Summary
यहां, हम एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइक्रोआरएनए पैकेजिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने और बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) में निर्यात करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइक्रोआरएनए की प्रचुरता के इन विट्रो मूल्यांकन में सक्षम बनाता है।
Abstract
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) सेलुलर संचार के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं जो विभिन्न कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं। ये ईवीएस प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड (डीएनए, एमआरएनए, माइक्रोआरएनए और अन्य नॉनकोडिंग आरएनए) सहित बायोएक्टिव अणुओं को एक सेल से दूसरे सेल में शटल करते हैं, जिससे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में फेनोटाइपिक परिणाम होते हैं। सभी विभिन्न ईवी कार्गो में से, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) ने माइक्रोएन्वायरमेंट को आकार देने और ईवीएस में उनके स्पष्ट डिसरेग्यूलेशन और बहुतायत के कारण प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को शिक्षित करने में उनकी भूमिका के लिए बहुत अधिक ध्यान आकर्षित किया है। अतिरिक्त डेटा इंगित करता है कि कई miRNAs सक्रिय रूप से EVs में भरी हुई हैं. इस स्पष्ट सबूत के बावजूद, निर्यात और miRNA छँटाई के तंत्र की गतिशीलता पर अनुसंधान सीमित है. यहाँ, हम EV-miRNA लोड हो रहा है की गतिशीलता को समझने और miRNA निर्यात में शामिल मशीनरी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि EV-miRNA के प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, miRNAs पूर्व निर्धारित ईवीएस में समृद्ध और दाता कोशिकाओं से समाप्त एक फ्लोरोफोर के लिए संयुग्मित और दाता कोशिकाओं में transfected हैं. फ्लोरोसेंटली टैग miRNAs तो QRT-पीसीआर का उपयोग कर कोशिकाओं से EVs और कमी में लोड हो रहा है के लिए सत्यापित कर रहे हैं. दोनों एक अभिकर्मक नियंत्रण और कोशिकाओं के ट्रांसफ़ेक्ट आबादी gating के लिए एक उपकरण के रूप में, एक फ्लोरोसेंटली लेबल सेलुलर शाही सेना (सेल बनाए रखा और EV समाप्त) शामिल है. EV-miRNA और सेल बनाए रखा miRNA दोनों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 72 घंटे के पाठ्यक्रम पर फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. EV-miRNAs के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता सेल बनाए रखा miRNA की तुलना में तेजी से कम हो जाती है. इस सीधा प्रोटोकॉल का प्रयोग, एक अब miRNA लोड हो रहा है की गतिशीलता का आकलन और ईवीएस में miRNAs लोड हो रहा है के लिए जिम्मेदार विभिन्न कारकों की पहचान सकता है.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) छोटे नॉनकोडिंग RNAs के सर्वोत्तम-विशेषता वाले सबसेट में से एक हैं, जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाने जाते हैं। अभिव्यक्ति और सबसे miRNAs के biogenesis नाभिक में प्राथमिक miRNAs (pri-miRNAs) के प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है कि घटनाओं की एक समन्वित श्रृंखला का पालन करें. अग्रदूत-miRNAs (पूर्व miRNAs) में माइक्रोप्रोसेसर परिसर द्वारा परमाणु प्रसंस्करण के बाद, पूर्व miRNAs वे RNase III endonuclease, 21-23 न्यूक्लियोटाइड परिपक्व miRNA डुप्लेक्स 1 में डाइसर द्वारा आगे प्रसंस्करण से गुजरना जहां साइटोप्लाज्म को निर्यात कर रहेहैं. संसाधित परिपक्व miRNA के किस्में में से एक लक्ष्य2 के गिरावट या translational दमन के लिए अग्रणी, दूत RNAs (mRNAs) को लक्षित करने के लिए बांधता है. एक साथ कई विविध लक्ष्य mRNAs को विनियमित करने में miRNAs के pleiotropic भूमिका के आधार पर, यह miRNA अभिव्यक्ति कसकर3 विनियमित है कि आश्चर्य की बात नहीं है. दरअसल, अनुचित अभिव्यक्ति विभिन्न रोग राज्यों में योगदान देती है, खासकर कैंसर में। miRNAs की aberrant अभिव्यक्ति न केवल एक रोग विशिष्ट हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह भी रोगनिरोधी और चिकित्सीय क्षमता 4,5,6 के लिए एक लक्ष्य के रूप में उभरा है. उनके intracellular भूमिकाओं के अलावा, miRNAs भी गैर स्वायत्त भूमिकाएं हैं. उदाहरण के लिए, miRNAs चुनिंदा दाता कोशिकाओं द्वारा EVs में पैक किया जा सकता है और वे सामान्य और रोग शरीर क्रिया विज्ञान 7,8,9 में विविध फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश प्राप्त जहां प्राप्तकर्ता साइटों के लिए निर्यात किया.
