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Cancer Research

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर सेल के विकास और सिस्प्लैटिन संवेदनशीलता में अपनी भूमिका को सत्यापित करने के लिए FAM83A की दस्तक

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65667
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम FAM83A नॉकडाउन के लिए प्रक्रियाएं दिखाते हैं; गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के प्रसार, प्रवास और आक्रमण पर इसके प्रभावों का पता लगाने के लिए; और सिस्प्लैटिन के लिए इन कोशिकाओं का संवेदीकरण। यह अध्ययन गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के लिए एक आशाजनक लक्ष्य जीन और आगे की दवा अनुसंधान के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।

Abstract

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर की रोकथाम और उपचार के लिए ट्यूमर लक्ष्य जीन की खोज सर्वोपरि महत्व रखती है। इस अध्ययन में, हम गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में ट्यूमर लक्ष्य जीन FAM83A की पहचान में शामिल चरणों की रूपरेखा तैयार करते हैं। सबसे पहले, कैंसर जीनोम एटलस डेटासेट को महिलाओं में FAM83A की अभिव्यक्ति और रोगनिरोधी महत्व को मान्य करने के लिए नियोजित किया गया था। एक छोटे से हस्तक्षेप आरएनए (siRNA) HeLa और C33a कोशिकाओं में FAM83A जीन की दस्तक के लिए इस्तेमाल किया गया था. अगला, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) धुंधला ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार क्षमताओं पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया था. घाव भरने और झरझरा झिल्ली डालने assays ट्यूमर सेल प्रवास और आक्रमण क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया.

वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग एपोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। जेसी -1 धुंधला माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया गया था। इसके अलावा, सिस्प्लैटिन (डायमिनेडिक्लोरोप्लैटिनम, डीडीपी) हस्तक्षेप का उपयोग लक्ष्य जीन की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए किया गया था। जीन की एंटीकैंसर विशेषताओं को और अधिक मान्य करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री और कॉलोनी गठन परख आयोजित किए गए थे। नतीजतन, FAM83A नॉकडाउन को गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के प्रसार, प्रवास और आक्रमण को रोकने और इन कोशिकाओं को सिस्प्लाटिन के प्रति संवेदनशील बनाने के लिए दिखाया गया था। ये व्यापक पद्धतियां सामूहिक रूप से FAM83A को ट्यूमर से जुड़े लक्ष्य जीन के रूप में मान्य करती हैं, जो गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर की रोकथाम और उपचार में संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में वादा करती हैं।

Introduction

सर्वाइकल कैंसर एक वैश्विक चिंता का विषय है क्योंकि यह दुनिया भर में स्त्री रोग संबंधी दुर्दमता के अग्रणी प्रकारों में से एक हैऔर महिलाओं में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। रेडिकल सर्जरी और केमोरेडियोथेरेपी प्राथमिक चरण में उच्च इलाज दर से जुड़े हैं। हालांकि, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के उन्नत चरण में रोगियों के लिए उपचार के परिणाम जो मेटास्टेटिक बीमारी विकसित करते हैं, बहुत प्रतिकूल हैं2. इसलिए, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को अंतर्निहित जैविक तंत्र को और समझना और इस बीमारी की रोकथाम और उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करना महत्वपूर्ण है।

कैंसर की प्रगति में शामिल लक्ष्य जीन की पहचान करना और उनकी अभिव्यक्ति या कार्रवाई को रोकने के तरीके खोजना आशाजनक उपचार विकल्प प्रस्तुत करता है। इस अध्ययन में, हमने FAM83 को कैंसर पैदा करने वाले जीन के रूप में पहचाना और C33a और HeLa कोशिकाओं पर इसके निरोधात्मक प्रभावों की जांच की। FAM83 परिवार oncogenes (FAM83A-H) व्यापक रूप से मानव कैंसर 3,4 में रिपोर्ट कर रहे हैं. हाल ही में, FAM83A को फेफड़े5, स्तन6, डिम्बग्रंथि7, और अग्नाशयी8 कैंसर में अपग्रेड किया गया था, यह दर्शाता है कि FAM83A ट्यूमर कोशिकाओं में प्रसार, आक्रमण, स्टेम-सेल जैसे लक्षणों और दवा प्रतिरोध को बढ़ावा देने के माध्यम से कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। महत्वपूर्ण रूप से, FAM83A को गर्भाशय ग्रीवा घाव प्रगति और कार्सिनोजेनेसिस9 से जुड़े उपन्यास उम्मीदवार जीनों में से एक के रूप में पहचाना गया था। मानव गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में ऊंचा FAM83A अभिव्यक्ति की पुष्टि के बावजूद, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A का विशिष्ट प्रभाव और अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं है।

इस अध्ययन में, हम गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में एक ट्यूमर लक्ष्य जीन के रूप में FAM83A की पहचान में शामिल प्रोटोकॉल की रूपरेखा और HeLa और C33a कोशिकाओं में FAM83A जीन के दस्तक के लिए एक छोटे से हस्तक्षेप आरएनए (siRNA) का उपयोग करें. 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) धुंधला ट्यूमर सेल प्रसार पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए किया गया था, जबकि घाव भरने और झरझरा झिल्ली डालने वाले परख ने ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण क्षमताओं का मूल्यांकन करने में मदद की।

