Summary
Geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen kunnen worden gebruikt voor de analyse van immuunfuncties en -aandoeningen, stofwisselingsziekten of mitochondriale functies. In dit werk beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de bereiding van PBMC's uit volbloed en de daaropvolgende cryopreservatie. Cryopreservatie maakt deze tijd en plaats onafhankelijk.
Abstract
De fysiologische functies van eukaryote cellen zijn afhankelijk van energie die voornamelijk wordt geleverd door mitochondriën. Mitochondriale disfunctie wordt in verband gebracht met stofwisselingsziekten en veroudering. Oxidatieve fosforylering speelt een doorslaggevende rol, omdat het cruciaal is voor het behoud van energetische homeostase. PBMC's zijn geïdentificeerd als een minimaal invasief monster om de mitochondriale functie te meten en er is aangetoond dat ze ziektetoestanden weerspiegelen. De meting van de mitochondriale bio-energetische functie kan echter worden beperkt door verschillende factoren in menselijke monsters. Beperkingen zijn het aantal genomen monsters, de bemonsteringstijd, die vaak over meerdere dagen wordt gespreid, en de locaties. Cryopreservatie van de verzamelde monsters kan zorgen voor een consistente verzameling en meting van monsters. Er moet voor worden gezorgd dat de gemeten parameters vergelijkbaar zijn tussen gecryopreserveerde en vers bereide cellen. Hier beschrijven we methoden voor het isoleren en cryopreservatie van PBMC's uit menselijke bloedmonsters om de bio-energetische functie van de mitochondriën in deze cellen te analyseren. PBMC gecryopreserveerd volgens het hier beschreven protocol vertoont slechts kleine verschillen in celaantal en levensvatbaarheid, adenosinetrifosfaatspiegels en gemeten ademhalingsketenactiviteit in vergelijking met vers geoogste cellen. Voor de beschreven preparaten is slechts 8-24 ml menselijk bloed nodig, waardoor het mogelijk is om tijdens klinische onderzoeken multicentraal monsters te verzamelen en hun bio-energetica ter plaatse te bepalen.
Introduction
Menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden gebruikt voor verschillende toepassingen op vele wetenschappelijke gebieden, waaronder de studie van immunologische en bio-energetische problemen, zoals die met betrekking tot verouderingsprocessen of degeneratieve ziekten 1,2. PBMC's zijn heterogeen van samenstelling en bestaan uit lymfocyten (B-cellen, T-cellen en NK-cellen), monocyten en dendritische cellen. De cellen vertonen soms grote individuele verschillen en variaties binnen een proefpersoon, dus gestandaardiseerde procedures voor het hanteren van deze cellen zijn vereist. Belangrijke parameters zoals levensvatbaarheid en zuiverheid van de isolatie zijn de basisvereisten voor de behandeling ervan en worden bovendien beïnvloed door omgevingsfactoren zoals het tijdstip van verzameling, het melatoninegehalte, of de proefpersoon nuchter is en andere 3,4.
Op basis van studies naar bio-energetica van PBMC's beschrijven we hier een methode voor het isoleren, cryopreservatie en kweken van PBMC's die ook geschikt is voor andere methoden. Hoewel spierbiopsie wordt beschouwd als de gouden standaard voor mitochondriaal energiemetabolisme5, is het onderzoek van bloedcellen een snelle, minimaal invasieve procedure. Daarnaast suggereren steeds meer studies dat de veranderingen in de mitochondriale functie bij veroudering en de ziekte van Alzheimer (AD) niet alleen in de hersenen voorkomen, maar ook in de periferie 6,7,8,9,10. De methode maakt ook onderzoek mogelijk naar andere aandoeningen en ziekten, waaronder diabetes mellitus en obesitas 11,12,13. Genexpressiepatronen bij patiënten met multiple sclerose kunnen worden geanalyseerd, of de immuunfunctie en de invloed daarop in het algemeen 14,15,16.
PBMC's vertrouwen over het algemeen op oxidatieve fosforylering (OXPHOS) om adenosinetrifosfaat (ATP) te genereren17,18. Daarom bestrijken PBMC's een breed scala aan toepassingen als surrogaten. In eerdere rapporten is het energiemetabolisme van PBMC's gebruikt om orgaandisfuncties aan te pakken, zoals bij vroeg hartfalen19, septische shock20 of geslachtsgerelateerde verschillen4 in de mitochondriale functie. Een veralgemeende methode voor cryopreservatie, isolatie en kweek van PBMC's zou voordelen hebben bij de vergelijkbaarheid van resultaten die in verschillende instituten zijn verkregen. Er is veel variatie in de protocollen voor elke stap21,22, het doel van deze methode is om een richtlijn te bieden voor bio-energetische metingen in PBMC's.