स्पष्ट सबूत है कि ईवी जुड़े miRNAs कार्यात्मक biomolecules हैं, यह पूरी तरह से कैसे miRNAs के विशिष्ट subsets कैंसर के रूप में रोग राज्यों में disregulated हैं और कैसे सेलुलर मशीनरी का चयन करता है और Evs10,11 में miRNAs सॉर्ट कर रहे हैं समझ में नहीं आता है. microenvironment modulating में EV-miRNAs की संभावित भूमिका को देखते हुए, यह पूरी तरह से अंतरकोशिकीय संचार और रोग रोगजनन में EVs की भूमिका स्पष्ट करने के लिए चुनिंदा miRNAs के निर्यात में शामिल तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. ईवीएस में miRNA रिलीज की प्रक्रिया को समझना न केवल miRNA निर्यात के महत्वपूर्ण मध्यस्थों को उजागर करेगा, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सा विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ज्ञान के इस स्तर को प्राप्त करने के लिए, उपकरणों ईमानदारी से इन नए प्रयोगात्मक सवालों को संबोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है. दरअसल, ईवीएस का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन नई तकनीकों औरनियंत्रणों की शुरूआत के कारण तेजी से बढ़ रहे हैं 12,13. ईवीएस में निर्यात miRNAs की बहुतायत का मूल्यांकन करने के संबंध में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) वर्तमान मानक उपकरण किया गया है. इन उपकरणों EVs में miRNAs की बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होते हैं, उनकी संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए सीमाएं हैं, और गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इन स्थिर दृष्टिकोण का उपयोग अपर्याप्त है. ईवीएस में miRNA निर्यात की गतिशीलता को चित्रित करने के लिए विशेष उपकरणों के संयोजन की आवश्यकता होती है। यहाँ, हम fluorescently संयुग्मित miRNAs का उपयोग कर एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, दाता कोशिकाओं से miRNA रिलीज की गतिशीलता का विश्लेषण करने और EVs में निगमन करने के लिए. हम विधि के फायदे और सीमाओं पर भी चर्चा करते हैं और इष्टतम उपयोग के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं। बहुमुखी विधि इस पत्र में प्रस्तुत ईवीएस और सेलुलर संचार और रोग में उनकी संभावित भूमिकाओं में miRNA रिलीज का अध्ययन करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
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Protocol
नोट: इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक शर्त के रूप में, पहचान और चुनिंदा निर्यात miRNAs के सत्यापन की आवश्यकता है. विभिन्न सेल लाइनों miRNA कार्गो उनके EVs में हल के आधार पर भिन्न होते हैं, यह ब्याज और संबद्ध EVs की सेल लाइन का उपयोग करने से पहले miRNAs के लिए मूल्यांकन किया जा कि सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, लिपोफेक्टामाइन-आधारित अभिकर्मक प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है; प्रयोग की स्थापना से पहले अभिकर्मक दक्षता पूर्व निर्धारण की सिफारिश की है.
1. फ्लोरोफोरे-संयुग्मित EV-miRNA के साथ संस्कृति और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में बढ़ती कोशिकाएं
- प्लेट 200,000 करने के लिए 400,000 एक उपयुक्त संस्कृति माध्यम में एक 6 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों कुओं में कोशिकाओं. धीरे वर्दी सेल वितरण सुनिश्चित करने के लिए थाली भंवर. कोशिकाओं को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 70% -80% संगम तक न पहुंच जाएं, लगभग 24-48 घंटे।
- प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसफ़ेक्ट होने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम के 100μL में अभिकर्मक अभिकर्मक को पतला करें।
नोट: लिपिड की इष्टतम एकाग्रता इस सेटअप से पहले ब्याज की सेल लाइन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। - प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसफ़ेक्ट किया जा करने के लिए, सीरम मुक्त मीडिया के 100 माइक्रोन में एक microcentrifuge ट्यूब में अलग से फ्लोरोफोरे-संयुग्मित EV-miRNA (2nM) और सेल miRNA (2nM) पतला.
नोट: कुल मात्रा ट्रांसफ़ेक्ट कुओं की कुल संख्या के लिए गणना की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, प्रतिदीप्ति 7 समय अंक पर मूल्यांकन किया गया था; इसलिए, चरण 1.2 के लिए कुल मात्रा 700 माइक्रोन और चरण 1.3 के लिए 700 माइक्रोन थी। इसके अतिरिक्त, आत्मविश्वास से कोशिकाओं की सकारात्मक फ्लोरोसेंट आबादी पर कब्जा करने के लिए, उपयोगकर्ता एक गैर फ्लोरोसेंट तले हुए miRNA के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट और इन कोशिकाओं को छोड़कर एक गेट स्थापित करना चाहिए. - पतला अभिकर्मक अभिकर्मक (चरण 1.2 से) पतला अभिकर्मक (चरण 1.2 से) पतला शाही सेना मिश्रण जोड़ें और ट्यूब 3-4 बार उलट द्वारा धीरे मिश्रण. संयुक्त लिपिड-आरएनए मिश्रण कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- कोशिकाओं से नियमित संस्कृति मीडिया निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से सीरम मुक्त मीडिया के 800 माइक्रोन जोड़ें. धीरे लिपिड-आरएनए मिश्रण (चरण 1.4 से) ड्रॉपवाइज कोशिकाओं में 200 माइक्रोन जोड़ें।
नोट: Opti-MEM मीडिया ब्याज की सेल लाइन (Calu6 कोशिकाओं) ट्रांसफ़ेक्ट के लिए इस्तेमाल किया गया था. लिपिड-आरएनए मिश्रण को सीधे संस्कृति मीडिया में जोड़ने की कोशिश करें, मिश्रण को प्लेट के किनारों पर जोड़ने से बचें।
2. प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कटाई
- 7 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को सेते हैं।
नोट: दोनों miRNAs (EV-miRNA और सेल-miRNA) के लगातार अभिकर्मक को मान्य करने के लिए, कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी तरह से 3 घंटे के बाद अभिकर्मक से एकत्र किया जाता है। - 7 घंटे इनक्यूबेशन अवधि के बाद, कुओं से अभिकर्मक परिसर को हटा दें और इसे पूर्ण मीडिया के साथ बदलें।
- 7 घंटे समय बिंदु का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं फसल और 1x पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने.