पश्चिमी सोख्ता एपोप्टोसिस से संबंधित प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था, और जेसी -1 धुंधला माइटोकॉन्ड्रियल समारोह परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया गया था। इस प्रकार, हमने बताया कि FAM83A कोशिका प्रसार, मेटास्टेसिस और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में आक्रमण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। PI3K/AKT-पाथवे-जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और एपोप्टोसिस के माध्यम से, FAM83A नॉकडाउन ने सर्वाइकल कैंसर कोशिकाओं को सिस्प्लैटिन (डायमिनेडिक्लोरोप्लैटिनम, DDP) के प्रति संवेदनशील बनाया। यह अध्ययन गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर और संभवतः अन्य कैंसर के लिए एक नया लक्ष्य प्रदान करता है और कुछ कीमोथेरेपी दवाओं के लिए कैंसर कोशिकाओं के प्रतिरोध को दूर करने के लिए रणनीतियों के विकास के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।

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Protocol

अध्ययन पूरी तरह से टीसीजीए (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines) द्वारा प्रदान किए गए प्रकाशन दिशानिर्देशों के अनुरूप था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. डेटा स्रोत और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

  1. क्लस्टर विश्लेषण के लिए कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) डेटाबेस (https://cancergenome.nih.gov) से आरएनए अनुक्रमण डेटा प्राप्त करें। GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) का उपयोग करें, एक मानक प्रसंस्करण पाइपलाइन के साथ उम्मीदवार कैंसर दवा लक्ष्यों के लिए स्क्रीन करने के लिए, TCGA परियोजनाओं से नमूनों के कच्चे RNA-Seq डेटा की फिर से गणना करने के लिए एक वेब-आधारित उपकरण।
    नोट: GEPIA वेबसाइट सभी उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।
  2. जीईपीआईए वेबसाइट होमपेज पर पहुंचें और कैंसर प्रकार विश्लेषण पर क्लिक करें, विभेदक जीन विश्लेषण विकल्प चुनें, और निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: कैंसर का नाम = सीईएसई (इस वेबपेज पर सर्वाइकल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और एंडोकर्विकल एडेनोकार्सिनोमा के रूप में परिभाषित), |लॉग2एफसी| कटऑफ = 1, क्यू-वैल्यू कटऑफ = 0.01, डिफरेंशियल मेथड्स = एनोवा, और क्रोमोसोमल डिस्ट्रीब्यूशन = दोनों। फिर, एक जीन सूची प्राप्त करने के लिए सूची पर क्लिक करें जो ट्यूमर और सामान्य समूहों के बीच अंतर अभिव्यक्ति दिखाता है।
    नोट: यह अलग-अलग व्यक्त उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए एक व्यापक साहित्य समीक्षा की आवश्यकता है। इस अध्ययन में, उपलब्ध साहित्य से पृष्ठभूमि पर विचार करते हुए, हम ब्याज के ट्यूमर जीन, FAM83A पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
  3. फिर, आगे बढ़कर GEPIA का उपयोग करके गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर और सामान्य ऊतकों में FAM83A की अभिव्यक्ति की जांच करें webवेबसाइट पर अभिव्यक्ति DIY विकल्प और चार्ट प्रकार के रूप में बॉक्सप्लॉट चुनें। जीन पैरामीटर फ़ील्ड में FAM83A इनपुट करें और निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: |लॉग2एफसी| कटऑफ मूल्य = 1; क्यू-वैल्यू कटऑफ = 0.01। कैंसर नाम के रूप में सीईएसई का चयन करें और मिलान किए गए सामान्य डेटा फ़ील्ड के लिए टीसीजीए सामान्य डेटा का मिलान करें, अन्य सभी सेटिंग्स को उनके डिफ़ॉल्ट पर छोड़ दें। प्लॉट पर क्लिक करें और वेबसाइट को FAM83A जीन की अंतर अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करने वाला एक बॉक्सप्लॉट उत्पन्न करने की अनुमति दें; भविष्य के संदर्भ और विश्लेषण के लिए बॉक्सप्लॉट को सहेजें।
  4. अंत में, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों के साथ ट्यूमर असर रोगियों के समग्र अस्तित्व का विश्लेषण. वेबसाइट पर सर्वाइवल प्लॉट्स विकल्प पर नेविगेट करें, जीन को FAM83A पर सेट करें, और विश्लेषण प्रकार के रूप में ओवरऑल सर्वाइवल चुनें। ट्यूमर नाम CESE जोड़ें, एक्सिस इकाइयों के लिए महीने चुनें, और अन्य सभी मापदंडों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें। प्लॉट पर क्लिक करें और वेबसाइट को उत्तरजीविता वक्र चार्ट बनाने दें; भविष्य के संदर्भ और विश्लेषण के लिए इस चार्ट को सहेजें।
  5. गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में संभावित चिकित्सीय लक्ष्य जीन के रूप में FAM83A की पहचान करने के लिए ट्यूमर में FAM83A की अंतर अभिव्यक्ति और रोगी के अस्तित्व विश्लेषण के साथ इसके सहसंबंध दोनों को ध्यान में रखें।

2. सेल आधारित प्रयोगों

  1. सेल संस्कृति
    1. एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित माध्यम में संस्कृति मानव ट्यूमर सेल लाइनें।
      नोट: सेल लाइन की जानकारी और संस्कृति माध्यम घटकों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. कोशिका अभिकर्मक
    1. कोशिकाओं में FAM83A अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए siRNA का प्रयोग करें.
      नोट: विशिष्ट siRNA अनुक्रम के लिए तालिका 1 देखें.
    2. 6-अच्छी प्लेटों में बीज कोशिकाओं और 50% -70% संगम प्राप्त करने के बाद 4-6 घंटे के लिए 50 एनएम एसआई-एफएएम 83 ए या एसआईआरएनए-एनसी और 8 माइक्रोन ट्रांसफेक्शन एजेंट या अभिकर्मक एजेंट के केवल 8 माइक्रोन के मिश्रण के साथ इनक्यूबेट करें। नकारात्मक नियंत्रण में केवल सीरम-मुक्त DMEM जोड़ें।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, डीएमईएम + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ अभिकर्मक एजेंट युक्त माध्यम की जगह. इसके अलावा, अभिकर्मक के बाद 48 घंटे, इरादा के रूप में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (डीडीपी) के साथ इलाज करें और कुल आरएनए निष्कर्षण और क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए सभी कोशिकाओं की कटाई करें।