In dit artikel beschrijven we een methode voor het meten van bio-energetische parameters in PBMC's. We leggen de methoden uit voor het isoleren, cryopreservatie en meten van bio-energetica van PBMC's uit menselijk bloed. Deze methode kan worden gebruikt om bio-energetische parameters bij patiënten te bepalen en deze in een klinische context te evalueren. Om deze metingen toe te passen, hebben onderzoekers toegang nodig tot een patiëntenpopulatie waaruit verse bloedmonsters kunnen worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen die in dit manuscript worden beschreven voor bloedafname, isolatie en analyse zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Giessen, Duitsland. De toestemming van de patiënten om hun monsters in het onderzoek op te nemen, werd verkregen. Alle stappen voor isolatie en celkweek worden uitgevoerd onder een biologische veiligheidskast.
1. Venapunctie
- Bereid alle apparatuur voor die nodig is voor bloedafname, inclusief desinfectiespray, steriel wattenstaafje, bloedafnamecanule met 80 mm buis en multi-adapter, tourniquet/bloeddrukmanchet, Monovette 9 ml lithium-heparine.
OPMERKING: EDTA als antistollingsmiddel is ook effectief. - Verzamel bloed uit de meest geschikte armader, meestal vena mediana cubiti of vena cephalica.
- Breng een tourniquet/bloeddrukmanchet aan met lichte druk, ongeveer 80 mm/Hg.
- Desinfecteer handschoenen en prik op de prikplaats met desinfecterende spray die alcohol bevat. Laat de gedesinfecteerde prikplaats aan de lucht drogen.
- De aderen steken uit door de druk van de drukmanchet. Steek de naald (canulediameter (buitenkant) 21G / 0.8 mm, lengte 19 mm) in een hoek van 15°-20° van de ader in een poging trauma te voorkomen en sonderen tot een minimum te beperken.
- Neem bloed af met het juiste systeem, 4 buisjes met 9 ml bloed (meer dan 7-8 buisjes zijn problematisch voor één onderzoeker om goed te isoleren).
- Plaats de afnamebuisjes na bloedafname 5 minuten in het donker om een gelijkmatige antistolling te garanderen.
2. PBMC-isolatie
- Bereid alle benodigde oplossingen voor zoals hieronder beschreven.
- Breng Dulbecco's uitgebalanceerde zoutoplossing (DPBS; concentratie 1x) en lymfocytenisolatiemedium (1,077 g/ml) op kamertemperatuur (20-25 °C).
- Bereid foetaal runderserum (FBS) op kamertemperatuur en bewaar een steriele conische buis van 50 ml met FBS op ijs. Voor elk bloedmonster is 2 ml FBS nodig.
- Bewaar de vriescontainer bij 4 °C en koel cryobuizen voor bij 4 °C.
- Warm celkweekmedium tot 37 °C, het medium bestaat uit RPMI 1640 met 50 ml FBS en penicilline 50 E/ml streptomycine 50 E/ml. Deze oplossing kan maximaal 2 maanden bij 3 °C worden bewaard.
- Voeg 8 ml DPBS toe in steriele conische buisjes van 50 ml. Voeg 15 ml lymfocytenisolatiemedium toe in een steriele conische buis van 50 ml (medium is lichtgevoelig, voeg het toe voordat u met isolatie begint).
- Voeg 8 ml bloed toe aan 8 ml DPBS en meng voorzichtig verder met een plastic pasteurpipet van 3 ml.
- Breng het bloed/DPBS-mengsel voorzichtig aan met een plastic pasteurpipet van 3 ml op het lymfocytenisolatiemedium. Om de eerste laag op het medium aan te brengen, kantelt u de buis 20°-30°, wat resulteert in minder penetratie van het bloed-PBS-mengsel in de mediumlaag.
- Leg het bloed-PBS-mengsel voorzichtig over de zijwand van de buis op het lymfocytenisolatiemedium. Gebruik een constante snelheid om de bloedstroom constant te houden.
- In de volgende stap brengt u het buisje langzaam rechtop, het resterende bloed wordt voorzichtig over de zijwand van het buisje op de bloedlaag gelaagd.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1000 x g bij kamertemperatuur in een centrifuge met een rotor met zwenkbare emmer en uitgeschakelde remmen. Na centrifugeren wordt het bloed/PBMC-mengsel in vier lagen gescheiden. De bovenste laag bestaat uit plasma en bloedplaatjes, de tweede laag is de PBMC-laag, gevolgd door een laag lymfocytenisolatiemedium en ten slotte erytrocyten en granulocyten in de onderste laag. De verschillende lagen zijn weergegeven in figuur 1.
- Verwijder 2/3e van de plasmalaag met een plastic pasteurpipet.
- Verzamel met een pipet van 1 ml de PBMC's op de laag van het lymfocytisolatiemedium en zorg ervoor dat er geen medium in het monster komt.