- यदि पक्षपाती कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, तो एक अच्छी तरह से ट्रिप्सिन के 200 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को प्लेट से अलग करने की प्रतीक्षा करें। अलग कोशिकाओं को एक microcentrifuge ट्यूब और 5 मिनट के लिए 200xg पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली के लिए स्थानांतरण.
- सेल गोली को बाधित करने से बचने के लिए सतह पर तैरनेवाला सावधानी से त्यागें। पहले पीबीएस धोने के लिए, 1x पीबीएस के ~ 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और ऊपर अपकेंद्रित्र चरणों का उपयोग करके पेलेटिंग दोहराएं। पीबीएस धोने को अतिरिक्त दो बार दोहराएं।
- 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान के 200 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन करें।
नोट: 2% पीएफए जोड़ने के बाद, सेल गोली 3-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- खंड 2.3 में चरणों का पालन शेष समय अंक फसल. संग्रहीत सेल छर्रों के सभी ले लीजिए और अनुभाग में चरणों के साथ आगे बढ़ना 3.
3. कोशिकाओं में सेल-miRNA और EV-miRNA सिग्नल का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
- प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। फ्लोरोफोर विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं कि मलबे और सेल समुच्चय को हटाने के लिए सक्षम करने के लिए गोल नीचे polystyrene FACS ट्यूबों के माध्यम से खंड 2 से सेल निलंबन फ़िल्टर करें।
- अंशांकन निर्देशों का पालन करते हुए उपकरण सेट करें। प्रवाह साइटोमीटर चालू करें और उपयोग करने से पहले इसे कम से कम 30 मिनट तक गर्म होने दें। म्यान तरल पदार्थ के साथ द्रव प्रणाली प्रधानमंत्री, और जांच और लेजर संरेखण समायोजित.
- साधन fluidics की पुष्टि करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण चलाएँ। अल्ट्राप्योर फ़िल्टर्ड पानी को फ्लो साइटोमीटर में लोड करें और पर्याप्त अधिग्रहण समय के लिए उचित प्रवाह दर पर चलाएं।
नोट: उचित प्रवाह दर और अधिग्रहण समय ब्याज के सेल प्रकार, नमूना जटिलता, और वांछित डेटा गुणवत्ता पर निर्भर करेगा. - प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और डिटेक्टर और लेजर के प्रदर्शन की पुष्टि करें। ब्याज की सेल लाइन और पसंद के फ्लोरोफोर्स के आधार पर पता लगाने के लिए दहलीज और वोल्टेज पैरामीटर सेट करें।
नोट: सभी डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए, Calu6 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।- FSC 6 पर Calu5000 कोशिकाओं के लिए सिग्नल कैप्चर करने के लिए दहलीज सेट करें। प्रत्येक प्रयोगात्मक दोहराने के लिए 1 एक्स 104 कोशिकाओं के लिए विश्लेषण करें।
- विभिन्न फ्लोरोफोर्स के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए खाते के लिए, मुआवजा नियंत्रण स्थापित करने के लिए केवल एक फ्लोरोफोर्स के साथ स्वतंत्र रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किए गए अन-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और कोशिकाओं का उपयोग करें।
- miRNA निर्यात का पता लगाने के लिए, उम्मीदवार EV-miRNAs (miR-451a और miR-150) एलेक्सा-फ्लोर 488 के लिए संयुग्मित, और एक नियंत्रण कक्ष miRNA (cel-miR-67) Cy3 के लिए संयुग्मित का उपयोग करें.
- प्रत्येक EV-miRNA के लिए, फ्लोरोफोर को 5p स्ट्रैंड के 5′ अंत तक संयुग्मित करें। अभिकर्मक से पहले, फ्लोरोफोरे-संयुग्मित स्ट्रैंड को अपने 100% पूरक 3p स्ट्रैंड पर एनील करें।
- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, क्रमशः 258, 192, 269, और 423 वोल्टेज इकाइयों के लिए सेट एफएससी, एसएससी, एफआईटीसी, और पीई चैनलों का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें(चित्रा 1ए, बी)।
- प्रवाह साइटोमीटर में नकारात्मक नियंत्रण नमूना पेश करें। किसी कस्टम कार्यपत्रक में आगे स्कैटर (FSC) और साइड स्कैटर (SSC) तीव्रता निर्धारित करने के बाद कक्ष संकेतों को कैप्चर करें।
- प्लॉट में, एक्स-अक्ष के लिए एफएससी, वाई-अक्ष के लिए एसएससी और इसके चारों ओर एक बहुभुज खींचकर ब्याज की आबादी के लिए गेट चुनें ( चित्र 1 बी, निचला पैनल देखें)।
- गेटेड आबादी का उपयोग करके एक नया प्लॉट बनाएं।
- सेल miRNA का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत 1 (FS1) और EV-miRNA का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत 2 (FS2) के लिए वाई अक्ष सेट करें. फ्लोरोसेंटली टैग miRNAs में से प्रत्येक के साथ स्वतंत्र रूप से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग कर व्यक्तिगत fluorophores के लिए मुआवजा मापदंडों की स्थापना करें. नए भूखंड में, ब्याज की आबादी पर गेट।
- EV-miRNA का पता लगाने के लिए, FITC चैनल का उपयोग करें। सेल-miRNA संकेत के मूल्यांकन के लिए, पीई चैनल का उपयोग करें. सॉफ्टवेयर में, कोशिकाओं है कि दोनों FITC और पीई डबल प्रतिदीप्ति आबादी के आसपास एक बहुभुज ड्राइंग द्वारा सकारात्मक थे के चारों ओर एक गेट बनाने जब FITC एक्स अक्ष के लिए चुना गया था और पीई वाई अक्ष के लिए चुना गया था.