3. सेल प्रसार परख के लिए EdU का पता लगाना

नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार इन विट्रो में सेल प्रसार का आकलन करने के लिए EdU सेल प्रसार किट का उपयोग करें।

  1. 6 अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं बीज और 2 घंटे के लिए 10 माइक्रोन EdU समाधान के साथ उन्हें सेते हैं. कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पारगम्यता करें।
  2. पारगम्यता बफर निकालें और 1x प्रतिक्रिया समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें। फिर, परमाणु धुंधला के लिए अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ कोशिकाओं को दाग दें और उन्हें 200x आवर्धन पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करें। EdU के साथ प्रसार कोशिकाओं के नाभिक दाग और लाल प्रतिदीप्ति के लिए उन्हें जांच.
  4. अंत में, कम से कम 10 यादृच्छिक क्षेत्रों की गिनती करके परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और कुल कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करके प्रसार दर की गणना करें।

4. घाव भरने की परख

  1. अच्छी तरह से प्रति 2 × 105 कोशिकाओं के घनत्व पर 6-अच्छी तरह से प्लेटों में बीज कोशिकाओं।
  2. जब कोशिकाएं 90% संगम प्राप्त करती हैं, तो सेल मोनोलेयर में एक रैखिक खरोंच बनाने के लिए एक बाँझ 10 माइक्रोन माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करें। धीरे बाँझ पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला, खरोंच की वजह से किसी भी अलग कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए.
  3. इसके अलावा, 1% FBS युक्त माध्यम में कोशिकाओं सेते हैं. फिर, निरीक्षण करें और 12, 24, और 48 घंटे में घायल क्षेत्र के उपचार के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ चित्र लें।

5. झरझरा झिल्ली डालने परख

  1. वांछित सेल एकाग्रता (4 × 104 कोशिकाओं युक्त) पर सेल संस्कृति माध्यम में एक सेल निलंबन तैयार करें, जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट या नियंत्रण C33a कोशिकाओं और HeLa शामिल हैं। झिल्ली आवेषण के शीर्ष कक्ष में सेल निलंबन जोड़ें, यहां तक कि वितरण सुनिश्चित करना। निचले कक्ष में पूरा माध्यम जोड़ें।
  2. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद, क्रमशः निचले कक्षों में पलायन करने वाली कोशिकाओं के निर्धारण और धुंधला होने के लिए मिथाइल अल्कोहल और 0.1% क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करें।
  3. छवियों को लेने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और फिर ImageJ के साथ कम से कम 10 यादृच्छिक क्षेत्रों की गणना करके माइग्रेटिंग कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण.
    1. ImageJ के साथ संख्या विश्लेषण के लिए, ImageJ सॉफ़्टवेयर में छवि खोलें, टूल मेनू में छवि टैब पर जाएं, समायोजित करें चुनें, और फिर थ्रेसहोल्ड पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो, तो थ्रेशोल्ड सेटिंग्स को समायोजित करें, जब तक कि केवल कोशिकाएं सफेद पृष्ठभूमि के सामने दिखाई न दें।
    2. इन सेटिंग्स को छवि पर लागू करने के लिए थ्रेशोल्ड विंडो में लागू करें पर क्लिक करें। अब, टूलबार (विंडो के शीर्ष पर स्थित) से वैंड (ट्रेसिंग) टूल का चयन करें।
    3. छवि के उस क्षेत्र पर क्लिक करें जहां थ्रेशोल्ड छवि में सभी कोशिकाओं का चयन करने के लिए कोशिकाएं स्थित हैं। कोशिकाओं को हाइलाइट किए जाने के बाद, टूल मेनू में विश्लेषण पर जाएं और फिर, कणों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। विश्लेषण कण खिड़की में, वांछित आकार (जैसे, 0 - अनंत) और परिपत्र मूल्यों (जैसे, 0.00 - 1.00) प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार गिनती में सभी कोशिकाओं को शामिल करने के लिए दर्ज करें.
    4. ठीक क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर द्वारा कोशिकाओं की गणना करने और विश्लेषण परिणामों के साथ एक नई विंडो के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें।

6. कॉलोनी गठन परख

  1. बीज 2 × 105 कोशिकाओं के साथ या 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (डीडीपी) उपचार के बिना 6-अच्छी तरह से प्लेट में सी-एनसी और सी-एफएएम 83 ए समूहों के प्रति कुआं।
  2. दवा उपचार की 24 घंटे की अवधि के बाद, 0.25% ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें और उन्हें 10% एफबीएस युक्त डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में फिर से निलंबित करें। बीज 1 × 103 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के घनत्व पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में resuspended कोशिकाओं, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस के एक तापमान पर एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में सेते हैं.
  3. ~ 7-10 दिनों के लिए इनक्यूबेशन के बाद जब कालोनियों दिखाई दे रहे हैं, 4% Polyoxymethylene के साथ कोशिकाओं को ठीक करने और उन्हें 20 मिनट के लिए Giemsa धुंधला समाधान के साथ दाग.
  4. कोशिकाओं को थोड़ा धो लें और प्लेटों को हवा में सूखने दें। खुर्दबीन द्वारा कॉलोनी समूहों की छवियों ले लो और 50 से अधिक कोशिकाओं वाले कालोनियों की संख्या गिनती.