- Plaats de punt 1 mm boven de PBMC-laag. De PBMC-laag mag niet worden doorboord, anders stroomt het medium over de cellen. De zuigkracht van de pipet trekt de PBMC's naar dit punt, zodat ze op dit punt meerdere keren kunnen worden verzameld.
OPMERKING: Om het aantal verzamelde PBMC's te maximaliseren, zoekt u aan het einde van de procedure naar de rest op het oppervlak en probeert u ook daar de cellen te verzamelen. Om de procedure te stabiliseren, kan de buis op een oppervlak worden geplaatst. - Breng de PBMC's stap voor stap over in een nieuwe buis van 50 ml totdat de laag volledig is geoogst. Voeg DPBS toe tot de markering van 25 ml, spoel het isolatiemedium van lymfocyten en andere resten weg.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur met ingeschakelde remmen. Verwijder het supernatans met een vacuümpomp of iets dergelijks, zorg ervoor dat u de celpellet niet beschadigt.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml DPBS en tel DPBS op tot de 25 ml-markering. Herhaal het wassen nogmaals en breng het vervolgens opnieuw in medium dat geschikt is voor de volgende stappen.
Figuur 1: Schematische weergave van een dichtheidsgradiëntcentrifugatie om de verschillende lagen te illustreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Cryopreservatie
- Koel een vriescontainer af tot 4 °C, koel FBS af op ijs.
- Resuspendeer PBMC pellet in 1 ml FBS met een pipet van 1 ml, de FBS moet op kamertemperatuur zijn.
- Meng DMSO met voorgekoelde FBS op ijs 1:5, eindconcentratie 20% DMSO en zet het FBS: DMSO-mengsel terug op ijs. Bereid de oplossing altijd vers.
- Breng de PBMC-celsuspensie in FBS over naar goed gelabelde cryobuisjes van 2 ml. Gebruik één cryobuis per opvangbuis. Stel het aantal cellen in tussen 1 x 107 en 5 x 107 per ml. Gebruik een geautomatiseerde celteller om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te bepalen.
- Voeg druppelsgewijs 1 ml FBS: DMSO-mengsel toe met een pipet van 1 ml, ongeveer 1-2 druppels per s, in de buis. De druppelsgewijze toevoeging leidt tot een continue en consistente menging.
- Plaats de buizen in de voorgekoelde vriescontainer. Plaats de vriescontainer 24 uur in een vriezer van -80 °C. De vriescontainer zorgt voor een gecontroleerde koeling van -1 °C per minuut.
- Haal de buizen uit de vriezer van -80 °C. Bewaar de buizen na verwijdering uit de vriezer in de gasfase van vloeibare stikstof. Documenteer de plaats van elk monster.
4. Ontdooien
- Bereid alle benodigde oplossingen voor: Celkweekmedium RPMI 1640 met 50 ml FBS en penicilline 50 E/ml, streptomycine 50 E/ml. Deze oplossing kan maximaal 2 maanden bij 3°C worden bewaard.
- Verwarm het celkweekmedium voor tot 37 °C. Voeg 3 ml voorwarm celkweekmedium toe aan steriele conische buisjes van 50 ml.
- Verwijder het monster uit de tank met vloeibare stikstof. Ontdooi de monsters in een waterbad bij 37 °C gedurende ca. 3,5 min, haal ze uit het waterbad zodra het laatste ijs is gesmolten. Een stuk ijs ter grootte van een speldenknop zou nog steeds zichtbaar moeten zijn in de buis.
OPMERKING: DMSO is schadelijk voor PBMC's werk zo snel mogelijk. - Verwijder het cel:FBS:DMSO-mengsel met een pipet van 1 ml uit de cryobuis. Meng de PBMC-monsters met het celkweekmedium in de voorbereide buisjes van 50 ml. Spoel de buisjes uit met 5 ml kweekmedium in drie stappen van 2 ml, 2 ml en 1 ml.
- Breng het medium over in de buizen. Dit wordt uitgevoerd om mogelijke celresten over te dragen. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatans weg en voeg 1 ml medium toe dat geschikt is voor gepland gebruik. De cellen zijn klaar voor volgende experimenten.
OPMERKING: Bij functionele tests op verse of ingevroren cellen wordt echter vaak een rustperiode in een incubator (meestal 's nachts) aanbevolen na isolatie op basis van lymfocytenisolatiemedium of het ontdooien van cellen.
5. Celkweek
- Na isolatie of ontdooien van kweekcellen 's nachts bij 37 °C in 5% CO2/95% lucht.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml RPMI-medium aangevuld met 10% FBS, peniciline 50 E/ml, streptomycine 50 E/ml. Voor verder gebruik zijn er veel mogelijkheden, behandel cellen zoals nodig voor de assays.