- गेटेड आबादी के लिए आंकड़े रिकॉर्ड करें।
- गेटेड आबादी में कोशिकाओं का प्रतिशत रिकॉर्ड करें जो एफआईटीसी और पीई दोनों के लिए सकारात्मक हैं, साथ ही उन लोगों के लिए जो एफआईटीसी या पीई के लिए सकारात्मक हैं।
- प्रयोग में किसी भी अतिरिक्त नमूने या नियंत्रण के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
4. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से ईवीएस को अलग करना
- सीरम युक्त मीडिया में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, पार संदूषण को रोकने के लिए सीरम से ईवीएस को कम करें।
- ईवी-समाप्त सीरम उत्पन्न करने के लिए, चिपचिपाहट को कम करने के लिए सेल कल्चर मीडिया में सीरम को 50% तक पतला करें और 18 घंटे के लिए 110,000 x ग्राम पर परिणामी 50% सीरम को अपकेंद्रित्र करें।
- सतह पर तैरनेवाला (ईवी मुक्त सीरम) ध्यान से लीजिए और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर विधानसभा का उपयोग कर इसे फिल्टर. पूर्ण मीडिया उत्पन्न करने के लिए परिणामी 50% ईवी-मुक्त सीरम का उपयोग करें, इस मामले में, आरपीएमआई प्लस 10% सीरम।
- ईवीएस को इकट्ठा करने के लिए, ईवी-समाप्त पूर्ण मीडिया को कोशिकाओं में जोड़ें और इनक्यूबेशन के बाद ईवीएस 48 घंटे इकट्ठा करें।
नोट: नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल Kowal एट अल.14 से संशोधित किया गया है.
- 80% संगम करने के लिए 15 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन में कोशिकाओं बढ़ो. प्रोटोकॉल की धारा 1 में अभिकर्मक प्रोटोकॉल निम्नलिखित Opti-MEM के 10 एमएल में सेल miRNA और EV-miRNA के साथ अलग से कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट करें।
नोट: नहीं सभी अभिकर्मक प्रोटोकॉल रैखिक रूप से स्केलअप. यह पहले अनुकूलित और 15 सेमी प्लेटों में अभिकर्मक शर्तों का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. - 7 घंटे के बाद, अभिकर्मक मीडिया महाप्राण और ईवी-समाप्त मीडिया (15 एमएल) के साथ बदलें। 48 घंटे के लिए EV समाप्त मीडिया में कोशिकाओं बढ़ो.
- कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया निकालें और जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फैलाना. मृत कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर वातानुकूलित मीडिया अपकेंद्रित्र. परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और इसे 0.2 माइक्रोन फिल्टर असेंबली का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
- फ़िल्टर्ड सेल कल्चर मीडिया को जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक बाँझ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक दूसरे के खिलाफ ट्यूबों का वजन और संतुलन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 110,000 x ग्राम पर नमूने स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 90 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 110,000 x ग्राम पर धोने और अपकेंद्रित्र करने के लिए 1x पीबीएस की उचित मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें।
नोट: ईवी गोली इस अध्ययन में इस्तेमाल फिक्स्ड-एंगल रोटर ट्यूबों के लिए अनुमत अधिकतम मात्रा के आधार पर 1x पीबीएस के 60 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया गया था। - पीबीएस को महाप्राण करें और ईवी गोली को ताजा 1x पीबीएस और भंवर की उचित मात्रा (50-100 माइक्रोन) में निलंबित करें। बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ईवीएस स्टोर करें।
5. ईवीएस में सेल-miRNA और EV-miRNA सिग्नल का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
- फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए ईवी निलंबन तैयार करने के लिए, अल्ट्राफिल्टर्ड 1x पीबीएस की उचित मात्रा में ईवीएस को पतला करें।
नोट: ईवीएस के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए लोडिंग वॉल्यूम नमूनों में ईवीएस की संख्या के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। मोटे तौर पर, अगर ईवी निलंबन में ~ 30,000 कण हैं, तो अंतिम मात्रा 1x पीबीएस में ~ 500-600 माइक्रोन होनी चाहिए। एक साफ नमूने में लगभग 35-50 कण/μL होते हैं। - नैनो-फ्लो साइटोमीटर या नैनो-आकार के कणों का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त शक्तिशाली वैकल्पिक उपकरण का उपयोग करें।
नोट: यहां, अट्यून एनएक्सटी नैनो-फ्लो साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। - सॉफ्टवेयर खोलें और अनुशंसित अंशांकन निर्देशों का पालन करते हुए उपकरण को सेट करें। प्रदर्शन नैनो मोती का उपयोग कर प्रदर्शन परीक्षण प्रदर्शन. यदि नैनो-मोतियों को मानक आकार सीमा में पाया जाता है, तो प्रदर्शन इष्टतम है। ईवी कणों का पता लगाने के लिए उपयुक्त प्रवाह दर निर्धारित करें।
- उपकरण फ्लुइडिक्स और डिटेक्टर और लेजर के प्रदर्शन की पुष्टि करने के लिए अल्ट्राप्योर फ़िल्टर्ड पानी का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण चलाएं।
- प्रयोग के लिए उपयुक्त अंशांकन मोती का प्रयोग, सही ढंग से अलग अलग आकार मोती का पता लगाने और प्रतिदीप्ति संकेतों को मापने के लिए प्रवाह cytometer सेट.