7. जेसी -1 डाई का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली विध्रुवण (एमएमपी) विश्लेषण

  1. बीज 1.2 × 106 ट्यूमर कोशिकाओं Si-NC और Si-FAM83A समूहों से छह-अच्छी प्लेट और संस्कृति में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (DDP) उपचार के साथ या बिना।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित परख किट का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के तहत 15-20 मिनट के लिए 1x जेसी -1 धुंधला समाधान के साथ सेते हैं।
  3. कोशिकाओं को धो लें और क्रमशः ~ 490 एनएम और 590 एनएम पर जेसी -1 के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके 200x आवर्धन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत उनकी जांच करें। जेसी -1 प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए, इस तरह के एक नीले उत्तेजना फिल्टर (450-490 एनएम) और एक लाल उत्सर्जन फिल्टर (लंबे समय >से पास 590 एनएम) के रूप में उपयुक्त फिल्टर का उपयोग चुनिंदा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत पर कब्जा करने के लिए.

8. एमपीटीपी का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. बीज 1.2 × 106 ट्यूमर कोशिकाओं Si-NC और Si-FAM83A समूहों से छह-अच्छी प्लेट और संस्कृति में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (DDP) उपचार के साथ या बिना।
  2. कोशिकाओं से संस्कृति माध्यम निकालें, पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को समान रूप से कवर करने के लिए कैल्सिन एएम धुंधला समाधान और प्रतिदीप्ति शमन कार्य समाधान के 300 माइक्रोन प्रत्येक (1x मात्रा) जोड़ें। 30-45 मिनट के लिए एक प्रकाश संरक्षित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा preheated संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम की जगह. इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ द्वारा कैल्सिन एएम के पूर्ण हाइड्रोलिसिस को सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त 30 मिनट के लिए प्रकाश-संरक्षित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर ग्रीन-फ्लोरोसेंट कैल्सिन की पीढ़ी होती है।
  3. संस्कृति माध्यम निकालें, पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2-3x धो लें, और पता लगाने बफर जोड़ने. प्रवाह साइटोमेट्री और 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके सेल एमपीटीपी का पता लगाएं।

9. फ्लो साइटोमेट्री

  1. बीज 1.2 × 106 ट्यूमर कोशिकाओं Si-NC और Si-FAM83A समूहों से छह-अच्छी प्लेट और संस्कृति में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (DDP) उपचार के साथ या बिना।
  2. दवा उपचार के 24 घंटे के बाद, बाध्यकारी बफर समाधान के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन में एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के 10 माइक्रोन और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के 5 माइक्रोन को धीरे से मिलाएं। प्रकाश से बचने के दौरान 15 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को बाध्यकारी बफर समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें। 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके सेल एपोप्टोसिस का पता लगाएं।

10. आरटी-पीसीआर विश्लेषण

  1. बीज 1.2 × 106 ट्यूमर कोशिकाओं Si-NC और Si-FAM83A समूहों से छह-अच्छी प्लेट और संस्कृति में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (DDP) उपचार के साथ या बिना।
  2. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालें और निकाले गए आरएनए को पूरक डीएनए (सीडीएनए) में सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण के साथ 45 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके और फिर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तित करें।
  3. डीएनए पोलीमरेज़, न्यूक्लियोटाइड्स, बफर, और डिज़ाइन किए गए जीन-विशिष्ट प्राइमरों से युक्त पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में सीडीएनए टेम्पलेट जोड़ें और निम्नलिखित थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों के साथ वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर उपकरण पर पीसीआर प्रदर्शन करें: 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, इसके बाद 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पिघलने वक्र चरण, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। आंतरिक नियंत्रण के रूप में जीएपीडीएच का उपयोग करके 2−ΔΔCq विधि का उपयोग करके एमआरएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तालिका 1 में दिखाई गई है, और प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं।
    1. 2−ΔΔCq मान की गणना करने के लिए, नमूनों में लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन (GAPDH) के लिए Cq मानों को मापें। प्रत्येक नमूने के लिए लक्ष्य जीन के Cq मान से संदर्भ जीन के Cq मान घटाकर ΔCq की गणना करें। प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के ΔCq से एक नियंत्रण नमूने के ΔCq घटाकर ΔΔCq की गणना करें। अंत में, 2−ΔΔCq मान की शक्ति तक 2 बढ़ाकर 2−ΔΔCq मान की गणना करें।
      नोट: सीक्यू मान चक्र संख्या का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर प्रतिदीप्ति संकेत सेट थ्रेशोल्ड तक पहुंचता है।

11. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. बीज 1.2 × 106 ट्यूमर कोशिकाओं Si-NC और Si-FAM83A समूहों से छह-अच्छी प्लेट और संस्कृति में 24 घंटे के लिए 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (DDP) उपचार के साथ या बिना।
  2. सुसंस्कृत कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें किसी भी अवशिष्ट विकास मीडिया या सीरम को हटाने के लिए बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से धो लें। सेलुलर प्रोटीन को छोड़ने के लिए फेनिलमिथाइल सल्फोनील फ्लोराइड (पीएमएसएफ) युक्त आरआईपीए लाइसिस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को लाइज़ करें। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 12,000 × ग्राम पर पूर्ण लसीका और अपकेंद्रित्र सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए अपने प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके सेल लाइसेट में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें। एक लोडिंग बफर के साथ सेल लाइसेट मिलाएं और प्रोटीन को विकृत करने और जेल पर समान पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए 95-100 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को गर्म करें।
  4. प्रत्येक नमूने से, एसडीएस-पेज जेल पर कुल प्रोटीन के 30 माइक्रोग्राम लोड करें और एसडीएस-पेज को 80 वी के निरंतर वोल्टेज के तहत चलाएं।
  5. 1.5 घंटे के लिए 200 एमए की धारा के साथ बर्फ स्नान पर गीला स्थानांतरण प्रणाली का उपयोग करके जेल से अलग प्रोटीन को पॉलीविनाइल्डिफ्लोराइड झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
  6. आरटी पर 1 घंटे के लिए 0.05% ट्वीन -20 बफर (टीबीएसटी) के साथ ट्रिस-बफर खारा में 5% नॉनफैट दूध के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें और सामग्री की तालिका में दिए गए संबंधित एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. टीबीएसटी के साथ झिल्ली को कई बार धोएं और आरटी पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ इनक्यूबेट करें, इसके बाद टीबीएसटी के साथ धोएं। एक बढ़ाया chemiluminescence पहचान किट और इमेजर प्रणाली का उपयोग प्रोटीन बैंड कल्पना.

12. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. जैसा कि सभी प्रयोगात्मक डेटा बिंदु स्वतंत्र होंगे, डेटा को एसडी के माध्य ± रूप में प्रस्तुत करें।
  2. कई तुलनाओं के लिए विचरण (एनोवा) के एकतरफा विश्लेषण और नियंत्रण समूह के साथ प्रत्येक समूह की तुलना करने के लिए डनेट के परीक्षण का उपयोग करें। दो समूहों की तुलना करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट (अनपेयर्ड टू-टेल्ड) का उपयोग करें; P < 0.05 को सार्थक मानिए।

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Representative Results

TCGA डेटाबेस विश्लेषण और PCR सत्यापन

टीसीजीए डेटाबेस विश्लेषण से, हमने एफएएम 83 ए की अंतर अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए 306 गर्भाशय ग्रीवा कैंसर सेल नमूनों और 13 सामान्य सेल नमूनों में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का तुलनात्मक विश्लेषण किया। एफएएम 83 ए गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में अपग्रेड किया गया था, जबकि सामान्य ग्रीवा ऊतक में इसकी अभिव्यक्ति नगण्य थी (चित्रा 1 ए)। FAM83A अभिव्यक्ति के रोगनिरोधी निहितार्थों में और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने एक कपलान-मीयर वक्र विश्लेषण किया। आश्चर्यजनक रूप से, उच्च एफएएम 83 ए अभिव्यक्ति वाले रोगियों ने एक स्पष्ट रूप से बदतर समग्र अस्तित्व (चित्रा 1 बी) प्रदर्शित किया। गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A की भूमिका निर्धारित करने के लिए, हमने दो गर्भाशय ग्रीवा कैंसर सेल लाइनों, HeLa और C33a के साथ-साथ एक अमर ग्रीवा सेल लाइन, End1/E6E7 में FAM83A अभिव्यक्ति स्तरों की जांच की। क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करते हुए, हमने एंड1/ई6ई7 सेल लाइन(चित्रा 1सी)की तुलना में हेला और सी33ए सेल लाइनों में एफएएम 83ए की एक महत्वपूर्ण अतिअभिव्यक्ति देखी। ये निष्कर्ष गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के संदर्भ में FAM83A के महत्व को रेखांकित करते हैं।

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A के जैविक कार्य को सत्यापित करने के लिए प्रसार और एपोप्टोसिस प्रयोग

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A की कार्यात्मक भूमिका की जांच करने के लिए, हमने C33a और HeLa कोशिकाओं(चित्रा 2A,B)में FAM83A के siRNA-मध्यस्थता वाले नॉकडाउन का उपयोग किया। हमने तब सेल प्रसार पर FAM83A दमन के प्रभाव का आकलन किया। EdU धुंधला पता चला है कि FAM83A की अभिव्यक्ति में कमी काफी C33a और HeLa कोशिकाओं(चित्रा 2C-F) दोनों में सेल प्रसार बाधित. अमर घातक कोशिकाओं बेहद कम apoptosis दर10 के साथ जुड़े रहे हैं. इसलिए, नियंत्रण और si-FAM83A-उपचारित गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में विरोधी और proapoptotic प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन किया गया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि एफएएम 83 ए की दबी हुई अभिव्यक्ति ने बैक्स और क्लीव्ड कैसपेज़3 प्रोटीन (प्रोपोप्टोटिक प्रोटीन) की अभिव्यक्ति में वृद्धि की, बीसीएल -2 (एंटीपोप्टोटिक प्रोटीन) की अभिव्यक्ति में कमी आई, और सीवाईटीसी रिलीज(चित्रा 2सी-ई)में वृद्धि हुई, जो अवलोकन के अनुरूप है कि एंटीपोप्टोटिक प्रोटीन साइटीसी(चित्रा 2जी-जे)10के माइटोकॉन्ड्रियल रिलीज को अवरुद्ध करके एपोप्टोसिस को नियंत्रित करते हैं. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों ने सुझाव दिया कि एफएएम 83 ए गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर सेल प्रसार और एपोप्टोसिस को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में FAM83A के जैविक कार्य को सत्यापित करने के लिए घाव भरने और झरझरा झिल्ली डालने परख

घाव भरने और झिल्ली डालने assays प्रवास और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण पर FAM83A दमन के प्रभाव का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया. परिणामों से पता चला कि दबा एफएएम 83 ए अभिव्यक्ति के साथ गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 3 ए-डी) माइग्रेट और नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कम कुशलता से (चित्रा 3 ई-एच) पर आक्रमण किया।