- Gebruik voor algemene opslag steriele celkweekplaten met 6 putjes en oogstcellen na de rustperiode. Breng 1 ml celsuspensie met een pipet van 1 ml over in een putje en voeg 4 ml celkweekmedium toe.
OPMERKING: De hoeveelheid geïsoleerde PBMC's varieert sterk van persoon tot persoon, één putje met 5 ml celkweekmedium is voldoende voor elke 8 ml geïsoleerd bloed. Bij het isoleren van PBMC's uit buffy coats is de hoeveelheid PBMC's echter aanzienlijk hoger dan in volbloedmonsters en moeten de cellen daarom in verschillende putjes worden verdeeld. - Laat de cellen 24 uur rusten in een bevochtigde atmosfeer aangevuld met 5% CO2 bij 37 °C. Deze incubatie wordt uitgevoerd voor vers geïsoleerde cellen, maar ook voor gecryopreserveerde cellen.
6. ATP-test
- Resuspendeer ontdooide PBMC's in 1 ml RPMI-medium aangevuld met 10% FBS, penicilline 50 E/ml, streptomycine 50 E/ml.
- Neem een monster en bepaal het celgetal, en voer vervolgens een levend-dode discriminatie uit met trypanblauw. Neem 10 μL uit de geresuspendeerde cellen en meng met 90 μL celkweekmedium. Neem vervolgens 10 μL en meng met 10 μL trypan blue. Plaats de cellen in een cellentelkamer of een automatische cellenteller en bepaal het aantal levende/dode cellen.
- Plaat 100 μL cellen met een dichtheid van 1 x 105 cellen/100 μL per putje in een witte polystyreenplaat met 96 putjes.
- Laat de cellen 24 uur rusten in een bevochtigde atmosfeer aangevuld met 5% CO2 bij 37 °C.
- Bepaal de ATP-concentraties met een ATP-assay.
- Gebruik lichtemissie die optreedt wanneer ATP wordt gecombineerd met luciferine. Het uitgestraalde licht kan worden geëvalueerd met een plaatlezer. Verwijder de platen voor de broedstoof om gedurende 15 minuten af te koelen tot kamertemperatuur. Lyse de cellen en laat ze 5 minuten staan. Breng vervolgens bewakingsreagens aan op de cellen en meet volgens de instructies van de fabrikant. Een interne standaard wordt gebruikt om het ATP-niveau te bepalen.
7. Respirometrie met hoge resolutie
- Zet de oxygraaf met hoge resolutie AAN en laat deze 30 minuten opwarmen.
- Behandel cellen volgens een protocol beschreven in figuur 1. Bereid alle benodigde voorraden voor zoals in tabel 1.
- Pipetteer 2,1 ml ademhalingsbuffer (tabel 1) in beide oxygraafkamers met hoge resolutie en roer de buffer continu met behulp van een magnetische roerstaaf die in de kamers aanwezig is (750 rpm) bij 37 °C gedurende 30 minuten totdat een stabiel zuurstoffluxsignaal van de polarografische zuurstofsensor is verkregen.
OPMERKING: In de kamers van de oxygraaf worden het zuurstofverbruik in real time (flux) en de zuurstofverzadiging van de kamer gemeten met behulp van polarografische zuurstofelektroden. Achtergrondkalibratie moet worden uitgevoerd om achtergrondgeluid te voorkomen en betrouwbare resultaten te garanderen. - Voer een luchtkalibratie van de polarografische zuurstofsensor uit volgens de protocollen van de fabrikant23.
- Resuspendeer geïsoleerde PBMC's in 1 ml mitochondriaal ademhalingsmedium (MIR05, de samenstelling wordt weergegeven in tabel 1) en verdun tot 8 x 10,6 cellen/ml.
- Zuig na de luchtkalibratie het ademhalingsmedium op uit de oxygraafkamer en voeg 2,1 ml celsuspensie toe in elke camber van de ademhalingsmeter. Indien nodig tijdens de meting de kamers van zuurstof voorzien (zie Open bij punt h in figuur 2), mag de zuurstofverzadiging van de kamers niet onder de 100 μM komen.
- Sluit de kamers door de stoppers erin te steken, de kamers zijn ontworpen om een volume van 2,0 ml te bevatten. Zuig de opkomende celsuspensie op.
- Meng de celsuspensie continu bij 37 °C met een magneetroerder (750 rpm) die zich in de kamer bevindt. Wacht ongeveer 20 minuten tot een stabiel signaal wordt verkregen. Bepaal de endogene ademhaling ((a) in figuur 2).
- Om de verschillende complexe activiteiten van de ademhalingsketen te bepalen, injecteert u de substraten en remmers voor mitochondriale ademhaling via de titaniuminjectiepoorten van de stoppers. Gebruik de volgende eindconcentratie in de kamer.