नोट: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ईवी विश्लेषण की स्थापना के लिए, ApogeeMix मोतियों का उपयोग किया गया था। इन मोतियों में गैर-फ्लोरोसेंट सिलिका मोतियों और फ्लोरोसेंट पॉलीस्टायर्न मोतियों का मिश्रण होता है जो 80 एनएम से 1300 एनएम तक के आकार में होता है।- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मनका मिश्रण में विभिन्न आबादी की संवेदनशीलता और संकल्प का आकलन करने के लिए पैरामीटर सेट करें। साधन शोर से मनका आबादी को हल करने के लिए उपयुक्त गेटिंग का प्रयोग करें.
- विश्लेषण के लिए लोड करने से पहले ईवीएस को समान रूप से वितरित करने के लिए नमूनों को अच्छी तरह से भंवर करें।
- प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और अल्ट्रा-फ़िल्टर्ड पीबीएस पेश करें। अल्ट्रा-फ़िल्टर्ड पीबीएस का उपयोग करके ईवी कणों के लिए गेटिंग सेट करें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि गेटिंग चरण 5.5 में मोतियों के आधार पर कणों के उचित आकार से मेल खाती है।
- ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण नमूना लोड करें क्योंकि वे प्रवाह साइटोमीटर से गुजरते हैं। X-अक्ष पर FSC और Y-अक्ष पर SSC की साजिश रचते हुए EV संकेतों को कैप्चर करें।
नोट: ईवीएस पर कब्जा करने के लिए एसएससी सीमा 300 पर निर्धारित की गई थी। अधिग्रहण की मात्रा कुल 145 माइक्रोन खींची मात्रा से 95 माइक्रोन पर सेट की गई थी। प्रवाह दर 12.5 μL/मिनट पर सेट किया गया था। विश्लेषण 1 x 106 EV कणों के साथ किया गया था। EV आबादी विषम है और इसके परिणामस्वरूप EVs के साथ कुछ मलबा अलग हो जाएगा। एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट में समग्र कण का पता लगाने में एक विविध श्रेणी में कणों को उजागर किया गया है, जो कच्चे ईवी तैयारी का उपयोग करते समय अपेक्षित है। - गेटेड आबादी का उपयोग करके एक नया प्लॉट बनाएं।
- इस बार, प्रतिदीप्ति संकेत 1 (FS1) एक्स अक्ष और प्रतिदीप्ति संकेत 2 (FS2) Y-अक्ष पर EV-miRNA का पता लगाने के लिए पर सेल miRNA का पता लगाने के लिए चुनें.
- एक एकल miRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से अलग EV नमूनों का उपयोग करके फ्लोरोफोर्स के लिए मुआवजा पैरामीटर सेट करें। नए प्लॉट में, ब्याज की ईवी आबादी पर गेट।
- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से अलग ईवीएस में फ्लोरोफोर-संयुग्मित miRNAs की अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, क्रमशः 370, 370, 400, और 400 वोल्टेज इकाइयों पर सेट FSC, SSC, BL1, और YL1 चैनलों का उपयोग करके EV नमूनों का विश्लेषण करें(चित्रा 2A, B)।
- गेटेड आबादी के लिए आंकड़े रिकॉर्ड करें और हिस्टोग्राम और डॉट प्लॉट का उपयोग करके उनकी कल्पना करें।
- प्रयोग में किसी भी अतिरिक्त नमूने या नियंत्रण के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
6. क्यूआरटी-पीसीआर के माध्यम से ईवीएस में miRNAs की रिहाई को मान्य करना
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए miRVana RNA आइसोलेशन किट का उपयोग करके EVs और मूल कोशिकाओं से RNA निकालें।
नोट: ईवीएस से अलग आरएनए की मात्रा का ठहराव संभव नहीं है क्योंकि ईवीएस से अलग आरएनए की कुल मात्रा आमतौर पर एक मानक नैनो-ड्रॉप की न्यूनतम मात्रा सीमा को पार नहीं करती है। यह ईवी नमूनों से राइबोसोमल आरएनए की कमी के कारण है, जिसे एगिलेंट बायोएनालाइज़र का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है। इस प्रकार, ईवी-आरएनए परिमाणीकरण के लिए अखंडता स्कोर आमतौर पर विश्वसनीय नहीं है और ईवी-आरएनए मात्रा का सही प्रतिनिधित्व नहीं है। इसलिए, ईवी-आरएनए और सेल-आरएनए के क्यूआरटी-पीसीआर परिमाणीकरण के लिए, समान संख्या में कोशिकाओं से अलगाव के बाद आरएनए आइसोलेट्स के बराबर संस्करणों का उपयोग किया गया था। क्यूआरटी-पीसीआर के सामान्यीकरण के लिए, miRNAs सर्वव्यापी रूप से कई नमूनों में मौजूद है जैसा कि पहले से अधिग्रहित आरएनए अनुक्रमण डेटा से निर्धारित किया गया था। - छोटे आरएनए के लिए विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग करके निकाले गए आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करें।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक सीडीएनए टेम्पलेट और miRNA विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर qRT-पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें.