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग पर प्रभाव

सेल एपोप्टोसिस को शामिल करने में PI3K/AKT की भूमिका को देखते हुए, हमने यह निर्धारित करने का लक्ष्य रखा कि क्या FAM83A अभिव्यक्ति का दमन गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में PI3K/Akt/mTOR मार्ग के संवैधानिक फॉस्फोराइलेशन को बाधित करेगा। FAM83A के दमन ने PI3K/Akt/mTOR मार्ग में प्रमुख फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन स्तरों को काफी बाधित किया, जिसमें p-PI3K, p-Akt, और p-mTOR c333a और HeLa कोशिकाओं(चित्रा 4A-D)में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर चयापचय और सेल एपोप्टोसिस प्रेरण के लिए जिम्मेदार अंग हैं। साक्ष्य जमा करना इंगित करता है कि कैंसर सेल एपोप्टोसिस में माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता को बढ़ाने और साइटोप्लाज्म10 में Cytc जैसे प्रोपोप्टोटिक अणुओं की रिहाई के कारण आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल मार्ग के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन शामिल है। PI3K/AKT मार्ग माइटोकॉन्ड्रिया में Bax के स्थानांतरण को विनियमित कर सकता है, जो एपोप्टोटिक उत्तेजनाओं के जवाब में Cytc रिलीज को प्रेरित करता है। इसलिए, यह बोधगम्य है कि PI3K-AKT सिग्नलिंग मार्ग के ऑन्कोजेनिक घटक माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार को प्रभावित करके सीधे सेल एपोप्टोसिस को नियंत्रित करते हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल स्थिति निर्धारित करने के लिए एक लाइव-सेल माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र (एमपीटीपी) परख किया गया था। एमपीटीपी उद्घाटन एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक सेल मौत11 के साथ जुड़ा हुआ है. इस परख में, एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट डाई (कैल्सिन एएम) को साइटोप्लाज्म और माइटोकॉन्ड्रिया में बनाए रखा जाता है जब एमपीटीपी बंद हो जाता है, जबकि साइटोप्लाज्म में डाई को सीओसीएल2 द्वारा बुझाया जाता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रिया में केवल गहन प्रतिदीप्ति निकल जाती है। परिणामों से पता चला कि माइटोकॉन्ड्रिया में तीव्र हरी प्रतिदीप्ति के साथ सेल आबादी एफएएम 83 ए दमन के बाद काफी कम हो गई, जो एक खुले एमपीटीपी(चित्रा 4ई,एफ)का संकेत देती है। इसके अलावा, हमने जेसी -1 धुंधला का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (ΔΨm) में परिवर्तन की जांच की। जेसी -1 एपोप्टोटिक कोशिकाओं में कम एमएमपी के तहत उच्च झिल्ली क्षमता और मोनोमर्स (हरी प्रतिदीप्ति) के साथ बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया युक्त जीवित कोशिकाओं में समुच्चय (लाल प्रतिदीप्ति) बनाता है। FAM83A दमन धीरे-धीरे एमएमपी(चित्रा 4जी)में कमी आई।

प्रसार और आक्रमण के लिए दवा संवेदनशीलता विश्लेषण

सिस्प्लैटिन (DDP) आधारित कीमोथेरेपी सर्वाइकल कैंसर के लिए एक मानक उपचार रणनीति है। हालांकि, कीमोरेसिस्टेंस एक चुनौती बनी हुई है। हमने सिस्प्लैटिन का उपयोग करके गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के उपचार में FAM83A की भूमिका की जांच की। नियंत्रण, si-NC-इलाज, और si-FAM83A-उपचारित HeLa कोशिकाओं के साथ या 5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन12 के बिना इलाज किया गया. इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता पर FAM83A दमन के प्रभावों का आकलन किया गया। डीडीपी ने केवल डीडीपी उपचार(चित्रा 5 ए और चित्रा 5 सी) की तुलना में एफएएम 83 ए दमन के बाद हेला कोशिकाओं के प्रसार पर अधिक महत्वपूर्ण निरोधात्मक प्रभाव प्रेरित किया। 5 माइक्रोन सिस्प्लाटिन के साथ गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, एफएएम 83 ए दमन ने सेल आक्रमण(चित्रा 5 बी और चित्रा 5डी) को भी रोक दिया।

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए दवा संवेदनशीलता विश्लेषण

5 माइक्रोन सिस्प्लैटिन (डीडीपी) के साथ या बिना सी-एनसी-इलाज और सी-एफएएम 83 ए-उपचारित हेला कोशिकाओं का इलाज करके, हमने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) का मूल्यांकन किया और जेसी -1 धुंधला का उपयोग करके कोशिका मृत्यु के कारण माइटोकॉन्ड्रियल क्षति का आकलन किया। डीडीपी ने अधिक माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को प्रेरित किया, जैसा कि एफएएम 83 ए नॉकडाउन के बाद जेसी -1 मोनोमर प्रतिशत में कमी से पता चला है, केवल डीडीपी उपचार (चित्रा 6 ए और चित्रा 6 डी) की तुलना में। 5 माइक्रोन सिस्प्लाटिन के साथ गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, एफएएम 83 ए नॉकडाउन ने कॉलोनी गठन (चित्रा 6 बी और चित्रा 6 ई) और बढ़ाया सेल एपोप्टोसिस(चित्रा 6सी और चित्रा 6एफ) को भी बाधित किया। इसके अलावा, डीडीपी की उपस्थिति में एफएएम 83 ए नॉकडाउन ने प्रोपोप्टोटिक प्रोटीन, बैक्स और क्लीव्ड कैसपेज़3की अभिव्यक्ति को स्पष्ट रूप से बढ़ाया, सीवाईटीसी रिलीज को बढ़ावा दिया, और बीसीएल -2 अभिव्यक्ति (चित्रा 6जी, एच) में कमी आई। इन परिणामों ने संकेत दिया कि एफएएम 83 ए नॉकडाउन ने एपोप्टोसिस प्रेरण के माध्यम से डीडीपी को गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं को संवेदनशील बनाया।