- Om de celmembranen te verstoren, voegt u 5 μL 8,1 mM digitonine toe, via de titaniuminjectiepoort van de kamerstopper, om naïeve substraten (b) in figuur 2 te verwijderen terwijl de mitochondriale membranen intact blijven.
- Voeg substraten 2 M glutamaat en 800 mM malaat toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om extra substraten zoals pyruvaat te gebruiken. - Voeg 8 μL 500 mM adenosinedifosfaat (ADP) toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (d) in figuur 2.
- Voeg 20 μL 1 M-succinaat toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (e) in figuur 2.
- Titreer 1 M carbonylcyanide p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP) stapsgewijs bij 0,5 μl tot het punt waarop geen verdere toename optreedt. Wacht 2-4 minuten totdat het signaal stabiliseert (f) in afbeelding 2. Als er geen verdere toename van de ademhaling is, ga dan verder met de volgende stap.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van FCCP, aangezien dit gezondheidsrisico's voor mensen met zich meebrengt. - Voeg 5 μL 0,1 mM rotenon toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (g) in figuur 2.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van rotenon, aangezien dit gezondheidsrisico's voor mensen met zich meebrengt. - Voeg 1 μL van 4 mg/ml oligomycine toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (h) in figuur 2.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van oligomycine, aangezien het een gif is dat gezondheidsrisico's voor de mens met zich meebrengt. - Voeg 1 μL 5 mM antimycine A toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (i) in figuur 2.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van antimycine A, aangezien het een gif is dat gezondheidsrisico's voor mensen met zich meebrengt. - Bij het evalueren van de run om het zuurstofverbruik van enzymen die niet betrokken zijn bij oxidatieve fosforylering uit te sluiten, trekt u de antimycine A-waarden af van alle andere gemeten waarden.
- Voeg 200 mM N,N,N',N'-tetramethyl-p-fenyleendiaminedihydrochloride (TMPD; elektronendonor) en 800 mM ascorbaat toe om TMPD in een gereduceerde toestand te houden. Injecteer de substraten via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert na 2-4 minuten (j) in figuur 2.
- TMPD is onderhevig aan autooxidatie, dus trek het resulterende zuurstofverbruik af van de gemeten waarde bij Complex IV.
- Voeg NaN3 ≥ 100 mM toe via de injectiepoort van de kamerstopper en registreer de ademhaling totdat een stabiel signaal is bereikt. Het signaal stabiliseert zich na 2-4 minuten om complexe IV-activiteit te remmen, alleen TMPD-autooxidatie blijft over.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van natriumazide, aangezien het een gif is dat gezondheidsrisico's voor de mens met zich meebrengt.
Figuur 2: Schematisch verloop van de O2 flux. Het schematische verloop van de zuurstofflux wordt weergegeven. De curve is verdeeld in de verschillende fasen na toevoeging van remmers en substraten van a-k. A: Endogene ademhaling; b: gepermeabiliseerde cellen; c: ontkoppelde complex I-ademhaling; d: gekoppelde complex I-ademhaling; e: OXPHOS ; f: maximale ontkoppelde activiteit van CI en CII; g: ontkoppelde ademhaling van complex II; H: lek ademhaling; I: resterende ademhaling; j: CIV(U) ontkoppelde ademhaling en auto-oxidatie van TMPD; k: auto-oxidatie van TMPD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. Citraatsynthase-activiteit
- Meet de citraatsynthase-activiteit als een afzonderlijke parameter en gebruik deze om de metingen van de oxygraaf met hoge resolutie te normaliseren.
- Resuspendeer geïsoleerd PBMC in 1 ml mitochondriaal ademhalingsmedium (MIR05) en verdun tot 8 x 106 cellen/ml.
- Vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij −80 °C totdat experimenten zijn uitgevoerd of om verse cellen te meten.
- Bereid alle benodigde oplossingen voor: 0,1 M triethanolamine HCl-buffer pH 8,0, 1,0 M Tris-HCl-buffer pH=8,1, 10% Triton X-100, 10 mM Oxalacetaat in 0,1 M triethanolamine HCl-buffer pH 8,0, 1,01 mM DTNB in 1,0 M Tris-HCl-buffer pH=8,1, Acetyl-CoA 12,2 mM in dubbel gedistilleerd H2O.
- Bereid een reactiemedium (tabel 1) dat 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobezoëzuur) (DTNB; 0,1 mM), acetylco-enzym A (0,31 mM), EDTA (50 μM), triethanolamine HCl (5 mM) en Tris HCl (0,1 M) bevat.
- Bereid het startreagens (tabel 1) met 0,5 mM oxaalacetaat opgelost in dubbel gedestilleerd H2O.