नोट: सत्यापन प्रयोगों के लिए, miRCURY LNA qRT पीसीआर किट और निर्माता से इसी प्राइमरों सेल-miRNA और EV-miRNA की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
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Representative Results
यहां, हम कोशिकाओं से ईवीएस में miRNA की रिहाई की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, सेल miRNA और EV-miRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण EV-miRNA के लिए इसी प्रतिदीप्ति संकेत की एक अनुक्रमिक कमी का पता चला, जबकि सेल miRNA के लिए इसी संकेत कोशिकाओं में बनाए रखा गया था. यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ्लोरोफोर संयुग्मन ईवीएस में miRNA रिलीज में हस्तक्षेप नहीं करता है, miR-451a को दो अलग-अलग फ्लोरोफोर्स (यानी, एलेक्सा फ्लोर 488 और एलेक्सा फ्लोर 750) में संयुग्मित किया गया था, और सेल प्रतिधारण का मूल्यांकन किया गया था। परिणाम अलग-अलग फ्लोरोफोर संकेतों के बाद अभिकर्मक का पता लगाने के बीच न्यूनतम परिवर्तनशीलता का संकेत देते हैं, इस दृष्टिकोण की विश्वसनीयता को मान्य करते हैं (चित्र 3ए, बी)।
क्योंकि विभिन्न कारणों से आरएनए गिरावट सहित कोशिकाओं से फ्लोरोसेंटली टैग किए गए miR-451a के नुकसान की व्याख्या की जा सकती है, इसलिए यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण था कि सेलुलर हानि ईवी बहुतायत के साथ मेल खाती है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, ईवीएस में एलेक्सा फ्लोर-488 के लिए संयुग्मित miR-451a का संचय समय-निर्भर तरीके से देखा गया, जो कुशल पैकेजिंग और ईवीएस में miRNA की अंतिम रिलीज का प्रमाण प्रदान करता है। इसके विपरीत, सेल बनाए रखा miRNA, cel-miR-67 के लिए इसी प्रतिदीप्ति संकेत EVs (चित्रा 4) में पता नहीं चला था. इस नए दृष्टिकोण का उपयोग कर इन निष्कर्षों को क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके मान्य किया गया था, जिसने सेल-miRNA, cel-miR-67(चित्रा 5)की तुलना में miR-150, एक अतिरिक्त EV-miRNA के लिए काफी अधिक EV/सेल अभिव्यक्ति अनुपात का खुलासा किया।
चित्रा 1: कोशिकाओं में संकेतों का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमीटर मापदंडों की स्थापना। (ए) सेल प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए, सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, हाइलाइट किए गए वोल्टेज को इंगित मापदंडों के लिए स्थापित किया गया था। उपकरण प्रति नमूना 10,000 कोशिकाओं को रिकॉर्ड करने के लिए स्थापित किया गया था। इंस्पेक्टर व्यू पता लगाने और विश्लेषण के लिए स्थापित मापदंडों की पुष्टि करता है। (बी) सेल प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए, एफएससी पैरामीटर के लिए थ्रेशोल्ड सॉफ्टवेयर के साइटोमीटर सेटिंग्स टैब के तहत 5,000 पर सेट किया गया था। ऊपरी दाएं पैनल डेटा कैप्चर के लिए लेजर सेटिंग्स दिखाता है। नीचे के पैनल कोशिकाओं का पता लगाने की प्रगति के दौरान एक सक्रिय वैश्विक कार्यपत्रक दिखाते हैं। नमूने एक मध्यम प्रवाह पर चलाए गए थे और क्रमशः एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष मापदंडों के रूप में एफएससी-ए और एसएससी-ए स्थापित करते समय कब्जा कर लिया गया था। गेटिंग को ब्याज की आबादी के चारों ओर एक ड्राइंग बहुभुज उपकरण का उपयोग करके सेट किया गया था। सेल आबादी की विविधता के आधार पर ब्याज की एक और सेल लाइन के लिए गेटिंग अलग हो सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ईवीएस में सिग्नल डिटेक्शन के लिए फ्लो साइटोमेट्री मापदंडों की स्थापना। (ए) ईवीएस का पता लगाने और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, अधिग्रहण की मात्रा 95 माइक्रोन पर सेट की गई थी, जिसमें प्रवाह की गति 12.5 माइक्रोन/मिनट पर सेट की गई थी। EV डिटेक्शन के लिए चुनी गई थ्रेशोल्ड 0.3 x1000 सॉफ्टवेयर के इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स टैब के तहत इस्तेमाल किए गए कैलिब्रेशन बीड्स पर आधारित थी। FSC, SSC, BL1 और YL1 के लिए वोल्टेज क्रमशः 370, 370, 400 और 400 थे। (बी) विषम ईवी आबादी को पकड़ने और उपकरण की पृष्ठभूमि शोर से ईवीएस को अलग करने के लिए गेटिंग की स्थापना। ईवी आबादी से पृष्ठभूमि शोर को हल करने के लिए एक खाली पीबीएस नमूना (शीर्ष) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ईवी नमूना (नीचे) से पता चलता है कि ब्याज की आबादी कुल आबादी का केवल 1.8% है क्योंकि नमूना आकार सीमा में अतिव्यापी कणों के साथ विषम है। हालांकि, ब्याज की ईवी आबादी का पता लगाने के लिए कड़े गेटिंग को चुना गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से कोशिकाओं में सिग्नल का पता लगाना। (ए)EV-miRNA और सेल-miRNA के अनुरूप प्रतिदीप्ति अभिकर्मक के बाद 7 घंटे और 72 घंटे के बीच संकेत दिया समय पर कोशिकाओं में पाया गया था. EV-miR-451a (एलेक्सा फ्लोर-488) के अनुरूप संकेत सेल-बनाए रखा-miRNA, cel-miR-67 से