Figure 1
चित्रा 1: एफएएम 83 गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं में अतिअभिव्यक्ति और बदतर रोग का निदान के साथ सहसंबंध। (ए) गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के नमूनों में एफएएम 83 ए के एमआरएनए स्तरों का बॉक्सप्लॉट विश्लेषण। (बी) गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर वाले रोगियों में समग्र अस्तित्व के निर्धारण के लिए एफएएम 83 ए अभिव्यक्ति का कपलान-मेयर विश्लेषण। (सी)गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर सेल लाइनों HeLa और C33a और मानव अमर ग्रीवा सेल लाइन End1/E6E7 में FAM83A के सापेक्ष mRNA स्तर। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *P < 0.05, एक तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके End1/E6E7 कोशिकाओं की तुलना में। संक्षिप्ताक्षर: सीईएसई = ग्रीवा स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और एंडोकर्विकल एडेनोकार्सिनोमा; HR = जोखिम अनुपात। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के प्रसार और एपोप्टोसिस पर एफएएम 83 ए के दमन के प्रभाव।C33a और HeLa कोशिकाओं FAM83A-विशिष्ट siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. (सी) सी 33 ए और (डी) हेला कोशिकाओं में क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके ग्रीवा कैंसर सेल लाइनों में (ए, बी) एफएएम 83 ए के एमआरएनए स्तर का मूल्यांकन किया गया था, ईडीयू परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। (ई, एफ) "C33a और हेला कोशिकाओं की EDU प्रतिदीप्ति छवियां"। (जी-जे) Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3, और cleaved-caspase-3 सहित apoptosis से संबंधित प्रोटीन के स्तर की जांच के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण; जीएपीडीएच का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; ** पी < 0.001, एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग कर नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना में. संक्षिप्ताक्षर: एनसी = नकारात्मक नियंत्रण; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; CytC = साइटोक्रोम सी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो में गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण पर एफएएम 83 ए का प्रभाव। (एडी) घाव भरने परख सेल प्रवास का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया था. छवियाँ 0, 24, और 48 घंटे पर लिया गया (ईएच) Transwell assays सेल आक्रमण की जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया. स्केल बार = 100 माइक्रोन (ई, एफ)। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; ** पी < 0.001, एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग कर नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: PI83K/AKT/mTOR मार्ग और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर FAM3A दमन का प्रभाव।(ए-डी) FAM3A दमन के बाद C33a और HeLa कोशिकाओं में PI83K/AKT/mTOR मार्ग से प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण। (ईएच) "जेसी -1 धुंधला का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित विश्लेषण"। जेसी -1 समुच्चय लाल रंग में दाग दिए गए थे, और जेसी -1 मोनोमर्स हरे रंग में दाग दिए गए थे जो कम एमएमपी का संकेत देते थे। (मैं, जे) माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता का मूल्यांकन एक एमपीटीपी किट और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ई, एफ)। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; पी < 0.001, एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में। संक्षिप्ताक्षर: एमएमपी = माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता; mPTP = माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सेल प्रसार और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण पर डीडीपी द्वारा निषेध पर एफएएम 83 ए दमन के प्रभाव।HeLa कोशिकाओं si-NC या si-FAM83A के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और 5 माइक्रोन DDP के साथ या बिना इलाज किया गया. (ए, सी) नियंत्रण में सेल प्रसार पर डीडीपी का प्रभाव, सी-एनसी-उपचारित, और सी-एफएएम 83-उपचारित हेला कोशिकाएं। (बी, डी) नियंत्रण में सेल आक्रमण पर डीडीपी का प्रभाव, सी-एनसी-उपचारित, और सी-एफएएम 83-उपचारित हेला कोशिकाएं। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; पी < 0.001, नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना में। && पी < 0.01; &&&P < 0.001, एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डीडीपी की तुलना में। संक्षिप्ताक्षर: डीडीपी = डायमिनेडिक्लोरोप्लैटिनम; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोसिस पर डीडीपी के प्रभावों पर एफएएम 83 ए दमन के प्रभाव। HeLa कोशिकाओं si-NC या si-FAM83A के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और 5 माइक्रोन DDP के साथ या बिना इलाज किया गया. (ए, डी) जेसी -1 धुंधला का उपयोग कर एमएमपी विश्लेषण। (बी, ई) प्लेट क्लोनिंग परिणाम। (सी, एफ) "विभिन्न उपचार समूहों में एपोप्टोसिस दरों का पता लगाने वाले फ्लो साइटोमेट्री"। (जी, एच) "बीसीएल -2, बैक्स, सीवाईटीसी और डाउनस्ट्रीम क्लीव्ड कैस्पेज़ -3 सहित माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित एपोप्टोटिक प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण"। जीएपीडीएच का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; पी < 0.001, नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना में। &पी < 0.05; && पी < 0.01; &&&P < 0.001, एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डीडीपी की तुलना में। संक्षिप्ताक्षर: डीडीपी = डायमिनेडिक्लोरोप्लैटिनम; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: siRNA, qRTPCR प्राइमर, और इस अध्ययन में इस्तेमाल qRT-पीसीआर प्रतिक्रिया सेटअप. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर की रोकथाम और उपचार दोनों के लिए ट्यूमर लक्ष्य जीन की जांच अत्यंत महत्वपूर्ण है। गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले विशिष्ट जीन को समझना रोग के अंतर्निहित आणविक तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके अलावा, इन लक्ष्य जीनों की पहचान करने से उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों और लक्षित उपचारों का विकास हो सकता है। इस अध्ययन में, हम FAM83A को लक्ष्य जीन के रूप में पहचानने और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में इसकी यांत्रिक भूमिकाओं की जांच करने के लिए TCGA डेटासेट विश्लेषण के उपयोग का वर्णन करते हैं। हम गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं में FAM83A की काफी उच्च अभिव्यक्ति का निरीक्षण करते हैं, जो गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के रोगियों के खराब पूर्वानुमान से जुड़ा हुआ है। सेल-आधारित प्रयोगों की एक श्रृंखला ने गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं में उच्च FAM83A अभिव्यक्ति का खुलासा किया, जो सेल प्रसार, प्रवास और आक्रमण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। FAM83A अभिव्यक्ति के दमन ने प्रसार और प्रवास को रोक दिया और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को बढ़ावा दिया।