- Ontdooi de monsters op ijs, want citraatsynthase is onstabiel als het te snel wordt ontdooid.
- Voeg 40 μl van de monsters toe aan een plaat met 96 putjes op ijs en voeg vervolgens 110 μl reactiemedium toe met een multipipet.
- Verwarm het reactiemedium en bemonster in een incubator tot 30 °C gedurende 5 min. Verwarm het startreagens in een waterbad tot 30 °C gedurende 5 min.
- Voeg 50 μl van het startreagens met een multipipet toe aan elk putje. Meet de absorptie bij 30 °C bij een golflengte van 412 nm gedurende 20 minuten via een plaatlezer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levensvatbaarheid en aantal cellen
Om succesvolle isolatie en cryopreservatie te bereiken, moeten het aantal cellen en de levensvatbaarheid zo hoog mogelijk zijn. Voor en na cryopreservatie worden de cellen geteld en wordt hun levensvatbaarheid bepaald om de gezondheid en kwaliteit van de cellen te waarborgen. Figuur 3 is een representatieve illustratie van PBMC's voor en na cryopreservatie, celgetal en levensvatbaarheid verschillen nauwelijks. Dit duidt op succesvolle isolatie en conservering van PBMC's.
Figuur 3: Effect van cryopreservatie op het aantal cellen en de levensvatbaarheid. De testgroepen worden verdeeld in de controlegroep met vers geïsoleerde PBMC's en PBMC's na 1 maand cryopreservatie. Het tellen van de cellen en het bepalen van hun levensvatbaarheid werd uitgevoerd met een geautomatiseerde cellenteller. Trypanblauw werd gebruikt om de levensvatbaarheid te bepalen. Elke meting werd uitgevoerd als een drievoud van de gemiddelde waarde werd berekend op basis van de resultaten van de individuele metingen. (A) Bepaling van de cellevensvatbaarheid van PBMC's na nieuwe isolatie en na cryopreservatie van 1 maand. Waarden worden gegeven als gemiddelde ± SEM. Significanties werden bepaald met een gepaarde t-toets. (B) Bepaling van het aantal cellen van PBMC's na nieuwe isolatie en na cryopreservatie van 1 maand. Waarden worden gegeven als gemiddelden ± SEM. Significanties werden bepaald met een gepaarde t-toets. Dezelfde vorm en kleur tonen hetzelfde monster voor en na een maand cryopreservatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ATP is de belangrijkste energiebron voor eukaryote cellen. ATP wordt bepaald via een luminescentietestsysteem. Als cryopreservatie succesvol is, zou ATP tussen vers geïsoleerde cellen en gecryopreserveerde cellen niet moeten verschillen. Figuur 4 is een representatieve illustratie van PBMC's voor en na cryopreservatie; ATP-niveaus zijn vergelijkbaar. Dit duidt op succesvolle isolatie en conservering van PBMC's.
Figuur 4: Vergelijking van ATP-concentratie van verschillende cryopreservatieperioden. ATP-concentratie (μM / 100.000 cellen) in PBMC's. De testgroepen worden verdeeld in de controlegroep met vers geïsoleerde PBMC's en PBMC's na 1 maand cryopreservatie. Monsters werden tegelijkertijd verzameld en vervolgens cryo-opgeslagen of na isolatie gemeten. Er werd een gepaarde t-toets uitgevoerd om significante verschillen te testen; Het resultaat toonde aan dat de verschillen niet significant waren. De waarden worden gegeven als gemiddelde waarden ± SEM (N = 13). Dezelfde vorm en kleur tonen hetzelfde monster voor en na een maand cryopreservatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Citraatsynthase (CS) is een belangrijk enzym van de citraatcyclus, gelegen in mitochondriën. Daarom vertegenwoordigt CS-activiteit een robuuste marker voor mitochondriale massa. De CS-activiteit wordt bepaald op basis van de omrekening van DTNB naar TNB. Figuur 5 laat zien dat voor en na cryopreservatie de CS-waarden niet verschillen in PBMC's. Nogmaals, dit duidt op een succesvolle isolatie en conservering van PBMC's.