संकेत की तुलना में समय के साथ कम हो गया। (बी)एलेक्सा फ्लोर-750 के साथ लेबल EV-miR-451a के लिए इसी प्रतिदीप्ति एलेक्सा Fluro-488 लेबल miR-451a के रूप में एक ही प्रवृत्ति से पता चला, यह दर्शाता है कि फ्लोरोफोर कोशिकाओं द्वारा miRNAs के प्रतिधारण को प्रभावित नहीं करता है. कुल मिलाकर, प्रतिनिधि परिणाम transfected miRNA EVs में miRNA के निर्यात के आधार पर अंतर्जात miRNA के लिए इसी तरह व्यवहार करता है कि संकेत मिलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से ईवीएस में सिग्नल का पता लगाना। EV-miR-451a और सेल-cel-miR-67 के अनुरूप प्रतिदीप्ति EVs 24 घंटे और 48 घंटे के बाद अभिकर्मक में पाया गया था। EV-miR-451a (एलेक्सा फ्लोर-488) के अनुरूप सिग्नल को अभिकर्मक के बाद EVs 48 घंटे में कैप्चर किया गया था। इसके विपरीत, cel-miR-67 के लिए संकेत ईवीएस में नहीं पाया गया था. एक खाली पीबीएस नमूना चित्रा 2 बी में दिखाया गया के रूप में, इस प्रयोग के लिए गेटिंग स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. गैर-फ्लोरोसेंट तले हुए आरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से अलग किए गए ईवी नमूनों का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग कर कोशिकाओं और ईवीएस में ईवी-miRNA और सेल miRNA की मात्रा का ठहराव. Calu6 कोशिकाओं miR-150 और cel-miR-67 प्रत्येक के 2 एनएम के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया. ईवीएस अभिकर्मक के बाद 48 घंटे एकत्र किए गए थे। ईवी संवर्धन की गणना miR-150 और cel-miR-67 के लिए ट्रांसफ़ेक्ट Calu6 कोशिकाओं में सेलुलर अभिव्यक्ति द्वारा विभाजित EV अभिव्यक्ति के अनुपात के रूप में की गई थी। Calu6 कोशिकाओं और उनके इसी EVs में miRNAs की अभिव्यक्ति की तुलना शाही सेना अनुक्रमण परिणामों के आधार पर, miR-30c एक अंतर्जात नियंत्रण और गुना परिवर्तन गणना के लिए एक normalizer के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रस्तुत डेटा एक जैविक प्रतिकृति से हैं, जिसमें प्रत्येक डेटा बिंदु ट्रिपल क्यूआरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाएं पेश करता है। डेटा को एसडी ± मतलब के रूप में व्यक्त किया जाता है, और पी-मानों की गणना वेल्च के सुधार (** पी < 0.01) के साथ एक अयुग्मित टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| ताकत | कमजोरियों |
| कोशिकाओं और संबंधित EVs में कई miRNAs के चयनात्मक निर्यात के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है | सक्रिय और निष्क्रिय निर्यात घटना के बीच अंतर करने के लिए अतिरिक्त प्रक्रियाओं की आवश्यकता है |
| क्रूड विषम आबादी का आकलन संभव है और ईवी आबादी के पूर्व पृथक्करण की आवश्यकता नहीं है। विभिन्न प्रकार के ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नोट: विभिन्न प्रकार के कणों का पता लगाने के लिए थ्रेशोल्ड अलग-अलग होंगे |
कम संवेदनशीलता कोशिकाओं या EVs में miRNAs की सीमित सांद्रता का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं है. ईवीएस से आरएनए अलगाव के बाद डाउनस्ट्रीम क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण को शामिल करके इसे दूर किया जा सकता है |
| miRNA परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया मानक तरीकों की तुलना में सेट अप और विश्लेषण के लिए समय की एक छोटी राशि की आवश्यकता है | विभिन्न प्रकार के उपकरणों, सेल-लाइनों और विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए मानकीकरण प्रोटोकॉल का अभाव। |
तालिका 1: प्रोटोकॉल की प्रमुख ताकत और कमजोरियां।
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Discussion
नव स्थापित प्रोटोकॉल ईवीएस EVs EV-miRNAs के अभिकर्मक अभिकर्मक में miRNA रिलीज के कैनेटीक्स पर कब्जा करने में सक्षम बनाता है. दृष्टिकोण साइटोमीटर की क्षमताओं के अधीन कई EV-miRNAs और सेल-miRNAs के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, जबकि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ईवी miRNA जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। यद्यपि अधिक व्यापक समझ के लिए अन्य तकनीकों के संयोजन के साथ उपयोग किए जाने पर कुछ सीमाओं को दूर किया जा सकता है।
ईवी जीव विज्ञान में रुचि का एक उभरता हुआ क्षेत्र ईवीएस15,16 में miRNAs के चयनात्मक निर्यात को समझ रहा है. इस प्रोटोकॉल miRNA के चयनात्मक निर्यात का अध्ययन करने की अनुमति देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक सक्रिय और निष्क्रिय निर्यात के बीच भेद है. सावधानी के बाद से प्रयोग किया जाना चाहिए एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता पर एक miRNA overexpress miRNA के निर्यात को बदल सकता है, संभावित अनुचित निष्क्रिय लोड हो रहा है में जिसके परिणामस्वरूप. इसलिए, प्रयोग miRNAs के इष्टतम अभिकर्मक सांद्रता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि चयनात्मक निर्यात का अध्ययन.
