zentrifugalkraft und die Beibehaltung der oberen Hälfte des Überstandes die Thrombozytenkontamination wirksam reduzieren kann33. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Restplättchen in EV-reichem Plasma nachzuweisen, was ihre sehr geringe Präsenz bestätigte. Unqualifizierte Proben resultieren in erster Linie aus Thrombozytenkontamination und Zellfragmentierung, die durch den Handhabungsprozess verursacht werden. Die Thrombozytenkontamination ist durch das Vorhandensein von Partikeln außerhalb des "Gates" von EVs gekennzeichnet, während die Zellfragmentierung als ausgeprägter Cluster innerhalb des "Gates" von EVs erscheint.
Neuere Studien haben signifikant erhöhte Plasma-EVs bei bestimmten Krankheiten bestätigt34,35. Diese EVs fördern die Gerinnung in erster Linie durch das Vorhandensein von Phosphatidylserin (PS) und Gewebefaktor (TF) auf ihrer Oberfläche. Daher hängt die ACT-Zeit von EV-reichem Plasma weitgehend vom Gehalt an koagulanziösen EVs ab. Eine Einschränkung dieses Tests besteht darin, dass sichergestellt werden muss, dass sich die Konzentrationen der Gerinnungsfaktoren nicht signifikant ändern, so dass sie die Gerinnungszeit während der EV-ACT-Analyse beeinflussen. Studien zu Veränderungen der Gerinnungsfaktorspiegel nach Ausbruch der Krankheit sind jedoch relativ selten, und ihre Wirkung auf EV-ACT muss in weiterer Forschung untersucht werden. Darüber hinaus kann eine übermäßige Verwendung von gerinnungshemmenden Medikamenten die EV-ACT-Ergebnisse erheblich beeinflussen, so dass diese Methode während einer solchen Behandlung nicht angewendet werden sollte.
Es gibt mehrere Methoden zur Bestimmung von gerinnungsfördernden EVs, jede mit ihren Vor- und Nachteilen. Piwkham et al. untersuchten die EV-Prokoagulanzienaktivität, indem sie die EV-Suspension mit normalem Plasma mischten und den Zeitpunkt der Blutgerinnselbildung in einem Wasserbad bei 37 °C beobachteten36. Obwohl diese Methode einfach ist, kann die subjektive Beobachtung der Gerinnselbildungszeit zu Ergebnisschwankungen zwischen verschiedenen Beobachtern führen. Patil et al. verwendeten einen hauseigenen standardisierten Gerinnungsassay für die Prokoagulanzien-Mikropartikelprüfung unter Verwendung von Russell-Viperngift auf einem halbautomatischen Koagulometer37. Diese Detektionsmethode verwendet halbautomatische Geräte und bietet eine hohe Effizienz und Einfachheit. Die Zugabe von Russell-Viperngift zur Aktivierung von Faktor X übersieht jedoch das Vorhandensein anderer Antikoagulanzien im Plasma, wie z. B. des Lactadherin-Proteins. Diese Methode bewertet die Ergebnisse auf der Grundlage des Gleichgewichts zwischen gerinnungshemmenden EVs und gerinnungshemmenden Komponenten im Plasma und liefert eine genauere Reflexion der Gerinnungsfunktion der Plasmaprobe.
Bestehende Gerinnungsfunktionstests konzentrieren sich in erster Linie auf die Thrombinaktivierungszeit in Vollblut oder plättchenreichem Blut oder weisen Mängel an Gerinnungsfaktorennach 24. Die Entwicklung einer Testmethode für die Aktivität von EV-Prokoagulanzien wird dazu beitragen, die Rolle von EVs bei Krankheiten und zukünftigen Behandlungen aufzuklären. Der einfache Probenvorbereitungsprozess, bei dem nur CaCl2 hinzugefügt wird, macht den Assay für Kliniker bequem, um den Gerinnungsfunktionsstatus von Patienten schnell zu bestimmen. Der EV-ACT-Test ist einfach durchzuführen und die Ergebnisse liegen innerhalb von 10-15 Minuten vor, wodurch er sich gut für die Entwicklung als Test am Krankenbett eignet. Frühere Studien haben vorläufige Anwendungen von EV-ACT bei Präeklampsie, Tumoren und Frakturen identifiziert. Zukünftige Forschungen werden die klinischen Anwendungsaussichten von EV-ACT weiter untersuchen.
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Disclosures
Alle Autoren erklärten, dass es keine potenziellen Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China, Grant Nr. 81930031, 81901525, unterstützt. Darüber hinaus danken wir Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. für die Bereitstellung von Maschinen und technischer Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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