Figuur 5: Effect van cryopreservatie op citraatsynthase-activiteit. Citraatsynthase-activiteit in PBMC's na cryopreservatie van 1 maand in vergelijking met de vers gemeten controle. Monsters werden tegelijkertijd verzameld en vervolgens cryo-opgeslagen of na isolatie gemeten. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (N = 8). Significanties werden bepaald met een gepaarde t-toets. Dezelfde vorm en kleur tonen hetzelfde monster voor en na een maand cryopreservatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De bio-energetische profielen van PBMC's kunnen worden bepaald met behulp van polarografische zuurstofsensoren, bijvoorbeeld in oxygraaf met hoge resolutie. Het cellulaire zuurstofverbruik wordt gemeten in een gesloten kamersysteem met een zeer hoge resolutie en gevoeligheid in biologische monsters, bijvoorbeeld intacte en doormeabiliseerde cellen, weefsels of geïsoleerde mitochondriën. Het oxygraafapparaat met hoge resolutie is uitgerust met twee kamers en maakt gebruik van polarografische zuurstofsensoren om de zuurstofconcentratie te meten en het zuurstofverbruik in elke kamer te berekenen. Het zuurstofverbruik wordt berekend met behulp van software en uitgedrukt in picomol per s per aantal cellen24. In elke oxygraafkamer meten polarografische zuurstofelektroden de zuurstofconcentratie en berekenen ze het zuurstofverbruik (flux) in elke kamer. Het zuurstofverbruik en de zuurstofconcentratie in de kamer worden in realtime weergegeven (afbeelding 6). Met de toevoeging van specifieke remmers en substraten worden de afzonderlijke complexen van de ademhalingsketen aangevallen om hun activiteit te meten. Na de test worden de gegevens geanalyseerd met de software. De fluxwaarden werden genormaliseerd naar citraatsynthase-activiteit. De oxygrafie leverde lagere waarden op voor complex IV als gevolg van gedeeltelijk geoxideerde TMPD. In een reeks tests ontdekten we dat de gebruikte TMPD met een factor 1,8 afweek. Deze factor werd gebruikt om de waarden in figuur 6 te normaliseren.
Figuur 6: Mitochondriale ademhaling in PBMCS na cryopreservatie in vergelijking met vers gemeten controle. Een oplossing met 1,6 x 107 cellen/ml werd gebruikt om het zuurstofverbruik van cellen in een oxygraaf te meten. De ademhaling werd 1 maand na cryopreservatie gemeten. Om de activiteit van de complexen in de ademhalingsketen te onderzoeken, werden verschillende remmers, substraten en ontkoppelaars toegevoegd. Het toevoegen van een stof gebeurde als volgt: CI(L) = lekademhaling van complex I; CI(P) = gekoppelde ademhaling van complex I; CI&CII(P) = fysiologische ademhaling; CI&CII(U) = ontkoppelde ademhaling die maximale activiteit van complexen I en II vertoont; CII(U) = ontkoppelde ademhaling van complex II; CII(L) = lekademhaling van complex II; CIV(U) = ontkoppelde ademhaling. Een factor 1,8 werd gebruikt om de waarden te normaliseren. Deze factor is experimenteel bepaald voor de huidige opzet. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (N = 10). Statistische significantie werd getest via de Student's t-toets (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Endogene ademhaling wordt bepaald door 2 ml celsuspensie aan de kamers toe te voegen. De flux met endogene substraten wordt gemeten. Om verder onderscheid te maken tussen complexen wordt digitonine toegevoegd. Digitonine permeabiliseert het plasmamembraan terwijl de mitochondriale membranen intact blijven. Om het protonlek door het membraan te compenseren, worden substraten glutamaat en malaat toegevoegd. De ademhalingsfrequenties op dit punt illustreren complexe I-gestuurde ademhaling in afwezigheid van gekoppelde ademhaling. Om de oxidatieve fosforyleringscapaciteit (OXPHOS) van complex I ADP te detecteren, wordt toegevoegd, de ademhaling bevindt zich nu in een gekoppelde toestand. De gekoppelde ademhaling van CI en CII wordt bereikt door toevoeging van succinaat. Nu werkt de ademhalingsketen op maximale capaciteit. Bij de titratie van carbonylcyanide p-trifluormethoxyfenylhydrazon (FCCP) wordt de elektronentransportketen (ETC) ontkoppeld. Met deze ontkoppeling wordt de maximale ontkoppelde activiteit van CI en CII bepaald. Om onderscheid te maken tussen CI en CII wordt de complexe I-specifieke remmer rotenon toegevoegd. Door toevoeging van oligomycine wordt de lekademhaling van CII bepaald. Om het zuurstofverbruik uit te sluiten door bronnen die niet betrokken zijn bij oxidatieve fosforylering, wordt het antibioticum antimycine A toegevoegd en wordt dit resterende zuurstofverbruik afgetrokken van alle metingen die in het experiment zijn verkregen. De elektronendonor N,N,N',N'-tetramethyl-p-fenyleendiaminedihydrochloride (TMPD; 0,5 mM) is een kunstmatig substraat voor CIV. Om TMPD in een gereduceerde toestand te houden, wordt ascorbaat gebruikt. Ascorbaat en TMPD worden gebruikt om de maximale ontkoppelde ademhaling van CIV te meten. Aangezien TMPD onderhevig is aan auto-oxidatie, wordt NaN3 toegevoegd na stabilisatie van de flux om CIV te remmen. Het resterende zuurstofverbruik wordt afgetrokken van de ruwe CIV-waarden. Figuur 2 toont een typische meetcurve.