FAM83A-नॉकडाउन गर्भाशय ग्रीवा कैंसर सेल लाइनों का निर्माण इस अध्ययन में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। siRNAs डिजाइन और उनकी प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए लक्ष्य जीन दृश्यों के अनुसार मान्य कर रहे हैं. इसके अलावा, गर्भाशय ग्रीवा कैंसर सेल लाइनों siRNA का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं. प्लाज्मिड अभिकर्मक की सफलता दर बाद के प्रयोगों, जो सेल घनत्व और प्लाज्मिड घनत्व के सख्त नियंत्रण की आवश्यकता के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, अभिकर्मक दक्षता एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि बाद के प्रयोगों का आयोजन किया जा सके। वेस्टर्न ब्लॉटिंग और क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम पुष्टि करते हैं कि एफएएम 83 ए के निषेध ने पीआई 3 के / एकेटी मार्ग को दबा दिया और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित किया। हम परिकल्पना करते हैं कि तंत्र में PI3K/AKT द्वारा साइटोप्लाज्म से माइटोकॉन्ड्रिया में बैक्स के स्थानांतरण का निषेध शामिल है, जो सेल अस्तित्व13 को बढ़ावा देता है।

गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के उपचार में प्रगति ने नए लक्ष्य अणुओं को विकसित करना संभव बना दिया है। एक उपन्यास ओंकोजीन की पहचान गर्भाशय ग्रीवा विकृतियों14,15 के नैदानिक रोग का निदान में सुधार करने के लिए चिकित्सीय लागू किया जा सकता है. इस अध्ययन में, हमने सफलतापूर्वक HeLa और C83a कोशिकाओं में FAM33A नॉकडाउन सिस्टम का निर्माण किया और सेलुलर स्तर पर गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं पर FAM83A नॉकडाउन के प्रभावों को सत्यापित किया। हम प्रस्ताव करते हैं कि गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के इलाज के लिए FAM83A के निषेध का उपयोग किया जा सकता है।

हालाँकि, इस अध्ययन की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, यह अध्ययन केवल डेटाबेस के माध्यम से जीन स्क्रीनिंग करता है और नैदानिक रोगियों के रोग संबंधी डेटा का अभाव है। दूसरा, इस अध्ययन ने केवल इन विट्रो में प्रभाव को मान्य किया है, और परिणामों को सत्यापित करने के लिए विवो अध्ययन में आगे की आवश्यकता थी। फिर भी, इस अध्ययन में विस्तृत लक्षित चिकित्सीय लोकी की पहचान करने के लिए लक्ष्य जीन पहचान, जीन नॉकआउट और सेलुलर सत्यापन के तरीके अन्य बीमारियों के लिए लक्ष्य जीन की खोज और सत्यापन के लिए अनुसंधान विचार प्रदान कर सकते हैं।

संक्षेप में, FAM83A को अतिरंजित किया गया था और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर में एक बदतर रोग का निदान के साथ सहसंबद्ध किया गया था। FAM83A गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं के प्रसार, प्रवास और आक्रमण को नियंत्रित करता है। "FAM83A-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और एपोप्टोसिस का दमन, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं को सिस्प्लैटिन के प्रति संवेदनशील बनाना"। इन परिणामों ने संकेत दिया कि एफएएम 83 ए गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के उपचार के लिए एक उपयुक्त शोध लक्ष्य है। इस अध्ययन ने सहायक कीमोथेरेपी में प्रगति में योगदान दियागर्भाशय ग्रीवा के कैंसर वाले रोगियों के पूर्वानुमान में सुधार करने का लक्ष्य है।

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Disclosures

लेखक इस काम में हितों के टकराव की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को जिंगझोउ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ब्यूरो फाउंडेशन (नंबर 2020HC06) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and Medium Formulation
C33a American Type Culture Collection
Hela American Type Culture Collection
Modified medium 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT 4691, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Bcl2  26593-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:1,000
Caspase 3 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:2,000
cleaved-caspase3 abs132005; Absin Bioscience Inc. ‘1:1,000
Cytc 10993-1-AP; Proteintech Group ‘1:1,000
GAPDH  10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. ‘1:8,000
mTOR 2983, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
PI3K 4292, Cell Signaling Technology Inc ‘1:1,000
p-AKT  4060, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448) #5536, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit 17366, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Secondary antibodies GB23303, Servicebio ‘1:2,000
Materials
6-well plate Corning, NPY
Alexa Fluor 555 Beyotime
BCA Protein assay kit  Beyotime, China  P0011
ChemiDoc XRS Imager System  BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit  Servicebio, Inc.,China cat. no. G2014
Fluorescence microscope  Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix  11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope  Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts  Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit  Beyotime, China
PMSF  ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China #ST506
Real-time quantitative PCR instrument  Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer  Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent Invitrogen 15596026
TRIzol reagent  Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6.0  

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References

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इस महीने JoVE अंक 204 FAM83A गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर एपोप्टोसिस माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन DDP में
गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर सेल के विकास और सिस्प्लैटिन संवेदनशीलता में अपनी भूमिका को सत्यापित करने के लिए <em>FAM83A</em> की दस्तक
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Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang,… More

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang, Y. Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity. J. Vis. Exp. (204), e65667, doi:10.3791/65667 (2024).

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