इसके अलावा, प्रोटोकॉल, जब नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) जैसी पूरक तकनीकों के साथ संयुक्त होता है, तो शोधकर्ता को ईवी कण गणना का आकलन करने में सक्षम बनाता है, जबकि एमआईआरएनए रिलीज का मूल्यांकन भी करता है और ईवी बायोजेनेसिस रास्ते और एमआईआरएनए निर्यात तंत्र में परिवर्तन के बीच अंतर करने में सक्षम बनाता है। यह इन प्रक्रियाओं17 के अतिव्यापी मध्यस्थों के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह देखते हुए कि miRNAs EV biogenesis में शामिल कुछ सहित विभिन्न phenotypes, को प्रभावित कर सकते हैं, यह miRNAs18 के अभिकर्मक निम्नलिखित कण गिनती का मूल्यांकन करने के लिए विवेकपूर्ण होगा. इस बाधा को दूर करने के लिए, एक अन्य विकल्प एक EV-miRNA को शामिल करना होगा जो प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत अपरिवर्तित रहता है, जिससे EV-miRNA निर्यात में शामिल मार्गों को उजागर करते हुए EV बायोजेनेसिस में शामिल कारकों को खारिज किया जा सके।
कई अध्ययनों qRT-PCR, अंतर्जात miRNA परिमाणीकरण10,11,16 के लिए एक मानक विधि का उपयोग miRNAs मात्रा निर्धारित की है. हालांकि, यह गतिशील ईवीएस में miRNAs की रिहाई पर कब्जा करने की क्षमता का अभाव. प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना क्यूआरटी-पीसीआर से करते समय, वे परख संवेदनशीलता और डिजाइन के आधार पर बहुत भिन्न होते हैं। क्यूआरटी-पीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक और सैद्धांतिक रूप से न्यूनतम miRNA प्रतिलिपि मायने रखता है यों में सक्षम है, दो नमूनों भेद ब्याज की miRNAs की प्रतिलिपि संख्या में कम से कम एक 2 गुना (100%) अंतर की आवश्यकता है. दूसरी ओर, फ्लो साइटोमेट्री, फ्लोरोसेंटली लेबल miRNA की प्रचुरता के आधार पर संकेत आधारित मतभेदों को पकड़ती है और संकेतों में छोटे प्रतिशत परिवर्तन अंतर कर सकते हैं. बहरहाल, इसकी कम संवेदनशीलता सीमित प्रतिलिपि संख्या के साथ miRNAs का पता लगाने को प्रतिबंधित करता है. दो तकनीकों synergistically एक दूसरे के पूरक जब संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल चयनात्मक miRNA निर्यात गतिशीलता की जांच करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है. उपर्युक्त चुनौतियों के बावजूद, इस प्रोटोकॉल की ताकत एक साथ कई miRNAs का विश्लेषण करने की क्षमता में निहित है, miRNA जीव विज्ञान, उनके निर्यात, और ईवी जीव विज्ञान में उनकी भूमिका की बेहतर समझ के लिए योगदान. प्रमुख ताकत और प्रोटोकॉल है कि विचार किया जा करने की जरूरत की कमजोरियों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं.
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम पर्ड्यू विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा के निदेशक डॉ जिल हचक्रॉफ्ट से समर्थन और सलाह स्वीकार करते हैं। इस काम को R01CA226259 और R01CA205420 द्वारा समर्थित किया गया था एएलके, एक अमेरिकन लंग एसोसिएशन इनोवेशन अवार्ड (ANALA2023) IA-1059916 से ALK, एक पर्ड्यू साझा संसाधन सुविधा अनुदान P30CA023168, और एक प्रमुख फुलब्राइट डॉक्टरेट छात्रवृत्ति राज्य विभाग, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा एचएच को सम्मानित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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