De getoonde parameters tonen het succes van de techniek. De techniek is ontwikkeld om bio-energetische metingen uit te voeren na cryopreservatie. De getoonde resultaten vergelijken de cellen voor en na de meting, aangezien er geen statistisch significante verschillen te zien zijn, kan worden aangenomen dat deze conserveringsmethode geschikt is voor opslag gedurende 1 maand.
Tabel 1: Oplossingen, buffers en verbruiksartikelen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een middel om perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit menselijk bloed te isoleren en te cryopreservatie op een manier die geschikt is voor bio-energetische analyses. De beschreven methode biedt de mogelijkheid om PBMC's voorzichtig en in grote hoeveelheden te isoleren, met een hoge levensvatbaarheid en voldoende cellen voor bio-energetische metingen. Het heeft het nadeel dat zelfs met minimale onderbrekingen lange isolaties optreden, maar dat de daaropvolgende cryopreservatie een tijdonafhankelijke meting van bio-energetica mogelijk maakt. Met deze methode kunnen monsters worden verzameld en op latere tijdstippen worden gemeten. Het is ook geschikt om monsters te verzamelen in multicenter proeven en tegelijkertijd parameters te meten op een centrale locatie.
Cryopreservatie biedt de mogelijkheid om cellen voor een lange periode op te slaan en daarna te meten. Het isoleren van PBMC's is een tijdrovend proces van ongeveer 2-3 uur en maakt het slechts mogelijk om een klein aantal monsters tegelijk te nemen. Het is niet mogelijk voor een enkele onderzoeker om verse PBMC's van meer dan 2 individuen tegelijk te isoleren zonder kwaliteitsverlies. De noodzaak om vervolgexperimenten met verse cellen uit te voeren, bemoeilijkt de procedure en gaat dus gepaard met extra stress en tijdnood. Het scheiden van isolatie van de uitvoering van de experimenten kan studies vereenvoudigen en tests meer gestandaardiseerd maken. In het bijzonder bloedafname, isolatie, cryopreservatie van een monstercollectief, gevolgd door het uitvoeren van specifieke experimenten. Monsters kunnen op verschillende locaties en op verschillende tijdstippen worden verzameld en vervolgens tegelijkertijd op dezelfde locatie worden gemeten.
Bio-energetica speelt een essentiële rol in het celmetabolisme, verstoorde bio-energetica die leidt tot mitochondriale disfunctie speelt waarschijnlijk een belangrijke rol bij veroudering en vervolgens bij neurodegeneratie en andere ziekten25,26. De hierboven beschreven methoden kunnen worden gebruikt in vers geïsoleerde en gecryopreserveerde PBMC's om veranderingen te monitoren. Deze bio-energetische metingen kunnen worden gebruikt als basis voor klinische studies en onderzoek.
Er zijn verschillende beperkende factoren aan deze techniek en de voor- en nadelen van nieuwe meting versus meting na cryopreservatie moeten worden afgewogen. Cryopreservatie is over het algemeen zeer veeleisend voor PBMC's; Daarom is het belangrijk om het aantal stressoren zo laag mogelijk te houden. Tijd is van essentieel belang, aangezien de cellen zo min mogelijk tijd moeten doorbrengen in DMSO, dat giftig is voor PBMC's, elke stap moet worden voorbereid voordat cellen met DMSO worden ontdooid of ingevroren. Ook voor bio-energetische metingen bleek opslag in een vriezer van -80 °C niet effectief te zijn - de monsters moeten na 24 uur worden overgebracht naar vloeibare stikstof. Een gecontroleerde bevriezingssnelheid is verplicht als het koelen te snel gaat, het water dat in de cellen achterblijft, bevriest en vormt kristallen die celmembranen en compartimenten beschadigen. Een te lage afkoelsnelheid leidt tot langdurig contact met de giftige DMSO. Celvriezers die isopropanol gebruiken, kunnen een vriessnelheid van 1 °C/min bereiken in een vriezer van -80 °C. Het ontdooien en opnieuw invriezen van PBMC's moet worden vermeden.
Dit protocol beschrijft de isolatie en cryopreservatie van PBMC's. Om de functionaliteit van de PBMC's na conservering voor bio-energetische metingen te bevestigen, werden voorbeeldmetingen van bio-energetica uitgevoerd. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het meten van bio-energetische factoren. Bio-energetische factoren kunnen worden bepaald na cryopreservatie, maar ook voor andere protocollen kan worden bepaald of metingen mogelijk zijn na cryopreservatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We willen het klinische team van het Universitair Ziekenhuis Giessen-Marburg bedanken voor de bloedafname. Dit werk werd gefinancierd door de Justus Liebig universiteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
